TW202142851A - 組織切片的製備方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種組織標本的製備方法，包含以一澄清劑及至少一標記劑處理一組織標本以獲得一澄清且標記的組織標本；生成該澄清且標記的組織標本的一個三維影像；對該三維影像執行一影像切片程序以生成複數個二維影像；從該複數個二維影像中辨識出一目標二維影像以獲得一距離值D1，其指示該目標二維影像與該三維影像的一預定表面之間的距離；自該澄清且標記的組織標本製備一硬化組織標本；以及在該硬化組織標本的一預定位置附近進行切割以獲得一組織切片，其中該預定位置與該三維影像預定表面所對應的該硬化組織標本的一表面之間的距離係為D1。

Description

組織切片的製備方法

本發明係關於一種生物標本的製備方法，更具體而言，係關於一種利用三維(three-dimensional，3D)組織病理學(histopathology)成像方法以製備組織切片的方法。

組織病理學係指對組織進行顯微鏡檢查藉以研究疾病的表現。 組織病理學在臨床醫學中可以更明確地被定義及指稱對一活體組織切片(biopsy)標本或外科手術標本加以處理，並將組織切片放置於載玻片上後，再由病理學家檢視該標本。

三維組織病理學影像涉及使用現有技術，例如顯微鏡系統及電腦成像系統，以促進傳統的顯微檢查。圖1係描述用於執行三維組織病理學的一種傳統技術。如圖1所示，藉由活體組織切片取得一組織標本。該組織可以是肺或腎組織。其後，利用所謂的福馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE)方法處理該組織標本以形成一組織塊(tissue block)。然後，將組織塊切割成切片，每一切片的厚度約為3-5 µm。接著，將每一切片染色，並使用一配備相機的顯微鏡對切片進行成像及生成每一切片的二維影像。該些二維影像可被傳送至一電腦並加以處理。該電腦收集及處理該些二維影像以便由此重建一個三維影像。然而，由於組織自始就被切成多片，這種傳統技術會造成二個連續二維影像之間存在2 µm的影像損失。

圖2係描述另一種用於獲取三維組織病理學成像的傳統技術。類似地，藉由活體組織切片取得一組織，但接著該組織被染色及被包埋在石蠟中以形成一組織塊。後續的切片程序、二維成像及三維重建程序與圖1中描述的程序相似，因此省略相關說明。儘管此種技術的效果有所改進，但在二個連續二維影像之間仍然存在1-2 µm的影像損失，且此影像損失亦歸因於切片過程。因此，如何減少影像損失仍是有待解決的問題。

另一個源自傳統組織病理學的問題是，組織切片製備過程中的盲切可能會毀壞組織中重要形態特徵的完整性，進而降低所得組織切片之於其來源的代表性。再者，一個活體組織切片標本通常需要數百次的切割和數百次的染色，才能得到數百個染色組織切片以供後續檢視，然而這些切片中僅有少數呈現出決定性的異常結果而能用作診斷基礎。顯而易見地，在這種情況下，過量的時間及化學藥品被消耗在製備數百個無法被進一步運用的組織切片。因此，開發一種新的組織切片製備方法以增進臨床診斷的準確度和效率，實有其必要。

本發明之一目的係提供一種直接從一組織標本的一特定部位製備一組織切片的方法，該方法利用了一種能減少影像損失的三維組織病理學成像方法。更具體而言，該方法包含下列步驟：(a)以一澄清劑及用於標記一細胞成分的至少一標記劑處理一組織標本，以獲得一澄清且標記的組織標本；(b)生成該澄清且標記的組織標本的一個三維影像；(c)對該三維影像執行一影像切片(image slicing)程序以生成複數個二維(two-dimensional，2D)影像；(d)從該複數個二維影像中辨識出一目標二維影像以獲得一距離值D1，其中D1係為該目標二維影像與該三維影像的一預定表面之間的距離；(e)自該澄清且標記的組織標本製備一硬化組織標本；以及(f)在該硬化組織標本的一預定位置附近進行切割以獲得一組織切片，其中該預定位置與該三維影像預定表面所對應的該硬化組織標本的一表面之間的距離係為D1。透過構成該三維組織病理學成像方法的步驟(a)-(c)，以及將空間資訊運用於實體切割的步驟(d)-(f)，本發明之方法能有效率地產出更具代表性的組織切片。

在某些實施例中，該澄清劑係為一水性澄清劑，該水性澄清劑的折射率為1.33-1.55，較佳為1.40-1.52，更佳為1.45-1.52。使用此種澄清劑進行處理能使得一厚度至少為200 µm的組織標本變得足夠透明，同時防止組織收縮或變形，並且避免脂質被移除。由於經過澄清的組織標本的結構完整性被完好地保存，該標本的三維影像提供了更準確的形態訊息。此外，對細胞膜及膜相關蛋白質的螢光標記處理能夠和此種澄清劑相容，因此得以檢測多種疾病的各類標誌蛋白質(marker proteins)，特別是癌症的標誌蛋白質。

