JP2022168842A - 生物材料を透明化する方法およびキット - Google Patents

生物材料を透明化する方法およびキット Download PDF

Info

Publication number
JP2022168842A
JP2022168842A JP2022068424A JP2022068424A JP2022168842A JP 2022168842 A JP2022168842 A JP 2022168842A JP 2022068424 A JP2022068424 A JP 2022068424A JP 2022068424 A JP2022068424 A JP 2022068424A JP 2022168842 A JP2022168842 A JP 2022168842A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
reagent
biological material
reagents
less
sphere
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022068424A
Other languages
English (en)
Inventor
哲朗 成相
Tetsuro Narai
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sumitomo Chemical Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Chemical Co Ltd filed Critical Sumitomo Chemical Co Ltd
Publication of JP2022168842A publication Critical patent/JP2022168842A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

【課題】従来技術よりも、透明化の程度および／または迅速性が向上している生物材料を透明化する方法を提供する。【解決手段】本発明の一態様に係る方法は、(i)試薬（１）および試薬（２）、(ii)試薬（２）および下記試薬（３）、または、(iii)試薬（１）、試薬（２）および試薬（３）のいずれかの組合せを含んでいる混合液に、生物材料を浸漬する工程を含む。試薬（１）～（３）は、それぞれ、ＨＳＰ空間における特定の球（１）～（３）の内部または表面に位置する１種類以上の試薬である。【選択図】図２

Description

本発明は、生物材料を透明化する方法およびキットに関する。
生物材料の光透過性を向上させ、当該生物材料を透明化する技術が知られている。この技術は、生物材料内における遺伝子発現や物質の局在など、高度な観察に応用されている。今日まで、生物材料を透明化するための様々な試薬、装置、処理方法などが提案されている。
例えば特許文献１は、(i)アミノアルコールと、(ii)尿素および尿素誘導体からなる群より選択される少なくとも一種の化合物と、(iii)非イオン性界面活性剤とを含んでいる第一溶液を、生物材料に浸潤させる第一浸潤工程を包含する、光透過性に優れた生物材料を調製する方法を開示している。
国際公開第２０１５／０２２８８３号パンフレット
しかしながら、上述のような従来技術は、透明化の程度および迅速性に関して、改善の余地が残されていた。
本発明の一態様は、従来技術よりも透明化の程度が向上している生物材料を透明化する方法を提供することを目的とする。本発明の他の態様は、従来技術よりも透明化の迅速性が向上している生物材料を透明化する方法を提供することを目的とする。
本発明者らが鋭意検討したところ、生体材料を浸漬する試薬のハンセン溶解度パラメータが、上記の課題を解決する上で重要になることを見出した。本発明は、以下の構成を包含している。
＜１＞
生物材料を透明化する方法であって、
(i)下記試薬（１）および下記試薬（２）
(ii)下記試薬（２）および下記試薬（３）
(iii)下記試薬（１）、下記試薬（２）および下記試薬（３）
のいずれかの組合せを含んでいる混合液に、上記生物材料を浸漬する工程を含む、方法：試薬（１）：ＨＳＰ空間において、点（δＤ＝１８．９７，δＰ＝１．６１，δＨ＝１３．９２）を中心とし、半径が５．７である球（１）の内部または表面に位置する１種類以上の試薬；
試薬（２）：ＨＳＰ空間において、点（δＤ＝１７．７７，δＰ＝１４．０８，δＨ＝７．５７）を中心とし、半径が３．８である球（２）の内部または表面に位置する１種類以上の試薬；
試薬（３）：ＨＳＰ空間において、点（δＤ＝１６．２６，δＰ＝８．８７，δＨ＝２３．９６）を中心とし、半径が４．８である球（２）の内部または表面に位置する１種類以上の試薬。
＜２＞
上記試薬（１）、上記試薬（２）および上記試薬（３）を含んでいる混合液に、上記生物材料を浸漬する工程を含む、＜１＞に記載の方法。
＜３＞
上記生物材料は、がん組織である、＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜４＞
生物材料を透明化するためのキットであって、
(i)下記試薬（１）および下記試薬（２）
(ii)下記試薬（２）および下記試薬（３）
(iii)下記試薬（１）、下記試薬（２）および下記試薬（３）
のいずれかの組合せを備えている、キット：
試薬（１）：ＨＳＰ空間において、点（δＤ＝１８．９７，δＰ＝１．６１，δＨ＝１３．９２）を中心とし、半径が５．７である球（１）の内部または表面に位置する１種類以上の試薬；
試薬（２）：ＨＳＰ空間において、点（δＤ＝１７．７７，δＰ＝１４．０８，δＨ＝７．５７）を中心とし、半径が３．８である球（２）の内部または表面に位置する１種類以上の試薬；
試薬（３）：ＨＳＰ空間において、点（δＤ＝１６．２６，δＰ＝８．８７，δＨ＝２３．９６）を中心とし、半径が４．８である球（２）の内部または表面に位置する１種類以上の試薬。
＜５＞
透明化された生物材料の製造方法であって、
＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の方法によって生物材料を透明化する工程を含む、
方法。
＜６＞
生物材料の検査を補助する方法であって、
＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の方法で生物材料を透明化する工程と、
上記生物材料に含まれる標的に可視化処理を施す工程と、
を含み、
上記生物材料は、生体から採取された生物材料であるか、または、ヒト以外の生物に由来する生物材料である、方法。
＜７＞
生物材料の検査を補助する方法であって、
＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の方法で生物材料を透明化する工程と、
