KR102582110B1 - 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지 분석용 조성물 - Google Patents

3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지 분석용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지 분석용 조성물, 및 이를 이용한 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지화를 동시에 진행하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 특정 함량의 폴리에틸렌 글리콜 및 소듐 도데실 설페이트를 유효성분으로 포함함으로써 고가의 장비를 이용하지 않고 단순히 시약으로 3차원 세포 또는 생체 조직을 효과적으로 투명화시킬 수 있으며, 단백질 변성 등에 의해 조직 내 원하는 정보가 손실 또는 왜곡되지 않고, 생체 내 중요 정보(DNA, RNA, 단백질, 형광신호)가 유지될 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 조성물을 이용하는 경우 투명화된 조직을 이미징하기 위한 별도의 굴절율 맞춤 용액이 필요하지 않는바, 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지화를 동시에 진행할 수 있는 이점을 가진다.

Description

3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지 분석용 조성물{Composition for clearing and image analysis of three-dimensional cell or tissue}
본 발명은 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지 분석용 조성물, 및 이를 이용한 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지화를 동시에 진행하는 방법에 관한 것이다.
조직 투명화 기술은 조직의 손상 없이 조직 내부 구조 및 단백질 분포를 확인할 수 있어 기존의 기술의 관찰 한계를 뛰어넘어 더 깊은 곳까지 조직 구조를 관찰하고 다양한 기관계(system)로부터 통합적인 구조와 분자 정보의 접근을 가능하게 하므로 최근 다양한 방법으로 조직을 투명화하는 기술이 개발되었다.
종래 조직 투명화 기술로는 크게 4가지로 구분될 수 있다.
첫째, 유기용매 (solvent)를 이용한 지질의 제거를 통해 투명화하는 방법으로, 상기 방법의 경우 인체유해 유기용매 사용으로 후드에서 사용하여야 하며 생체 조직 구조와 형태의 변화 및 단백질 변성으로 형광 등을 오래 보관하지 못하는 단점이 있다.
둘째, 다당류와 특정 성분을 이용하여 생체 조직의 빛의 굴절율을 맞춰주는 굴절률 용액(Refractive index(RI) Matching solution)을 이용한 단순 침투방식의 투명화 방법으로, 상기 방법의 경우 투명화 가능한 생체 조직의 두께가 얇고 투명화 시간이 길며, 점도가 높아 이미징 시 RI 용액에 의한 이미지 왜곡이 생기는 단점이 있다.
셋째, 조직 탈수화를 통한 투명화 방법으로, 상기 방법을 사용하는 경우 여러 농도의 용액교체를 통해 조직 탈수화를 가져오고, RI 용액에 투명화 될 때까지 장시간이 소요되며 여러 농도의 용액에 따른 조직의 구조와 크기의 변화가 발생하는 문제점이 있다.
넷째, 하드로겔을 이용한 열과 전기영동을 통한 지질의 제거 후 굴절율 맞춤 용액에 담궈 사용하는 방법으로, 이 방법의 경우 하드로겔(아크릴아마이드 등)의 사용으로 하이드로겔 농도에 의한 조직샘플의 크기가 증가하고 지질을 SDS 미셀(micelle)로 제거하기 위한 특별한 전기영동장치가 필요한 단점이 있다(SDS를 전기장 안에서 수 일에서 수 주일간 가해 하이드로겔 네트워크에 공유결합적으로 연결되지 않은 포화 지방만을 제거함).
한편, 상기 언급된 여러 투명화 방법에서 최종적으로 투명화된 샘플을 이미징하기 위해서는 샘플과 대물렌즈의 굴절률 동기화를 통하여 고해상도로 나타낼 수 있다. 이를 위해 각각의 투명화 방법마다 제시된 굴절률 동기화 용액(굴절률 맞춤 용액, RI Matching solution)이 존재하며 이미 상업화되어 판매되고 있다.