在某些實施例中，該標記劑係為一螢光染劑，或一螢光染劑與一分子探針(molecular probe)的一綴合物(conjugate)，該分子探針係選自由促進劑(agonist)、拮抗劑(antagonist)、抗體(antibody)、卵白素(avidin)、寡核苷酸(oligonucleotide)、脂質核苷酸(lipid nucleotide)及毒素(toxin)所組成的群組。

在某些實施例中，步驟(a)中的該組織標本係包埋於一包埋材料(embedding material)，該包埋材料為該組織標本提供了物理性的支持。該包埋材料可以是一瓊脂膠(agarose gel)或一水凝膠(hydrogel)。

在某些實施例中，該標記劑係在步驟(e)之前自該澄清且標記的組織標本移除，或在步驟(f)之後自該組織切片移除。當該標記劑被移除，該組織切片可被進一步染色以獲得一染色的組織切片。組織染色可以透過本技術領域中熟知的組織染色方法來執行，例如蘇木素-伊紅染色(hematoxylin and eosin (H&E) staining)、免疫組織化學法(immunohistochemistry，IHC)、免疫螢光染色(immunofluorescence (IF) staining)、及原位螢光雜合(fluorescence in situ hybridization，FISH)染色。

在某些實施例中，該澄清劑及該標記劑係包含於一澄清組合物中，且該澄清組合物進一步包含一滲透劑(permeating agent)。在該澄清組合物中，該澄清劑包含一折射率吻合(refractive index matching)材料，該折射率吻合材料係選自由放射造影劑(radiocontrast agent)、單糖、寡糖、及其任意組合所組成的群組。該滲透劑較佳地係為一界面活性劑，該界面活性劑係選自由聚山梨醇酯100 (Triton X-100)、聚山梨醇酯20 (Tween-20)、聚山梨醇酯80 (Tween-80)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、正十二烷基-β-D-麥芽糖苷(n-dodecyl-β-d-maltoside，DDM)、尿素(urea)、3-[3-(膽胺丙基)-二甲基胺]-1-丙磺酸鹽(3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate，CHAPS)、去氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)、及其任意組合所組成的群組。

在某些實施例中，該三維影像係藉由使用一顯微鏡技術，例如掃描式雷射顯微鏡(laser scanning microscopy)，去掃描該澄清且標記的組織標本而生成。該三維影像係該組織標本的三維模型，透過影像切片程序，可在三維維度上進一步分析該三維影像。在該影像切片程序中，該三維影像在不同方向上被切分，以生成複數個二維影像切片。前述影像切片係沿著選自該三維影像的三個相互垂直軸(即一X軸、一Y軸及一Z軸)的一個軸而進行。

在某些實施例中，被標記的細胞成分係為一細胞膜、一胞器或一生物分子。該胞器可為一膜狀胞器(如細胞核)，或一無膜胞器(如核醣體)。該生物分子可為一核酸或一蛋白質，例如一疾病相關蛋白質。標記步驟使得組織標本在細胞層級及甚至分子層級的構造或生理狀態顯露而出，因此得以從複數個二維影像中辨識出展現一特定特徵的一個目標二維影像。在某些實施例中，該目標二維影像係藉由測量該複數個二維影像中的每一二維影像中的一生物分子的表現量而辨識出。在某些實施例中，該目標二維影像係藉由測量該複數個二維影像中的每一二維影像中具有異常型態的細胞(例如細胞聚集或細胞侵襲)相對於所有細胞的比例而辨識出。

本文揭露的方法可以在包含一三維組織病理學成像系統，且該系統與一切片機(microtome)相連的一平台上操作。該三維組織病理學成像系統包含一顯微鏡及一處理器(processor)。該顯微鏡係被設置為建立一組織標本的一個三維影像。該處理器係被設置為對該三維影像進行一影像切片程序以生成複數個二維影像，辨識出一目標二維影像，以及產出一距離值D1。該切片機可以是能對標本的一預定位置進行切割的一傳統切片機。

本文揭露的方法能直接製備得最足以代表一已患病或易患病組織的組織切片，進而節省製備組織玻片所需花費的時間與化學藥品，同時節省玻片儲存所需的空間。此外，由於在實體切片之前就能辨識出組織標本內最具代表性的部分，可以避免該些部分因為盲切而被毀損。因此，病理學家基於本方法製備的組織標本得以做出更準確的診斷，協助醫師為每位患者決定適當的治療方法。

除非另有定義，本文中使用的所有技術與科學術語具有與本發明所屬技術領域中熟習技藝者通常理解者相同的含義。可進一步理解的是，該些術語，例如常用字典中定義的術語，應該被解釋為所具有的含義與其在相關技術領域及本文的上下文中的含義相一致，且除非在本文中有明確定義，該些術語不會以理想化的或過度正式的意義作解釋。