上記生物材料に含まれる標的に可視化処理を施す工程と、
生物材料を解析する工程と、
を含み、
上記生物材料は、生体から採取された生物材料であるか、または、ヒト以外の生物に由来する生物材料である、方法。
本発明の一態様によれば、従来技術よりも透明化の程度が向上している生物材料を透明化する方法が提供される。本発明の他の態様によれば、従来技術よりも透明化の迅速性が向上している生物材料を透明化する方法が提供される。
本発明者らが透明化作用を検討した試薬が、ＨＳＰ空間においてどこに位置しているかを表す概念図である。球状の点は、透明化作用の高い試薬を表す。立方体の点は、透明化作用の低い試薬を表す。 ＨＳＰ空間における球（１）、球（２）および球（３）を表す概念図である。 本発明の一実施形態に係る方法によって透明化したヒトのがん組織片の、経時的変化を表す図である。 従来技術によって透明化したヒトのがん組織片の、経時的変化を表す図である。 本発明の一実施形態に係る方法によって透明化したヒトのがん細胞塊の、経時的変化を表す図である。 従来技術によって透明化したヒトのがん細胞塊の、経時的変化を表す図である。 透明化したヒトのがん細胞塊を、さらに血管平滑筋マーカーで染色した様子を表す図である。 本発明の一実施形態に係る方法および従来技術によって透明化した、ヒトの乳がん組織を表す図である。 透明化したヒトの乳がん組織を、さらにＫｉ６７抗体で染色した様子を表す図である。 本発明の一実施形態に係る方法または従来技術によって透明化した、マウスの脳を表す図である。 本発明の一実施形態に係る方法または従来技術によって透明化した、マウスの心臓を表す図である。 本発明の一実施形態に係る方法または従来技術によって透明化した、マウスの肺を表す図である。 本発明の一実施形態に係る方法または従来技術によって透明化した、マウスの肝臓を表す図である。 本発明の一実施形態に係る方法または従来技術によって透明化した、マウスの腎臓を表す図である。
以下、本発明の実施の形態の一例について詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されない。本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。
文脈上明らかな例外を除き、本明細書においては、試薬（１）を試薬（１ｂ）と読み換えることができる。文脈上明らかな例外を除き、本明細書においては、試薬（２）を試薬（２ａ）または試薬（２ｂ）と読み換えることができる。文脈上明らかな例外を除き、本明細書においては、試薬（３）を試薬（３ｂ）と読み換えることができる。
本発明者らは、どのような試薬に生物材料を透明化させる効果を有しているかに関して、種々の試薬を比較検討した。その結果、試薬のハンセン溶解度パラメータと、試薬の透明化作用の高低には、ある種の傾向性があることを見出した。具体的には、ＨＳＰ空間において互いに近い位置にある試薬群が、高い透明化作用を示す場合があることを見出した（正確な位置関係を表す図ではないが、図１を参照）。このことから、本発明者らは、特定のハンセン球の内部または表面に位置する試薬が、高い透明化作用を示すのではないかと着想した（正確な位置関係を表す図ではないが、図２を参照）。
上記の知見に基づき、本発明者らは、生物材料の透明化作用をさらに向上させるために検討を重ねた。その結果、複数のハンセン球の内部または表面に位置する試薬を組合せた混合液に生物材料を浸漬することにより、特に高い透明化作用が得られることを見出し、本発明を完成させた。
〔１．ハンセン溶解度パラメータ〕
本発明の一態様に係る生物材料を透明化する方法は、ハンセン溶解度パラメータが特定の領域内にある試薬を組合せた混合液に生物材料を浸漬する工程を含む。
ハンセン溶解度パラメータ（δ）とは、物質の溶解性を表すパラメータである。このパラメータは、分散力項（δＤ）、双極子間力項（δＰ）および水素結合項（δＨ）により、「δ２＝（δＤ）２＋（δＰ）２＋（δＨ）２」と表される。それゆえ、特定の物質のハンセン溶解度パラメータは、δＤ、δＰおよびδＨからなる３次元空間内の特定の点として表すことができる。本明細書では、δＤ、δＰおよびδＨからなる３次元空間をＨＳＰ空間と称する。
非常に多くの物質において、ハンセン溶解度パラメータが特定されている。異なる２種類の物質のハンセン溶解度パラメータをδＸおよびδＹとすると、ＨＳＰ空間におけるδＸとδＹとの距離が近い物質同士は溶解性が高く、距離が遠い物質同士は溶解性が低い傾向にある。
ＨＳＰ空間における点δＸ（δＤＸ，δＰＸ，δＨＸ）と点δＹ（δＤＹ，δＰＹ，δＨＹ）との間の距離Ｒは、下記式により求められる。ＨＳＰ空間における球の半径も、下記式によって求められるＨＳＰ距離を表している。
Ｒ＝［４×（δＤＸ－δＤＹ）２＋（δＰＸ－δＰＹ）２＋（δＨＸ－δＨＹ）２］１／２。
ハンセン溶解度パラメータに関する詳細は、［D.W. van Krevelen (1990) "Properties
of polymers, 3rd, completely rev. ed.", Amsterdam: Elsevier］を参照。また、物質のδＤ、δＰおよびδＨは、プログラム「HSPiP（Hansen Solubility Parameters in Practice）」によって計算できる。
［１．１．試薬（１）］
試薬（１）は、ＨＳＰ空間において、点（δＤ＝１８．９７，δＰ＝１．６１，δＨ＝１３．９２）を中心とし、半径が５．７である球（１）の内部または表面に位置する１種類以上の試薬である。一実施形態において、試薬（１）は、球（１）の内部に位置する１種類以上の試薬である。好ましくは、試薬（１）には、トリクロロエタノールは含まれない。
試薬（１）の具体例としては、２－フェノキシエタノール、１－フェニル－２－プロパノール、２－ｏ－トリルエタノール、フェニルエチルアルコール、ベンジルアルコール、シクロペンチル酢酸、２－フェニル－１－プロパノール、４－フェニル－２－ブタノール、３－フェニル－１－プロパノール、ペンタエチレンヘキサミン、３－クロロ－１－プロパノール、ベンジルアミン、１－（ｐ－トリル）エタノール、２－（ｍ－トリル）エタノール、３－メチルベンジルアルコール、１－フェニル－１－プロパノール、４－フェニル－１－ブタノール、またはこれらの混合物が挙げられる。一実施形態において、試薬（１）は、２－フェノキシエタノール、２－ｏ－トリルエタノールおよびベンジルアミンからなる群より選択される１種類以上である。一実施形態において、試薬（１）は、２－フェノキシエタノールである。一実施形態において、試薬（１）は、２－ｏ－トリルエタノールである。一実施形態において、試薬（１）は、ベンジルアミンである。
一実施形態において、試薬（１）は、試薬（１ｂ）である。試薬（１ｂ）は、ＨＳＰ空間において、点（δＤ＝１８．７４，δＰ＝４．９８，δＨ＝９．８６）を中心とし、半径が０．８である球（１ｂ）の内部または表面に位置する１種類以上の試薬である。一実施形態において、試薬（１ｂ）は、球（１ｂ）の内部に位置する１種類以上の試薬である。試薬（１ｂ）は、試薬（１）の中でも、透明化スコアがより高い試薬である。
