TWI695846B - 固化式組織澄清方法與組合物 - Google Patents
固化式組織澄清方法與組合物 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI695846B TWI695846B TW107135588A TW107135588A TWI695846B TW I695846 B TWI695846 B TW I695846B TW 107135588 A TW107135588 A TW 107135588A TW 107135588 A TW107135588 A TW 107135588A TW I695846 B TWI695846 B TW I695846B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- composition
- tissue
- group
- biological sample
- combinations
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 37
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 17
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 11
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 claims description 11
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 9
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 claims description 6
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- SERLAGPUMNYUCK-DCUALPFSSA-N 1-O-alpha-D-glucopyranosyl-D-mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SERLAGPUMNYUCK-DCUALPFSSA-N 0.000 claims description 5
- GJKGAPPUXSSCFI-UHFFFAOYSA-N 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone Chemical group CC(C)(O)C(=O)C1=CC=C(OCCO)C=C1 GJKGAPPUXSSCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- HWSSEYVMGDIFMH-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-(2-methylprop-2-enoyloxy)ethoxy]ethoxy]ethyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCOCCOCCOC(=O)C(C)=C HWSSEYVMGDIFMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- RIWRBSMFKVOJMN-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1-phenylpropan-2-ol Chemical compound CC(C)(O)CC1=CC=CC=C1 RIWRBSMFKVOJMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 5
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000905 isomalt Substances 0.000 claims description 5
- 235000010439 isomalt Nutrition 0.000 claims description 5
- HPIGCVXMBGOWTF-UHFFFAOYSA-N isomaltol Natural products CC(=O)C=1OC=CC=1O HPIGCVXMBGOWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000832 lactitol Substances 0.000 claims description 5
- 235000010448 lactitol Nutrition 0.000 claims description 5
- VQHSOMBJVWLPSR-JVCRWLNRSA-N lactitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O VQHSOMBJVWLPSR-JVCRWLNRSA-N 0.000 claims description 5
- 229960003451 lactitol Drugs 0.000 claims description 5
- VQHSOMBJVWLPSR-WUJBLJFYSA-N maltitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O VQHSOMBJVWLPSR-WUJBLJFYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000845 maltitol Substances 0.000 claims description 5