본 발명은 종래 알려진 조직 투명화 기술이 가진 다양한 문제점 및 투명화된 조직의 이미징화를 위하여 별도의 굴절률 맞춤 용액을 사용해야 하는 번거로움을 극복하기 위하여 안출된 것으로, 70%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜 및 0.5%(w/v) 소듐 도데실 설페이트를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하는 경우, 고가의 장비를 이용하지 않고 단순히 시약으로 3차원 세포(스페로이드, 오가노이드) 또는 생체 조직을 효과적으로 투명화시킬 수 있으며, 단백질 변성 등에 의해 조직 내 원하는 정보가 손실 또는 왜곡되지 않고, 생체 내 중요 정보(DNA, RNA, 단백질, 형광신호)가 유지되는 것을 확인하였다. 또한, 투명화된 3차원 세포(스페로이드, 오가노이드) 또는 생체 조직을 이미징하기 위하여 별도의 굴절율 맞춤 용액이 없이도 본 발명의 상기 조성물을 이용 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국공개특허 제10-2019-0116872호
따라서 본 발명의 목적은 생체 내 중요 정보(DNA, RNA, 단백질, 형광신호)를 유지하면서 빠른 시간에 투명화가 가능하며, 동시에 이미지 분석을 가능하게 하는 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지 분석용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지화를 동시에 진행하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은 65 ~ 75%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜 및 0.1 ~ 0.5%(w/v) 소듐 도데실 설페이트를 유효성분으로 포함하는, 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지 분석용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜 400일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 3차원 세포는 스페로이드 또는 오가노이드일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생체 조직은 뇌, 허파, 심장, 간, 신장, 소장 및 비장으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 a) 고정화된 3차원 세포 또는 생체 조직을 상기 조성물로 1차 처리하는 단계; b) 투명화된 3차원 세포 또는 생체 조직을 면역염색하는 단계; 및 c) 면역염색된 3차원 세포 또는 생체 조직을 상기 조성물로 2차 처리하는 단계를 포함하는, 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지화를 동시에 진행하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 a) 단계는 35 내지 37℃에서 30분 내지 60분 동안 진행될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 c) 단계는 상온에서 90분 내지 120분 동안 진행될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 상온은 15℃ ~ 25℃의 온도일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 3차원 세포는 스페로이드 또는 오가노이드일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생체 조직은 뇌, 허파, 심장, 간, 신장, 소장 및 비장으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물은 특정 함량의 폴리에틸렌 글리콜 및 소듐 도데실 설페이트를 유효성분으로 포함함으로써 고가의 장비를 이용하지 않고 단순히 시약으로 3차원 세포 또는 생체 조직을 효과적으로 투명화시킬 수 있으며, 단백질 변성 등에 의해 조직 내 원하는 정보가 손실 또는 왜곡되지 않고, 생체 내 중요 정보(DNA, RNA, 단백질, 형광신호)가 유지될 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 조성물을 이용하는 경우 투명화된 조직을 이미징하기 위한 별도의 굴절율 맞춤 용액이 필요하지 않는바, 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지화를 동시에 진행할 수 있는 이점을 가진다.
도 1a 및 1b는 본 발명의 조성물을 이용하여 투명화시킨 3D 세포의 이미지를 현미경을 통해 측정한 결과이다.
도 2a 및 2b는 본 발명의 조성물을 이용하여 투명화시킨 3D 세포의 조직 면역염색 및 NucBlue™ Live Cell 염색을 통해 단백질 염색 및 세포 핵 염색을 확인한 결과이다.
본 발명은 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지 분석용 조성물로서, 상기 조성물은 65 ~ 75%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜 및 0.1 ~ 0.5%(w/v) 소듐 도데실 설페이트를 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 '폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)'은 물에 녹는 특징이 있으며 무색, 무취의 점성이 있는 액체이거나 고체의 형태를 지니고 산화에틸렌을 종합하여 얻을 수 있는 물질로서 하이드록시 알코올 중 하나이다. PEG는 분자 구조 내에 탄소와 수소가 있으며, 탄수-소수성, 산소-친수성 성분을 가지고 있어서 친수성 물질들과 잘 결합(침투, 혼합이 쉬움)할 수 있어서 다양한 곳에서 활용되고 있다. 생체 재료 관점에서 PEG는 반응성이 낮아 생체 재료 소재로 사용해도 안전한 물질이다. PEG는 분자량이 늘어남에 따라 액체보다는 고체로 변하며(녹는점과 끓는점 상승), 물과 유기용매에 대한 용해성은 감소한다. PEG에 붙는 숫자는 분자량을 나타낸다. 일반적으로, 분자량 20,000 g/mol 미만인 물질을 PEG로 지칭하는 반면 분자량 20,000 g/mol을 초과하면 PEO로 지칭한다.
