CN115701532A

CN115701532A - 用于生物组织透明化处理的脱脂组合物

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Publication number: CN115701532A
Application number: CN202110879793.9A
Authority: CN
Inventors: 高亮; 冯瑞丽; 陈燕璐
Original assignee: Westlake University
Current assignee: Fuhai Bioscience Instrument Shanghai Co ltd
Priority date: 2021-08-02
Filing date: 2021-08-02
Publication date: 2023-02-10
Also published as: WO2023010845A1

Abstract

本发明涉及用于生物组织透明化处理的脱脂组合物，所述脱脂组合物用于制备脱脂试剂的用途，脱脂试剂，包含所述脱脂组合物或脱脂试剂的透明化试剂盒，使用所述脱脂试剂的生物组织透明化处理方法，以及包括所述生物组织透明化处理方法的步骤的生物组织透明化的成像方法。所述脱脂组合物包含尿素、N‑丁基二乙醇胺和曲拉通X‑100(Triton X‑100)，其中，尿素、N‑丁基二乙醇胺和曲拉通X‑100的质量比约为(0.6‑5):(0.3‑3):1。使用本发明的脱脂组合物的透明化方法具有更快的脱脂速度，对大体积生物样品有更好的脱脂能力，可以很好的保持生物组织从细胞级到亚细胞级的结构特征。

Description

用于生物组织透明化处理的脱脂组合物

技术领域

本发明涉及生物组织透明化处理技术领域，具体涉及一种脱脂组合物，所述脱脂组合物用于制备脱脂试剂的用途，脱脂试剂，包含所述脱脂组合物的透明化试剂盒，使用所述脱脂脂试剂组合物的组织透明化处理方法，以及包括所述生物组织透明化处理方法的步骤的生物组织透明化的成像方法。

背景技术

对生物组织进行高分辨率三维荧光成像是获取生物组织的三维结构，以及在亚细胞、细胞、和组织尺度上研究基因表达、细胞形态、和细胞分布等生物问题的有效手段。由于生物组织不透明，传统方法对生物组织的高分辨率三维成像需要通过对生物组织的切片、二维成像、和三维重构获得[1-7]。然而，这种方法成像效率低，样品预处理难度大，数据重构复杂。此外，组织切片会破坏生物组织的完整性和连续性。这些问题使得生物组织切片、成像并重构的技术很难被广泛应用[8-12]。

生物组织透明化技术使生物组织变得透明，从而克服了使用荧光显微镜对生物组织进行高分辨率三维成像的主要障碍，使光片显微镜技术等前沿的三维荧光显微镜成像技术可以被用于高效的获取各种生物组织的细胞级和亚细胞级三维结构信息，从而帮助科研人员更好的了解生物组织、器官的结构和功能 [13-16]。由于这一显著优点，生物组织透明化技术很快的被应用于生命科学研究的各个领域。

生物组织透明化技术可以大致分为三类：疏水型[12-21]，亲水型[22-27]，和水凝胶型[28-38]。不同的透明化方法具有不同的性能，对经过透明化处理的生物样品的三维成像结果也有不同的影响。

以uDISCO为代表的疏水型方法采用疏水性有机溶剂对生物组织进行脱水、脱脂、和折射率匹配[18]。疏水型方法对生物组织的透明能力强，但是对样品中的内源荧光蛋白的破坏性强。此外，经过疏水型透明化方法处理的样品的折射率为1.55左右，因此很少有折射率与之匹配的高数值孔径物镜可以对处理后的样品进行高分辨成像，为疏水型透明化方法所处理的生物样品的高分辨率三维成像制造了障碍。

以CLARITY为代表的水凝胶型透明化方法利用如丙烯酰胺等单体形成水凝胶[27]，并通过交联将大部分含氨基的蛋白质分子固定在水凝胶结构上，之后通过电泳或十二烷基硫酸钠(SDS)等去垢剂对样品进行脱脂透明，样品最终的折射率为1.33左右，在多数高数值孔径物镜的折射率匹配范围内。然而，水凝胶型透明化方法处理程序复杂，样品容易在处理过程中被破坏，同时也会造成样品比较严重的内源荧光蛋白的损失，在很大程度上局限了这一类方法的使用。

以CUBIC系列方法为代表的亲水型方法采用亲水性化学试剂对生物组织进行去脂处理和折射率匹配[22-24]。这一类方法具有高生物相容性和生物安全性，在内源荧光蛋白的保留上具有显著优势并且兼容免疫染色，适合对使用内源荧光蛋白或免疫染色标记的生物组织样品进行透明化处理。经过亲水型透明化方法处理的样品的最终折射率约为1.49，在大多数高数值孔径显微物镜折射率的匹配范围内，易于进行高分辨率成像。

然而，亲水型透明化方法对于生物组织的透明化速度较慢，对大体积生物样品的透明效果不理想。例如，亲水型方法中较快速的CUBIC-L试剂完成一个成年小鼠整脑的透明仍然需要10天左右的时间[23]。

因此，仍然需要开发透明化速度更快、透明效果更理想的透明化试剂。

发明内容

本发明人在已有的CUBIC系列方法的基础上，通过研究得到一种脱脂组合物的配方。通过与现有的脱脂试剂相比，使用本发明的脱脂组合物的透明化方法具有更快的脱脂速度，对大体积生物样品有更好的脱脂能力，可以很好的保持生物组织从细胞级到亚细胞级的结构特征。

本发明的一个目的是提供一种脱脂组合物。

本发明的另一目的是提供所述脱脂组合物用于制备脱脂试剂的用途。

本发明的又一个目的是提供一种脱脂试剂。

本发明的又一个目的是提供一种用于进行生物组织透明化处理的试剂盒。

本发明的再一个目的是提供一种生物组织透明化处理方法。

本发明的再一个目的是提供一种生物组织透明化的成像方法。

本发明一个方面提供一种脱脂组合物，其包含尿素、N-丁基二乙醇胺和曲拉通X-100(Triton X-100)，其中，尿素、N-丁基二乙醇胺和曲拉通X-100 的质量比约为(0.6-5):(0.3-3):1。