本說明書全文中提及的「一個實施例」或「一實施例」係指涉及該實施例所描述的一特定特徵、結構或特性是包含於至少一個實施例中。因此，在本說明書全文各處出現的用語「在一個實施例中」或「在一實施例中」未必指稱同一實施例。此外，該些特定的特徵、結構或特性可以在一個或多個實施例中以任何合適的方式組合。

除非上下文另有明確定義，本文中所用單數形式的「一」、「一個」及「該」包含複數指稱。

本文提供的數值為近似值，並且實驗數值可以在20%的範圍內變化，較佳為在10%的範圍內變化，更佳為在5%的範圍內變化。

如圖3所示，本文揭露的方法包含以下步驟：(a)以一澄清劑及用於標記一細胞成分的至少一標記劑處理一組織標本，以獲得一澄清且標記的組織標本；(b)生成該澄清且標記的組織標本的一個三維影像；(c)對該三維影像執行一影像切片程序以生成複數個二維影像；(d)從該複數個二維影像中辨識出一目標二維影像以獲得一距離值D1，其中D1係為該目標二維影像與該三維影像的一預定表面之間的距離；(e)自該澄清且標記的組織標本製備一硬化組織標本；以及(f)在該硬化組織標本的一預定位置附近進行切割以獲得一組織切片，其中該預定位置與該三維影像預定表面所對應的該硬化組織標本的一表面之間的距離係為D1。

本發明之方法始於收集自接受診斷的一個體的一組織樣品或標本。該個體係指一哺乳類，包含人類及非人類，例如靈長類、鼠類、狗、貓、牛、馬、兔、豬等。該個體不論是已經患病或是容易患病，通常會進行活體組織切片(biopsy)，即從一個體的身體中移除一塊組織的過程，以便隨後可以分析該標本以確定疾病是否存在及其程度。為了獲取一組織標本以依據本文揭露之方法進行檢視，可以執行各種類型的活體組織切片。活體組織切片的例子包含皮膚活體組織切片、內視鏡活體組織切片、針穿刺活體組織切片、骨髓活體組織切片以及手術活體組織切片。

在本文所揭露方法的步驟(a)中，使用一澄清劑及用於標記一細胞成分的至少一標記劑處理一組織標本。此種組織澄清(tissue clearing)過程藉由使一組織的多種折射率均勻化而令該組織在光學上清晰或透明，因而減少了光散射並且提高了光穿透力。因此，組織澄清使得厚度約為150-250 µm的厚組織標本在用顯微鏡觀察前，幾乎不經歷任何物理性組織切片，故能減少由於組織的拉伸、彎曲及撕裂而可能產生的人為偏差。

在某些實施例中，該澄清劑係為一水性澄清劑，該水性澄清劑的折射率為1.33-1.55，較佳為1.40-1.52，更佳為1.45-1.52。該澄清劑包含一溶劑及一折射率(refractive index，RI)吻合材料。該溶劑可以是水、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS；例如137 mM氯化鈉、2.7 mM氯化鉀、7.7 mM磷酸氫二鈉和1.47 mM磷酸二氫鉀溶於水，pH 7.4)或其他無機緩衝液。該水性澄清劑可以藉由在水或PBS中加入一折射率吻合材料來製備，該折射率吻合材料可選自由甘油(glycerol)、碘苯六醇(以Histodenz之名販售)、甲醯胺(formamide)、三乙醇胺(triethanolamine)、泛影葡胺(meglumine diatrizoate)及其任意組合所組成的群組。該折射率吻合材料在該水性澄清劑中的最終濃度可以在30-70wt%之間變化。使用此種水性澄清劑的組織澄清可以在室溫下進行2至12小時，較佳為2至8小時，更佳為2至4小時。

除了經過澄清處理，組織標本亦被加以標記，該標記係透過用於標記一細胞成分的至少一標記劑，該細胞成分例如細胞膜、細胞核、或者具有特定胺基酸序列或特定修飾或特定構形的一蛋白質。在某些實施例中，該標記劑係為一螢光染劑，或一螢光染劑與一分子探針的一綴合物，該分子探針係選自由促進劑、拮抗劑、抗體、卵白素、寡核苷酸、脂質核苷酸及毒素所組成的群組。不同種類的標記劑適合用於標記不同目標。舉例而言，細胞核可以用碘化丙啶(propidium iodide，PI)、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)及SYTO系列染劑(例如，購自Thermo Fisher Scientific的SYTO 16和SYTO 40)、NucRed染劑、或NucGreen染劑進行標記。細胞的膜狀構造可以用親脂性螢光染劑進行標記，例如Di系列染劑(例如，購自Invitrogen的DiD和DiR)、PKH系列染劑(例如，購自Merck的PKH26和PKH67)。有關一疾病的一標誌蛋白質可以用一級抗體(primary antibody)和二級抗體(secondary antibody)進行標記，該一級抗體能專一地結合該標誌蛋白質，而該二級抗體能辨識該一級抗體。

