CN113189071B - 用于完整器官血管三维网络精准成像的试剂盒及成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于完整器官血管三维网络精准成像的试剂盒及成像方法。具体地，包括：(A)抗凝血剂；(B)去血剂，所述去血剂包括抗凝血剂和血管扩张剂；(C)血管标记物，所述血管标记物包括荧光微球；(D)组织固定剂；和(E)荧光微球稀释液，其中所述荧光微球稀释液包括肝素钠和碳化二亚胺(EDAC)。本发明的试剂盒可实现实验动物或其组织器官的快速、完整、稳定的血管标记。
Description
技术领域
本发明涉及医学成像领域，具体涉及一种用于完整器官血管三维网络精准成像的试剂盒和成像方法。
背景技术
血管是生物体运输血液的管道，负责将血液运输到所有器官，为机体的各种细胞提供营养物质和氧气，在生物体中扮演着不可替代的重要角色。精确测量和绘制生物体血管三维结构图谱，是研究血液循环系统功能的基础，也是理解器官功能紊乱、疾病发病机制的关键。尤其是对微血管在体内环境中进行形态评估，可为理解感染、高血压、糖尿病、缺血、癌症等各种疾病的发生和发展提供独特视角。
但是传统的血管研究方法难以获得器官的完整血管网络在毛细血管分辨率尺度的精准三维信息。研究器官中的血管分布与结构，最常用的方法是组织切片加显微镜测量。基于薄物理切片(约5-10μm)的组织切片往往只能提供局部二维结构信息，不能提供三维的完整网络信息(器官的尺寸往往在1cm以上)。并且传统的解剖学研究是以大尺度的血管为主，无法看到微米级的毛细血管。因此急需一种高分辨率、简单实用且能全尺度可视化完整3D血管网络的方法。
常规的血管成像，是通过免疫荧光染色，特异性标记血管，进而用荧光显微镜成像，但是抗体染色存在以下几方面的缺点：首先，耗时长，抗体分子难以进入致密的完整组织，尽管对组织进行通透、透明化处理后，全器官的染色也需要10-20天；其次，难洗脱，正常情况下，抗体分子难以洗脱干净，通常存在背景高、信噪比低的问题，难以清晰显示微血管部分，更难以对微血管进行准确分割、定量测量分析；另外，可用于血管染色的特异性抗体价格昂贵，染色复杂，需要严格控制染色温度、浓度、时间等条件。因此，对于全组织染色而言，抗体染色不仅价格昂贵、而且染色效果不稳定。
除此之外，还有一些研究提出将荧光染料注入小鼠心脏或尾静脉，通过体循环将染料送至全身，进而快速标记全身血管网络，例如：如FITC-BSA-gel、FITC-Lectin、RITC-Dextran-GMA等。然而，这些染料都由荧光小分子缀合而成，每种荧光小分子存在最适宜的pH和温度。一旦条件稍有改变，这些荧光染料容易发生淬灭(如在透明化过程中)，此外，荧光染料容易在光激发几分钟后就会突然降低，从而影响实验结果。特别是共聚焦、双光子这类点扫描显微镜，扫描范围小时间短，必然需要更强的激发功率，组织中不同深度的所有荧光分子实际上都被多次照射，相比传统宽场荧光显微镜，光漂白和光毒性更加严重。因此，上述已有的荧光染料并不适用于大尺寸组织样本的血管标记及成像。
综上所述，本领域急需提供一种能够快速、完整地标记大组织样本的血管网络的试剂，以及能够用于长时间、高分辨的完整器官血管三维网络精准成像的试剂盒及成像方法，从而实现包括微血管在内的全器官完整血管3D成像。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够快速、完整地标记大组织样本的血管网络，且能够长时间、高分辨成像的血管标记染料3D成像试剂盒，从而实现包括微血管在内的全器官完整血管3D成像。
本发明第一方面，提供了一种用于血管成像的组织样本处理的试剂盒，包括：
(A)抗凝血剂；
(B)去血剂，所述去血剂包括抗凝血剂和血管扩张剂；
(C)血管标记物，所述血管标记物包括荧光微球；
(D)组织固定剂；和
(E)荧光微球稀释液，其中所述荧光微球稀释液包括肝素钠和碳化二亚胺(EDAC)。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括：(F)组织透明化试剂。
在另一优选例中，所述荧光微球为聚苯乙烯微球。
在另一优选例中，所述荧光微球的粒径为10-500nm，较佳地，20-300nm，更佳地，25-200nm，例如，30nm、50nm、80nm、100nm、120nm、150nm或200nm。
在另一优选例中，所述荧光微球上的荧光染料(或发光基团)的发射波长可从近紫外至近红外的整个光谱，如200-1000nm，较佳地300-800nm或400-760nm。
在另一优选例中，所述荧光微球具有选自下组的功能化修饰基团：羧基、氨基、巯基、或硫酸醛基(Aldehyde-Sulfate)，较佳地，羧基、巯基或硫酸醛基。
在另一优选例中，所述荧光微球选自下组：赛默飞公司F8781、F8805、F8797、F8787、F8795、F8803、F8811、F8813、F8784、F8792、F8800、F8809、F8794、F8786、F8793、F8801、F8810、F8812、F8782、F8806、F8783、F8789、F8807、F8791、F8799、F8845、F8848、F8760、F8764或F8763；较佳地，选自下组：F8805、F8797、F8795、F8803、F8811、F8792、F8800、F8809、F8794、F8793、F8801、F8810、F8806、F8789、F8807、F8791、F8799、F8848、F8764或F8763。