本发明脱脂组合物中的三种成分可以分开存放，在使用时再混合在一起，或者也可以混合在一起作为单独的产品。

本发明的脱脂组合物中，尿素、N-丁基二乙醇胺和曲拉通X-100的质量比为(0.6-5):(0.3-3):1，优选为(1-2.25):(0.6-1.5):1，例如可以为1:0.6:1、 1:0.8:1、1:1:1、1.2:1:1、1.5:1:1、2:1.5:1等，但不限于此，其中最优选为1.5:1:1。当在上述比例范围内时，可以实现脱脂速度快且细胞形态保留好的技术效果。而在超出上述比例范围时，例如如果尿素比例过大，则组织易破裂，而尿素比例过小，则脱脂速度慢；如果N-丁基二乙醇胺比例过大，则组织易破裂，而 N-丁基二乙醇胺比例过小，则脱脂速度慢；如果曲拉通X-100比例过大，则细胞膜破坏严重，而曲拉通X-100比例过小，则脱脂速度慢。

本发明的脱脂组合物还可以包含溶剂，例如水。在含有水的情况下，本发明脱脂组合物中的三种成分可以分别配制成溶液，在使用时再混合在一起，或者也可以混合在一起配制成单个溶液。

此外，根据需要，本发明的脱脂组合物还可以包含其他成分，所述其他成分可以为选自乙二胺四乙酸二钠，N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺的一种或多种，例如为了脱色可以加入N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺。所述其他成分的用量在本领域技术人员的视界内，例如可以根据使用目的和期望的最终效果按照常规方法确定合适的用量。

本发明人通过研究发现，采用上述脱脂组合物配制成脱脂试剂后对生物组织(例如成年小鼠整脑或脊髓)进行脱脂处理，可以大幅缩短脱脂处理时间。

因此，本发明的另一方面提供所述脱脂组合物用于制备脱脂试剂的用途。

本发明再一方面提供一种脱脂试剂，其为一种水溶液，其中以质量百分浓度计，包含10-25％的尿素，5-15％的N-丁基二乙醇胺和5-15％的曲拉通X-100。

本发明的脱脂试剂中，尿素的质量百分浓度为10～25％，优选12～18％，例如12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、 18％等，更优选15％。在上述含量范围内，可以实现脱脂速度快、细胞形态保留好且内源荧光蛋白不易淬灭的技术效果。如果尿素含量过高，则脱脂速度加快，但组织易破损，而尿素含量过低，则脱脂速度慢，内源荧光蛋白易淬灭。

本发明的脱脂试剂中，N-丁基二乙醇胺的质量百分浓度为5-15％，优选8-12％，例如8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％等，更优选10％。在上述含量范围内，可以实现脱脂速度快、内源荧光蛋白保留效果好且细胞形态保留好的技术效果。如果N-丁基二乙醇胺含量过高，则脱脂速度加快，但组织易破损，而N-丁基二乙醇胺含量过低，则脱脂速度慢，内源荧光蛋白保留效果差。

本发明的脱脂试剂中，曲拉通X-100的质量百分浓度为5-15％，优选8-12％，例如8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％等，更优选10％。在上述含量范围内，可以实现脱脂速度快且细胞形态保留好的技术效果。如果曲拉通 X-100含量过高，则细胞形态破坏严重，而曲拉通X-100含量过低，则脱脂速度缓慢。

此外，根据需要，本发明的脱脂试剂还可以包含其他成分，所述其他成分可以为选自乙二胺四乙酸二钠，N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺的一种或多种，例如为了脱色可以加入N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺。所述其他成分的用量在本领域技术人员的视界内，例如可以根据使用目的和期望的最终效果按照常规方法确定合适的用量。

根据本发明的脱脂试剂的制备方法没有特别限制，例如可以分别将脱脂组合物的各成分分别溶解在纯水中，然后再混合在一起并定容，或者可以将脱脂组合物的各成分同时溶解在规定量的纯水中。

本发明再一方面提供用于生物组织透明化成像的试剂盒，其包含上述脱脂组合物或者上述脱脂试剂。

所述试剂盒还可以包括选自磷酸盐缓冲剂(Phosphate buffer,PB)、多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)、折射率匹配组合物、凝胶试剂、成像缓冲液、染色剂等中的一种或多种。此外，所述试剂盒还可以包括说明书，用于记载相关试剂信息，教导如何配制相关试剂等。所述说明书可以记载于适当的介质上，例如纸，或者可以存储在适当的存储介质中，例如胶片、磁盘、光盘、U盘、硬盘等。或者，所述试剂盒可以包括记载有如何获得说明书信息的说明的介质，例如印刷有二维码或者说明书链接信息的纸、载有二维码或者说明书链接信息的胶片或者存储有二维码图片或者说明书链接信息的磁盘、光盘、U盘、硬盘等，通过扫描所述二维码可以下载说明书或者链接至可以下载说明书的网站。

所述磷酸盐缓冲剂可以为适用于处理处理生物组织的磷酸盐缓冲剂，例如可以为由磷酸氢二钠和磷酸二氢钠组成的pH为7.0至7.4，例如7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35等，优选为约7.2的磷酸盐缓冲剂。本领域技术人员可以根据最终所需的pH适当地选择磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的用量。在试剂盒中，所述磷酸盐缓冲剂可以为由磷酸氢二钠和磷酸二氢钠组成的固体，在使用时配制成适合的溶液，或者可以为使用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配制而成的磷酸盐缓冲液。在一个实施方式中，可以采用0.1M磷酸盐缓冲液，其pH为7.2，使用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配制而成。这里磷酸盐缓冲液的浓度是以磷酸根的浓度计算的。

所述多聚甲醛用于配制处理生物组织的固定液，所述固定液用于固定生物组织。在试剂盒中，其可以为固体，在使用时配制成质量体积浓度为4％的多聚甲醛在磷酸盐缓冲液中的溶液，或者可以为溶液。在一个实施方式中，所述多聚甲醛为4％多聚甲醛(质量(g)/体积(ml)浓度)，其pH为7.2-7.4，通过将多聚甲醛溶解在上述的磷酸盐缓冲液(例如0.1M)中并调节pH得到。

