JP7281230B2 - 光透過性に優れた生物材料を調製するための組成物およびその利用 - Google Patents
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Description
(A)高い脂質除去能を有する化合物
(B)N,N,N’,N’-テトラキス(2-ヒドロキシプロピル)エチレンジアミンよりも高い脱色活性を示す化合物
(C)EDTAと酸と塩基との組み合わせ
(D)水に対して60wt%以上溶解し、且つ、60~80wt%の範囲内の少なくとも1点の濃度の水溶液における屈折率が1.47~1.50の範囲内である化合物
(E)尿素よりも高い膨潤活性を示す化合物
を含んでいる溶液であることを特徴とする。
本発明は、光透過性に優れた生物材料を調製するための組成物を提供する。本発明に係る組成物は、後述の(A)~(E)のうちの少なくとも1つ(1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ)を含んでいる溶液であることを特徴とする。
・蛍光タンパク質、蛍光物質のシグナルの消失が最小限に抑制される。
・多サンプル(数十個~数百個)を同時に並行して処理することができる。
・シート照明顕微鏡との併用が実現する程度に高度な透明化が実現する。
・組織領域の構築に対する影響を最小限に抑制することができる。
・成体のような、大きく且つ多様な組織からなるサンプルに対しても、効果的に透明化を実現する。
本発明に係る組成物に含まれ得る(A)の化合物は、脂質除去能を有する化合物である。(A)の化合物は、一例において、高い脂質除去能を有する。
本発明に係る組成物に含まれ得る(B)の化合物は、生体色素脱色能を有する化合物である。(B)の化合物は、一例において、高い生体色素脱色能を有する。
本発明に係る組成物に含まれ得る(C)の化合物は、脱灰能を有する化合物である。(C)の化合物は、一例において、高い脱灰能を有する。
本発明に係る組成物に含まれ得る(D)の化合物は、屈折率調整能を有する化合物である。(D)の化合物は、一例において、高い屈折率調整能を有する。
本発明に係る組成物に含まれ得る(E)の化合物は、組織膨潤能を有する化合物である。(E)の化合物は、一例において、高い組織膨潤能を有する。
1つの組成物中に(A)~(E)のうちの複数が含まれていてもよい。
本発明に係る組成物に使用される溶媒の種類は、上述した有効成分を溶解し得る限り特に限定されないが、水を主溶媒として用いることが好ましく、水のみを溶媒として用いることが特に好ましい。なお、本発明において、「水を主溶媒として用いる」とは、使用される全溶媒に占める水の体積の割合が他の溶媒と比較して最も多いことを指し、好ましくは使用される全溶媒の体積の合計の50%を超え100%以下の量の水を用いることを指す。また、水を主溶媒として用いて調製された本発明に係る組成物を、水溶液としての試薬と称する。
1)本発明に係る組成物の有効成分は水への溶解性に優れているため、本発明に係る組成物の調製が容易かつ低コストとなる;
2)有機溶媒を主溶媒として用いる場合と比較して、透明化処理時に処理対象となる生物材料の脱水を伴わない。そのため、生物材料が収縮するという問題を抑制可能となる;
3)有機溶媒を主溶媒として用いる場合と比較して、蛍光タンパク質に損傷を与える可能性が著しく低減される。そのため、透明化処理を受けた生物材料を、蛍光タンパク質を用いて観察可能となる;
4)固定化された材料に限定されず、生材料の透明化処理に適用可能となる;
5)透明化処理が可逆的となり、透明化処理後の生体試料を必要に応じて透明化処理前の状態に戻すことができる;
6)有機溶媒を主溶剤として用いる場合と比較して、取り扱いの安全性がより高くなる。
本発明に係る組成物において、溶液は、必要に応じて、さらなる任意成分を含んでいてもよい。任意成分としては、例えば、pH調整剤、および浸透圧調整剤等が挙げられる。