- 235000010449 maltitol Nutrition 0.000 claims description 5
- 229940035436 maltitol Drugs 0.000 claims description 5
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 4
- FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N methacrylamide Chemical compound CC(=C)C(N)=O FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 3
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims description 3
- CCJAYIGMMRQRAO-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[(2-hydroxyphenyl)methylideneamino]butyliminomethyl]phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1C=NCCCCN=CC1=CC=CC=C1O CCJAYIGMMRQRAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 9
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 abstract description 7
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 abstract 2
- 238000009877 rendering Methods 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 62
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 31
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 21
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 9
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 description 9
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 7
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 6
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 5
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 5
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 4
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 4
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 4
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 4
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 4
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CNCOEDDPFOAUMB-UHFFFAOYSA-N N-Methylolacrylamide Chemical compound OCNC(=O)C=C CNCOEDDPFOAUMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 150000003926 acrylamides Chemical class 0.000 description 3
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 3
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 3
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 210000000277 pancreatic duct Anatomy 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 3
- 230000001699 photocatalysis Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 2
- SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N benzyl benzoate Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OCC1=CC=CC=C1 SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 238000010526 radical polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- QURLONWWPWCPIC-UHFFFAOYSA-N 2-(2-aminoethoxy)ethanol;3,6-dichloro-2-methoxybenzoic acid Chemical compound NCCOCCO.COC1=C(Cl)C=CC(Cl)=C1C(O)=O QURLONWWPWCPIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 102100025038 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1 Human genes 0.000 description 1
- 101710186825 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1 Proteins 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 210000002565 arteriole Anatomy 0.000 description 1
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 229960002903 benzyl benzoate Drugs 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000000298 carbocyanine Substances 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 208000020082 intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 230000035168 lymphangiogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 238000007146 photocatalysis Methods 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/44—Sample treatment involving radiation, e.g. heat
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Instructional Devices (AREA)
Abstract
本發明揭示了使生物組成〔例如動物組織或器官〕在固化之後成為透明檢體的組合物及方法。
Description
本揭示內容為使生物組成或生物材料，例如動物的組織或器官，在固化之後成為透明檢體的方法與組合物。
傳統上，由於厚片組織〔例如手術檢體〕不利光線穿透，若欲觀察組織的內部結構，必須先進行檢體切片，再利用顯微鏡獲取切片的二維影像，接著將所得到的影像重組疊圖形成三維影像，藉以觀察更完整的組織結構。然而，影像重組的過程不僅耗時且不夠精確。為突破檢體於影像擷取時所受到的光學限制，在過去的二十年間，已經發展出許多能夠改善光線穿透樣本的試劑與技術。例如將檢體浸泡於苯甲醇/苯甲酸苄酯溶液〔又稱「Murray’s clear」，Dodt et al.(Nature Methods(2007)4(4),331-336)〕、或浸泡於以尿素為主的SCALEVIEW-A2溶液〔Miyawaki et al.(US 20130045503A1)〕、或浸泡於FocusClear溶液〔Ann-Shyn Chiang(US 6,472,216 B1)〕、或以
CLARITY技術處理檢體〔Chung et al.(Nature(2013)497,332-337)〕。上述的方法皆是以「溶液浸泡」的形式使生物樣本透明化，因此樣本需要放置且固定於合適的載具中，才能加入溶液浸泡，以利組織影像的擷取與分析〔例如，三維共軛焦顯微影像的擷取與分析〕。此外，「溶液浸泡式」的組織澄清有一項重要的缺陷，即溶液中的液態成分〔例如溶劑〕會逐漸蒸散而導致折射率產生改變。
本發明提供了一種新穎的「固化式」組織澄清之組合物與方法，其能夠簡易、快速且安全地使生物樣本透明化，並能夠改善前述「溶液浸泡式」組織澄清技術的缺點。
本發明的部分內容是基於非預期的實驗發現：當以本發明的化學組成處理生物樣本之後，例如將動物或昆蟲的組織或器官包埋於其中，能使樣本變得透明。因此，經螢光標記的生物樣本，透過本發明之「固化式」組織澄清方法處理且變得透明後，即可直接置於顯微鏡下擷取與分析組織內部的影像。由於沒有液態(體)成分於系統之中，突破了傳統「溶液浸泡式」組織澄清方法的操作限制。
換言之，本發明的一個特點係提供了一種新穎的組織澄清方法與組合物，能使生物樣本於一固化聚合物中變得透明。所述組合物包含丙烯醯胺的衍生化合物
(作為單體)、雙醣、交聯劑、光起始劑以及溶劑，其中丙烯醯胺的衍生化合物與雙醣分別佔該組合物之總重量百分比約15-45%；交聯劑與光起始劑所佔之重量百分比例則分別為2-10%與2%；其餘的重量百分比例為溶劑，且該組合物係藉由紫外光照而交聯成該固化聚合物。
依據本發明的實施例，該丙烯醯胺的衍生化合物是選自由甲基丙烯醯胺、N-羥甲基丙烯醯胺、丙烯醯胺以及其組合所組成的群組。
依據本發明的實施例，該雙醣是選自由麥芽糖醇、異麥芽酮糖醇、乳糖醇、蔗糖、海藻糖以及其組合所組成的群組中。