所述折射率匹配组合物可以为CUBIC方法中适合用于配制折射率匹配溶液的任何配方的组合物。所配制的折射率匹配溶液的折射率可以为1.46至1.50，以满足光学显微镜的测量要求。在试剂盒中，所述折射率匹配组合物可以为由一定配方的折射率匹配试剂组成的固体，在使用时配制成合适的折射率匹配溶液；或者所述折射率匹配组合物可以是配制完成的折射率匹配溶液。也即，所述折射率匹配组合物可以为所配制的折射率匹配溶液的折射率为1.46至1.50 的折射率匹配试剂组成的固体，或者折射率为1.46至1.50的折射率匹配溶液。

在一些实施方式中，所述折射率匹配组合物包含尿素、蔗糖、安替比林和三羟乙基胺，其中尿素、蔗糖、安替比林和三羟乙基胺的比例为(1-7):(1-6.5): (1-6.5):1，特别为(1.6-3.8):(1.6-3.2):(1.6-3.2):1，例如1.7:1.7:1.7:1、 2:1.8:1.9:1、2.5:2:2:1、2.5:2.25:2.25:1、3:2:2:1、3:2.5:2.5:1、3.5:3:2.5:1、3.5:3:3:1 等，更特别为约2.5:2.25:2.25:1。

在另一些实施方式中，所述折射率匹配组合物为水溶液，其中，以质量百分浓度计，包含15～35％，优选20～30％，例如21％、22％、23％、24％、25％、 26％、27％、28％、29％等，特别是25％的尿素，15～32.5％，优选20～25％，例如21％、21.5％、22％、22.5％、23％、23.5％、24％、24.5％等，特别是22.5％的蔗糖，15～32.5％，优选20～25％，例如21％、21.5％、22％、22.5％、23％、 23.5％、24％、24.5％等，特别是22.5％的安替比林，和5～15％，优选8～12％，例如9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％等，特别是10％的三羟乙基胺。

所述凝胶试剂可以为琼脂糖，用于配制凝胶溶液，通过将琼脂糖溶解在折射率匹配溶液中制成凝胶溶液。在试剂盒中，所述凝胶试剂可以为琼脂糖固体，在使用时配制成适合的溶液，或者可以为配制完成的凝胶溶液。在一些实施方式中，所述凝胶溶液为以质量百分浓度计，1.5％至3％，优选1.8％至2.5％，例如1.85％、1.90％、1.95％、2.0％、2.05％、2.10％、2.15％、2.20％、2.25％、 2.30％、2.35％、2.40％、2.45％等，特别是约2％的琼脂糖溶液。

所述成像缓冲液为硅油和矿物油的混合物，其折射率与折射率匹配溶液基本一致，可以为折射率匹配溶液的折射率的99.8％至100.06％，优选99.9％至 100.01％。在一些实施方式中，所述成像缓冲液为折射率为1.494的硅油和矿物油的混合物。对于成像缓冲液的配制方法没有特别限制，例如可以通过向硅油中加入矿物油，同时测量折射率，直至最终折射率达到目标值为止。

在一些实施方式中，所述试剂盒包括：

1.快速脱脂溶液(Fast delipidating solution,S1)，其为以质量百分浓度计，包含15％的尿素，10％的N-丁基二乙醇胺和10％的曲拉通X-100的水溶液；

2.折射率匹配溶液(RI matching solution，S2)，其为以质量百分浓度计，含25％尿素、22.5％蔗糖、22.5％安替比林和10％三羟乙基胺的水溶液；

3.凝胶溶液(Gelling solution，S3)，其为以质量百分浓度计，2％琼脂糖在折射率匹配溶液中的溶液；

4.成像缓冲液(Imaging buffer，S4)，其为折射率为1.494的硅油与矿物油的混合物。

本发明再一方面提供一种生物组织透明化处理的方法，所述方法包括：将生物组织样品在根据本发明的脱脂试剂中进行脱脂处理直至样品透明，之后将生物组织样品在折射率匹配溶液中进行折射率匹配。

在一些实施方式中，在所述生物组织透明化处理的方法中，所述处理可以在震荡条件下(例如在摇床上)进行。

在一些实施方式中，在所述生物组织透明化处理的方法中，可以定期或不定期更换根据本发明的脱脂试剂。例如，可以每隔6小时、每隔12小时或每隔24小时更换脱脂试剂，但是本发明不限于此。在所述生物组织透明化处理的方法中，根据本发明的脱脂试剂的单次用量没有特别限制，只要可以浸没生物组织样品即可。特别地，可以基于生物组织样品的体积决定具体用量，例如脱脂试剂的单次用量可以为样品体积的5-25倍，优选为10至20倍，特别为15倍。

在一些实施方式中，在所述生物组织透明化处理的方法中，所述脱脂处理的时间可以为5分钟以上，1小时以上，1天以上等，但不限于此。具体脱脂处理的时间可以根据生物组织的体积、年龄，脱脂试剂的用量等而适当变化。例如，采用本发明的快速脱脂溶液，对于厚度200微米的小鼠脑片而言，可以在约10分钟实现脱脂；对于成年小鼠整脑和脊髓而言，可以在约2-3天实现整脑脱脂；对于P7家兔整脑而言，可以在约7天实现整脑脱脂。

在所述生物组织透明化处理的方法中，折射率匹配可以通过将脱脂处理后的生物组织样品浸泡在折射率匹配溶液中而进行。

所述折射率匹配溶液没有特别限制，可以采用本领域中的已知的任何适合的折射率匹配溶液，或者采用上述的折射率匹配溶液，而没有特别限制。

特别地，所述折射率匹配溶液是水溶液，其中，以质量百分浓度计，包含 15～35％，优选20～30％，例如21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、 29％等，特别是25％的尿素，15～32.5％，优选20～25％，例如21％、21.5％、22％、22.5％、23％、23.5％、24％、24.5％等，特别是22.5％的蔗糖，15～32.5％，优选20～25％，例如21％、21.5％、22％、22.5％、23％、23.5％、24％、24.5％等，特别是22.5％的安替比林，和5～15％，优选8～12％，例如9％、9.5％、10％、 10.5％、11％、11.5％等，特别是10％的三羟乙基胺。