在另一优选例中，所述抗凝血剂为肝素钠，所述肝素钠可以为固体或者配置成溶液，较佳地，配置成溶液时，肝素钠的浓度为800-1200U/mL的肝素钠溶液；较佳地1000U/mL。
在另一优选例中，所述血管扩张剂选自下组：亚硝酸钠、维拉帕米，或其组合。
在另一优选例中，所述去血剂包括肝素钠和亚硝酸钠。
在另一优选例中，所述去血剂包括：
肝素钠80-120U/mL；和
亚硝酸钠0.3-1wt％。
在另一优选例中，所述组织固定剂为PFA固定液、PLP固定液，或其组合，例如，4-10％PFA溶液。
在另一优选例中，所述荧光微球稀释液包括：
肝素钠80-120U/mL；
碳化二亚胺(EDAC)0.015-0.025％(w/v)；和
PBS缓冲液最终pH为7-8，较佳地pH为7.4-7.6。
在另一优选例中，所述荧光微球与荧光微球稀释液分开提供，或荧光微球用荧光微球稀释液稀释制备成荧光微球灌注液形式一起提供。
在另一优选例中，当以荧光微球灌注液提供时，其中荧光微球浓度为0.03-0.2％(w/v)，较佳地，0.04-0.1％(w/v)，更佳地，0.04-0.06％(w/v)。
在另一优选例中，所述荧光微球灌注液包括：
荧光微球0.03-0.2％(w/v)；
肝素钠80-120U/mL；
碳化二亚胺(EDAC)0.015-0.025％(w/v)；和
PBS缓冲液最终pH为7.4-7.6。
在另一优选例中，所述透明化试剂为亲水性透明化试剂、水凝胶包埋法透明化试剂。
在另一优选例中，所述亲水性透明化选自下述方法：Scale、SeeDB、FRUIT、Ce3D、CUBIC或CUBIC-new。
在另一优选例中，所述水凝胶包埋法透明化选自下述方法：CLARITY、PACT、SWITCH、SHIELD或MAP。
在另一优选例中，所述透明化试剂为CUBIC-new透明化试剂。
在另一优选例中，所述透明化试剂包括：
(F-1)CUBIC-L溶液，所述CUBIC-L包括丁基二乙醇胺和Triton X-100；和(F-2)CUBIC-R溶液，所述CUBIC-R包括安替比林和烟酰胺。
在另一优选例中，所述CUBIC-L中，丁基二乙醇胺和Triton X-100的质量比为1：0.8-1.2，较佳地1:1。
在另一优选例中，所述CUBIC-R中，安替比林和烟酰胺的质量比为1-2:1，较佳地，1.5-1.6:1。
在另一优选例中，所述血管三维成像可用于大组织样本中的血管三维成像，如动物全身、完整器官等，如所述大组织样本的尺寸可大于0.5*0.5*0.5cm，如(0.5-1.5)*(0.5-1.5)*(0.5-1.5)cm，如1*1*1cm等。
在另一优选例中，所述血管包括：大动脉、小动脉、微动脉、大静脉、微静脉、小静脉、毛细血管(微血管)，或其组合。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括麻醉剂。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括说明书。在另一优选例中，所述试剂盒包括：
(A)抗凝血剂，所述抗凝血剂800-1200U/mL的肝素钠溶液；
(B)去血剂，所述去血剂包括肝素钠80-120U/mL和血管扩张剂0.3-1wt％；
(C)血管标记物，所述血管标记物包括荧光微球，所述荧光微球为20-300nm的羧基或硫酸醛基修饰的聚苯乙烯荧光微球；
(D)组织固定剂；和
(E)荧光微球稀释液，其中所述荧光微球稀释液为包括80-120U/mL肝素钠、0.015-0.025％(w/v)碳化二亚胺(EDAC)的PBS缓冲液，且最终pH为7.4-7.6。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括CUBIC透明化试剂。
本发明第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述试剂盒的用途，用于制备微血管相关疾病的诊断试剂盒或用于血管成像样品的荧光标记。
在另一优选例中，所述血管成像样品在标记前为完整动物体(存活或死亡(如死亡后1h内))。
在另一优选例中，所述血管成像样品为完整死亡动物体或其离体组织(如离体完整器官、组织切片等)。
本发明第三方面，提供了一种血管成像用样本，所述是样本通过如下方法制备得到，包括步骤：
(i-1)向实验动物腹腔注射高浓度抗凝血剂(如800-1200U/mL的肝素钠)，并麻醉；
(i-2)剪开下腔静脉，从左心室灌注去血剂(优选地，其中包括80-120U/mL的肝素钠和0.3-1wt％的亚硝酸钠)，去除全身血液；
(i-3)灌注荧光微球灌注液对血管进行标记；和
(i-4)灌注固定液进行组织固定，从而获得固定化的完整死亡动物体样本或摘取获得其离体组织样本。
在另一优选例中，所述样本是使用如权利要求1的试剂盒制备得到的。
在另一优选例中，所述灌注为通过蠕动泵灌注。
在另一优选例中，步骤(i-3)具有一个或多个选自下组的特征：
(1)所述灌注的流速为5-12mL/min，较佳地，6-9mL/min；和/或