試薬（１ｂ）の具体例としては、２－ｏ－トリルエタノール、ベンジルアミン、１－（ｐ－トリル）エタノール、２－（ｍ－トリル）エタノール、またはこれらの混合物が挙げられる。一実施形態において、試薬（１ｂ）は、２－ｏ－トリルエタノールおよびベンジルアミンからなる群より選択される１種類以上である。一実施形態において、試薬（１ｂ）は、２－ｏ－トリルエタノールである。一実施形態において、試薬（１ｂ）は、ベンジルアミンである。
［１．２．試薬（２）］
試薬（２）は、ＨＳＰ空間において、点（δＤ＝１７．７７，δＰ＝１４．０８，δＨ＝７．５７）を中心とし、半径が３．８である球（２）の内部または表面に位置する１種類以上の試薬である。一実施形態において、試薬（２）は、球（２）の内部に位置する１種類以上の試薬である。好ましくは、試薬（２）には、ジメチルスルホキシドは含まれない。
試薬（２）の具体例としては、ジメチルスルホキシド、γ－ブチロラクトン、１－メチル－２－ピロリドン、クロロジメチルアセタミド、ε－カプロラクトン、リン酸トリス（２－クロロエチル）、テトラメチレンスルホキシド、またはこれらの混合物が挙げられる。一実施形態において、試薬（２）は、１－メチル－２ピロリドン、ジメチルスルホキシド、クロロジメチルアセタミドおよびテトラメチレンスルホキシドからなる群より選択される１種類以上である。一実施形態において、試薬（２）は、１－メチル－２ピロリドンである。一実施形態において、試薬（２）は、ジメチルスルホキシドである。一実施形態において、試薬（２）は、クロロジメチルアセタミドである。一実施形態において、試薬（２）は、テトラメチレンスルホキシドである。
一実施形態において、試薬（２）は、試薬（２ａ）である。試薬（２ａ）は、ＨＳＰ空間において、点（δＤ＝１７．７３，δＰ＝１１．１７，δＨ＝８．２５）を中心とし、半径が４．０である球（２ａ）の内部または表面に位置する１種類以上の試薬である。一実施形態において、試薬（２ａ）は、球（２ａ）の内部に位置する１種類以上の試薬である。試薬（２ａ）が含まれる球（２ａ）は、球（２）の他の態様であり、中心の座標のδＰがより低い位置に位置している。
試薬（２ａ）の具体例としては、１－メチル－２－ピロリドン、２－メチルチアリゾン、クロロジメチルアセタミド、Ｎ－メチルホルムアニリド、ε－カプロラクトン、リン酸トリス（２－クロロエチル）、テトラメチレンスルホキシド、またはこれらの混合物が挙げられる。一実施形態において、試薬（２ａ）は、１－メチル－２ピロリドン、クロロジメチルアセタミドおよびテトラメチレンスルホキシドからなる群より選択される１種類以上である。一実施形態において、試薬（２ａ）は、１－メチル－２ピロリドンである。一実施形態において、試薬（２ａ）は、クロロジメチルアセタミドである。一実施形態において、試薬（２ａ）は、テトラメチレンスルホキシドである。
一実施形態において、試薬（２）は、試薬（２ｂ）である。試薬（２ｂ）は、ＨＳＰ空間において、点（δＤ＝１８．１３，δＰ＝１２．０３，δＨ＝８．３７）を中心とし、半径が１．３である球（２ｂ）の内部または表面に位置する１種類以上の試薬である。一実施形態において、試薬（２ｂ）は、球（２ｂ）の内部に位置する１種類以上の試薬である。試薬（２ｂ）は、試薬（２）の中でも、透明化スコアが特に高い試薬である。
試薬（２ｂ）の具体例としては、１－メチル－２－ピロリドン、クロロジメチルアセタミド、テトラメチレンスルホキシド、またはこれらの混合物が挙げられる。一実施形態において、試薬（２ｂ）は、１－メチル－２ピロリドン、クロロジメチルアセタミドおよびテトラメチレンスルホキシドからなる群より選択される１種類以上である。一実施形態において、試薬（２ｂ）は、１－メチル－２ピロリドンである。一実施形態において、試薬（２ｂ）は、クロロジメチルアセタミドである。一実施形態において、試薬（２ｂ）は、テトラメチレンスルホキシドである。
［１．３．試薬（３）］
試薬（３）は、ＨＳＰ空間において、点（δＤ＝１６．２６，δＰ＝８．８７，δＨ＝２３．９６）を中心とし、半径が４．８である球（３）の内部または表面に位置する１種類以上の試薬である。一実施形態において、試薬（３）は、球（３）の内部に位置する１種類以上の試薬である。好ましくは、試薬（３）には、グリセロールは含まれない。
試薬（３）の具体例としては、エチレングリコール、プロピレングリコール、チオジエチレングリコール、乳酸（ｄｌ）、乳酸（ｌ）、またはこれらの混合物が挙げられる。一実施形態において、試薬（３）は、エチレングリコールおよび乳酸（ｌ）からなる群より選択される１種類以上である。一実施形態において、試薬（３）は、エチレングリコールである。一実施形態において、試薬（３）は、乳酸（ｌ）である。
一実施形態において、試薬（３）は、試薬（３ｂ）である。試薬（３ｂ）は、ＨＳＰ空間において、点（δＤ＝１７．７７，δＰ＝６．２５，δＨ＝２４．４１）を中心とし、半径が５．３である球（３ｂ）の内部または表面に位置する１種類以上の試薬である。一実施形態において、試薬（３ｂ）は、球（３ｂ）の内部に位置する１種類以上の試薬である。試薬（３ｂ）は、試薬（３）の中でも、透明化スコアがより高い試薬である。
試薬（３ｂ）の具体例としては、エチレングリコール、乳酸（ｄｌ）、乳酸（ｌ）、またはこれらの混合物が挙げられる。一実施形態において、試薬（３ｂ）は、エチレングリコールおよび乳酸（ｌ）からなる群より選択される１種類以上である。一実施形態において、試薬（３ｂ）は、エチレングリコールである。一実施形態において、試薬（３ｂ）は、乳酸（ｌ）である。
［１．４．試薬（１）～（３）の組成］
一実施形態において、透明化方法は、試薬（１）および試薬（２）を含んでいる混合液に生物材料を浸漬する。この実施形態において、混合液における試薬（１）の配合量の下限は、試薬（２）の重量を１．０とすると、０．１以上、０．２以上、０．３以上、０．４以上、０．５以上、０．６以上、０．７以上、０．８以上、０．９以上または１．０以上でありうる。この実施形態において、混合液における試薬（１）の配合量の上限は、試薬（２）の重量を１．０とすると、３．０以下、２．８以下、２．６以下、２．４以下、２．２以下、２．０以下、１．８以下、１．６以下、１．４以下、１．２以下または１．０以下でありうる。
一実施形態において、透明化方法は、試薬（２）および試薬（３）を含んでいる混合液に生物材料を浸漬する。この実施形態において、混合液における試薬（３）の配合量の下限は、試薬（２）の重量を１．０とすると、０．１以上、０．２以上、０．３以上、０．４以上、０．５以上、０．６以上、０．７以上、０．８以上、０．９以上または１．０以上でありうる。この実施形態において、混合液における試薬（３）の配合量の上限は、試薬（２）の重量を１．０とすると、２．０以下、１．９以下、１．８以下、１．７以下、１．６以下、１．５以下、１．４以下、１．３以下、１．２以下、１．１以下または１．０以下でありうる。