在一些实施方式中，可以在震荡条件下(例如在摇床上)进行折射率匹配。

在一些实施方式中，在折射率匹配中，可以定期或不定期更换折射率匹配溶液。例如，可以每隔6小时、每隔12小时或每隔24小时更换折射率匹配溶液，但是本发明不限于此。折射率匹配溶液的单次用量没有特别限制，只要可以浸没生物组织样品即可。特别地，可以基于生物组织样品的体积决定具体用量，折射率匹配溶液的单次用量可以为样品体积的2-22倍，优选为7至17倍，特别为12倍。

在一些实施方式中，上述折射率匹配中，使用折射率匹配溶液浸泡的时间可以为5分钟以上，1小时以上，1天以上等，但不限于此。具体处理的时间可以根据生物组织的体积、年龄，折射率匹配溶液的用量等而适当变化。例如，对于成年小鼠整脑和脊髓而言，可以浸泡约2-3天；对于P7家兔整脑而言，可以浸泡约7天。

本发明再一方面提供一种生物组织透明化的成像方法，所述方法包括用根据本发明的生物组织透明化处理的方法对生物组织样品进行透明化处理的步骤。

所述成像方法还可以包括用于成像所需的其他步骤，例如在透明化处理之前进行的获取生物组织并固定等步骤，以及在透明化处理之后进行的凝胶包埋、成像，或者染色、制片和成像等步骤，但是本发明不限于此。

在一个实施方式中，所述成像方法包括：

1.固定生物组织样品；

2.使用根据本发明的生物组织透明化处理的方法对固定后的生物组织样品进行透明化处理；

3.将透明化处理后的生物组织样品进行凝胶包埋；

4.将凝胶包埋后的生物组织样品成像。

上述步骤1中，对于固定生物组织样品没有特别限制，可以采用本领域中的常规方法。例如，可以将从生物体分离出的生物组织在多聚甲醛溶液(例如pH为7.2-7.4的在0.1M磷酸盐缓冲液中的4％(g/mL)多聚甲醛溶液)中浸泡过夜而完成固定。但是，本发明不限于此。

上述步骤2中，进行透明化处理的步骤的描述与上述根据本发明的生物组织透明化处理的方法的描述相同，在此不再赘述。

上述步骤3中，凝胶包埋指的是将折射率匹配后的生物组织样品包埋在凝胶中。对于生物组织样品包埋在凝胶中的方法没有特别限制，可以采用已知的任何适合的方法。例如可以将凝胶溶液加入模具中，然后放入生物组织样品，然后凝胶化得到经凝胶包埋的生物组织样品。

所述凝胶溶液可以通过将任何合适的凝胶试剂溶解在折射率匹配溶液中而配制。在一些实施方式中，所述凝胶试剂为琼脂糖。在一些实施方式中，所述凝胶溶液为以质量百分浓度计，1.5％至3％，优选1.8％至2.5％，例如1.85％、 1.90％、1.95％、2.0％、2.05％、2.10％、2.15％、2.20％、2.25％、2.30％、2.35％、 2.40％、2.45％等，特别是约2％的琼脂糖在折射率匹配溶液中的溶液。

可以通过在高温下将凝胶试剂溶解在折射率匹配溶液中，然后冷却而实现凝胶化；或者也可以采用加入交联剂的方法来实现凝胶化，但是本发明不限于此。

上述步骤4中，成像可以按照本领域中已知的任何成像方法进行。例如，将凝胶包埋后的生物组织样品固定于成像显微镜的样品架上进行。成像时，生物组织样品需要浸没在成像缓冲液中。

成像缓冲液在成像时提供保护样品免于蒸发脱水而皱缩以及避免激发光在进入样品前多次折射而影响成像质量作用，其折射率与折射率匹配溶液基本一致，可以为折射率匹配溶液的折射率的99.8％至100.06％，优选99.9％至 100.01％的范围内。

在一些实施方式中，所述成像缓冲液为硅油和矿物油的混合物，特别地，所述成像缓冲液为折射率为1.494的硅油和矿物油的混合物。

在本文中，所有以数值范围或百分比范围形式界定的特征或条件仅是为了简洁及方便。据此，数值范围或百分比范围的描述应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的个别数值，特别是整数数值。举例而言，“1至8”的范围描述应视为已经具体公开如1至7、2至8、2至6、3至6、4至8、3 至8等等所有次级范围，特别是由所有整数数值所界定的次级范围，且应视为已经具体公开范围内如1、2、3、4、5、6、7、8等个别数值。除非另有指明，否则前述解释方法适用于本发明全文的所有内容，不论范围广泛与否。

若数量或其他数值或参数是以范围、优选范围或一系列上限与下限表示，则其应理解成是本文已特定公开了由任一对该范围的上限或优选值与该范围的下限或优选值构成的所有范围，不论这些范围是否有分别公开。此外，本文中若提到数值的范围时，除非另有说明，否则该范围应包括其端点以及范围内的所有整数与分数。

在本文中，在可实现发明目的的前提下，数值应理解成具有该数值有效位数的精确度。举例来说，数字40.0则应理解成涵盖从39.50至40.49的范围。除了在详细描述最后提供的工作实施例之外，本申请文件(包括所附权利要求) 中的参数(例如，数量或条件)的所有数值在所有情况下都应被理解为被术语“大约”修饰，不管“大约”是否实际出现在该数值之前。“大约”表示所述的数值允许稍微不精确(在该值上有一些接近精确；大约或合理地接近该值；近似)。如果“大约”提供的不精确性在本领域中没有以这个普通含义来理解，则本文所用的“大约”至少表示可以通过测量和使用这些参数的普通方法产生的变化。例如，“大约”可以包括小于或等于10％，小于或等于5％，小于或等于4％，小于或等于3％，小于或等于2％，小于或等于1％或者小于或等于0.5％的变化，并且在某些方面，小于或等于0.1％的变化。

在上文中已经详细地描述了本发明，但是上述实施方式本质上仅是例示性，且并不欲限制本发明。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下实施例中所描述的任何理论的限制。

有益效果

本发明提供对生物样品具有更高的透明化效率，和更强透明能力的一种脱脂试剂。所述脱脂试剂相对于现有的亲水型透明化方法中采用的脱脂试剂，除了具有一般脱脂试剂的高生物兼容性，高生物安全性，和对内源荧光蛋白保留能力好等优点外，还具有以下优于现有脱脂试剂的优点：