本発明は、光透過性に優れた生物材料を調製する方法を提供する。本発明に係る方法は、上述の(A)~(E)のうちの少なくとも1つ(1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ)を含んでいる溶液を、生物材料に浸潤させる工程(浸潤工程)を含むことを特徴とする。溶液については、上記で説明したとおりである。
浸潤工程では、(A)の化合物による脱脂、(B)の化合物による脱色、(C)の化合物による脱灰、(D)の化合物による屈折率調整、および(E)の化合物による膨潤のうちの少なくとも1つが行われる。すなわち、本発明に係る方法は、(A)の化合物による脱脂工程、(B)の化合物による脱色工程、(C)の化合物による脱灰工程、(D)の化合物による屈折率調整工程、および(E)の化合物による膨潤工程のうちの少なくとも1つ(1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ)を含む。複数の工程を含む場合、それらの工程は、別々に行われてもよいし、2つ以上が同時に行われてもよい。
(1)脱脂工程、脱色工程
(2)脱灰工程、膨潤工程
(3)屈折率調整工程
(1)において、脱脂工程と脱色工程とは別々に行ってもよいし、同時に行ってもよい。一例において、脱脂工程に用いる(A)の化合物と脱色工程に用いる(B)の化合物とが部分的にまたは全部が共通しており、同時に行うことができる。あるいは、(A)の化合物と(B)の化合物とを混合して同時に行ってもよい。また、別々に行う場合には、どちらを先に行ってもよいが、脱脂工程を先に行うことが好ましい。(2)において、脱灰工程と膨潤工程との順序は特に限定されず、どちらを先に行ってもよい。
本発明に係る方法では、任意のタイミングで、生物材料を洗浄する工程(洗浄工程)を行ってもよい。洗浄工程は、例えば、浸潤工程を開始する前、各浸潤工程の合間、および/または浸潤工程を終了した後等のタイミングで行うことができる。洗浄は、例えば、PBSまたは蒸留水等を用いて行えばよい。また、洗浄は、各洗浄工程につき、例えば、1~5回行えばよい。
本発明はまた、光透過性に優れた生物材料を調製するための組成物を含むキットを提供する。
1619種類の水溶性化合物のライブラリを対象に、透明化に求められる(A)脂質除去能、(B)生体色素の脱色能、(C)脱灰能、(D)屈折率調整能、および(E)組織膨潤能の5つのパラメータのそれぞれについて、良好な化合物をハイスループットに評価するための実験手法を開発した。
文献:Susaki et al., Cell, 157, 726-739,2014.に記載の固定脳組織可溶化アッセイ法を用いて、1619種類の水溶性化合物のライブラリから脂質除去能を有する化合物をスクリーニングした。
ウシ凝固血液に対して各種化合物水溶液を混合後、上清に回収されたヘムの吸光度を計測することで脱色能を評価するハイスループットなスクリーニング系を構築した。これを用いて、1619種類の水溶性化合物のライブラリから生体色素脱色能を有する化合物をスクリーニングした。
1619種類の水溶性化合物のライブラリから脱灰活性を有する化合物を包括的にスクリーニングするために、骨組織の主成分であるハイドロキシアパタイトを用いたスクリーニング系を構築した。ハイドロキシアパタイト(200mg/mL)を40v/v%グリセロールに懸濁させて各種化合物水溶液に混合後、濁度を計測した。具体的には、200mg/mLのハイドロキシアパタイト40v/v%グリセロール懸濁液を96wellプレートリーダーに20μLずつ分注し、各種試薬を130μLずつ加えて37℃で終夜振盪および撹拌した。その後、OD600を計測することで脱灰活性の評価を行った。水で処理したときのOD600の値をScore1.0としたときの各種化合物水溶液のScore値を算出した。Score値が0に近い程、脱灰活性が強いケミカルであることを示している。脱灰は一般的に塩酸および硝酸などの強酸によって速やかに進行することが知られているが、これらの条件下では蛍光タンパク質のシグナルを観察することはできない。一方、中性域のEDTAは蛍光タンパク質のシグナルを保持することはできるものの強酸に比べて脱灰能が弱く、長時間の脱灰操作が必要となる。本発明において、中性域のEDTAと組み合わせて飛躍的に脱灰活性を示す溶液の開発を行った。スクリーニングの結果、pHが2.0を下回るとほとんどの化合物においてScoreが0になった。そこで、pHが2.0以上の化合物群を構造式の特徴毎にソートしたリストを表4に示した。これらの化合物のグループ中、Score値の低い化合物を枠囲みで示した。