一実施形態において、透明化方法は、試薬（１）、試薬（２）および試薬（３）を含んでいる混合液に生物材料を浸漬する。この実施形態において、混合液における試薬（１）の配合量の下限は、試薬（２）の重量を１．０とすると、０．１以上、０．２以上、０．３以上、０．４以上、０．５以上、０．６以上、０．７以上、０．８以上、０．９以上または１．０以上でありうる。この実施形態において、混合液における試薬（１）の配合量の上限は、試薬（２）の重量を１．０とすると、１０．０以下、９．５以下、９．０以下、８．５以下、７．０以下、６．５以下、６．０以下、５．５以下、５．０以下、４．５以下、４．０以下、３．５以下、３．０以下、２．５以下または２．０以下でありうる。この実施形態において、混合液における試薬（３）の配合量の下限は、試薬（２）の重量を１．０とすると、０．１以上、０．２以上、０．３以上、０．４以上、０．５以上、０．６以上、０．７以上、０．８以上、０．９以上または１．０以上でありうる。この実施形態において、混合液における試薬（３）の配合量の上限は、試薬（２）の重量を１．０とすると、３．０以下、２．８以下、２．６以下、２．４以下、２．２以下、２．０以下、１．８以下、１．６以下、１．４以下、１．２以下または１．０以下でありうる。
好ましい実施形態において、混合液は試薬（１）～（３）を含んでおり、試薬（１）は２－ｏ－トリルエタノールであり、試薬（２）はクロロジメチルアセタミドであり、試薬（３）はエチレングリコールである。この実施形態では、試薬（１）～試薬（３）に該当する他の試薬は混合液に含まれていない。この実施形態において、混合液に含まれている各試薬の重量比は、試薬（１）：試薬（２）：試薬（３）＝（０．５～１．５）：１．０：（０．２５～１．２５）でありうる。好ましくは、混合液に含まれている各試薬の重量比は、試薬（１）：試薬（２）：試薬（３）＝（０．７５～１．０）：１．０：（０．５～１．０）でありうる。
他の好ましい実施形態において、試薬（１）は２－ｏ－トリルエタノールおよびベンジルアミンであり、試薬（２）は１－メチル－２－ピロリドンおよびテトラメチレンスルホキシドであり、試薬（３）はエチレングリコールである。この実施形態では、試薬（１）～試薬（３）に該当する他の試薬は混合液に含まれていない。この実施形態において、混合液に含まれている各試薬の重量比は、２－ｏ－トリルエタノール：ベンジルアミン：１－メチル－２－ピロリドン：テトラメチレンスルホキシド：エチレングリコール＝（１．５～２．５）：（１．５～２．５）：１．０：（２．５～３．５）：（１．５～２．５）でありうる。好ましくは、混合液に含まれている各試薬の重量比は、２－ｏ－トリルエタノール：ベンジルアミン：１－メチル－２－ピロリドン：テトラメチレンスルホキシド：エチレングリコール＝（１．７５～２．２５）：（１．７５～２．２５）：１．０：（２．２５～３．７５）：（１．７５～２．２５）でありうる。
さらに他の好ましい実施形態において、試薬（１）はベンジルアミンであり、試薬（２）はテトラメチレンスルホキシドであり、試薬（３）はエチレングリコールである。この実施形態では、試薬（１）～試薬（３）に該当する他の試薬は混合液に含まれていない。この実施形態において、混合液に含まれている各試薬の重量比は、試薬（１）：試薬（２）：試薬（３）＝（１．５～２．５）：（１．５～２．５）：１．０でありうる。好ましくは、混合液に含まれている各試薬の重量比は、試薬（１）：試薬（２）：試薬（３）＝（１．７５～２．２５）：（１．７５～２．２５）：１．０でありうる。
混合液は、試薬（１）～（３）以外のその他成分を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。このような成分の例としては、水、界面活性剤が挙げられる。その他成分の合計含有量は、混合液の全重量を基準として、１０重量％以下、７重量％以下、５重量％以下、３重量％以下、１重量％以下または０．５重量％以下でありうる。一実施形態において、混合液における水の含有量は、混合液の全重量を基準として、１重量％以下、０．５重量％以下または０．１重量％以下でありうる。一実施形態において、混合液は、水を含有していない。一実施形態において、混合液における界面活性剤の含有量は、混合液の全重量を基準として、１重量％以下、０．５重量％以下または０．１重量％以下でありうる。一実施形態において、混合液は、界面活性剤を含有していない。
その他成分のさらなる例としては、ｐＨ調整剤、浸透圧調整剤が挙げられる。
［１．５．推定作用機序］
本発明の一実施形態に係る方法では、複数の試薬を組合せた混合液に生物材料を浸漬する。これらの試薬は、ＨＳＰ空間において異なる球の内部または表面に位置している。球（１）、球（２）および球（３）に重複する領域は存在しない。それゆえ、試薬（１）、試薬（２）および試薬（３）は、物質の溶解性が異なっている。
ところで、生物材料を透明化においては、細胞膜などに含まれている脂質を除去することが重要である。脂質を除去することにより、生物材料の光透過性が向上し、透明化された生物材料が得られることになる。生物材料を構成する脂質には、複数のクラスが存在することが知られている。
このことから、試薬（１）、試薬（２）および試薬（３）により生物材料から除去される脂質のクラスは、それぞれ異なっていると推定される。本発明の一実施形態に係る方法は、浸漬する試薬を複数種類組合せることによって、より多種の脂質を生物材料から除去できるのだと考えられる。その結果、より迅速に脂質を除去でき、あるいは高い透明化を実現できると考えられる。
この仮説を支持する知見として、生物材料を試薬（１）に浸漬した後の残留液には、トリアシルグリセロール（ＴＧ）などの脂質が多く含まれる傾向がある。生物材料を試薬（２）に浸漬した後の残留液には、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）などの脂質が多く含まれる傾向がある。生物材料を試薬（３）に浸漬した後の残留液には、ホスファチジルコリンなどの脂質が多く含まれる傾向にある。
ただし、上述の推定作用機序は本発明の一態様を理解するための仮説であり、本発明の範囲を拘束するものではない。
〔２．生物材料を透明化する方法〕
本発明の一態様に係る生物材料を透明化する方法は、特定のハンセン溶解度パラメータを有する試薬の組合せた混合液に、生物材料を浸漬する。一実施形態において、混合液は、試薬（１）および試薬（２）を含んでいる。一実施形態において、混合液は、試薬（２）および試薬（３）を含んでいる。一実施形態において、混合液は、試薬（１）、試薬（２）および試薬（３）を含んでいる。