第一、根据本发明的脱脂试剂具有更快的透明化速度，对大体积生物样品有更好的透明化能力；

第二、根据本发明的脱脂试剂对生物样品的透明化过程中，生物样品的变形过程更加平缓，从而保护了生物组织的完整性；

第三、根据本发明的脱脂试剂可以很好的保持生物组织从细胞级到亚细胞级的结构特征。

附图说明

图1是显示使用本发明的脱脂溶液，折射率匹配溶液和凝胶溶液制备透明小鼠整脑样品的流程和效果的图。

图2是显示使用本发明的脱脂溶液，折射率匹配溶液和凝胶溶液制备透明小鼠脊髓样品的流程和效果的图。

图3是显示根据本发明的去脂溶液和现有技术中的CUBIC-L去脂溶液的透明化能力和效果的比较的图，其中A显示分别用本发明的去脂溶液和现有技术中的CUBIC-L去脂溶液对成年小鼠整脑进行透明化处理过程中样品的透明度变化过程，B显示分别用本发明的去脂溶液和现有技术中的CUBIC-L去脂溶液对P7家兔整脑进行透明化处理过程中样品的透明度变化过程，标尺均为1cm。

图4是显示显示根据本发明的去脂溶液和现有技术中的CUBIC和 CUBIC-L去脂溶液对小鼠脑片进行透明化处理过程中的形态变化的比较的图，其中，A是小鼠脑片样品制备和记录小鼠脑片的透明化过程中形变的实验方法示意图，B-D显示小鼠脑片透明化过程中的结构变化，其中B显示小鼠脑片在使用现有技术的CUBIC和CUBIC-L去脂溶液和根据本发明的去脂溶液S1 进行透明化处理过程中的形态变化，标尺为5mm；C显示小鼠脑片面积变化的百分比；D显示小鼠脑片透明化达到平衡状态后的平均面积变化百分比。

图5显示Thy1-GFP-M小鼠脑切片在用本发明的去脂溶液S1处理前后细胞分布和形态的变化。其中，A显示杏仁核区域在进行透明化处理前和处理后的细胞分布的变化，标尺为100μm；B显示皮层区域单个神经元细胞在进行透明化处理前和处理后的细胞形态的变化，标尺为(a，d)30μm，(b，e)5 μm，(c，f)0.5μm。

图6显示用本发明的去脂溶液S1进行透明化处理的小鼠整脑微米级到亚微米级的空间分辨率的三维成像，其中，A和B是使用0.25数值孔径(NA) 空气检测物镜以2×2×5μm³空间分辨率对透明化处理后的Thy1-eGFP小鼠整脑三维成像结果的横向和轴向投影视图，比例尺为1mm；C是图A中所标注样品区域的轴向投影视图，比例尺为200μm；D是对C中相同区域使用折射率匹配为1.49，0.5NA浸入式检测物镜以0.6×0.6×1.5μm³空间分辨率成像所获得的三维成像结果的轴向投影视图，比例尺为200μm；E-H是对D中所标注的2个100×100×100μm³区域的侧向和轴向投影视图，比例尺为10μm。

具体实施方式

以下，为了更好地理解本发明而提供优选的实施例。然而，提供以下的实施例仅用于更容易地理解本发明，且本发明的范围并不限于此。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下实施例中所描述的任何理论的限制。实施例中所采用的方法、试剂和条件，除非另有说明，否则为本领域常规的方法、试剂和条件。

实施例

1.试剂和仪器

十二水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)和二水磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O) 购自生工生物工程(上海)股份有限公司

多聚甲醛(Paraformaldehyde)为购自国药集团化学试剂有限公司的 80096618

尿素(Urea)购自生工生物工程(上海)股份有限公司的A600148-9001

曲拉通X-100(Triton X-100)购自生工生物工程(上海)股份有限公司的A110694-9001

N-丁基二乙醇胺(N-butyldiethanolamine)购自TCI的B0725

蔗糖(Sucrose)购自生工生物工程(上海)股份有限公司的A610498-0005 安替比林(Antipyrine)购自Sigma-Aldrich的V900710-500G

三羟乙基胺(Triethanolamine)购自Sigma-Aldrich的V900257-500ML

琼脂糖S(Agarose S)为购自Nacalai Tesque的01163-76-500G

矿物油(Mineral oil)为购自Sigma-Aldrich的M8410-1L

硅油(Silicone oil AP 100)为购自Sigma-Aldrich的10838-500ML

成像在体视显微镜(购自OLYMPUS的SZ61)，荧光体视显微镜(购自 ZEISS的AxioZoom.V16)，激光共聚焦显微镜(购自ZEISS的LSM800)以及实验室自建的用于大样品成像的光片显微镜上进行。

2.溶液配制

(1)0.1M磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer,PB)

将28.998克Na₂HPO₄·12H₂O和2.964克NaH₂PO₄·2H₂O溶于900毫升去离子水(ddH₂O)中,调节pH至7.2,最终定容到1升。

(2)4％多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)

将40克多聚甲醛(PFA)加入900毫升0.1M PB中，边搅拌边加入少量氢氧化钠促进PFA溶解，待PFA完全溶解通过滴加浓盐水调节pH至7.2-7.4 并定容到1升。4％PFA可在4℃保存1个月,但建议使用前新鲜配制。

(3)快速脱脂溶液(Fast delipidating solution,S1)

将150克尿素、100克N-丁基二乙醇胺和100克曲拉通X-100溶入650 克dd H₂O中，静置至气泡消失后使用。

(4)折射率匹配溶液(RI matching solution，S2)

将250克尿素、225克蔗糖和225克安替比林通过加热溶入200克ddH₂O 中，待温度恢复至室温后加入100克三羟乙基胺并搅拌均匀，之后过滤去除杂质备用。

(5)凝胶溶液(Gelling solution，S3)

称量2克琼脂糖S和98克S2，两者混合均匀后微波加热，琼脂糖S溶解后将配置好的凝胶溶液S3置于37℃保存。

(6)成像缓冲液(Imaging buffer，S4)

S4为硅油与矿物油的混合物，最终折射率为1.494。S4可以反复使用，使用前搅拌均匀并消除气泡。

实施例1 小鼠整脑的透明化处理和成像

1.取材及固定(1天)