步驟(a)之實施可以透過將該組織標本分別或同時與該澄清劑及該標記劑接觸。在某些較佳實施例中，該澄清劑與該標記劑係包含於一澄清組合物中，且該澄清組合物進一步包含一滲透劑，使得組織澄清和組織標記可以在單一步驟中完成。在該澄清組合物中，折射率吻合材料較佳為選自由放射造影劑(例如碘克沙醇(iodixanol))、單糖(例如果糖)、寡糖(例如蔗糖)及其任意組合所組成的群組。該滲透劑較佳為一界面活性劑，該界面活性劑係選自由聚山梨醇酯100、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、十二烷基硫酸鈉(SDS)、正十二烷基-β-D-麥芽糖苷(DDM)、尿素、3-[3-(膽胺丙基)-二甲基胺]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、去氧膽酸鈉及其任意組合所組成的群組。該折射率吻合材料的濃度可介於30%至80% (w/v)。該滲透劑的濃度可介於0.1%至2%(v/v)。該標記劑的濃度可介於100 ng/ml 至1 mg/mL。

用於澄清和標記步驟的組織標本可以是新鮮的或庫存的。在一實施例中，該組織標本係立即從一患者身體的一部分(例如固態瘤)收集而得，因此處於新鮮狀態。在另一實施例中，該組織標本係依據本技術領域中熟習技藝者已知的樣品製備方法經過處理，稱其為一庫存標本。該樣品製備方法可以包含固定(fixing)、脫水(dehydration)、滲透(infiltration)及包埋(embedding)的步驟。固定是一種防止腐爛及維持組織形態的程序。在此程序中，一組織標本在室溫下被浸入一固定劑，例如福馬林(依質量計4%甲醛於緩衝鹽水中)，浸泡時間通常為4-48小時，該時間依組織標本的大小而異。脫水是一種藉由使用濃度遞增的脫水劑處理一被固定的標本以去除該標本中水分的程序。例如，施以70%、95%及100%的醇類，例如乙醇，然後再用二甲苯(xylene)處理。滲透是使一包埋介質(例如樹脂或蠟)滲透到標本中的程序。滲透的一個例子是將一脫水的標本置入二甲苯和及一熔融蠟(例如加熱至56-60^o C的石蠟(paraffin wax))的一混合物中。包埋之實施係將一被滲透的標本轉移到一包埋容器中，隨後將包埋介質(例如熔融石蠟)導引至該標本周圍並使其冷卻以形成一組織硬塊(亦稱為組織塊)。經過福馬林固定及石蠟包埋處理的庫存標本被稱為經過FFPE處理。

在組織標本是新鮮的情況下，在澄清和標記步驟之前，該標本可以進一步以例如福馬林的固定劑在室溫下固定6至12小時。或者，當待檢查的標本係經過FFPE處理時，在澄清和標記步驟之前，可以在室溫下用二甲苯及醇類分別對其脫蠟2小時及4-6小時。

在步驟(a)的組織澄清和標記過程中，該組織標本可以被包埋於一包埋材料，例如一瓊脂膠或一水凝膠。包埋處理能為該標本提供物理性的支持。在一實施例中，瓊脂膠係由含有1-4%w/w瓊脂(agarose)的溫熱水溶液製備而得。在另一實施例中，該水凝膠係由至少一種天然或合成聚合物的水分散液製備而得，該水分散液會在溫度、pH值、鹽分或輻射發生變化時固化。該聚合物的例子包括海藻酸鹽(alginates)、透明質酸鹽(hyaluronates)及丙烯醯胺類聚合物(acrylamide-based polymers)。

在接下來的步驟(b)中，藉由顯微鏡技術生成該澄清且標記的組織標本的一個三維影像。在某些實施例中，使用掃描式雷射顯微鏡取得該澄清且標記的組織標本在不同深度的複數個連續二維影像，由該些影像得以重建出一個三維影像。掃描式雷射顯微鏡的例子包括掃描式雷射共軛焦顯微鏡(laser scanning confocal microscopy，LSCM)、雙光子顯微鏡(two-photon microscopy)、三光子顯微鏡(three-photon microscopy)、以及線掃描共軛焦顯微鏡(line-scanning confocal microscopy)。其他涉及掃描技術的顯微鏡如旋轉盤共軛焦顯微鏡(spinning disk confocal microscopy)或層光顯微術(light-sheet microscopy)亦可應用於本文揭露的方法以產生組織標本的三維影像。因此，本發明的範圍不應被限制於掃描式雷射顯微鏡技術。鑒於掃描程序係在一完整的組織標本上執行，換言之，該組織標本是在切分成片之前被掃描，故由本文揭露的方法所獲得的三維影像具有更少的影像損失。