本発明の一態様は、〔２〕節で説明する方法によって生物材料を透明化する工程を含む、透明化された生物材料の製造方法である。この製造方法は、本技術分野に関連する公知の手法を含んでいてもよい（生体から生物材料を採取する工程、生物材料を固定する工程、生物材料を薄片化する工程など）。
［２．１．生物材料］
本明細書において、生物材料とは、生物由来の材料を一般に表す。生物材料の例としては、個体（ただし、ヒトを除く）、器官、組織、細胞塊、体液が挙げられる。個体の例としては、動植物の成体、幼体、胎仔、胚が挙げられる。器官および組織の例としては、脳、心臓、肺、肝臓、腎臓が挙げられる。透明化する器官または組織は、当該器官または組織の全部であってもよいし、一部であってもよい。細胞塊の例としては、生物から採取された細胞塊、培養された細胞塊が挙げられる。体液の例としては、血液、唾液、血清、血漿、尿、滑液、髄液が挙げられる。一実施形態において、生物材料は、生体から採取された生物材料である。一実施形態において、生物材料は、ヒト以外の生物に由来する生物材料である。
生物材料は、どのような生物に由来していてもよい。一実施形態において、生物材料は、ヒト由来ではない。一実施形態において、生物材料は、植物由来または動物由来である。動物の例としては、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類が挙げられる。これらの中では、哺乳類が好ましい。哺乳類の例としては、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、非ヒト霊長類など）、愛玩動物（イヌ、ネコなど）、家畜（ウシ、ウマなど）、野生生物、ヒトが挙げられる。
一実施形態において、生物材料は、がん組織である。本願実施例で示すように、特許文献１に開示されている技術によりがん組織を透明化すると、透明化が不充分であったり、透明化に時間を要したりするという難点があることを本発明者らは見出した。同技術と比較すると、本発明の一実施形態に係る方法は、(i)がん組織の透明化の程度が高い、および／または、(ii)がん組織をより迅速に透明化できる。
がん組織は、どのようながんに由来していてもよい（固形がん、血液がんなど）。一実施形態において、がん組織は、固形がんの組織である。一実施形態において、がん組織は、癌腫の組織である。一実施形態において、がん組織は、肉腫の組織である。がんの例としては、腎臓がん、前立腺がん、乳がん、肺がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、頭頸部がん、結腸がん、肝臓がん、大腸がん、食道がん、小腸がん、膀胱がん、脳腫瘍、子宮頸がん、甲状腺がん、喉頭がん、皮膚がんが挙げられる。
［２．２．試薬の混合液への浸漬］
本発明の一実施形態に係る方法は、生物材料を試薬の混合液に浸漬する工程を含む。一実施形態においては、生物材料を試薬（１）および試薬（２）を含んでいる混合液に浸漬する工程を含む。一実施形態においては、生物材料を試薬（２）および試薬（３）を含んでいる混合液に浸漬する工程を含む。一実施形態においては、生物材料を試薬（１）、試薬（２）および試薬（３）を含んでいる混合液に浸漬する工程を含む。
生物材料を試薬（１）および試薬（２）を含んでいる混合液に浸漬する工程において、当該混合液は、試薬（１）および試薬（２）以外の成分を実質的に含んでいなくてもよい。生物材料を試薬（２）および試薬（３）を含んでいる混合液に浸漬する工程において、当該混合液は、試薬（２）および試薬（３）以外の成分を実質的に含んでいなくてもよい。生物材料を試薬（１）、試薬（２）および試薬（３）を含んでいる混合液に浸漬する工程において、当該混合液は、試薬（１）、試薬（２）および試薬（３）以外の成分を実質的に含んでいなくてもよい。ここで、「実質的に成分Ｘを含んでいない」とは、成分Ｘの存在量が、混合液の、１０重量％以下、７重量％以下、５重量％以下、３重量％以下、１重量％以下、０．５重量％以下、０．１重量％以下または０重量％であることを意味する。
本発明の一実施形態に係る方法は、生物材料を上述の試薬の混合液以外の試薬に浸漬する工程を含んでもよい。一実施形態において、生物材料を、上述の試薬の混合液以外の他の透明化試薬に浸漬してもよい。一実施形態においては、生物材料を、上述の試薬の混合液以外の他の透明化試薬に浸漬しない。また、生物材料を透明化試薬以外の試薬に浸漬してもよい。一例として、生物材料を固定液に浸漬してもよい。
生物材料を上述の試薬の混合液に浸漬する時間は、１時間以上が好ましく、４時間以上がより好ましい。浸漬時間が上述の範囲であれば、生物材料を充分に透明化できる。生物材料を上述の試薬の混合液に浸漬する時間は、８時間以下が好ましく、４時間以下がより好ましい。浸漬時間が上述の範囲であれば、従来技術（特許文献１に開示された技術など）よりも迅速に生物材料を透明化できていると言える。
［２．３．透明化の程度の評価］
本明細書において、生物材料の透明化の程度は、透明化処理を施す前後におけるサンプルの透明度の比較によって規定する。サンプルとして組織片を採用する場合は、「透明化処理後にサンプルを透過する光の相対強度－透明化処理前にサンプルを透過する光の相対強度」を透明化の程度（透明化スコア）とすることができる。この場合、透明化スコアが高いほど、透明化の程度が高いと言える。透明化スコアの具体的な算出方法の例は、実施例１を参照。透明化スコアは、０超が好ましく、１５以上がより好ましく、２４以上がさらに好ましい。透明化スコアの上限値は、例えば、８０以下とすることができる。
［２．４．透明化した生物材料の利用］
透明化した生物材料は、例えば、顕微鏡観察に利用できる。顕微鏡観察に先立って、生物材料に可視化処理を施してもよい（染色、マーキングなど）。可視化処理は、透明化処理前に施してもよいし、透明化処理中に施してもよいし、透明化処理後に施してもよい。可視化処理を施すことで、顕微鏡観察による生体材料の解析が容易になる。
蛍光タンパク質を用いて可視化処理を施す場合には、透明化処理に先立って、生きた状態の生物材料に蛍光タンパク質遺伝子を導入して、当該蛍光タンパク質を発現させればよい。
化学物質（蛍光化学物質など）を注入して可視化処理を施す場合には、透明化処理前または透明化処理中の生物材料に、当該化学物質を注入することが好ましい。もっとも、透明化処理後の生物材料に、当該化学物質を注入してもよい。
顕微鏡観察では、通常、光学顕微鏡を使用する。光学顕微鏡の種類は、特に限定されない。顕微鏡観察においては、三次元超分解顕微鏡技術（ＳＴＥＤ、３Ｄ ＰＡＬＭ、ＦＰＡＬＭ、３Ｄ ＳＴＯＲＭ、ＳＩＭなど）を適用してもよい。顕微鏡観察においては、１光子共焦点顕微鏡またはシート照明マクロズーム顕微鏡を用いることが好ましい。もっとも、多光子励起型（一般的には２光子励起型）の光学顕微鏡技術を用いて顕微鏡観察をしてもよい。