一般に水溶液の屈折率は溶質の濃度に依存して上昇することが知られており、個々の試薬により単位重量当たりの屈折率は異なっている。したがって、高屈折率水溶液を調製するために求められる性質は、(1)水溶性が極めて高いこと、(2)低濃度の水溶液で屈折率が高い溶剤であること、の2点である。1619種類の水溶性化合物のライブラリから(2)に該当する試薬を網羅的に探索するために、各種10wt%化合物水溶液の589nmにおける屈折率を測定し、屈折率の高い化合物をスクリーニングした。さらにその中から水溶性の高い化合物を選別するために、60~80wt%水溶液を調製し、屈折率が1.47~1.50の化合物群を同定した(表3)。
組織に対して膨潤を引き起こすことで、組織の透明度を上げることができることが一般に知られている。脳の膨潤収縮とゼラチンの膨潤収縮の挙動とが高い相関を示すことを確認し、ゼラチンを用いるスクリーニング系を確立した。9%のゼラチン水溶液と0.8%パラホルムアルデヒド溶液とを混合し、混合された溶液を96ウェルプレート上に200μL分注したのちに4℃で16時間インキュベートした。固まったゼラチンプレートに対して、1619種類の水溶性化合物のライブラリ各種10wt%化合物水溶液を170μL分注し、室温で72時間インキュベートを行った。その後ゼラチンプレートを、3回ほど純水を用いて洗浄し、水をよくふき取り、水の吸収波長の1つである975nmの吸光度を測定した。1619種類の水溶性化合物のライブラリから尿素の膨潤活性をScore 1として尿素を超える化合物群をスクリーニングした。その結果、膨潤活性をもつ水溶性化合物が同定された(図20)。
(1.マウス肝臓およびヒト脳白質を含む組織の透明化)
マウス肝臓およびヒト脳白質を含む組織の透明化は、例えば、以下の手順で行うことができる。
(1)4%パラホルムアルデヒド溶液で還流固定したマウス肝臓、またはホルマリン固定したヒト脳組織を、PBSに浸漬する。
(2)Permeabilization solution(Sol. PE:10wt% 1,3-ビス(アミノメチル)シクロヘキサン、10 wt% ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムまたはドデシル硫酸ナトリウム)に37℃で2~4日間ほど浸漬する。
(3)PBSで数回、各数時間ずつ洗浄する。
(4)Clearing solution(Sol. CL: 22.5wt% スクロース、22.5wt% アンチピリン、10wt% トリエタノールアミン、25% 尿素)に50℃で2~4日間ほど浸漬する。
(5)必要に応じて、再度PBSで洗浄し、保存する。
マウス脾臓の脱色は、例えば、以下の手順で行うことができる。
(1)4%パラホルムアルデヒド溶液で還流固定した脾臓組織をPBSに浸漬する。
(2)10wt% ♯0441(ベンゼトニウムクロリド)、♯0484(1-(3-アミノプロピル)イミダゾール)、♯0651(デシルジメチル(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド分子内塩)、♯0938(1-エチルイミダゾール)、または♯1283(N-メチルニコチンアミド)に37℃で2~4日間ほど浸漬する。対照として♯10(N,N,N’,N’-テトラキス(2-ヒドロキシプロピル)エチレンジアミン)、またはCUBIC-1、PBSに37℃で2~4日間ほど浸漬したものも作製する。(3)脱色された脾臓を撮影する。上清に溶出されたヘムを420nmの吸収を測定することで定量する。