依據本發明的實施例，該交聯劑可選自由三乙二醇二甲基丙烯酸酯、N,N’-亞甲基雙丙烯醯胺以及其組合所組成的群組中。
依據本發明的實施例，光起始劑可選自由Irgacure 2959、Darocur 1173以及其組合所組成之群組中。
依據本發明的實施例，以水作為溶劑為較好的選擇。
本發明也涵蓋一種能使生物樣本於一固化聚合物中透明化的方法。所述方法包含以下步驟：(a)將生物樣本完全浸沒於本揭示內容之組合物中；及(b)以紫外光照射步驟(a)之產物直至形成該固化聚合物為止。
依據本發明的實施例，生物樣本可為哺乳動物或昆蟲的組織。
依據本發明的實施例，該哺乳動物的組織可為大腦、心臟、肺臟、胃、胰臟、小腸、肝臟、腎臟或直腸。
依據本發明的實施例，生物樣本係先以影像示蹤劑標記，且影像示蹤劑可為螢光染劑、螢光蛋白質或帶有螢光標記的抗體。
本發明的實施例詳細地列於下文中，關於本發明的特性與優點也將藉由請求項的細節說明而呈現。
關於本發明的前述內容與接下來的細節描述皆為示例性的，目的在於更進一步的闡釋本發明的請求範圍。
本說明書的細節描述將藉由附圖以協助說明，其目的在使讀者能更了解本發明於不同生物樣本系統中的使用方法，並提供具有示例性的實施例。下述為附圖說明：第1圖為本揭示內容的一個實施例，其內容為呈現當組織在進行「固化式澄清方法」處理後所產生的差異。其中(A)為完整的小鼠消化道，分別保存於生理食鹽水(圖左)及本發明所揭示之組織澄清聚合物中(圖
右)，箭頭所指為腸胃道的內容物。(B)為小鼠結腸組織樣本，分別保存於生理食鹽水(圖左)及本發明所揭示之組織澄清聚合物中(圖右)。(C)為人類胰臟組織樣本，分別保存於生理食鹽水(圖左)及本發明所揭示之組織澄清聚合物中(圖右)。
第2圖為本揭示內容的一個實施例，其內容為呈現小鼠結腸樣本在經由「固化式澄清方法」處理之後，以共軛焦顯微鏡技術所擷取的三維組織影像，其中(A)為小鼠結腸組織的正投影視圖，可看到結腸隱窩(黏膜結構)與肌肉組織的訊號，影像堆疊尺寸為360×360×250(x,y,z)μm。(B)為小鼠結腸組織其血管網絡之三維投影影像。(C)為小鼠結腸組織其神經網絡之三維投影影像。(D)則為圖2-B與2-C的疊合影像。
第3圖為本揭示內容的一個實施例，其內容為呈現當人類胰臟組織檢體在經由「固化式澄清方法」處理之後，以共軛焦顯微鏡技術所獲得之二維組織影像與三維投影影像。其中，我們可觀察到在人類胰臟中「神經」與「胰小島」所形成的網絡結構(neuro-insular network)。(A)為人類胰臟組織的二維組織影像。(B)為人類胰臟神經與胰小島網絡的三維投影影像。其中綠色表示神經網絡訊號，以神經標記PGP 9.5染色；紅色表示血管訊號，以血管標記CD31染色；白色則為細胞核染色標記的訊號。虛線箭頭所指為小動脈周圍之神經血管的交互情形；箭頭所指為胰臟內
的神經節結構；星號處則表示胰小島結構。比例尺為500μm。
第4圖為本揭示內容的一個實施例，其內容為呈現經由「固化式澄清方法」處理的小鼠腎臟樣本之組織影像。此樣本先以Alexa Fluor® 488作血管灌流標記處理，再以細胞核染色標記組織微結構。其中，(A)為穿透式可見光照射下所取得的組織影像。(B)則為(A)小圖與螢光訊號重疊所產生之影像。星號處表示腎小球；虛線箭頭所指為小動脈結構；紅色表示血管標記的訊號；綠色表示細胞核染色的訊號。比例尺為200μm。
第5圖為本揭示內容的一個實施例，其內容為呈現經由「固化式澄清方法」處理的人類胰臟病理樣本之二維與三維組織影像。其中，我們可以觀察到胰臟癌患者的「胰臟上皮瘤變」病灶(pancreatic intraepithelial neoplasia)。(A)為組織樣本中之「胰臟上皮瘤變」病灶，此病灶距離胰臟癌邊緣約5公分的位置。箭頭所指為胰小島結構。(B)為胰導管病灶之三維投影影像的放大圖，星號表示(A)小圖與(B)小圖的相對位置。(C)為小動脈周圍交感神經訊號之三維投影影像的放大圖，(C)的範圍為(A)小圖黑色方框區域。其中綠色表示交感神經纖維訊號，以交感神經標記酪氨酸羥化酶(TH)染色所得；紅色表示血管訊號(CD31)；白色為細胞核染色的訊號。(A)小圖的比例尺為1cm；(B)及(C)小圖的比例尺為500μm。
下文與附圖的結合係為協助描述本發明的內容，其僅為示例性質，並非應用於本發明實施例的唯一形式。
整體而言，本揭示內容係關於一種生物檢體的處理方法。當使用本發明所揭示之組合物處理生物檢體(例如動物或昆蟲組織或器官)之後，能使檢體固化並包埋在材料中，且使檢體變得透明。此外，透明化的生物檢體能直接進行後續的組織影像擷取與分析，以評估組織樣本的狀況(例如是否有血管新生、發炎、淋巴管新生、或神經病變等)，以觀察與判斷疾病的進程。
換言之，本發明的一個特點係提供了一種組合物，能使生物樣本於固化條件下透明化。為達此目的，我們使用光催化聚合反應，以能形成聚合物之單體為主體，加入交聯劑、催化劑(自由基光起始劑)與雙醣之後，經由紫外光照射產生自由基，引發連鎖反應形成聚合物，固化所包埋之生物樣本使其透明化。
本發明的揭示內容中，合適的單體可以是甲基丙烯醯胺、N-羥甲基丙烯醯胺、丙烯醯胺或其之組合，但不限於這幾種材料。合適的交聯劑可以是三乙二醇二甲基丙烯酸酯、N,N’-亞甲基雙丙烯醯胺或其組合，但不限於這幾種材料。合適的雙醣可以是麥芽糖醇、異麥芽酮糖醇、乳糖醇、蔗糖、海藻糖或其之組合，但不限於這幾種材料。合適的光起始劑可以是Irgacure
2959、Darocur 1173或其之組合，但不限於這幾種材料。合適的溶劑可以是水或緩衝溶液，但不限於這兩種材料。適合本發明目的之緩衝溶液可以是平衡鹽溶液(例如PBS、HBSS等)、TRIS緩衝液(TBS)、人工腦脊髓流體(ACSF)、細胞培養液(例如非必需胺基酸溶液、Dulbecco’s DMEM、或Ham’s F12溶液等)。