본 발명에서 사용 가능한 폴리에틸렌 글리콜(PEG)는 200 내지 600의 분자량을 갖는 PEG일 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)는 PEG 400일 수 있다.
상기, PEG 400은 저분자량 등급의 폴리에틸렌 글리콜로 맑고 무색이며 점성이 있는 액체이다. PEG 400은 강한 친수성을 나타내며, 물, 아세톤, 알코올, 벤젠, 글리세린, 글리콜 및 방향족 탄화수소에 용해되고, 지방족 탄화수소에 약간 용해된다. PEG 400은 고무성형, 섬유, 도자기, 금속 가공의 조작, 윤활제, 접착제, 셀로판, 인쇄잉크, 연마재, 계면활성제 등의 용도로 사용되고 있다.
본 발명에서 상기 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 65 ~ 75%(w/v)의 농도로 사용될 수 있으며, 이러한 농도 조건에서 투명화가 빠르게 진행됨과 동시에 세포내 단백질이 크게 손상되지 않는 이점을 갖는다. 조성물에 포함되는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 농도가 65%(w/v) 미만인 경우 투명화시키는 효과가 감소하게 되며, 농도가 75%(w/v)를 초과하는 경우 세포내 단백질 손상을 야기할 수 있다.
특히, 본 발명의 하기 실시예에서는 조성물에 포함되는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 농도로 70%(w/v)를 사용함에 따라, 500 μm 이상의 크기를 갖는 스페로이드도 1시간 이내에 투명화시킬 수 있어, 단시간에 스페로이드의 단백질 분석이 가능하게 됨을 확인하였다(도 1b 참조).
본 발명에서 '소듐 도데실 설페이트(Sodium dodecyl sulfatel, SDS)'는 음이온성 계면활성제의 일종이다. 분자식은 NaC12H25SO4이며, 분자량은 288.38, 밀도는 1.01g/cm3, 녹는점은 206℃이다. 백색 또는 엷은 황색의 결정으로 약간 특이한 냄새가 난다.
본 발명에서 상기 소듐 도데실 설페이트(SDS)는 0.1 ~ 0.5%(w/v)의 농도로 사용될 수 있으며, 이러한 농도 조건에서 조직의 손상을 줄이고 안정적으로 지방만 제거하여 단백질과 핵산 등의 생분자를 보호할 수 이점을 갖는다. 조성물에 포함되는 소듐 도데실 설페이트(SDS)의 농도가 0.1%(w/v) 미만인 경우 지방 제거 효과가 감소하게 되며, 농도가 0.5%(w/v)를 초과하는 경우 세포내 단백질 손상을 야기할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 3차원 세포는 스페로이드 또는 오가노이드일 수 있다.
본 발명에서 '스페로이드(spheroid)'란 이차원적으로 자라는 세포주를 키워 삼차원적 구조를 이루게 한 것이 공처럼 생겼다 하여 붙여진 이름으로, '세포 스페로이드', '3차원 세포 응집체', '3차원 구형 세포집합체' 등으로 불릴 수 있다.
본 발명에서 '오가노이드(organoid)'란 장기(organ)에서 유래한 말로 체내 환경을 흉내 내어 실험실에서 키워낸 삼차원 줄기세포 배양물을 의미한다.