(2)荧光微球灌注液灌注完成后等待5-15min，以使得荧光微球与血管壁充分结合。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(ii)将所述待测样本透明化，从而获得透明化的样本。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(ii-1)将透明化的样本切片后进行免疫染色，从而获得双重或多重标记的样本。
在另一优选例中，所述实验动物为哺乳动物，如大鼠、小鼠、狗、兔或猴。
在另一优选例中，所述实验动物为正常动物或患有微血管相关疾病的动物。
在另一优选例中，所述离体组织可以为完整器官或组织切片。
在另一优选例中，所述器官选自下组：脑、心、肾、肝、脾、肺，或其组合。
在另一优选例中，所述透明化试剂为亲水性透明化、水凝胶包埋法透明化。
在另一优选例中，所述透明化为CUBIC透明化。
本发明第四方面，提供了一种血管三维成像方法，包括步骤：
(i)提供如本发明第三方面所述的固定化的样本；
(ii)将所述固定化的样本透明化，从而获得透明化的样本；
(iii)将所述透明化的样本在荧光微球对应激发波长下进行光学成像。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
(iv)对步骤(iii)获得的图像进行图像处理，从而获得样本血管三维图像。
在另一优选例中，步骤(i)是使用本发明的试剂盒进行的。
在另一优选例中，步骤(ii)是使用本发明的试剂盒进行的。
在另一优选例中，用于光学成像的仪器为：光片荧光显微镜、激光共聚焦显微镜，或其组合。
在另一优选例中，所述方法是非诊断非治疗的。
本发明第五方面，提供了一种实验动物微血管相关疾病诊断方法，包括步骤：
(i-1)向实验动物腹腔注射高浓度抗凝血剂(如800-1200U/mL的肝素钠)，并麻醉；
(i-2)剪开下腔静脉，从左心室灌注去血剂(优选地，其中包括80-120U/mL的肝素钠和0.3-1wt％的亚硝酸钠)，去除全身血液；
(i-3)灌注荧光微球灌注液对血管进行标记；和
(i-4)灌注固定液进行组织固定，从而获得固定化的完整死亡动物体样本或摘取获得其离体组织样本；
(ii)将所述固定化的样本透明化，从而获得透明化的样本；
(iii)将所述透明化的样本在荧光微球对应激发波长下进行光学成像，从而获得包含微血管的图像；和
(iv)根据所述图像进行疾病的诊断。
在另一优选例中，步骤(iii)中获得的图像为三维图像。
在另一优选例中，所述微血管相关疾病包括但不限于：微血管病变、高血压、糖尿病、缺血、癌症等。
在另一优选例中，步骤(i)是使用本发明的试剂盒进行的。
进一步地，可通过步骤(iii)的图像确定病变部位，并利用免疫荧光染色进一步成像，以获得更多信息。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
(iii-1)将步骤(iii)光学成像后的样本进行切片，得到局部切片样本；
(iii-2)对所述局部切片样本进行免疫荧光染色并成像，从而得到局部免疫荧光染色图像；和
(iii-3)结合步骤(iii)的图像进行诊断。
在另一优选例中，所述免疫荧光染色可以为标记血管、细胞核、神经元等。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为本发明的血管3D成像实验流程示意图；
图2为本发明的血管3D成像实验流程图(A)；及小鼠组织CUBIC透明化前后的效果对比图(B)(以脑、心、肾为例)。
图3为荧光微球(也称为beads)标记及CD31免疫荧光染色脑组织的定位情况；其中，A示出了荧光微球标记的全脑血管成像；B示出了荧光微球和CD31抗体良好的共定位情况。
图4为荧光微球和FITC-BSA标记的小鼠脑切片血管成像对比图；其中，A示出了荧光微球标记的脑切片血管成像；B示出了FITC-BSA标记的脑切片血管成像；C展示了荧光微球标记的脑切片的一个256*256堆栈的立体图；D-F分别表示C中第100、280、450层图像的二维图；D为信噪比衰减曲线；H为光激发下的信号强度曲线。
图5为全脑血管树系统三维可视化效果；A-B标尺代表1000μm，C-D标尺代表50μm。
图6为肾脏血管树系统和交感神经三维可视化效果，B为血管树图像，C为交感神经图像。A标尺代表1000μm，B-C标尺代表800μm。
图7为共聚焦显微镜成像图片(可视3μm毛细血管)；
图8为不同灌注法处理后CUBIC透明化前后对比图；
图9为不同灌注方法标记后100μm脑片血管共聚焦成像对比图；
图10为不同荧光微球标记的效果图；
图11不同beads稀释液的灌注流程图；
图12为采用不同beads稀释液的灌注效果图及CD31染色对比；
图13为采用不同beads稀释液的灌注效果图及CD31染色对比；其中红色为beads(赛默飞，F8801)，绿色为CD31信号；A为使用稀释液D的效果图，B为A中白色方框的局部放大图，C是使用稀释液C的效果图，D为C中白色方框的局部放大图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，提供了一种用于完整器官血管三维网络精准测量的试剂盒。
本发明人惊讶地发现，采用荧光微球作为标记物，其在透明化过程中不会被淬灭，从而可以在离体组织器官透明化之前通过心脏灌注法灌注至全身血管，进而快速标记全身血管网络。
优选地本发明的荧光微球具有特定尺寸，不仅可到达全身血管，又不会穿过血管壁，造成其他组织的标记，从而实现血管系统的完整标记，并提高了成像时的信噪比和分辨率。