本発明の一態様は、〔２〕節で説明された方法により生体から採取された生物材料を透明化する工程と、当該生物材料に含まれる標的に可視化処理を施す工程と、を含む生物材料の検査を補助する方法（または、生物材料を検査する方法）である。可視化される標的の例としては、がん細胞、免疫細胞、神経細胞が挙げられる。あるいは、これらの細胞を示すマーカー（タンパク質、脂質、糖鎖、核酸など）を標的としてもよい。標的を可視化する方法は、上述した通りである。可視化処理は、透明化処理前に施してもよいし、透明化処理中に施してもよいし、透明化処理後に施してもよい。生物材料の検査を補助する方法（または、生物材料を検査する方法）は、可視化処理を施した生物材料を用いて病理検査を行う工程を含んでもよい。病理検査を行う具体的な方法は、本技術分野において周知であるため、説明を省略する。
本発明の一態様は、〔２〕節で説明された方法により生体から採取された生物材料を透明化する工程と、当該生物材料に含まれる標的に可視化処理を施す工程と、を含む疾患の診断方法である。この診断方法は、可視化処理を施した生物材料を用いて病理検査を行う工程を含んでもよい。診断方法によって診断される疾患の例としては、がん、炎症性疾患、神経変性などが挙げられる。
〔３．生物材料を透明化するためのキット〕
本発明の一態様は、生物材料を透明化するためのキットである。一実施形態において、キットは、試薬（１）および試薬（２）を備えている。一実施形態において、キットは、試薬（２）および試薬（３）を備えている。一実施形態において、キットは、試薬（１）、試薬（２）および試薬（３）を備えている。試薬（１）～（３）の具体例は、〔１〕節の［試薬（１）］～［試薬（３）］の項目に記載した通りであるため、本項目では記載を省略する。キットにおいて、試薬（１）～（３）は、それぞれ分離された状態で格納されていてもよいし、一部または全部が混合状態で格納されていてもよい。
本明細書において、「キット」とは、特定の要素（試薬（１）～（３）など）が格納されている容器（ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えているパッケージを表す。ここで、キットがある要素を「備えている」とは、キットを構成する容器のうち１つ以上に、当該要素が格納されている状態を表す。キットは、複数の異なる要素を１つにまとめて梱包したパッケージであってもよい。この組成物は、複数の異なる容器に格納されていてもよい。キットが複数の要素を備えている場合、複数の構成要素は、同一の容器に混合して格納されていてもよいし、異なる容器に別々に格納されていてもよい。
キットは、指示書を備えていることが好ましい。指示書は、キットに備えられている各要素を使用して、生物材料を透明化する方法を説明する。指示書は、紙などの媒体に記されていてもよいし、電子媒体（磁気テープ、コンピュータ読取り可能ディスク、ＣＤ－ＲＯＭなど）に格納されていてもよいし、通信によりインターネットから取得する形態であってもよい。
キットは、稀釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を格納した容器を備えていてもよい。キットは、生物材料を透明化するために必要な器具を備えていてもよい。
上記各項目で記載した内容は、他の項目においても適宜援用できる。本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。したがって、異なる実施形態にそれぞれ開示されている技術的手段を適宜組合せて得られる実施形態も、本発明の技術的範囲に含まれる。
本明細書中に記載された学術文献および特許文献のすべてが、本明細書中において参考文献として援用される。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記実施例のみに限定されるものではない。
〔実施例１〕
がん組織のスライス標本を使用して、各種試薬を１種類のみ使用した場合の透明化作用を検討した。具体的な手順は、以下の通りである。
１． ヒトがん組織（ヒト大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６をマウスに移植したもの）を適当な大きさに切出し、厚さ：２ｍｍのスライス標本を作製した。
２． 得られたスライス標本を、３ｍＬの各種試薬に浸漬してインキュベートした。インキュベート条件は、３７℃にて２４～４８時間とした。
３． 色付きのフィルム上にスライス標本を載置し、当該フィルムの下側から光を照射した状態で画像を撮像した。
４． 得られた画像を画像処理ソフト（Image J）で処理し、モノクロ画像とした。このモノクロ画像に基づいて、一定面積における透過光の平均強度を求めた。
５． 「（スライス標本における透過光の平均強度／バックグラウンドにおける透過光の平均強度）×１００」の値を、透明化度とした。さらに、それぞれの試薬に関して、「透明化処理前の透明化度－透明化処理後の透明化度」で表される値を、透明化スコアとした。透明化スコアが大きいほど、各試薬の透明化作用が大きいことになる。
結果を表１に示す。表中、「スコア」の項目は、透明化スコアの相対評価を表している。それぞれの記号の意味は、下記の通りである。
－ ：透明化スコアが０．１未満。
＋ ：透明化スコアが０．１以上１５未満。
＋＋ ：透明化スコアが１５以上２４未満。
＋＋＋：透明化スコアが２４以上。
表中、「球」の項目は、各試薬がＨＳＰ空間において球（１）、球（１ｂ）、球（２）、球（２ａ）、球（２ｂ）、球（３）または球（３ｂ）に含まれるか否かを表している。この項目が１である試薬は球（１）の内部または表面に位置している。この項目が１ｂである試薬は球（１ｂ）の内部または表面に位置している。この項目が２である試薬は球（２）の内部または表面に位置している。この項目が２ａである試薬は球（２ａ）の内部または表面に位置している。この項目が２ｂである試薬は球（２ｂ）の内部または表面に位置している。この項目が３である試薬は球（３）の内部または表面に位置している。この項目が３ｂである試薬は球（３ｂ）の内部または表面に位置している。
Figure 2022168842000002
Figure 2022168842000003
Figure 2022168842000004
〔実施例２〕
がん組織のスライス標本を使用して、複数の試薬を組合せた混合液の透明化作用を検討した。具体的には、がん組織のスライス標本を表２に記載の混合液に浸漬した以外は、実施例１と同様に実験を行った。試薬（１）としては、２－フェノキシエタノールおよび２－ｏ－トリルエタノールを使用した。試薬（２）としては、１－メチル－２ピロリドン、ジメチルスルホキシドおよびクロロジメチルアセタミドを使用した。試薬（３）としては、エチレングリコールを使用した。
Figure 2022168842000005
Figure 2022168842000006
［結果］