상기 오가노이드와 스페로이드는 모두 3차원으로 배양되는 세포로, 스페로이드는 흔히 암 세포주 또는 종양 생체 조직 절편에서 초저 부착 플레이트의 자유롭게 유동하는 세포 군집체로 형성되는 반면, 오가노이드는 매트리겔 같은 ECM 하이드로겔 기질 내에 포함된 조직줄기세포에서 유래한다는 점에서 차이점을 갖는다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 생체 조직은 뇌, 허파, 심장, 간, 신장, 소장 및 비장으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지 분석용 조성물은 65 ~ 75%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜 및 0.1 ~ 0.5%(w/v) 소듐 도데실 설페이트을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 70%(w/v)의 폴리에틸렌 글리콜 및 0.5%(w/v)의 소듐 도데실 설페이트를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 a) 고정화된 3차원 세포 또는 생체 조직을 상기 조성물로 1차 처리하는 단계; b) 투명화된 3차원 세포 또는 생체 조직을 면역염색하는 단계; 및 c) 면역염색된 3차원 세포 또는 생체 조직을 상기 조성물로 2차 처리하는 단계를 포함하는, 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지화를 동시에 진행하는 방법을 제공한다.
본 발명의 a) 단계는 3차원 세포 또는 생체 조직을 투명화시키는 단계로서, 자세하게는 고정화된 3차원 세포 또는 생체 조직에 70%(w/v)의 폴리에틸렌 글리콜 및 0.5%(w/v)의 소듐 도데실 설페이트를 포함하는 조성물을 처리하여 일정시간 반응시킴으로써 상기 3차원 세포 또는 생체 조직을 투명화시키는 단계이다.
상기 a) 단계는 35 내지 37℃에서 30분 내지 60분 동안 진행될 수 있으며, 바람직하게는 37℃에서 30분 동안 진행될 수 있다.
본 발명의 b) 단계는 투명화된 3차원 세포 또는 생체 조직을 면역염색을 진행하는 단계로서, 자세하게는 상기 a) 단계를 거쳐 투명화된 3차원 세포 또는 생체 조직을 세척하고, 이후 형광분석을 위하여 1% BSA에 고정해준 후 1xPBS, 0.1% Triton X-100에 1차 항체를 넣고 반응시킨 다음, 2차 항체를 처리하여 반응시키는 단계이다.
본 발명의 c) 단계는 면역염색된 3차원 세포 또는 생체 조직을 이미지화하는 단계로서, 자세하게는 상기 b) 단계를 거쳐 면역염색된 3차원 세포 또는 생체 조직을 아가로오스 젤로 코팅 처리한 후 70%(w/v)의 폴리에틸렌 글리콜 및 0.5%(w/v)의 소듐 도데실 설페이트를 포함하는 조성물로 2차 처리하여 일정시간 반응시킴으로써 조직 샘플의 투명화도를 더욱 높임과 동시에, 조직 샘플과 대물렌즈의 굴절률을 맞추는 단계이다.
상기 c) 단계는 상온에서 90분 내지 120분 동안 진행될 수 있으며, 바람직하게는 15℃ ~ 25℃ 온도의 상온에서 60분 동안 진행될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 3차원 세포는 스페로이드 또는 오가노이드일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 생체 조직은 뇌, 허파, 심장, 간, 신장, 소장 및 비장으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
재료 준비
폴리에틸렌 글리콜 400 (Polyethylene glycol 400)은 Sigma-Aldrich에서 구입하였고; SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)는 Sigma-Aldrich에서 구입하였으며; PBS (Phosphate buffered saline)는 Gibco에서 구입하였고; 아가로오스 (Agarose)는 Invitrogen에서 구입하였으며; 트리톤 X-100 (Triton X-100)은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.
1차 항체로 사용한 VE-cadherin, α-SMA 와 2차 항체로 사용한 Anti-Rabbit (Alexa Fluor
Figure 112022074472811-pat00001
488), Anti-Mouse (Alexa Fluor647) 그리고 핵 염색을 위해 사용한 DAPI등은 Abcam에서 구매하였다. Live cell Stain (NucBlue™ Live ReadyProbes™ Reagent, Hoechst 33342)는 Invitrogen에서 구입하였다.