另一方面，由于荧光微球在成像时不易被激发光漂白，可长时间保持高荧光亮度，可显著延长成像时间、提高成像深度(组织厚度可≥1cm)。
基于上述多种优势，本发明意外地实现了包括直径≤3μm的微小血管在内的全器官完整血管的3D成像。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用，术语“室温”或“常温”是指温度为4-40℃，较佳地，25±5℃。
如本文所用，术语“血管”和脉管可互换使用，包括参与血液循环的所有血管，如包括动脉、静脉和毛细血管。
如本文所用，所述“毛细血管”和“微血管”可互换使用，包括直径≤10μm的血管，如直径为约5μm、3μm、2μm的血管。
荧光微球
本发明中使用荧光微球作为血管标记物用于成像。
本发明中，对荧光微球的种类没有特别要求，可以使用本领域常用的荧光微球，可商业购得或通过本领域常规方法制备。例如，常见的荧光微球有聚苯乙烯微球。所述荧光微球上的荧光染料(或发光基团)的发射波长可从近紫外至近红外的整个光谱，如200-1000nm，较佳地300-800nm或400-760nm，如红光、蓝光、绿光、黄光等。
不希望在理论上限制本发明，荧光微球可能通过物理吸附方式或通过修饰基团与血管结合，从而标记血管。本发明对所述荧光微球的功能化修饰基团没有特别要求，所述荧光微球可没有功能基团，或包括羧基、氨基、硫酸醛基或硫酸基等修饰基团。
本发明中，荧光微球的粒径可以根据需要进行选择。通常，由于血管壁内皮细胞间间隙约为10～20nm，如果荧光微球粒径太小，微球可能渗漏出血管壁，导致背景信号增强；如果微球粒径过大，则可能堵塞毛细血管，影响标记效果。优选地，荧光微球的粒径可以为10-500nm，较佳地，20-300nm，更佳地，25-200μm，例如，30nm、50nm、80nm、100nm、120nm、150nm或200nm。
通常，荧光微球比组织免疫荧光、荧光小分子染料等具有更好的稳定性，在透明化和成像过程中，很少因为pH、温度、时间、透明化过程、光照射等原因导致荧光猝灭。因而荧光微球可以在透明化之前进行标记，透明化处理后还能提供稳定、持久、高分辨的荧光信号，从而给血管成像提供高质量的图像。
而当使用组织免疫荧光进行成像时，为了保证荧光强度，通常需要在透明化后进行标记，而此时，动物体或组织结构已经被破坏或非常脆弱，无法通过灌流进行标记，标记时间会大幅延长(几天甚至更长)；而且免疫染色深度有限，对样本大小造成了严重限制，无法处理大尺寸样品；此外，为了避免背景信号干扰，需要使用对血管具有特异性的抗体，成本和难度显著升高。
标记方法
本发明优选通过心脏灌注法进行血管标记。心脏灌注法可通过液体在血管系统中的循环流动，将含有荧光微球灌注液泵送至全身血管。从而可一次性快速、针对性的标记全身血管，不受动物体大小的影响，可形成大尺寸样本；而且不会将荧光微球标记至其他组织，避免背景信号的噪音干扰。
特别地，由于本发明中，用于成像的组织需要经过透明化，因此在灌注过程中，血液是否去除干净，会影响到透明化效果，从而影响成像效果。在灌注液体时，动物会迅速产生应激反应而凝血，导致去血效果不佳，而本发明人发现，传统的心脏灌流法无法有效去除血液，组织器官的透明化后颜色较深，不利于成像，另一方面，去血不完全，会影响荧光微球与血管壁的结合，进而影响血管的标记。
本发明中，进一步改进了标记方法。具体地，所述标记方法包括步骤(以小鼠为例)：
(i-1)向实验动物腹腔注射高浓度抗凝血剂(如800-1200U/mL的肝素钠)，并麻醉；
(i-2)剪开下腔静脉，从左心室灌注去血剂(优选地，其中包括80-120U/mL的肝素钠和0.3-1wt％的亚硝酸钠)，去除全身血液(可去除包括右心房中的血液)，去血剂中的肝素钠可进一步防止凝血；
(i-3)灌注荧光微球灌注液对血管进行标记；和
(i-4)灌注固定液进行组织固定，从而获得固定化的完整死亡动物体样本或摘取获得其离体组织样本。
特别优选的，通过本发明的试剂盒中的试剂进行灌注，可简便地获得包括微血管在内的完整血管标记的样本。
离体组织可进一步在固定液中进行后固定。
通常，完成标记后的实验动物可直接用于透明化或摘取目标样品后用于透明化。
令人意外地，大量实验证明，本发明的试剂盒或方法标记的样品，即使以切片形式进行后续的透明化和/或免疫染色处理，荧光微球也不会流失，标记非常稳定。
组织透明化
本发明中，对组织透明化方法没有特别要求，可根据需求选择。例如，可从本领域广泛应用的组织透明化方法中选择，包括但不限于水凝胶包埋、疏水类透明化法和亲水类透明化法。其操作方法对于本领域技术人员而言是已知的。
优选地，透明化过程不会破坏荧光微球的结构。例如，由于uDISCO等疏水类透明化方法中会使用到能够溶解如聚苯乙烯微球类的荧光微球，所以此类荧光微球与疏水类透明化方法不能兼容。但聚苯乙烯微球在亲水性溶剂中非常稳定，从而可以选用以CLARITY为代表的水凝胶包埋法(包括PACT、SHIELD等)和以CUBIC为代表的亲水性透明化法(包括FRUIT、Ce3D等)，优选地，CUBIC。
通常，透明化后的样品可直接用于光学成像或切片后光学成像。
三维成像
典型地，用于组织三维成像的仪器有光片荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等，其成像方法和图像处理方法是领域已知的。