在接下來的步驟(c)中，對該三維影像執行一影像切片程序以生成複數個二維影像。該影像切片程序是一虛擬的切片程序，在此過程中該三維影像被切片為多個虛擬切片。每個影像切片可以如同一傳統二維影像呈現在一顯示器上，顯現出被成像組織標本的一剖面圖。虛擬影像切片在影像處理領域中是眾所周知的，因此為了方便起見，將省略關於虛擬影像切片的相關描述。

對該三維影像的虛擬切片可以是沿著X軸、Y軸、Z軸或其組合而進行。在某些實施例中，該三維影像是相繼地沿著三個軸被切片而產生三批次的二維影像(即在XY平面、YZ平面及XZ平面上的複數個二維影像)。前述X軸、Y軸及Z軸可被解釋為一歐幾里得空間的座標軸，而該三維影像可以表示為該歐幾里得空間中的一向量。在某些實施例中，沿著該三個軸虛擬地對該三維影像切片，以生成XY平面、YZ平面及XZ平面上的複數個二維影像。該X軸、Y軸及Z軸的方向不受特定限制，只要該X軸、Y軸及Z軸彼此垂直即可。換言之，該X軸、Y軸及Z軸共同構成一可以任意旋轉的正交集(每個都是一單位矢量)。

在某些實施例中，該三維影像被切成不同片以生成具有生物學特徵概況的複數個二維影像。該生物學特徵概況可以是一生物分子的表現概況、組織形態異常的分期(staging)概況、或其他生物性特徵的概況。在某些實施例中，該生物學特徵係可以被量化和評估的疾病特徵。舉例來說，該生物學特徵可以是一癌症的特徵蛋白質的表現量、美國癌症聯合委員會(America Joint Committee on Cancer AJCC)所制定的TNM分期、或利用臨床醫學領域已知的分析方法可判定的腫瘤侵襲狀態。

病變組織是非均質的，特別是腫瘤/癌症組織。非均質性使得病變組織從不同方向上看起來明顯不同。請參考圖4a及4b，其描述三維影像在不同方向上的虛擬切片。圖4a從左到右顯示了對一正常乳房組織標本在XY平面、XZ平面、或YZ平面的方向上進行切片。該正常乳房組織標本係採集自一健康個體，並且進一步經過澄清及被用於標記細胞膜和細胞核的螢光染劑加以標記。圖4b從左到右顯示了對一乳癌組織標本在XY平面、XZ平面、或YZ平面的方向上進行切片。該乳癌組織標本係採集自一乳癌病患，並且進一步經過澄清及被用於標記細胞膜和細胞核的螢光染劑加以標記。由圖4b可以明顯看出，從XY平面、XZ平面、或YZ平面觀察到的乳癌組織的三維影像十分不同。相對地，在圖4a中，從XY平面、XZ平面、或YZ平面觀察到的正常乳房組織的三維影像顯示出相似的圖樣。

在接下來的步驟(d)中，從該複數個具有各自生物學特徵概況的二維影像中辨識出一目標二維影像。由於在一批二維影像中，一特定的二維影像可以藉由一距離值D1加以定義，該D1係指該目標二維影像與該三維影像的一預定表面之間的距離，故對該目標二維影像的辨識可以產出一個確定的D1值。此D1值不僅指出該目標二維影像在該三維影像中的位置，亦指示該目標二維影像所對應的一特定部分在該組織標本中的位置。因此，該D1值可用於輔助自一組織標本製備一特定組織切片。

請參考圖5a，其係人體肺部組織標本的三維影像。該標本經過澄清，隨後被標記上一用於標記細胞核的螢光染劑(顯示為紅色)、一用於標記細胞膜的螢光染劑(顯示為藍色)，以及一抗甲狀腺轉錄因子1 (TTF-1)抗體，該抗體被一結合Alexa Flour 555(一種螢光染劑)的二級抗體(顯示為綠色)所辨識。TTF-1通常用作診斷評估疑似肺癌案例的一種預測與預後標誌物。肺癌可分為以下四個等級(grades)：第1級(亦標示為+)，有6%至25%的腫瘤細胞呈TTF-1陽性；第2級(亦標示為++)，有26%至50%的腫瘤細胞呈TTF-1陽性； 第3級(亦標示為+++)，有51%到75%的腫瘤細胞呈TTF-1陽性；以及第4級(亦標示為++++)，超過75%的腫瘤細胞呈TTF-1陽性。

為了識別及進一步評估一個三維影像中的生物學特徵，例如蛋白質表現量或腫瘤區域，一種直接的做法是採用三維特徵辨識演算法(3D feature recognition algorithms)，例如三維卷積神經網絡(convolutional neural network，CNN)。然而，執行這類演算法涉及昂貴的運算基礎架構，以致限制了三維影像分析的應用。此外，這類演算法僅能辨識一個三維影像中的某些特徵，卻無法擷取最具代表性且足以作為臨床診斷基礎的二維影像。因此，在臨床診斷領域中，利用基於二維影像的特徵辨識演算法來分析二維影像切片而非對三維影像進行分析是更為適當的。