依據本發明的實施例，本發明之組合物包含丙烯醯胺的衍生化合物(佔重量百分比例約為15-45%)、交聯劑(佔重量百分比例約為2-10%)、雙醣(佔重量百分比例約為15-45%)、光起始劑(佔重量百分比例約為2%)以及溶劑(佔組成重量百分比例之其餘部分)。
依據本發明的實施例，本發明之組合物包含約40%重量百分比之丙烯醯胺的衍生化合物，其係由甲基丙烯醯胺、N-羥甲基丙烯醯胺與丙烯醯胺混合後組成；約6%重量百分比例之交聯劑，其係由三乙二醇二甲基丙烯酸酯與N,N’-亞甲基雙丙烯醯胺混合後組成；約24%重量百分比例之雙醣，其係由麥芽糖醇、異麥芽酮糖醇、乳糖醇、蔗糖及海藻糖混合後組成；小於2%重量百分比例之光起始劑，其係由Irgacure 2959與Darocur 1173混合後組成；以及水(佔組成重量百分比例之其餘的部分)。所述組和物在照射紫外光後會引發聚合反應，此反應將使聚合物固化並使所包埋的生物樣本澄清化。一般而言，經由「組織澄清化」處理後的生物樣本，在一定的深度範圍內能得到較高解析度的組織顯
微影像。當生物樣本在經本發明所揭示之「固化式澄清方法」處理後，能在共軛焦顯微鏡下觀察並辨別500μm樣本深度之相鄰的細胞核訊號。
可應用於本發明的生物樣本為動物或植物的組織或器官，其中以動物的組織器官為佳，如昆蟲、魚類、兩棲類、鳥類或哺乳類動物等，其中又以哺乳類動物的組織器官為最佳。哺乳類動物並不限於實驗動物(如小鼠、大鼠、兔子、天竺鼠或其他靈長類)、寵物動物(如狗、貓)、家畜動物(如母牛、馬、綿羊)；或人類皆在本發明的請求範圍內。依據本發明的實施例，取自於哺乳動物的組織可為小鼠的大腦、心臟、肺臟、胃、胰臟、小腸、肝臟、腎臟或直腸；或人類的胰臟。
依據本發明的實施例，生物樣本可先以影像示蹤劑標記。而影像示蹤劑可為螢光染劑(如碘化丙啶、長鏈親脂性羰花青染劑)、螢光蛋白質(如GFP)或帶有螢光標記的抗體(如TH)。因此，在生物樣本透明化或澄清化後能在顯微鏡進行觀察分析(以共軛焦顯微鏡為佳)。
本發明也涵蓋一種能使生物樣本於一固化聚合物中透明化的方法。所述方法包含以下步驟：(a)將生物樣本完全浸沒於本揭示內容之組合物中；及(b)以紫外光照射步驟(a)之產物直至形成該固化聚合物為止。
依據本發明的實施例，人類胰臟組織與小
鼠的完整腸胃道等生物樣本將先被置於容器內，再將本發明所揭示之組合物混合後加入前述的容器中，直至生物樣本被完全浸沒。接著以紫外光照射產生自由基，引發連鎖聚合反應，而使生物樣本與組合物固化。其中照射的紫外光波段介於10nm-400nm間，如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390或400nm。此外，經由光催化引發的自由基聚合反應則需要至少2分鐘的時間，如2、3、4、5、6、7、8、9、10分鐘等，直到混合物中的溶液完全反應，使樣本包埋於固化材料中且變得透明。而本發明之組織澄清方法可於0℃至50℃的溫度環境進行，如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃；其中此光催化性之自由基聚合反應的反應溫度於約0℃至25℃的溫度環境進行為佳，如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25℃；其中更以24℃的溫度環境為最佳。
雖然本發明中廣泛的數值區間與參數皆為近似值，本說明書已盡可能精確地呈現實施例中的數值。
然而，任何數值不可避免地皆含有因個別測試所產生的標準偏差。同時，本說明書中所使用的「約」字，通常係指給定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%以內。此外，「約」字於本發明所屬技術領域中具有通常知識者看來，也代表著數值落在可接受的標準誤差之內。除了操作時的示例，或另有明確的說明外，本說明書之揭示內容中所有描述的數值範圍、數量、數值與百分比(例如，用來描述材料用量、持續時間、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者等)應被理解為均需經過「約」字的修飾。因此，除非另有相反的描述，本說明書與請求項所揭示的數值參數皆為近似值，且可視需求而變動。至少每個數值參數應被理解為有效位數套用於一般進位法所得到的數值。
除非本說明書另有定義，本文所用之科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的應相同。此外，除非另有描述，本說明書所使用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；反之亦然。
下述將提出更多具體的實施例與參考資料來闡釋本發明，其目的為示例而非使本發明受限。本發明所屬領域之技術人員之讀者，可完整地利用並實踐本發明。此外，本說明書所引用的所有公開資料，其全文皆視為本說明書的一部分。
實施例
實施例1-「固化式組織澄清方法」之樣
本製備與特性分析
1.1 「固化式組織澄清方法」之生物樣本製備
為了展示本發明之組織澄清效能，本實施例分別以完整小鼠之腸胃道、小鼠結腸組織、以及人類胰臟組織進行樣本透明化處理。首先，將本發明所揭示之組合物(表1)置於容器中待其均勻溶解。接著，放入前述之生物樣本，直至樣本被溶液完全浸沒。過程中此容器置於環境溫度40℃的搖盪器上搖盪(若生物樣本為厚度約500μm的切片，約需搖盪10分鐘)。最後，以紫外光照射引發自由基連鎖聚合反應，直到溶液完全固化(若生物樣本為厚度約500μm的切片，照射時間約需2分鐘)，固化之後生物樣本變為透明，結果示於圖1。