通常组织的三维成像过程中，一方面，三维成像的分辨率受到仪器本身的限制，另一方面，受到标记方法的限制。
在本发明中，在不考虑仪器限制的情况下，由于所使用的荧光微球的粒径仅为纳米级，且可通过灌注法标记，理论上可以选择性(仅标记血管内壁，不会标记其他组织)标记包括微血管在内的所有血管。且由于荧光微球的荧光不会轻易猝灭，可长时间提供高强度荧光，所以随着成像仪器的进一步开发，使用本发明的方法和试剂盒可进一步获得分辨率更高的图像，从而避免了因为标记过程带来的分辨率限制。
试剂盒
本发明提供了一用于血管成像的样品处理试剂盒，其包括：
(A)抗凝血剂；
(B)去血剂，所述去血剂包括抗凝血剂和血管扩张剂；
(C)血管标记物，所述血管标记物包括荧光微球；
(D)组织固定剂；和
(E)荧光微球稀释液，其中所述荧光微球稀释液包括肝素钠和碳化二亚胺(EDAC)。
所述试剂盒还可以包括透明化试剂，优选地，所述透明化试剂与荧光微球是兼容的。本领域技术人员可根据荧光微球种类和透明化过程中所用试剂相应选择。
特别地，本发明人通过大量筛选试验获得本发明的去血剂和荧光微球稀释液。使用本发明的特定的去血剂和荧光微球稀释液进行灌注标记，能够非常有效的阻止凝血、防止血管堵塞，从而使荧光微球能够非常顺利的标记全身血管。
本发明的试剂盒提供了光学成像前实现血管荧光微球标记、样品透明化所需的所有试剂，使用非常方便、快速、标记效果稳定。
血管成像用样本
本发明还提供了一种血管成像用样本，所述样本通过上述标记方法制备得到。
通过本发明的方法，可快速制备常用实验动物，如大鼠、小鼠、狗、兔或猴的血管成像用样本。所述样本可作为实验室的成像标本，从而对正常动物或患有微血管相关疾病的动物体进行深入的生理、病理研究。
成像方法
本发明还提供了使用本发明的试剂盒或标记方法处理样本，进而对所述样本进行血管三维成像的方法。
更具体地，本发明的血管三维成像方法可参考图1，可包括步骤：
A：心脏灌流，去血，利用荧光微球标记小鼠全身脉管系统；
B：采用先进的CUBIC透明化方法对组织进行脱脂、脱色、折射率匹配；
C：利用光片荧光显微镜(light sheet fluorescence microscopy,LSFM)或激光共聚焦显微镜(confocal)对全器官或薄样品成像；
D：图像处理及展示。
应用
本发明还提供了根据上述血管三维成像的获得的图像进行实验动物微血管相关疾病诊断方法。
所述方法还可对同一样本(完整器官或)进行进一步的免疫荧光染色并成像，结合多种图像，进行疾病的诊断。例如，所述免疫荧光染色可以为标记血管、细胞核、神经元等。
根据血管尺寸、形态和分布，医生或研究者可判断实验动物是否患有相关疾病、或疾病的严重情况。例如，与正常动物的图像相比，所述实验动物的样本中，微血管异常，则可诊断为微血管病变。常见的微血管相关疾病包括但不限于：微血管病变、高血压、糖尿病、缺血、癌症等。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明采用特定尺寸的荧光微球作为染色剂，成像结果显示，所述荧光微球可到达并标记全身血管，其中包括微血管，又不会穿过血管壁，造成其他组织的标记，从而实现血管系统的完整标记，并提高了成像时的信噪比和分辨率。
(2)另一方面，由于本发明的荧光微球在成像时不易淬灭，荧光亮度高，可显著延长成像时间并提高成像深度(组织厚度可达1cm)，从而实现全器官的完整血管成像，可最大限度的消除由于标记方法带来的分辨率限制，随着成像仪器的发展，使用本发明的标记方法有望获得更高分辨率的血管图像。
(3)此外，使用荧光微球(Fluorescent microsphere)进行标记，可在透明化过程之前通过心脏灌注法快速全身标记、染色时间短，易洗脱，解决了传统免疫荧光染色中抗体染色耗时久、难以渗透和洗脱的问题，操作简单快捷。
(4)本发明的荧光微球标记样品且能与免疫染色等其他染色方法良好兼容，可对样品进行多次成像。
(5)通过本发明的试剂盒或方法可以对组织器官血管系统进行完整的三维成像，不仅可以获得更详细的血管分布图像，还能获得微小血管的精准测量数据，并利用微小血管图像辅助诊断早期病变。
(6)与免疫荧光染色相比，荧光微球廉价易得，适合大规模应用。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
1.实验材料与方法：
1.1材料
实验小鼠为SPF级C57BL/6品系，6～8周雄性成年小鼠。
1.2溶液制备
1)CUBIC-L
| 成分 | 浓度 | 用量(100g) |
| 丁基二乙醇胺 | 10％(wt/wt) | 10g |
| Triton X-100 | 10％(wt/wt) | 10g |
| 纯水 | - | 80g |
2)CUBIC-R
| 成分 | 浓度 | 用量(100g) |
| 安替比林 | 45％(wt/wt) | 45g |
| 烟酰胺 | 30％(wt/wt) | 30g |
| 纯水 | - | 35g |
3)1/2CUBIC-L、1/2CUBIC-R
分别由纯水等体积稀释CUBIC-L和CUBIC-R
4)荧光微球稀释液
通用方法
1.心脏灌流标记血管
1)首先在小鼠腹腔内注射0.2-0.3mL高浓度肝素钠(1000U/mL)，等待15min后，对小鼠进行腹腔深度麻醉。