表２に示されている通り、(i)試薬（１）および試薬（２）、(ii)試薬（２）および試薬（３）、または、(iii)試薬（１）、試薬（２）および試薬（３）の組合せを含んでいる混合液に浸漬することにより、生物材料（がん組織片）が透明化された。このときの透明化スコアは３０以上であり、従来技術（特許文献１に記載された技術）と同等またはそれ以上の透明化作用を有していることになる。
〔実施例３〕
試薬（３）として、エチレングリコールに代えて乳酸（ｌ）を使用し、透明化作用を検討した。具体的には、がん組織のスライス標本を表３に記載の混合液に浸漬した以外は、実施例１と同様に実験を行った。
Figure 2022168842000007
［結果］
表３に示すように、エチレングリコールの代わりに乳酸（ｌ）を配合した混合液も、高い透明化作用を有していた。実施例１～３の結果から、試薬（３）に該当する他の試薬を採用した場合でも、本発明の一実施形態に係る方法によれば、高い透明化作用を得られることが示唆される。
〔実施例４〕
試薬（１）として２－ｏ－トリルエタノールおよびベンジルアミン、試薬（２）として１－メチル－２－ピロリドンおよびテトラメチレンスルホキシド、試薬（３）としてエチレングリコールを含んでいる混合液を調製した。各成分の重量比は、２－ｏ－トリルエタノール：ベンジルアミン：１－メチル－２－ピロリドン：テトラメチレンスルホキシド：エチレングリコール＝２：２：１：３：２であった。したがって、混合液全体の重量比は、試薬（１）：試薬（２）：試薬（３）＝２：２：１であった。この混合液を透明化試薬Ａと称する。透明化試薬Ａによる種々の生物材料の透明化作用を検討した。
［実施例４ａ］
生物材料として、ヒトがん組織（ヒト大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６をマウスに移植したもの）のスライス（厚さ：２ｍｍ）を選択し、透明化試薬Ａによる透明化作用を検討した。比較対象とする従来技術としては、市販の動物透明化試薬「ＣＵＢＩＣ－Ｌ」（東京化成工業株式会社製）を使用した。ＣＵＢＩＣ－Ｌは、特許文献１に開示された技術を利用しているアミノアルコール系試薬である。図３および図４から分かるように、本発明の一実施形態に係る方法は、従来技術よりも、透明化の程度が高く、迅速に透明化が進んだ。
［実施例４ｂ］
生物材料として、ヒトがん組織（ヒト大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６をマウスに移植したもの）の細胞塊（最大径：約１０ｍｍ）を選択し、透明化試薬Ａによる透明化作用を検討した。比較対象とする従来技術としては、市販の動物透明化試薬「ＣＵＢＩＣ－Ｌ」（東京化成工業株式会社製）を使用した。図５および図６から分かるように、本発明の一実施形態に係る方法は、従来技術よりも、透明化の程度が高く、迅速に透明化が進んだ。
［実施例４ｃ］
実施例３ｂで透明化したがん細胞塊を血管平滑筋マーカーで染色し、蛍光顕微鏡（製品名：ＭＶＸ１０―ＬＳＦＭ、オリンパス株式会社製）で観察した。図７に示すように、良好な染色像が得られ、３Ｄイメージングが可能であった。
［実施例４ｄ］
生物材料として、ヒト乳がんサンプル（カスタム品、株式会社ケー・エー・シー製）を選択し、透明化試薬Ａによる透明化作用を検討した。比較対象とする従来技術としては、市販の動物透明化試薬「ＣＵＢＩＣ－Ｌ」（東京化成工業株式会社製）を使用した。図８から分かるように、本発明の一実施形態に係る方法は、従来技術よりも、透明化の程度が高く、迅速に透明化が進んだ。
［実施例４ｅ］
実施例３ｂで透明化したヒト乳がんサンプルをＫｉ６７抗体で染色し、蛍光顕微鏡（製品名：ＭＶＸ１０―ＬＳＦＭ、オリンパス株式会社製）で観察した。図９に示すように、良好な染色像が得られ、３Ｄイメージングが可能であった。
［実施例４ｆ］
生物材料として種々の非がん組織を選択し、透明化試薬Ａによる透明化作用を検討した。比較対象とする従来技術としては、市販の動物透明化試薬「ＣＵＢＩＣ－Ｌ」（東京化成工業株式会社製）を使用した。図１０はマウスの脳、図１１はマウスの心臓、図１２はマウスの肺、図１３はマウスの肝臓、図１４はマウスの腎臓を透明化した結果である。これらの図から分かるように、本発明の一実施形態に係る方法によれば、非がん組織においても、従来技術と同等以上に生物材料を透明化できることが分かる。このことから、本発明の一実施形態係る方法は、広汎な生物材料に応用できることが示唆される。
本発明は、生物材料の観察などに利用できる。より具体的な例を挙げると、本発明は、がんの病理診断などに利用できる。

Claims (4)

  1. 生物材料を透明化する方法であって、
    (i)下記試薬（１）および下記試薬（２）
    (ii)下記試薬（２）および下記試薬（３）
    (iii)下記試薬（１）、下記試薬（２）および下記試薬（３）
    のいずれかの組合せを含んでいる混合液に、上記生物材料を浸漬する工程を含む、方法：試薬（１）：ＨＳＰ空間において、点（δＤ＝１８．９７，δＰ＝１．６１，δＨ＝１３．９２）を中心とし、半径が５．７である球（１）の内部または表面に位置する１種類以上の試薬；
    試薬（２）：ＨＳＰ空間において、点（δＤ＝１７．７７，δＰ＝１４．０８，δＨ＝７．５７）を中心とし、半径が３．８である球（２）の内部または表面に位置する１種類以上の試薬；
    試薬（３）：ＨＳＰ空間において、点（δＤ＝１６．２６，δＰ＝８．８７，δＨ＝２３．９６）を中心とし、半径が４．８である球（２）の内部または表面に位置する１種類以上の試薬。
  2. 上記試薬（１）、上記試薬（２）および上記試薬（３）を含んでいる混合液に、上記生物材料を浸漬する工程を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 上記生物材料は、がん組織である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 生物材料を透明化するためのキットであって、
    (i)下記試薬（１）および下記試薬（２）
    (ii)下記試薬（２）および下記試薬（３）
    (iii)下記試薬（１）、下記試薬（２）および下記試薬（３）
    のいずれかの組合せを備えている、キット：
    試薬（１）：ＨＳＰ空間において、点（δＤ＝１８．９７，δＰ＝１．６１，δＨ＝１３．９２）を中心とし、半径が５．７である球（１）の内部または表面に位置する１種類以上の試薬；
    試薬（２）：ＨＳＰ空間において、点（δＤ＝１７．７７，δＰ＝１４．０８，δＨ＝７．５７）を中心とし、半径が３．８である球（２）の内部または表面に位置する１種類以上の試薬；
    試薬（３）：ＨＳＰ空間において、点（δＤ＝１６．２６，δＰ＝８．８７，δＨ＝２３．９６）を中心とし、半径が４．８である球（２）の内部または表面に位置する１種類以上の試薬。