第1圖的照片展示完整的小鼠腸胃道(第1圖，(A))、小鼠結腸組織樣本(第1圖，(B))以及人類胰臟組織樣本(第1圖，(C))分別包埋於由表1之組合物所製備之聚合物內且變得透明。第1圖的左方皆以浸泡 生理食鹽水 作為對照組。
1.2 實施例1.1之透明化小鼠結腸組織的影像分析
在本實施例中，我們以實施例1.1之小鼠結腸組織樣本進行三維共軛焦顯微鏡影像擷取與分析。如第2圖所示，結腸樣本在經過「固化式組織澄清方法」處理之後，可以觀察到腸道之神經與血管網絡在空間中的型態，此為非透明樣本所觀察不到的三維組織結構。
1.3 實施例1.1之透明化人類胰臟組織的影像分析
在本實施例中，我們以實施例1.1之人類胰臟組織樣本進行二維與三維組織影像分析。如第3圖所示，胰臟樣本在經過「固化式組織澄清方法」處理之後，可以觀察到人類胰臟組織中標準的小葉結構(lobular structure)(第3圖，(A))，其特徵為內分泌胰小島散佈於外分泌腺泡中，且周圍有密集的神經血管網絡，能夠調控胰小島之荷爾蒙分泌。三維投影影像(第3圖，(B))可觀察到一般條件下無法看見的人類神
經-胰小島網絡結構(neuro-insular network)。
實施例2-透明化小鼠腎臟組織樣本之深層影像分析
在本實施例中，小鼠(C57BL/6,B6)先以心臟灌流方式將Alexa Fluor® 488複合體導入血管作標記處理，並以4%多聚甲醛(PFA)灌流固定樣本。取下腎臟之後，再將其置於4% PFA中作後固定(15℃,40分鐘)。接著，以振盪切片機切出厚度約400μm的腎臟樣本切片後，將樣本浸泡於2% Triton X-100溶液中使之透化(15℃,2小時)。最後，進行SYTO Orange(Invitrogen)染色以標記細胞核。其中Alexa Fluor® 488的灌流劑量為30μg/每公克小鼠重量，螢光染劑會與血管內皮細胞膜結合標記血管位置。
利用實施例1的流程將標記好的樣本進行組織澄清化之後，我們以Zeiss LSM800共軛焦顯微鏡(Carl Zeiss,Jena,Germany)進行透明化樣本的影像擷取與分析。樣本中被Alexa Fluor® 488標記的血管會被波長488nm之雷射激發，產生之螢光在500-550nm區間會被感測器接收；而被SYTO Orange標記的細胞核會被波長543nm之雷射激發，產生之螢光在560-615nm區間會被感測器接收。結果示於圖4。
如第4圖所示，腎臟組織樣本變得透明後，光線便能穿透組織樣本，我們可使用穿透式顯微鏡(A)與螢光顯微鏡同時進行影像擷取並疊圖(B)，以呈現腎臟
組織的微結構與其血管網絡。
實施例3-透明化人類胰臟「上皮瘤變」樣本之深層影像分析
在本實施例中的人類胰臟「上皮瘤變」樣本，為距離胰臟癌邊緣5公分的位置所取得。在經過「固化式組織澄清方法」處理之後，進行二維與三維影像擷取，藉以分析疾病組織的結構資訊。
上述人類胰臟病變組織樣本之準備流程，與實施例2所述相同。其中，本實施例以交感神經標記物-酪氨酸羥化酶(TH,AB152,Millipore,Billerica,MA,USA)作抗體染色標記，藉以觀察病灶組織小動脈周圍的交感神經分佈狀況。
第5圖(A)為病變樣本經大範圍影像擷取之後，以縫圖整合而形成的組織地圖。圖中可發現胰管腺病灶的進程與脂肪的侵入(後者由穿透光訊號偵測)，以及病灶周圍處胰小島聚集的狀況(箭頭所指處)。由第5圖(B)之放大的三維組織影像與第5圖(C)中小動脈周圍交感神經的分布狀況，能夠觀察並分析於病變的過程中胰管腺組織的變化以及神經血管網絡與瘤變之間的關聯。
整體而言，本揭示內容係關於一種方法，以本發明之組合物處理生物樣本，能使生物樣本包埋於固化材料中且變得透明。因此透明化的生物樣本能夠直接進行後續的組織影像擷取與分析，以評估組織樣本的狀況，此為一般的組織澄清方法或試劑無法達到的。
上述實施方式與實施例僅為例示，且熟習此技藝者可對此進行各種修飾。上文提出之說明、實施例與資料的目的，在於使本說明書的結構完備，並作為實作本發明之例示。雖然本揭示內容已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本揭示內容，任何熟習此技藝者，在不脫離本揭示內容之精神和範圍內，當可進行各種之更動與潤飾，因此本揭示內容之保護範圍當視後附之申請請求範圍所界定者為準。
Claims (13)
- 一種能使生物樣本包埋於一固化聚合物中且變得透明的組合物，包含丙烯醯胺的衍生化合物、雙醣、交聯劑、光起始劑以及溶劑，其中丙烯醯胺的衍生化合物與雙醣分別約佔該組合物總重量的15-45%，該交聯劑約佔該組合物總重量的2-10%，該光起始劑約佔該組合物總重量的2%，該組合物其餘的重量為溶劑重，且該組合物在照射紫外光後會成為該固化聚合物，其中該丙烯醯胺的衍生化合物是選自由甲基丙烯醯胺、N-羥甲基丙烯醯胺、丙烯醯胺以及其組合所組成的群組中。
- 如請求項1所述之組合物，其中該雙醣是選自由麥芽糖醇、異麥芽酮糖醇、乳糖醇、蔗糖、海藻糖以及其組合所組成的群組中。
- 如請求項1所述之組合物，其中該交聯劑是選自由三乙二醇二甲基丙烯酸酯、N,N’-亞甲基雙丙烯醯胺以及其組合所組成的群組中。
- 如請求項1所述之組合物，其中該光起始劑是選自由Irgacure 2959、Darocur 1173以及其組合所組成的群組中。
- 如請求項1所述之組合物，其中該溶劑為水。
- 一種能使一生物樣本於一固化聚合物中透明化的方法，包含：(a)將該生物樣本完全浸沒於請求項1所述的組合物中；及(b)以紫外光照射步驟(a)之產物直至形成該固化聚合物為止。
- 如請求項6所述之方法，其中該雙醣是選自由麥芽糖醇、異麥芽酮糖醇、乳糖醇、蔗糖、海藻糖以及其組合所組成的群組中。
- 如請求項6所述之方法，其中該交聯劑是選自由三乙二醇二甲基丙烯酸酯、N,N’-亞甲基雙丙烯醯胺以及其組合所組成的群組中。