실험에 사용된 3D 세포는 사람 정상 기관지 상피세포인 BEAS-2B 세포 (Human lung epithelial cells, ATCC, Manassas,VA)를 직접 스페로이드 형태로 배양하여 사용하였다. 자세하게는, 18%(w/v) poloxamer 407 및 0.5%(w/v) FBS(Fetal bovine serum)를 증류수에 녹여 혼합 용액을 제조하였으며, 상기 혼합 용액을 2℃에서 하룻동안 배양(shaking incubation)하였다. 겔-졸 반응의 유지를 위해 용액은 차갑게 유지하고, 상온에서 24 웰(well) 세포 배양 플레이트에 10μl 씩 돔 형태로 떨어뜨려 겔(gel) 상태로 변환시켰다. 상온에서 겔(gel) 형태로 변한 용액 안에 준비된 세포(BEAS-2B cells)를 5 μl씩 주입하였다. 그 후 1ml DMEM을 파이펫에 넣어 플레이트 벽면에 조심스럽게 넣어주었다. 37℃, 5% CO2 조건에서 하루동안 배양하여 스페로이드 형태의 3D 세포를 수득하였다.
<실시예 1>
본 발명의 생체 조직 투명화 및 이미지 분석용 조성물 제조
본 발명의 생체 조직 투명화 및 이미지 분석용 조성물은 70%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜 400 및 0.5%(w/v) SDS를 증류수에 녹여 제조하였다. 37℃에서 30분 동안 자기 교반기에서 혼합 용액을 교반하였고 제조된 조성물은 37℃서 보관하며 실험하였다.
<실시예 2>
본 발명의 생체 조직 투명화 및 이미지 분석용 조성물을 이용한 조직 투명화
<2-1> 3D 세포(스페로이드) 고정화
3D 세포를 포르말린에 5시간 이상 고정시킨 후 포르말린을 제거하고 증류수로 3회 세척해주었다.
<2-2> 3D 세포(스페로이드)의 투명화
본 발명의 조성물의 조직 투명화 기능을 확인하기 위하여, 고정화된 3D 세포(스페로이드)를 24 웰 플레이트에 각각 분주한 후 상기 <실시예 1>을 통해 제조된 조성물을 웰(well) 당 1ml씩 넣어준 후 1시간 동안 37℃에서 천천히 교반하면서 인큐베이션하였다. 투명화 전 및 투명화 후의 3D 세포는 light-and fluorescence-microscopy systems (AxioVert40 CFL, AxioCamMRC, and AxioVision LE image system; Carl Zeiss)를 이용하여 측정하였다(4x 10x 20x 렌즈 배율로 측정함).
그 결과 도 1a에서 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 1>을 통해 제조된 조성물을 이용하여 투명화시킨 3D 세포(스페로이드)의 경우 배율로 보았을 때 현미경을 통해 빛이 잘 통과되어 높은 비율에서도 세포 내부가 잘 보이는 것을 확인할 수 있었다.
특히, 도 1b에서 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 1>을 통해 제조된 조성물을 이용하는 경우 1000 μm 이상의 크기를 갖는 스페로이드의 경우도 1시간 이내에 빠르게 투명화되는 것을 확인하였다. 스페로이드의 크기 분석은 ImageJ (U.S. National Institute of Health, USA) 소프트웨어용으로 개발된 프로그램을 사용하여 이미지를 분석하였다.