JP2022068424A 2021-04-26 2022-04-18 生物材料を透明化する方法およびキット Pending JP2022168842A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021074179 2021-04-26
JP2021074179 2021-04-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2022168842A true JP2022168842A (ja) 2022-11-08

Family

ID=83847026

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022068424A Pending JP2022168842A (ja) 2021-04-26 2022-04-18 生物材料を透明化する方法およびキット

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JP2022168842A (ja)
TW (1) TW202309495A (ja)
WO (1) WO2022230750A1 (ja)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015049101A (ja) * 2013-08-30 2015-03-16 オリンパス株式会社 生体透明化剤
JP7219451B2 (ja) * 2016-04-28 2023-02-08 国立研究開発法人理化学研究所 光透過性に優れた生物材料を調製するための組成物およびその利用
JP7033795B2 (ja) * 2017-02-22 2022-03-11 国立大学法人 長崎大学 生体由来材料の透明化用試薬
US11022528B2 (en) * 2017-04-21 2021-06-01 Korea Research Institute Of Chemical Technology Composition for biological tissue transparency and method for biological tissue transparency using same
JP7160350B2 (ja) * 2017-07-06 2022-10-25 公立大学法人大阪 生体組織透明化法及びその試薬

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022230750A1 (ja) 2022-11-03
TW202309495A (zh) 2023-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Copper et al. Comparative analysis of fixation and embedding techniques for optimized histological preparation of zebrafish
He et al. Combined whole-mount fluorescence in situ hybridization and antibody staining in zebrafish embryos and larvae
JP6433901B2 (ja) 光透過性に優れた生物材料を調製するための組成物およびその利用
Thisse et al. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos
Fox et al. Formaldehyde fixation.
Marx et al. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction
US10359344B2 (en) Composition for clearing of biotissue and clarity method for biotissue using thereof
CN110068559B (zh) 一种生物组织透明化成像方法
JP2021508820A (ja) 組織試料調製システム
US10955322B2 (en) Methods and devices for soft and osseous tissue clearing and fluorescent imaging
WO2021015196A1 (ja) 生体組織の処理方法及び処理用組成物
WO2022230750A1 (ja) 生物材料を透明化する方法およびキット
JP6161074B2 (ja) 抗体組成物、抗体組成物調製用キット、及び免疫染色方法
US11391653B2 (en) Composition for immunostaining cleared large tissues and method for immunostaining cleared large biological tissues
WO2022102623A1 (ja) 生物材料を透明化する方法およびキット
Kandyel et al. Tongue of the Egyptian Endemic Bridled Skink (Heremites vittatus; Olivier, 1804): Gross, Electron Microscopy, Histochemistry, and Immunohistochemical Analysis
Plaul et al. Morphological techniques used in ichthyopathological diagnosis
KR102477568B1 (ko) 1 mm 이하 크기 생체 시료의 투명화 전처리 방법 및 이를 포함하는 생체 시료의 투명화 방법
EP3519794A1 (en) Clearing agent and mounting media for microscopy
Rehfeld et al. Histological methods
KR102644979B1 (ko) 생물학적 이미징을 위한 새로운 수성 굴절률 동기화 및 조직 투명화 용액
Malloci et al. Label-free imaging of large samples: 3D rendering and morphological analysis within histological workflows using serial block face imaging
US20220276139A1 (en) Compositions and methods for clearing tissue
TW202142851A (zh) 組織切片的製備方法
Li et al. Hypertonic saline-and detergent-accelerated EDTA-based decalcification better preserves mRNA of bones