2)剖开小鼠腹腔，将输液针扎入小鼠左心室，并找到小鼠下腔静脉。
3)剪断下腔静脉，打开蠕动泵，以8mL/min的速率经小鼠心脏灌注30mL冰冷的hPBS(含100U/mL肝素钠及0.5％亚硝酸钠的PBS，pH为7.4-7.6)，然后将30mL荧光微球灌注液(含荧光微球0.04％(w/v))等速灌入小鼠体内，等待10分钟，接着灌入等体积冰冷的4％PFA。
4)小心地摘取目标样品并立即置于30ml冰冷的4％PFA中，置于4℃摇床一天。
2.CUBIC透明化
1)在用PFA灌注和后固定后，用PBS清洗样品至少3次，每次至少1小时，全程置于室温摇床。
2)用1/2CUBIC-L在37℃摇床孵育样品6-12小时，开始对样品进行脱脂和脱色处理，接着换新鲜的CUBIC-L继续孵育5-7天，至少两天换一次新鲜的CUBIC-L。
3)待组织完全脱脂脱色后，为终止反应并清洗掉残留的CUBIC-L，用PBS在室温摇床清洗至少3次，每次至少2小时。
4)用1/2CUBIC-R在室温摇床孵育组织6-12小时，开始对样品进行折射率匹配，接着换新鲜的CUBIC-R继续孵育1-2天，期间换一次液。
3.成像及图像处理
1)使用光片显微镜(LaVision BioTec,Bielefeld,Germany)进行样品的3D成像,用激光激发样品，用620/60nm带通滤光片检测荧光发射信号，设备装有Olympus MVX10变焦显微镜主体(Olympus,Tokyo,Japan)、LaVision BioTec激光模块、像素尺寸为6.5μm的Andor Neo sCMOS相机和光学检测系统。(NA＝0.5，放大倍率范围为1.26X-12.6X)
2)对1mm厚的切片样品，使用具有CFI Plan Apo 10x物镜的Leica TCS SP8共聚焦激光扫描显微镜，用552nm激光激发荧光(NA＝0.45，W.D.＝4.0mm，)
3)所有光片显微镜的原始数据以tiff格式保存，全脑的拼图由arivis Vision4D(arivis AG,Germany)完成，全脑的3D可视化由Imaris(Bitplane，Swit)重建完成；共聚焦数据以lif格式保存，用Matlab编程实现图像信噪比的定量计算。
全器官三维血管树可视化方法的示意图如图2中A所示。
实施例1
按上述方法对小鼠进行荧光微球(F8801)标记和透明化，对脑、肾和心脏进行光片显微镜全器官成像，激发波长为561nm。
CUBIC透明化小鼠组织前后的示意图如图2中B所示。
其中脑血管成像如图3中A所示。
实施例2
用经荧光微球标记的全脑样品，通过振动切片机切得100μm脑片，再用内皮细胞标记物CD31(Bioscience，550274)进行免疫荧光染色并成像。
共定位情况如图3中B所示，B示出了荧光微球和CD31抗体良好的共定位情况，一方面说明beads标记完全，另一方面说明beads能与抗体标记兼容。可通过不同的标记物成像，获取更多的血管信息。
实施例3
荧光强度和信噪比
分别用荧光微球和常用的FITC-BSA使用同样的方法标记小鼠血管和透明化，并用共聚焦显微镜成像2mm厚的脑切片，其血管树系统的三维可视化和信号衰减程度如图4所示。
图4中A-B展示了beads标记和FITC-BSA标记血管的效果图，可以看出，beads和FITC-BSA均能标记出血管系统，但是beads标记图像的背景更低。
图4中C展示了一个256*256堆栈的立体图，其纵向深度达1mm，Z方向步长为2.27μm，D-F分别表示图4中C中第100、280、450层图像的二维图，可见Z方向信号衰减程度较慢，两种标记方法的信噪比衰减曲线如图4中G所示，可以看出荧光微球标记的信噪比更高，这说明其分辨率也更高。
对两种标记方法的脑片，采用相同的成像方法，具有从0到10min的相同光激发持续时间，来验证染料的耐漂白性。
结果如图4中H所示，BSA-FITC标记样品的信号强度在光激发3min左右有明显的降低，并持续降低，而荧光微球的荧光强度高且稳定，10min内基本无衰减，经计算荧光微球信号10min内衰减比例仅为4.89％，而FITC-BSA衰减了51.34％，相差十倍以上，具有显著差别。
这说明荧光微球比一般传统荧光分子具有高信号强度、低背景噪声的特点，并且在3D成像暴露于光激发期间，具有非常强的耐漂白性，可用于长时间成像，获取更多层的图片，从而获得更清晰的三维图像。
实施例4
使用荧光微球对小鼠全脑血管网络进行三维可视化的效果
通过心脏灌流可一次性实现小鼠全身血管的标记，取小鼠全脑做CUBIC透明化约两周后，用光片显微镜拍摄可得到每一层的信息，拍摄时间大约三个小时。原始数据经imaris重建后，图像如图5所示。
图5中B为4mm深度处的二维图，C、D为B中白色方框的放大图，可以看见直径在5μm左右的毛细血管。
实施例5
使用荧光微球对小鼠肾脏血管网络进行三维可视化的效果
小鼠肾脏经CUBIC透明化约10天后，用光片显微镜拍摄可得到每一层的信息，拍摄时间大约两个小时。
使用Anti-Tyrosine Hydroxylase(abcam,ab112)对小鼠肾脏交感神经进行染色并成像。在同一肾脏上，经心脏灌流进行荧光微球标记后，然后摘取组织做脱脂脱色处理，接着进行免疫荧光染色，最后进行折射率匹配和成像。