圖5a中的三維影像在XY、XZ、或YZ平面的方向上虛擬地被切成多批次的複數二維影像，並且各批次二維影像中的每一二維影像中的TTF-1表現量以TTF-1陽性細胞數與細胞總數的比例加以測定。在一特定批次的二維影像中的一特定二維影像可以被此二維影像與該三維影像的一預定表面之間的距離值D1予以定義。舉例而言，D1可以是一個二維影像在一個三維影像的頂部表面下方的垂直深度(µm)。如圖5b所示，在YZ平面方向上的不同深度切片而得的複數二維影像具有不同的TTF-1表現量(以百分比表示)，而具有TTF-1最高表現量的二維影像可被辨識為位於該三維影像頂部表面下方的197 µm處。同樣地，在XY或XZ平面方向上的不同深度切片而得的複數二維影像中，可以辨識出具有TTF-1最高表現量的二維影像。相關結果如表1所示。

依據表1，不同批次二維影像的TTF-1平均表現量是相似的，但是TTF-1最高表現量卻明顯不同，顯示出腫瘤組織的非均質性。此外，透過病理學家對該組織標本的顯微鏡檢查，具有TTF-1最高表現量的三個二維影像被確認為表現肺癌的形態。因此，該三個二維影像中的任一者可被選作目標二維影像。較佳地，在YZ-平面(即沿著X軸)方向上深度為197 µm (即D1值)處切片而得的二維影像被選為目標二維影像。表 1

	XY平面	YZ平面	XZ平面
TTF-1平均表現量(%)	32.7%	32.4%	32.5%
具有TTF-1最高表現量的二維影像的深度(µm)	104	197	170
具有TTF-1最高表現量的二維影像中的細胞數 (TTF-1陽性細胞/所有細胞)	63/139	102/173	87/152
TTF-1最高表現量(%)	45.3%	59.0%	57.2%
基於TTF-1最高表現量的肺癌分級	++	+++	+++

當一目標二維影像被辨識出並且獲得D1值，即可從該澄清且標記的組織標本中切割出含有目標二維影像所揭示之結構特徵的一組織切片。依據本文所揭露方法的步驟(e)和(f)，該澄清且標記的組織標本經過處理而形成一硬化的組織標本，使其被切片時不會變形。隨後，在該硬化組織標本的一預定位置附近進行切割，該預定位置係取決於D1值而變動。更具體而言，該預定位置與該三維影像預定表面所對應的該硬化組織標本的一表面相隔D1的距離。該對應表面的一個例子是硬化組織樣本的頂部表面或底部表面。

該硬化組織標本之製備可以但不限於透過包埋組織標本於一包埋介質，例如石蠟，或者將組織標本在低於-5^o C的溫度冷卻。該硬化組織標本接著被移至一切片機，以便在預定位置附近進行切片。該切片機係一種切片設備，用於製作微米級的材料薄片。傳統的切片機包括一可調整樣品座，其能固定標本並且調整標本的位置和方向；一可移動刀片，其可被移動到相對於標本的最佳切片位置；以及支援其他功能的運作部件，該其他功能諸如設定切片厚度和機械性修剪(trimming)。在某些實施例中，使用傳統切片機對該硬化組織標本的預定位置進行切片而產生一組織切片。在其他實施例中，自高於該預定位置1-15 µm處至低於該預定位置1-15 µm處對該硬化組織標本進行連續切片，以生成至少二個或更多的組織切片，對其進行染色並且經過病理學家檢查之後，可以從其中選出一個最具代表性的組織切片。

本文揭露的方法可進一步包含在步驟(e)之前自該澄清且標記的組織標本移除標記劑，或者在步驟(f)之後自該組織切片移除標記劑。當標記劑係在步驟(f)之後被移除，可以透過將組織切片浸泡於去除緩衝液(stripping buffer)中的方式去除標記劑。該去除緩衝液的一個例子是含有0.8%二巰基乙醇(2-mercaptoethanol)及2% SDS的Tris緩衝液。該浸泡程序可以在室溫或更高溫度下進行。在一較佳實施例中，先利用二甲苯(或以Hemo-De之名販售的D-檸檬烯(D-limonene))與酒精將組織切片脫蠟，接著在室溫下用PBS潤洗該組織切片。其後，將該組織切片在約56°C浸泡於去除緩衝液中45分鐘，並用PBS清洗。

本文揭露的方法可進一步包含在標記劑被移除之後，將組織切片染色以獲得一染色的組織切片。組織染色可以透過本技術領域中眾所周知的染色方法進行。染色方法的例子包括但不限於H&E染色、免疫組織化學法(IHC)、免疫螢光(IF)染色、及原位螢光雜合(FISH)染色。