使用2％戊巴比妥钠腹腔注射深度麻醉小鼠后，心脏灌注50毫升在4℃预冷的0.1MPB和30毫升4％PFA，然后分离出小鼠脑。取材后将小鼠脑浸泡入 40毫升4％PFA，置于4℃过夜。第二天去除4％PFA后，使用0.01M PB清洗小鼠脑三次，每次两小时。

2.脱脂(2-4天)

将固定后的小鼠脑置于50毫升离心管中并加满S1。将离心管置于37℃摇床内，以60rpm的转速摇动去脂，每24小时更换一次S1。成年小鼠脑一般去脂3天完全透明。更大体积的样本或者老年生物样本可以适当延长去脂时间，直至样品透明。

3.折射率匹配(2天)

将去脂后的小鼠脑置于50ml离心管中并加满S2，于25℃摇床以60rpm 的速度进行折射率匹配，24小时后更换一次S2。

4.凝胶包埋(4小时)

先在凝胶模具中加入S3，之后放入多孔铁片并使其沉到模具底部，之后将折射率匹配后的样品放入模具中，调整样品的位置于模具中间后，将模具放入4℃冰箱加速S3凝胶，约4小时固化。

5.成像

将样品从模具中脱出，固定于成像显微镜的样品架上，浸没在成像缓冲液 S4中，进行三维成像。

图1示意性显示上述制备透明小鼠整脑透明化样品的流程及效果。

实施例2 小鼠脊髓的透明化处理和成像

1.取材及固定(1天)

使用2％戊巴比妥钠腹腔注射深度麻醉小鼠后，心脏灌注50毫升在4℃预冷的0.1MPB和30毫升4％PFA，将脊髓从脊椎中分离后先将脊髓固定到孔板和100目尼龙网之间(保证后固定时脊髓不会弯曲且PFA能够充分接触样品) 再将样品置于50毫升装有4％PFA的离心管中于4℃摇床上进行固定过夜。第二天去除4％PFA后，使用0.01M PB清洗样品三次，每次两小时，彻底去除PFA。

2.脱脂(2-3天)

PFA清洗干净后，在离心管中加满S1，于37℃摇床内，以60rpm的转速进行去脂，每24小时更换一次S1。去脂2-3天，直至脊髓完全透明。

3.折射率匹配(2天)

替换离心管中的S1试剂为S2，于25℃摇床以60rpm的速度进行折射率匹配，24小时后更换一次S2。

4.凝胶包埋(4小时)

先在脊髓凝胶模具中加入S3，之后放入多孔铁片并使其沉到模具底部，之后将折射率匹配后的样品放入模具中，调整样品的位置于模具中间后，将模具放入4℃冰箱加速S3凝胶，约4小时固化。

5.成像

图2示意性显示上述制备透明小鼠脊髓透明化样品的流程及效果。

实施例3 P7家兔整脑的透明化处理和成像

1.取材及固定(1天)

腹腔注射2％戊巴比妥钠深度麻醉家兔后，心脏灌注100毫升预冷的0.1M PB和60毫升4％PFA，之后分离出家兔脑。将兔脑浸泡入含有80毫升4％PFA 的蓝盖瓶中，置于4℃摇床，震荡过夜。第二天去除4％PFA后，使用0.01M PB于摇床上摇动清洗兔脑三次，每次两小时。

2.脱脂(2-4天)

PFA清洗干净后，在100毫升的蓝盖瓶中加满S1，于37℃摇床内，以60 rpm的转速进行去脂，每24小时更换一次S1。去脂2-4天，直至兔脑完全透明。

3.折射率匹配(2天)

替换蓝盖瓶中的S1试剂为S2，于25℃摇床以60rpm的速度进行折射率匹配，24小时后更换一次S2。

4.凝胶包埋(4小时)

先在兔脑凝胶模具中加入S3，之后放入多孔铁片并使其沉到模具底部，最后将折射率匹配后的样品放入模具中，调整样品的位置于模具中间后，将模具放入4℃冰箱加速S3凝胶，约4小时固化。

对比例1采用CUBIC-L进行小鼠整脑的透明化处理和成像

基于参考文献[27]如下配制CUBIC-L去脂溶液和折射率匹配溶液。 CUBIC-L去脂溶液如下配制：150克N-丁基二乙醇胺和100克曲拉通X-100 溶入850克ddH₂O中，静置至气泡消失后使用。

CUBIC-L折射率匹配溶液如下配制：450克安替比林，300克的烟酰胺溶入200克的ddH₂O中，使用N-丁基二乙醇胺调节pH到8-9，之后补充ddH₂O 至总质量为1000克。除了步骤2的去脂采用CUBIC-L去脂溶液，步骤3的折射率匹配采用CUBIC-L折射率匹配溶液以外，以与实施例1相同的方式进行小鼠整脑的透明化处理。

对比例2采用CUBIC-L进行P7家兔整脑的透明化处理和成像

除了步骤2的去脂采用CUBIC-L去脂溶液，步骤3的折射率匹配采用 CUBIC-L折射率匹配溶液以外，以与实施例3相同的方式进行P7家兔整脑的透明化处理。

在实施例1和3和对比例1和2的去脂过程中每日用体视显微(OLYMPUS SZ61)拍摄整脑图片以显示透明化处理过程中样品的透明度变化过程，结果显示在图3中。

图3显示根据本发明的去脂溶液和现有技术中的CUBIC-L去脂溶液的透明化能力和效果的比较，其中A显示分别用本发明的去脂溶液和现有技术中的CUBIC-L去脂溶液对成年小鼠整脑进行透明化处理过程中样品的透明度变化过程，B显示分别用本发明的去脂溶液和现有技术中的CUBIC-L去脂溶液对P7家兔整脑进行透明化处理过程中样品的透明度变化过程，标尺均为1cm。

由图3的A：对成年小鼠整脑的透明化实验结果表明，鼠脑经过本发明的去脂溶液S1进行透明化处理4天后的透明程度和经过CUBIC-L透明处理8 天后的透明度相当。小鼠整脑经过本发明的去脂溶液S1透明化处理6天后已经达到完全透明，优于经过CUBIC-L透明化处理10天后小鼠整脑的透明度。