マウス脳組織の透明化は、例えば、以下の手順で行うことができる。
(1)4%パラホルムアルデヒド溶液で還流固定したマウス脳組織をPBSに浸漬する。半脳に切り分ける。
(2)Brain delipidation solution(10wt%N-ブチルジエタノールアミン、10wt% Triton X-100)に37℃で2~4日間ほど浸漬する。
(3)PBSで数回、各数時間ずつ洗浄する。
(4)Clearing solution(Sol. CL: 22.5wt% スクロース、22.5wt% アンチピリン、10wt% トリエタノールアミン、25% 尿素)に37℃で1日間ほど浸漬する。
(5)必要に応じて、再度PBSで洗浄し、保存する。
脱脂処理組織の屈折率調整は、例えば、以下の手順で行うことができる。
(1)4%パラホルムアルデヒド溶液で還流固定したマウス脳組織を4%パラホルムアルデヒド溶液で後固定した後、PBSに浸漬する。半脳に切り分ける。
(2)切り分けられた脳組織をCUBIC-1に37℃で3~5日間ほど浸漬する。
(3)PBSに1日間ほど浸漬する。
(4)70wt% ♯0389(N-ベンジルエタノールアミン)、60wt% ♯0640(アンチピリン)、または70wt% ♯0788(N,N-ジメチルベンズアミド)に室温で1日間ほど浸漬する。
マウス各種臓器(脳、心臓、肺、肝臓および腎臓)の透明化は、例えば、以下の手順で行うことができる。
(1)4%パラホルムアルデヒド溶液で還流固定したマウス臓器を摘出し、4℃で終夜4%パラホルムアルデヒド溶液で後固定する。
(2)PBSで数回、各数時間ずつ洗浄する。
(3)Permeabilization CUBIC-L solution(Sol. PE CUBIC-L:10wt% N-ブチルジエタノールアミン、10 wt%Triton X-100)に37℃で2~4日間ほど浸漬する。
(4)PBSで数回、各数時間ずつ洗浄する。
(5)蒸留水で1/2倍希釈したClearing CUBIC-R solution(Sol. CL CUBIC-R: 46wt% アンチピリン、30wt% ニコチンアミド)に室温で終夜浸漬する。
(6)原液Sol. CL CUBIC-Rに2日間浸漬する。
マウス個体全身の透明化は、例えば、以下の手順で行うことができる。
(1)4%パラホルムアルデヒド溶液で還流固定した後、Sol. PE CUBIC-Lを100~200mL全身に灌流させる。
(2)Sol. PE CUBIC-Lに37℃で7日間浸漬する。この間、2日に1回の液交換を行う。
(3)PBSで数回、各数時間ずつ洗浄し、PBSに室温で終夜浸漬する。
(4)蒸留水で1/2倍希釈したSol. CL CUBIC-Rに室温で終夜浸漬する。
(5)原液Sol. CL CUBIC-Rに2日間浸漬する。
マウス背骨の透明化は、例えば、以下の手順で行うことができる。
(1)4%パラホルムアルデヒド溶液で還流固定したマウス背骨を摘出し、4℃で終夜4%パラホルムアルデヒド溶液で後固定する。
(2)PBSで数回、各数時間ずつ洗浄する。
(3)Sol. PE CUBIC-Lに37℃で3日間浸漬する。
(4)PBSで数回、各数時間ずつ洗浄する。
(5)Decalcification CUBIC-B solution(Sol. DC CUBIC-B:10wt% EDTA、15wt% イミダゾール)に37℃で6日間浸漬する。
(6)PBSで数回、各数時間ずつ洗浄する。
(7)Sol. PE CUBIC-Lに37℃で3日間浸漬する。
(8)PBSで数回、各数時間ずつ洗浄する。
(9)蒸留水で1/2倍希釈したSol. CL CUBIC-Rに室温で終夜浸漬する。
(10)原液Sol. CL CUBIC-Rに2日間浸漬する。
(1)ホルマリン固定したヒト組織をPBSに浸漬し、数回、各数時間ずつ洗浄し、室温で終夜PBSに浸漬する。
(2)Sol. PEに37℃で5~10日間ほど浸漬する。