原始数据经imaris重建后，完整肾脏血管和交感神经的三维结构图像如图6所示，图中红色为血管信号，绿色为交感神经信号，可清晰看见肾小球、肾小管等细微结构。由此可见，荧光微球不会影响普通抗体的免疫荧光染色，但相比于血管信号，交感神经信号较弱，只有粗大的神经可清晰看见，这说明本发明的荧光微球染色能够实现全身器官的完整血管树的3D成像，而免疫染色对大尺寸的器官染色能力非常有限。
实施例6
采用更高分辨率的仪器，如共聚焦的10X(N.A.＝0.4)镜头成像，能观察到尺寸更小(如2-3μm)的毛细血管。
一经本发明的方法进行荧光标记的100μm小鼠脑片如图7所示，A为小鼠脑的一个视野图像，其中单个像素大小为1.51μm，沿图7的A中红色直线拟合出信号强度曲线如图7中B所示，可知，该血管直径约为3μm左右。
可见本发明的标记方法，随着仪器分辨率的进一步提高、或延长成像时间，可达到更高(甚至1μm)分辨率的图像。
实施例7
心脏灌流方法
根据文献中心脏灌流方法通常是剪开右心耳，自左心室灌注含10U/mL肝素钠的1×PBS,然后灌注固定液获得样品；
以及通过本发明的上述方法进行心脏灌流荧光微球标记后，灌注固定液固定的获得的样品；
分别进行CUBIC透明化，透明化效果如图8所示(其中上为文献方法，下为本发明的方法)。
选取小鼠的脑，以及富含血红素、脂褐素的脾脏、肝脏进行展示，从图8可以看出，经过本发明改进的灌注方法，透明化后效果更好，尤其是脾脏差异最明显，这可能是由于文献方法去血不完全导致的。而本发明的灌注方法中，一方面，在灌流操作时，不剪右心耳，而是剪下腔静脉，使得右心房血液也被充分清除，另一方面，通过使用高浓度的抗凝血素，确保在灌注过程中不会凝血；从而更好的消除了血液的干扰。
进一部地，将对比例1的样品切出100μm切片，进行共聚焦成像，结果如图9所示。
图9中C、D分别是A、B中小鼠大脑皮层区域白色方框内的局部放大图，可见C中，文献公开的灌流方法大脑皮层的血管有明显缺损，而本发明的灌流方法可保持组织和血管连续、完整。
实施例8
分别选用0.02μm硫酸醛基修饰的微球F8760(Sulfate Micosphere,黄-绿(505/515))、0.1μm羧基修饰的F8801(Carboxylate-Modified Micosphere,红(580/605))、0.2μm羧基修饰的F8810(红(580/605))(赛默飞公司)荧光微球进行标记。
0.02μm硫酸醛基修饰的F8760标记效果如图10中A所示，0.1μm羧基修饰的F8801标记效果如图10中B所示，0.2μm羧基修饰的F8810标记效果如图10中C所示，D-F分别为A-C中白色方框的局部放大图。
可以看出，三种型号的beads进行实验，发现均可良好的标记血管。
实施例9
荧光微球稀释液
通常，纳米尺寸的荧光微球存储以较高浓度(2％(g/mL))分散在液体中保存，需要稀释后使用。
选用以下四种稀释液进行荧光微球的标记：
(A).以2％猪皮凝胶作为稀释液，其在高温下呈液态，低温下呈固态的胶体，在灌注前将beads稀释液置于40℃水浴锅中保持恒温，直至需要灌注beads为止，在灌注完成后立即将小鼠尸体头部斜向下45°置于冰上15分钟，以标记血管；
(B).以常用的蛋白电泳配置胶(即聚丙烯酰胺凝胶电泳胶，单体为丙烯酰胺和单叉双丙烯酰胺)作为稀释液，这种胶在低温下呈液态，37°水浴后才成胶，通过调节TEMED(四甲基乙二胺)和APS(过硫酸铵)改变成胶时间，避免在灌注时成胶凝固堵塞血管，灌注完成后，立即将小鼠尸体头部朝下置于50mL锥形管内，再置于37°水浴中10分钟左右；
(C).PBS缓冲液(1X PBS中含100U/mL肝素钠和0.02％EDAC，最终pH为7.4-7.6)。
(D).PBS缓冲液(1X PBS中含100U/mL肝素钠，最终pH为7.4-7.6)。
将荧光微球原液与上述4种稀释液(稀释倍数1：50)混合，并按照图11所述的流程标记血管后(稀释液C和D处理方法相同，且荧光微球的灌注在室温下进行)，组织经PFA后固定、切片后，对100μm脑片用CD31进行免疫荧光染色。CD31是标记血管内皮细胞间连接蛋白的特异性抗体，理论上应标记出所有血管外壁。用激光共聚焦成像后，实验结果如图12所示。
图12中A-C分别展示了beads在猪皮明胶中标记血管效果、CD31染色效果、二者重合效果图，E-G分别展示了beads在配置胶中标记血管效果、CD31染色效果、二者重合效果图，I-K分别展示了beads在hPBS中标记血管效果、CD31染色效果、二者重合效果图，图12的D、H、L分别为C、G、K图中白色方框内的纹状体局部放大图。
从图12的A-D可以看出，灌注了热的猪皮明胶后会影响免疫荧光染色，大部分区域CD31都没能染上，而染上的小部分区域，如：纹状体区域(如D图)，这说明猪皮明胶这种热的缓冲液不仅会影响多聚甲醛固定抗原的效果，还易在灌注未结束时就局部凝固堵塞血管。
从图12的E-H可以看出，使用配置胶稀释荧光微球用于标记，虽然基本没有影响抗体染色，但是凝胶在体内的形成难控制，难以避免出现堵塞血管的情况，如图12中H中箭头所指，仍有小面积区域荧光微球标记不全。
从图12的D-L可以看出，用hPBS作为荧光微球稀释液，能够标记出完整、连续的全组织血管壁，并且不会影响后续免疫荧光染色，从图12中L为小鼠大脑纹状体局部放大图，可以看出荧光微球和CD31染色能完美重合，而且其制备简单，灌注更方便。