由图3的B：对P7家兔整脑的透明化对比结果表明，根据本发明的去脂溶液S1经过7天即可以将P7家兔的整脑透明，优于CUBIC-L透明处理14 天后的透明度。

实验结果表明，本发明的去脂试剂具有比一般亲水型方法更高的透明化效率和对大样本更好的透明化能力。

实施例4和对比例3和4 200微米小鼠脑片的透明化处理

CUBIC去脂溶液如下配制：250克尿素和312克80wt％的N,N,N',N'-四(2- 羟基丙基)乙二胺加入288克dd H₂O中，加热至完全溶解且恢复室温后加入150 克曲拉通X-100，搅拌溶解后静置至气泡消失后使用。

生物组织在经过透明化处理后，生物组织原始三维结构的真实保留程度对透明化技术的应用具有至关重要的影响。为了更好的了解生物组织的透明化过程，并比较不同透明化方法所导致的生物组织结构的变形程度，分别采用对小鼠脑片的透明化过程进行观察。

分别使用根据本发明的去脂溶液S1(实施例4)、CUBIC去脂溶液(对比例3)和CUBIC-L去脂溶液(对比例4)对200微米厚的小鼠脑片进行透明化处理。图4的A是小鼠脑片样品制备和记录小鼠脑片的透明化过程中形变的实验方法示意图，具体操作步骤如下。

从经过固定的野生型成年小鼠大脑的相同脑区切下若干200微米厚的小鼠脑片，并进行碘化丙啶(PI)染色。染色后的每一片小鼠脑片分别置于两片保持500微米间隙的盖玻片间。夹持好的脑片被放置于不同的培养皿中，在培养皿中分别加入所选透明化方法的透明化试剂，在23℃室温下对脑片进行透明化处理。同时，使用Zeiss V16显微镜每10秒一次对脑片进行拍照，记录所有脑片的透明化和脑片的面积变化过程，直到脑片变得透明。所有的脑片在完全透明以后都留在相应的透明化溶液中过夜，使透明化脑片的形变达到最终的平衡状态。

图4的B-D显示小鼠脑片透明化过程中的结构变化，其中B显示小鼠脑片在使用现有技术的CUBIC和CUBIC-L去脂溶液和根据本发明的去脂溶液 S1进行透明化处理过程中的形态变化，标尺为5mm；C显示小鼠脑片面积变化的百分比；D显示小鼠脑片透明化达到平衡状态后的平均面积变化百分比。

由于脑片的厚度仅为200微米，透明化试剂可以很快渗透到脑片中，所有的脑片都在10分钟左右变得透明。然而，采用不同去脂溶液处理的脑片表现了不同的透明化和形变过程。使用CUBIC和CUBIC-L去脂溶液处理的脑片先经历了不同程度的收缩然后开始膨胀。而使用本发明的去脂溶液S1处理的脑片则在透明化过程中表现了平缓的膨胀过程。此外，根据图4的D，不同透明化方法处理的脑片在达到平衡状态以后，面积分别扩大了46％(CUBIC)， 30％(CUBIC-L)和50％(本发明S1)。

使用不同透明化方法进行透明的脑片的不同变形过程表明，生物组织的透明化过程受到生物组织成分和生物组织外部化学环境之间的多种相互作用的影响，而被透明的生物组织的最终形变则是这些相互作用的结果。实验结果也表明生物组织透明化所引起的形变可能具有轻微的各向异性。这种结果可能由多种原因导致。首先，生物组织不同局部区域的成分和化学环境不同，在组织透明化过程中，随着各种物理化学反应的进行和透明化试剂渗透到生物组织中，生物组织的成分和化学环境都会发生变化，从而在生物组织中产生不均匀的应变和应力，使生物组织发生各向异性的变形。第二，生物组织不规则的物理轮廓和不均匀的机械性能在生物组织的透明化过程中也可能导致不同程度的变形。第三，固定后的生物组织一般不具有弹性，导致生物组织在发生形变后无法恢复到原来的形态。因此，在对生物组织进行透明化的过程中，应该尽量避免引起生物组织快速的膨胀或者收缩，以减少产生造成生物组织形变的应变和应力，保持生物组织的完整。实验结果表明，根据本发明的去脂试剂对生物样品的透明化过程更加平缓，从而更加有利于保持生物组织在透明化过程中的完整性。

实施例5 100微米Thy1-eGFP小鼠脑片的透明化处理

为了进一步研究本发明的去脂试剂对生物组织结构的影响，对100微米厚的Thy1-eGFP小鼠脑片在用本发明的去脂溶液S1进行脱脂处理前(在PBS 溶液中)和处理后三维结构的变化进行了成像和比较。具体操作如下。

从经过固定的Thy1-eGFP成年小鼠大脑切下若干100微米厚的脑片，将脑片放在玻底皿中，加入少量PBS，盖上盖玻片，分别使用Zeiss LSM800激光共聚焦显微镜的20倍和63倍物镜进行成像获取脑片细胞级以及亚细胞级结构图像。之后去掉盖玻片，弃去PBS并加入2毫升脱脂溶液S1，在23℃室温下静置过夜。第二天弃去多余的S1，盖上盖玻片，再次使用Zeiss LSM800激光共聚焦显微镜对相同的区域进行拍照，记录脑片去脂后细胞级以及亚细胞级结构图像。

图5的A在细胞级分辨率上对比了小鼠脑切片在用本发明的去脂试剂进行透明化处理前后的细胞分布的变化，可以看出，采用本发明的去脂溶液S1 进行透明化处理后的脑片透明度较高，在透明化处理后的小鼠脑片上可以观察到更多的细胞。通过相同细胞间相对位置在小鼠脑片透明化前后的变化，可以说明小鼠脑片在透明化后发生了膨胀和轻微的各向异性的三维结构变化。然而，由于所发生的各向异性的结构变化非常轻微，可以认为小鼠脑片在经过本发明的去脂试剂进行透明化处理后保持了大致相同的细胞级的三维结构特征。

图5的B在亚细胞级分辨率水平上对比了小鼠脑切片上单个神经元细胞在本发明的去脂试剂进行透明化处理前后的形态的变化，结果表明，在本发明的去脂试剂进行透明化处理前后，神经元细胞前后保持了几乎相同的树突和突触特征。