在執行免疫組織化學法的一實施例中，組織切片之染色係先使用一級抗體在4°C下進行約12小時，接著使用一與呈色酵素(chromogenic enzyme)結合的二級抗體在室溫下進行約30分鐘。其後，該組織切片在室溫下浸泡於一色素原(chromogen)溶液中約5分鐘。最後，該組織切片在室溫下以蘇木素進行複染約4分鐘，再以蒸餾水清洗。

綜上所述，本文揭露的方法係利用一種減少影像損失的三維組織病理學成像方法來生成一組織標本的高傳真度三維影像，並且在實體切片之前，利用虛擬影像切片及基於二維影像的特徵辨識演算法來分析該組織標本的構造，最終完成從該組織標本中取得含有預先識別的組織病理學特徵的組織切片。鑒於所揭露方法中的三維影像生成過程不涉及將組織標本切成片段，因此可以預期有較少的甚至於沒有影像損失。此外，對沿著多個坐標軸切片而得的二維影像進行分析，可以產生豐富的資訊，使醫護人員能夠做出更可靠的診斷決定，並且提出更合適的治療建議。例如，醫師可以依靠從二維影像中獲得的人類表皮生長因子受體2(HER2)的表現概況來判定一病患是否符合賀癌平(Herceptin，即曲妥珠單株抗體(trastuzumab))治療的條件。對HER2狀態的準確評估可以確保唯有可以從賀癌平治療中獲益的病患才會接受該種治療。

本文揭露的方法可以在包含一三維組織病理學成像系統，且該系統與一切片機相連的一平台上操作。該三維組織病理學成像系統包含一顯微鏡及一處理器。該顯微鏡可以是能建立一組織標本的一個三維影像的傳統顯微鏡。該處理器可以是任何能執行電腦指令的設備。特別是，該處理器被設置為對該三維影像進行一影像切片程序以生成複數個二維影像，辨識出一目標二維影像，以及產出一距離值D1。該處理器可以是但不限於一微處理器、一微控制器或一中央處理單元(central processing unit，CPU)。該處理器可以包含於一電腦內，該電腦進一步包含用於儲存電腦指令的記憶單元。該切片機可以是能對標本的一預定位置進行切割的一傳統切片機。實施例 1 自乳房組織標本製備乳房組織切片

自一位可能患有乳癌的女性病患採集一新鮮的乳房組織標本。該組織標本首先用4%甲醛固定，接著以0.1-1% Triton-100進行滲透處理。隨後，利用SYTO 16及DiD染色該組織標本以分別標記細胞核及細胞膜。各該標記係在室溫下進行8小時。接著，將該標記的標本在室溫下浸入一水性澄清劑中約8小時。該澄清且標記的組織標本具有約150 µm的厚度，對其成像時係使用一掃描式雷射共軛焦顯微鏡系統(LSM780；Zeiss)從標本頂部表面至底部表面進行，以獲取該標本的約100個連續二維影像，然後將該些二維影像用於生成該標本的一個三維影像。該些影像的橫向解析度(在X和Y方向上)為小於1 µm，且軸向解析度(在Z方向上)為小於2 µm。

對該三維影像在沿著Z軸的方向上進行虛擬切片以生成一批二維影像，接著，該些二維影像經過病理學家檢視以辨識出在鄰近腫瘤邊緣顯現基質(stroma)的影像。此一特徵會受到關注是因為臨床研究顯示，基質的形態與癌細胞轉移的風險相關。圖6a-6e分別顯示了自該三維影像的一頂部表面下方深度為30 µm、60 µm、90 µm、120 µm及150 µm處切片而得的二維影像。圖6f係圖6e的複製圖，圖中的基質和腫瘤邊緣分別以點線及短劃線描繪出輪廓。在該些影像中，僅在圖6e中可觀察到基質。因此，圖6e被辨識為目標二維影像。由於圖6e係位在該三維影像的頂部表面下方深度為150 µm處，距離值D1設定為與該三維影像頂部表面相距150 µm。

隨後，將該標本脫水並包埋於石蠟中，接著使用一滑動式切片機(pfm Slide 2003)對被包埋的標本連續切片，切片的位置係為該被包埋標本的頂部表面(對應該三維影像的頂部表面)下方深度為150 µm處附近。執行切片動作3-7次，得到厚度為5 µm的複數個組織切片，取其中一個組織切片，依據本技術領域中已知的H&E染色方法製備為一染色組織切片，並使用MoticEasyScan數位玻片掃瞄器(Motic，San Francisco，美國)對其攝像。圖6g是該H&E染色切片的顯微影像。顯而易見地，圖6g和圖6e在組織形態上是相似的，說明了本文揭露的方法可用於直接製備具有事先識別出的組織病理學特徵的組織切片。