<실시예 3>
본 발명의 생체 조직 투명화 및 이미지 분석용 조성물을 이용한 조직 면역염색 & 세포 핵 염색
상기 <실시예 2>를 통해 투명해진 3D 세포(스페로이드)를 1% PBS(Phosphate buffered saline)에 3회 세척해준 후 형광분석을 위하여 1% BSA(Bovine serum albumin), 1xPBS, 0.1% Triton X-100를 혼합한 Blocking용액에 3D 세포가 완전히 잠길 정도의 농도로 넣어 주고 37℃에서 2시간동안 인큐베이션하였다. 그 후 앞서 만든 Blocking 용액에 1차 항체 VE-cadherin, α-SMA 를 1:100으로 희석시켜 넣고 4℃에서 4시간 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. 이후, PBS로 3회 세척해준 후 2차 항체 Anti-Rabbit (Alexa Fluor488), Anti-Mouse (Alexa Fluor647)를 PBS에 넣어 실온에서 1시간 이상 교반하면서 인큐베이션하였다. PBS로 3회 세척한 후 DAPI를 0.2 μg/ml로 넣고 30분 동안 상온에서 인큐베이션하였다. 그 후 다시 PBS로 3회 세척한 후 다시 상기 <실시예 1>을 통해 제조된 조성물을 넣어 주고, 조직이 투명해져 보이지 않기 때문에 1% 아가로스를 3D 세포가 덮이도록 한방울 떨어뜨려 3D 세포의 손상을 막고 취급하기 용이하게 하였다. 그 후 다시 상기 <실시예 1>을 통해 제조된 조성물을 넣어 주고 30분 동안 상온에서 반응시킨 후 light-and fluorescence-microscopy systems (AxioVert40 CFL, AxioCamMRC, and AxioVision LE image system; Carl Zeiss)를 이용하여 측정하였다.
또한, 상기 <실시예 2>를 통해 투명해진 3D 세포(스페로이드)를 PBS로 3회 세척하고 Live cell NucBlue™ Live ReadyProbes™ Reagent( Hoechst 33342)을 이용하여 PBS 1ml에 2방울의 용액을 넣어 3D 세포가 완전히 잠기도록 용액을 넣어준 후 30분 동안 37℃에서 반응 시킨 후 PBS로 2회 세척하고 1% 아가로스를 3D 세포가 덮이도록 한방울 떨어뜨려 3D 세포의 손상을 막고 취급하기 용이하게 하였다. 그 후 다시 조직 투명화 조성물을 넣어 주고 30분 동안 상온에서 반응 시킨 후 light-and fluorescence-microscopy systems (AxioVert40 CFL, AxioCamMRC, and AxioVision LE image system; Carl Zeiss)를 이용하여 측정하였다.
그 결과 본 투명화 과정 이후에 단백질 염색 수행이 가능하다는 것을 확인하였으며(도 2a 참조), 세포 생존율 측정을 통해 파랑색으로 생존한 새포들이 잘 염색되어 보이는 것을 통해 세포내 핵의 손상이 없고 세포내 핵의 염색이 명확히 됨을 확인하였다(도 2b 참조).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (10)

  1. 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지 분석용 조성물로서,
    상기 조성물은 65 ~ 75%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜 및 0.1 ~ 0.5%(w/v) 소듐 도데실 설페이트를 유효성분으로 포함하고,
    상기 조성물은 전기영동을 통한 별도의 지질 제거 과정 없이도 3차원 세포 또는 생체 조직을 투명화시킬 수 있는 것을 특징으로 하는, 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지 분석용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜 400인 것을 특징으로 하는, 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지 분석용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 3차원 세포는 스페로이드 또는 오가노이드인 것을 특징으로 하는, 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지 분석용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 생체 조직은 뇌, 허파, 심장, 간, 신장, 소장 및 비장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지 분석용 조성물.
  5. a) 고정화된 3차원 세포 또는 생체 조직을 제1항의 조성물로 1차 처리하는 단계;
    b) 투명화된 3차원 세포 또는 생체 조직을 면역염색하는 단계; 및
    c) 면역염색된 3차원 세포 또는 생체 조직을 제1항의 조성물로 2차 처리하는 단계를 포함하는, 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지화를 동시에 진행하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 a) 단계는 35℃ 내지 37℃에서 30분 내지 60분 동안 진행되는 것을 특징으로 하는, 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지화를 동시에 진행하는 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 c) 단계는 상온에서 90분 내지 120분 동안 진행되는 것을 특징으로 하는, 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지화를 동시에 진행하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 상온은 15℃ ~ 25℃의 온도인 것을 특징으로 하는, 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지화를 동시에 진행하는 방법.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 3차원 세포는 스페로이드 또는 오가노이드인 것을 특징으로 하는, 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지화를 동시에 진행하는 방법.
  10. 제5항에 있어서,
    상기 생체 조직은 뇌, 허파, 심장, 간, 신장, 소장 및 비장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지화를 동시에 진행하는 방법.
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