因此，实验结果表明，本发明的去脂试剂进行透明化处理可以很好的保持生物组织从细胞级到亚细胞级结构特征。

实施例6成年Thy1-eGFP小鼠整脑成像

为了检验本发明的去脂试剂对生物组织样品内源荧光蛋白的保留能力和处理后的生物组织样品的透明度，使用平铺光片显微镜以不同的空间分辨率对一个用本发明的去脂溶液S1进行透明化处理的成年Thy1-eGFP小鼠整脑在不同的成像条件下进行了三维成像。

对成年Thy1-eGFP小鼠整脑的透明化处理过程与实施例1中相同。

图6的A-C的成像结果反映了被内源绿色荧光蛋白所标记的鼠脑神经网络的三维结构，所标记神经网络中神经元的空间位置和分布都可以被很好的解析。

图6的D-H的成像结果以亚微米级分辨率显示了神经元的亚细胞形态，包括神经元树突、轴突、和神经突触等结构特征，以及神经元间的连接和投射。如成像结果所示，经过本发明去脂试剂进行透明化处理的鼠脑样品具有良好的透明度，同时也很好地保留了样品的内源性荧光蛋白，从而允许对透明化后的鼠脑样品进行高分辨率的三维成像。

以上已经详细描述了本发明。本发明的去脂试剂具有良好的透明化效率，对大体积样品的透明能力，和对内源荧光蛋白的保留能力，同时对生物样品的透明化过程更加平缓，因此可以更好的保护生物组织细胞级和亚细胞级的三位结构特征和生物组织的完整性。

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Claims

1.一种脱脂组合物，其包含尿素、N-丁基二乙醇胺和曲拉通X-100(Triton X-100)，其中，尿素、N-丁基二乙醇胺和曲拉通X-100的质量比为(0.6-5):(0.3-3):1。

2.根据权利要求1所述的脱脂组合物，其中，尿素、N-丁基二乙醇胺和曲拉通X-100的质量比为(1-2.25):(0.6-1.5):1，优选为1.5:1:1。

3.权利要求1或2所述的脱脂组合物用于制备脱脂试剂的用途。

4.一种脱脂试剂，其为一种水溶液，其中以质量百分浓度计，包含10-25％的尿素，5-15％的N-丁基二乙醇胺和5-15％的曲拉通X-100。

5.根据权利要求5所述的脱脂试剂，其中，

尿素的质量百分浓度为12～18％，优选15％；

N-丁基二乙醇胺的质量百分浓度为8-12％，优选10％；

曲拉通X-100的质量百分浓度为8-12％，优选10％。

6.一种用于生物组织透明化成像的试剂盒，其包含权利要求1或2所述的脱脂组合物或者权利要求4或5所述的脱脂试剂。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其还包括选自磷酸盐缓冲剂、多聚甲醛、折射率匹配组合物、凝胶试剂、成像缓冲液、染色剂中的一种或多种。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，

所述磷酸盐缓冲剂为由磷酸氢二钠和磷酸二氢钠组成的pH为7.0至7.4，优选7.2的磷酸盐缓冲剂；

所述多聚甲醛为固体，或者以g/ml计，4％多聚甲醛溶液；

所述折射率匹配组合物为所配制的折射率匹配溶液的折射率为1.46至1.50的折射率匹配试剂组成的固体，或者折射率为1.46至1.50的折射率匹配溶液；

所述凝胶试剂为琼脂糖固体，或者为以质量百分浓度计，1.5％至3％，优选1.8％至2.5％，特别是2％的琼脂糖溶液；

所述成像缓冲液为折射率为折射率匹配溶液的折射率的99.8％至100.06％，优选99.9％至100.01％的硅油和矿物油的混合物，特别地，所述成像缓冲液为折射率为1.494的硅油和矿物油的混合物。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，

所述折射率匹配组合物包含尿素、蔗糖、安替比林和三羟乙基胺，其中尿素、蔗糖、安替比林和三羟乙基胺的比例为(1-7):(1-6.5):(1-6.5):1，特别为(1.6-3.8):(1.6-3.2):(1.6-3.2):1，更特别为2.5:2.25:2.25:1；

特别地，所述折射率匹配组合物为水溶液，其中，以质量百分浓度计，包含15～35％，优选20～30％，特别是25％的尿素，15～32.5％，优选20～25％，特别是22.5％的蔗糖，15～32.5％，优选20～25％，特别是22.5％的安替比林，和5～15％，优选8～12％，特别是10％的三羟乙基胺。

10.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：

(1)快速脱脂溶液，其为以质量百分浓度计，包含15％的尿素，10％的N-丁基二乙醇胺和10％的曲拉通X-100的水溶液；

(2)折射率匹配溶液，其为以质量百分浓度计，含25％尿素、22.5％蔗糖、22.5％安替比林和10％三羟乙基胺的水溶液；

(3)凝胶溶液，其为以质量百分浓度计，2％琼脂糖在折射率匹配溶液中的溶液；

(4)成像缓冲液，其为折射率为1.494的硅油与矿物油的混合物。

11.一种生物组织透明化处理的方法，所述方法包括：将生物组织样品在权利要求4或5所述的脱脂试剂中进行脱脂处理直至样品透明，之后将生物组织样品在折射率匹配溶液中进行折射率匹配。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，

所述脱脂试剂定期或不定期更换，脱脂试剂的单次用量为样品体积的5-25倍，优选为10至20倍，特别为15倍；

所述折射率匹配溶液是水溶液，其中，以质量百分浓度计，包含15～35％，优选20～30％，特别是25％的尿素，15～32.5％，优选20～25％，特别是22.5％的蔗糖，15～32.5％，优选20～25％，特别是22.5％的安替比林，和5～15％，优选8～12％，特别是10％的三羟乙基胺；

所述折射率匹配溶液定期或不定期更换，折射率匹配溶液的单次用量为样品体积的2-22倍，优选为7至17倍，特别为12倍。

13.一种生物组织透明化的成像方法，所述方法包括用根据权利要求11或12所述的方法对生物组织样品进行透明化处理的步骤。

14.根据权利要求13所述的成像方法，所述成像方法包括：

(1)固定生物组织样品；

(2)使用根据权利要求11或12所述的方法对固定后的生物组织样品进行透明化处理；

(3)将透明化处理后的生物组织样品进行凝胶包埋；

(4)将凝胶包埋后的生物组织样品成像。