無。

本技術領域之熟習技藝者憑藉以下對最佳實施方式的詳細說明並參照所附圖式將清楚理解本發明，在該圖式中：

圖1係描述一種傳統的三維組織病理學成像方法；

圖2係描述另一種傳統的三維組織病理學成像方法；

圖3係描述本文所揭露方法之步驟的流程圖；

圖4a顯示一正常乳房組織標本的三維影像在XY平面、XZ平面或YZ平面的虛擬切片；

圖4b顯示一乳癌組織標本的三維影像在XY平面、XZ平面或YZ平面的虛擬切片；

圖5a係為一肺部組織標本的三維影像；該標本以二種螢光染劑分別標記細胞核及細胞膜，同時亦被標記以一抗甲狀腺轉錄因子1 (anti-thyroid transcription factor 1，TTF-1)抗體，該抗體被一結合螢光染劑的二級抗體所辨識；

圖5b顯示三批次二維影像中的每一二維影像中的TTF-1表現量，其中每一批二維影像係對圖5a之三維影像在XY平面、YZ平面或XZ平面(即分別沿著Z軸、X軸、或Y軸)的方向上依不同深度切片而生成；

圖5c顯示沿著XY平面切片並且呈現TTF-1最高表現量的二維影像；

圖5d顯示沿著YZ平面切片並且呈現TTF-1最高表現量的二維影像；

圖6a係為自一乳房組織標本的三維影像頂部表面下方深度為30 µm處切片而得的二維影像；

圖6b係為自一乳房組織標本的三維影像頂部表面下方深度為60 µm處切片而得的二維影像；

圖6c係為自一乳房組織標本的三維影像頂部表面下方深度為90 µm處切片而得的二維影像；

圖6d係為自一乳房組織標本的三維影像頂部表面下方深度為120 µm處切片而得的二維影像；

圖6e係為自一乳房組織標本的三維影像頂部表面下方深度為150 µm處切片而得的二維影像；

圖6f係圖6e的複製圖，圖中的基質(stroma)和腫瘤邊緣分別以點線及短劃線描繪出輪廓；及

圖6g係為一H&E染色切片的顯微影像，該染色切片含有圖6e所揭示的病理特徵。

無。

Claims (14)

1. 一種組織切片的製備方法，包含以下步驟： (a)  以一澄清劑及用於標記一細胞成分的至少一標記劑處理一組織標本，以獲得一澄清且標記的組織標本； (b) 生成該澄清且標記的組織標本的一個三維影像； (c)  對該三維影像執行一影像切片程序以生成複數個二維影像； (d) 從該複數個二維影像中辨識出一目標二維影像以獲得一距離值D1，其中D1係為該目標二維影像與該三維影像的一預定表面之間的距離； (e)  自該澄清且標記的組織標本製備一硬化組織標本；以及 (f)   在該硬化組織標本的一預定位置附近進行切割以獲得一組織切片，其中該預定位置與該三維影像預定表面所對應的該硬化組織標本的一表面之間的距離係為D1。
2. 如請求項1所述之方法，其中該澄清劑係為具有1.33-1.55之折射率的一水性澄清劑。
3. 如請求項1所述之方法，其中該標示劑係為一螢光染劑，或一螢光染劑與一分子探針的一綴合物，該分子探針係選自由促進劑、拮抗劑、抗體、卵白素、寡核苷酸、脂質核苷酸及毒素所組成的群組。
4. 如請求項1所述之方法，其中在步驟(a)中該組織標本係包埋於一包埋材料中。
5. 如請求項1所述之方法，進一步包含在步驟(f)之後自該組織切片移除該標記劑。
6. 如請求項5所述之方法，進一步包含在該標記劑被移除之後，將該組織切片染色以獲得一染色的組織切片。
7. 如請求項1所述之方法，其中該三維影像係藉由使用一顯微鏡技術掃描該澄清且標記的組織標本而生成。
8. 如請求項1所述之方法，其中在該影像切片程序中，對該三維影像之切片係沿著選自該三維影像的三個相互垂直軸的一個軸而進行。
9. 如請求項1所述之方法，其中該細胞成分係為一細胞膜、一胞器或一生物分子。
10. 如請求項9所述之方法，其中該目標二維影像係藉由測量該複數個二維影像中的每一二維影像中該生物分子的表現量而辨識出。
11. 如請求項1所述之方法，其中該目標二維影像係藉由測量該複數個二維影像中的每一二維影像中具有異常型態的細胞相對於所有細胞的比例而辨識出。
12. 如請求項1所述之方法，其中該澄清劑及該標記劑係包含於一澄清組合物中，且該澄清組合物進一步包含一滲透劑。
13. 如請求項12所述之方法，其中該澄清劑包含一折射率吻合材料，該折射率吻合材料係選自由放射造影劑、單糖、寡糖、及其任意組合所組成的群組。
14. 如請求項12所述之方法，其中該滲透劑係為一界面活性劑，該界面活性劑係選自由聚山梨醇酯100、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、十二烷基硫酸鈉(SDS)、正十二烷基-β-D-麥芽糖苷(DDM)、尿素、3-[3-(膽胺丙基)-二甲基胺]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、去氧膽酸鈉、及其任意組合所組成的群組。

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