图13为采用不同beads稀释液的灌注效果图及CD31染色对比；其中红色为beads(赛默飞，F8801)，绿色为CD31信号；A为使用稀释液D的效果图，B为白色方框的局部放大图，可见箭头所指处只有绿色CD31信号，没有红色beads信号，而C是使用稀释液C的效果图，可见看出D中两种信号能很好地重合。
讨论
目前，在本领域中，对于大尺寸样品(如全动物和完整器官)的3D光学成像存在许多困难。
例如，在透明化之前通过心脏灌注染色，虽然可标记全身血管，但在接下来的透明化过程和成像过程中，由于pH、温度、溶剂、光照射等原因，传统方法所使用的荧光染料容易发生荧光猝灭，导致荧光强度降低，分辨率不足，尤其对于微血管(如直径在5μm以下的血管)成像困难，难以获得血管系统的完整成像。
而在透明化后进行染色的方法，虽然染色物质不会受透明化过程的影响，但此时，动物体或组织结构已经被破坏或非常脆弱，无法通过灌流进行标记，只能通过电泳等方法进行标记，标记时间会大幅延长(几天甚至更长)；而且免疫组织染色深度有限，对样本大小造成了严重限制(通常仅为100μm左右切片)，无法处理大尺寸样品；此外，为了避免背景信号干扰，需要使用对血管具有特异性的抗体，成本和难度显著升高。
而本发明人意外地发现，使用荧光微球不仅可以在透明化之前通过灌流进行全身血管标记，且经过透明化过程、在激发光照射下，荧光微球还能保持高强度的荧光，从而实现大尺寸样品(如全器官)的快速(标记过程仅20-30min)、高分辨，更完整的血管成像(包括直径≤3μm的微血管)，随着成像仪器的发展或成像扫描时间延长，有望获得更高分辨率的图像。而且荧光微球廉价易得，适合大规模应用。
此外，如有需要，本发明的方法处理的样本成像后，可以进一步切片后进行组织染色，从而对局部进行二次成像，也就是说本发明的方法能够兼容普通组织染色，不会造成干扰。从而可提供更多组织血管信息。
而本领域技术人员理解，对微血管在体内环境中进行形态评估，可以为理解感染、高血压、糖尿病、缺血、癌症等各种疾病的发生和发展提供重要依据，因而本发明的试剂盒和方法具有显著的技术进步。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (12)
1.一种用于血管成像的组织样本处理的试剂盒，其特征在于，包括：
(A)抗凝血剂；所述抗凝血剂为肝素钠；
(B)去血剂，所述去血剂包括抗凝血剂和血管扩张剂；且所述的抗凝血剂为肝素钠，所述的血管扩张剂为亚硝酸钠；
(C)血管标记物，所述血管标记物包括荧光微球，所述的荧光微球为聚苯乙烯微球；
(D)组织固定剂；所述的组织固定剂选自下组：PFA固定液、PLP固定液，或其组合；和
(E)荧光微球稀释液，其中所述荧光微球稀释液包括肝素钠和碳化二亚胺；
且所述荧光微球的粒径为10-500nm。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光微球的粒径为20-300nm。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光微球具有选自下组的功能化修饰基团：羧基、氨基、巯基、或硫酸醛基。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述去血剂包括：
肝素钠80-120U/mL；和
亚硝酸钠0.3-1wt％。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光微球稀释液包括：
肝素钠80-120U/mL；
碳化二亚胺(EDAC)0.015-0.025％(w/v)；和
PBS缓冲液最终pH为7-8。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的抗凝血剂为800-1200U/mL的肝素钠溶液。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述去血剂包括肝素钠80-120U/mL和血管扩张剂0.3-1wt％。
8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光微球为20-300nm的羧基或硫酸醛基修饰的聚苯乙烯荧光微球。
9.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其中所述荧光微球稀释液为包括80-120U/mL肝素钠、0.015-0.025％(w/v)碳化二亚胺的PBS缓冲液，且最终pH为7.4-7.6。
10.如权利要求1所述试剂盒的用途，其特征在于，用于血管成像样品的荧光标记。
11.一种血管成像用样本，其特征在于，所述样本通过如用权利要求1中所述的试剂盒制备得到，且所述的制备方法包括步骤：
(i-1)向实验动物腹腔注射高浓度抗凝血剂，并麻醉；
(i-2)剪开下腔静脉，从左心室灌注去血剂，去除全身血液；
(i-3)灌注荧光微球灌注液对血管进行标记；和
(i-4)灌注固定液进行组织固定，从而获得固定化的完整死亡动物体样本或摘取获得其离体组织样本。
12.一种血管三维成像方法，其特征在于，包括步骤：
(i)提供如权利要求11所述的固定化的样本；
(ii)将所述固定化的样本透明化，从而获得透明化的样本；
(iii)将所述透明化的样本在荧光微球对应激发波长下进行光学成像。
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