- 如請求項6所述之方法，其中該光起始劑是選自由Irgacure 2959、Darocur 1173以及其組合所組成的群組中。
- 如請求項6所述之方法，其中該溶劑為水。
- 如請求項6所述之方法，其中該生物樣本為哺乳動物或昆蟲的組織。
- 如請求項11所述之方法，其中該哺乳動物的組織為大腦、心臟、肺臟、胃、胰臟、小腸、肝臟、腎臟或直腸。
- 如請求項12所述之方法，其中該生物樣本係先以一影像示蹤劑標記，且該影像示蹤劑為螢光染劑、螢光蛋白質或帶有螢光標記的抗體。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862637398P | 2018-03-02 | 2018-03-02 | |
| US62637398 | 2018-03-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW201938595A TW201938595A (zh) | 2019-10-01 |
| TWI695846B true TWI695846B (zh) | 2020-06-11 |
Family
ID=67768052
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW107135588A TWI695846B (zh) | 2018-03-02 | 2018-10-09 | 固化式組織澄清方法與組合物 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11009433B2 (zh) |
| TW (1) | TWI695846B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11009433B2 (en) * | 2018-03-02 | 2021-05-18 | iSun Technology LTD. | Composition and method for solid-state tissue clearing |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140271601A1 (en) * | 2013-03-13 | 2014-09-18 | Invivo Therapeutics Corporation | Crosslinkable trehalose for the covalent incorporation in hydrogels and methods of use |
| CN106908294A (zh) * | 2017-03-24 | 2017-06-30 | 漯河医学高等专科学校 | 一种病理标本的处理方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6416960B1 (en) * | 1996-08-08 | 2002-07-09 | Prolume, Ltd. | Detection and visualization of neoplastic tissues and other tissues |
| EP1796693A2 (en) * | 2004-08-26 | 2007-06-20 | Chandrashekhar P. Pathak | Implantable tissue compositions and method |
| US10350570B2 (en) * | 2014-12-15 | 2019-07-16 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for single molecular placement on a substrate |
| CA2898513A1 (en) * | 2015-07-27 | 2017-01-27 | Stephan HEATH | Methods, products, and systems relating to making, providing, and using nanocrystalline (nc) products comprising nanocrystalline cellulose (ncc), nanocrystalline (nc) polymers and/or nanocrystalline (nc) plastics or other nanocrystals of cellulose composites or structures, in combination with other materials |
| WO2018113723A1 (en) * | 2016-12-22 | 2018-06-28 | The University Of Hong Kong | Compositions and methods for clearing tissue |
| US11009433B2 (en) * | 2018-03-02 | 2021-05-18 | iSun Technology LTD. | Composition and method for solid-state tissue clearing |
-
2018
- 2018-10-09 US US16/154,752 patent/US11009433B2/en active Active