(3)PBSで数回、各数時間ずつ洗浄し、PBSに室温で終夜浸漬する。
(4)蒸留水で1/2倍希釈したSol. CL CUBIC-Rに室温で終夜浸漬する。
(5)原液Sol. CL CUBIC-Rに2日間浸漬する。
(1)ホルマリン固定したヒト組織をPBSに浸漬し、数回、各数時間ずつ洗浄し、室温で終夜PBSに浸漬する。
(2)Sol. PE CUBIC-HBL solution(Sol. PE CUBIC-HBL:10wt% N-ブチルジエタノールアミン、10wt%Triton X-100、15wt% イミダゾール)に37℃で5~10日間ほど浸漬する。
(3)PBSで数回、各数時間ずつ洗浄し、PBSに室温で終夜浸漬する。
(4)蒸留水で1/2倍希釈したSol. CL CUBIC-Rに室温で終夜浸漬する。
(5)原液Sol. CL CUBIC-Rに2日間浸漬する。
(1)4%パラホルムアルデヒド溶液で還流固定したマーモセット脳を摘出し、4℃で終夜4%パラホルムアルデヒド溶液で後固定する。
(2)PBSで数回、各数時間ずつ洗浄する。
(3)Sol. PE CUBIC-Lに37℃で21日間ほど浸漬する。この間、2日に1回の液交換を行う。
(4)0.01%アジ化ナトリウム入りPBS(以下、AzidoPBS)に室温で1週間浸漬する。この間、毎日液交換を行う。
(5)10μg/mLプロピジウムヨージドおよび1.5M NaCl含有PBSに37℃で12日間浸漬する。
(6)AzidoPBSに2日間浸漬し、洗浄する。この間、半日に1回の液交換を行う。
(7)蒸留水で1/2倍希釈したSol. CL CUBIC-Rに室温で終夜浸漬する。
(8)原液Sol. CL CUBIC-Rに4日間浸漬する。
(9)AzidoPBSに浸漬し、2日間洗浄する。この間、半日に1回の液交換を行う。
(10)10wt%イミダゾール水溶液に室温で2日間浸漬する。この間、半日に1回の液交換を行う。
(11)蒸留水で1/2倍希釈した1wt%#0414含むSol. CL CUBIC-R(以下、Sol. CL CUBIC-R2)に室温で4日間浸漬する。
(12)Sol. CL CUBIC-R2に室温で7日間浸漬する。途中1回の液交換を行う。
(13)AzidoPBSに2日間浸漬し、洗浄する。この間、半日に1回の液交換を行う。(14)Sol. PE CUBIC-Lに室温で3日間浸漬する。その後、37℃で2週間浸漬し、さらに45℃で1週間浸漬する。一連の工程において、2日間に1回の液交換を行う。
(15)AzidoPBSに2日間浸漬し、洗浄する。この間、半日に1回の液交換を行う。(16)10μg/mLプロピジウムヨージドおよび1.5M NaCl含有PBSに37℃で7日間浸漬する。
(17)AzidoPBSに2日間浸漬し、洗浄する。この間、半日に1回の液交換を行う。(18)10wt%イミダゾール水溶液に室温で2日間浸漬する。この間、半日に1回の液交換を行う。
(19)蒸留水で1/2倍希釈したSol. CL CUBIC-R2に室温で3日間浸漬する。
(20)Sol. CL CUBIC-R2に室温で7日間浸漬する。途中1回の液交換を行う。
Claims (3)
- N-ブチルジエタノールアミンおよびTriton(登録商標)X-100を含んでいる溶液(ただし尿素および尿素誘導体を含まない)であることを特徴とする、光透過性に優れた生物材料を調製するための
組成物。 - 光透過性に優れた生物材料を調製する方法であって、
N-ブチルジエタノールアミンおよびTriton(登録商標)X-100を含んでいる溶液(ただし尿素および尿素誘導体を含まない)を、生物材料に浸潤させる工程を含むことを特徴とする方法。 - N-ブチルジエタノールアミンおよびTriton(登録商標)X-100を含んでいる溶液(ただし尿素および尿素誘導体を含まない)が浸潤していることを特徴とする、光透過性に優れた生物材料。
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