- 2018-10-09 TW TW107135588A patent/TWI695846B/zh active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140271601A1 (en) * | 2013-03-13 | 2014-09-18 | Invivo Therapeutics Corporation | Crosslinkable trehalose for the covalent incorporation in hydrogels and methods of use |
| CN106908294A (zh) * | 2017-03-24 | 2017-06-30 | 漯河医学高等专科学校 | 一种病理标本的处理方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW201938595A (zh) | 2019-10-01 |
| US20190271616A1 (en) | 2019-09-05 |
| US11009433B2 (en) | 2021-05-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10794802B2 (en) | Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high resolution intact circuit mapping and phenotyping | |
| JP6228205B2 (ja) | 顕微分析のための生体標本を調製するための方法および組成物 | |
| US9778155B2 (en) | Methods for phenotyping of intact whole tissues | |
| CN108061677B (zh) | 用于生物材料的澄清试剂和其用途 | |
| CN104956201B (zh) | 组织透明化方法、组织透明化试剂及组织观察方法 | |
| WO2015022883A1 (ja) | 光透過性に優れた生物材料を調製するための組成物およびその利用 | |
| Gang et al. | Embedding and chemical reactivation of green fluorescent protein in the whole mouse brain for optical micro-imaging | |
| KR101866249B1 (ko) | 생체 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법 | |
| KR102296381B1 (ko) | 생체 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법 | |
| US20170108414A1 (en) | High-resolution three-dimensional imaging of mammalian hearts | |
| Matryba et al. | Optimized perfusion‐based CUBIC protocol for the efficient whole‐body clearing and imaging of rat organs | |
| Kántor et al. | Calcium buffer proteins are specific markers of human retinal neurons | |
| TWI695846B (zh) | 固化式組織澄清方法與組合物 | |
| US11802822B2 (en) | Multiplexed expansion (MultiExM) pathology | |
| WO2021015196A1 (ja) | 生体組織の処理方法及び処理用組成物 | |
| JP6966435B2 (ja) | 断層撮影の結像方法 | |
| CN113189071B (zh) | 用于完整器官血管三维网络精准成像的试剂盒及成像方法 | |
| Togawa et al. | Identification of Sox10‐positive cells at the dorsal fin base of juvenile flounder that are correlated with blind‐side skin ectopic pigmentation | |
| KR20210155870A (ko) | 1 mm 이하 크기 생체 시료의 투명화 전처리 방법 및 이를 포함하는 생체 시료의 투명화 방법 | |
| Sadovoy et al. | Encapsulated biosensors for advanced tissue diagnostics | |
| KR102644979B1 (ko) | 생물학적 이미징을 위한 새로운 수성 굴절률 동기화 및 조직 투명화 용액 | |
| KR20240000007A (ko) | 생체조직 투명화 조성물 및 이를 이용한 전기영동 투명화 방법 | |
| Ke | Optical clearing and deep-tissue fluorescence imaging using fructose | |
| Nagao et al. | Real‐time histological imaging of kidneys stained with food dyes using multiphoton microscopy | |
| Pollack | Methods of staining the nervous system |