JP2021508820A - 組織試料調製システム - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、光学分析用の生体組織試料の調製、より具体的には、組織透明化プロトコルに関する。
組織試料の化学的透明化は、組織試料(例えば、器官全体)における構造の検出および再構築のための重要な技法になっている。顕微鏡分析の場合、直接観察するために十分に薄い組織型は少ない。大部分の組織(例えば、生検試料、厚い組織試料、オルガノイドもしくはスフェロイドのような複合3D組織形成物、マウスのような小型成体哺乳動物の器官全体または全身または全胚)は、厚すぎるため、光が透過し得ない。薄いスライス切片への組織の切断は、生物医学的に重要な情報が失われるという欠点を有する:生物学的構造は、本質的に三次元(3D)である。一方、数種の顕微鏡技術(例えば、共焦点顕微鏡法、二光子顕微鏡法、および光シート顕微鏡法)が、組織の3Dイメージを得るために利用可能である。しかしながら、生物学的標本は本来、UV-VIS-NIR域の光学的な光に対して不透明である。
独立クレームにおいて指定される、光学分析用の生体組織試料を調製する改善された方法、生物学的試料の調製のための対応するシステムおよびキットを提供することが、目的である。本発明の態様は、従属クレームにおいて与えられる。本明細書中に記載された態様および例は、相互排他的である限り、相互に自由に組み合わせられてよい。
(a)組織試料を第1の固定溶液を用いて固定する工程;
(b)固定された組織試料を、試料の膨張を誘導するのに適したカオトロピック剤を含む脱脂溶液に浸漬する工程;
(d)組織試料を1種または複数種の染色溶液を用いて染色する工程;
(f)染色された組織試料を、試料の収縮を誘導するのに適した有機脱水溶液中で脱水する工程;および
(g)固定された組織試料を有機透明化溶液に浸漬する工程
を含む。
− 第1の固定溶液を用いて固定された、固定された組織試料を受け取る工程;
− 固定された組織試料を、試料の膨張を誘導するのに適したカオトロピック剤を含む脱脂溶液に浸漬する工程;
− 組織試料を1種または複数種の染色溶液を用いて染色する工程;
− 染色された組織試料を、試料の収縮を誘導するのに適した有機脱水溶液中で脱水する工程;および
− 固定された組織試料を有機透明化溶液に浸漬する工程
のために構成されている。
− 脱脂溶液を洗浄除去する工程;
− 後続の工程における染色分子の非特異的結合を最小化するため、脱脂溶液を洗浄除去した後に、試料をブロッキング溶液に浸漬する工程;
− 染色溶液を洗浄除去する工程。
− 組織試料または選択されたその成分の染色のために使用される予定の染料によって生成される光シグナルの波長を同定する工程;
− 同定された波長を含む波長域の光を試料に照射して、該波長域における試料の自己蛍光を選択的に除去または低減する工程。
・20体積%のQuadrol、
・5体積%のツイーン80、
・5%のトリエタノールアミン(TEA)、
・5%のジメチルスルホキシド(DMSO)、
・1ml当たり約3μgのヨウ化プロピジウム。
・25体積%のQuadrol、
・5体積%のツイーン80、
・5%のトリエタノールアミン(TEA)、
・5%のジメチルスルホキシド(DMSO)、
・1ml当たり約3μgのヨウ化プロピジウム。
*)脾臓のようないくつかの器官の強力な屈曲のため、投影面積は、それぞれの組織の幅および長さの横方向サイズとして決定された。
100 方法
102〜116 工程
202 第1の固定溶液
204 脱脂溶液
206 染色溶液
208 第2の固定溶液
210 有機脱水溶液(エタノール)
211 試料輸送システム
212 有機透明化溶液
213 ポンプ
214〜222 キット
301 組織試料
301' 調製され透明化された組織試料
302 試料調製システム
304 試料分析システム、例えば、顕微鏡
306 試料ローディングユニット
308 第1の固定ユニット
310 試料浸漬ユニット
312 光退色ユニット
314 染色ユニット
316 第2の固定ユニット
318 脱水ユニット
320 透明化ユニット
322 試料取り出し(unloading)ユニット
354 試料浸漬ユニット
502 組織試料を通過する光シートのイメージ
802 表
803 脳組織試料
806 96穴プレート
808 バープロット
Claims (20)
- 調製された試料の体積および/または形態の、元の組織の体積または形態からのずれが最小化されるように、光学分析用の生体組織試料(301)を調製する方法(100)であって、
(a)該組織試料を、第1の固定溶液(202)を用いて固定する工程(102);
(b)固定された該組織試料を、該試料の膨張を誘導するのに適したカオトロピック剤を含む脱脂溶液(204)に浸漬する工程(104);
(d)該組織試料を、1種または複数種の染色溶液(206)を用いて染色する工程(108);
(f)染色された該組織試料を、該試料の収縮を誘導するのに適した有機脱水溶液(210)中で脱水する工程(112);および
(g)固定された該組織試料を有機透明化溶液(212)に浸漬する工程(114)
を含む、方法。 - (c)染料の放射波長および/または励起波長のうちの一つまたは複数を含む波長域における前記試料の自己蛍光を選択的に除去または低減するために、該波長域の光を該試料に照射する工程
をさらに含む、請求項1記載の方法。 - (e)洗浄および脱水が実施される前に、染色された前記組織試料を、第2の固定溶液(208)を用いて固定する工程(110)
をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。 - 前記有機脱水溶液によって誘導される組織収縮が、前記脱脂溶液によって誘導される膨張によって前もって補償されるように、該脱脂溶液の組成が選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- − 前記カオトロピック剤が、前記元の試料の体積の少なくとも15%だけ、または該元の試料の体積の少なくとも20%だけ、前記試料の体積の膨張を引き起こすのに適しており;かつ/または
− 前記脱脂溶液によって誘導される膨張と、前記脱水溶液によって誘導される収縮との組み合わせ効果が、該元の未処理の組織試料の体積から15%未満、好ましくは10%未満、好ましくは5%未満だけずれている透明化された組織試料を提供するように、該脱脂溶液の組成が選択される、
前記請求項のいずれか一項記載の方法。 - 前記カオトロピック剤が、非イオン性カオトロピック剤、具体的には尿素もしくはチオ尿素、またはイオン性カオトロピック剤グアニジウム、具体的にはグアニジウム塩の形態で提供されるグアニジウムである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 前記脱脂溶液が、5〜30体積%、好ましくは10〜25体積%、好ましくは15〜25体積%、より好ましくは20〜25体積%のアミノアルコール、具体的には、N,N,N',N',-テトラキス(2-ヒドロキシプロピル)エチレンジアミンを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 前記脱脂溶液が水性透明化溶液である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 前記組織を第1の固定組成物中で固定する工程、固定された前記組織試料を脱脂溶液に浸漬する工程、固定された該組織試料を染色する工程、脱水する工程、および有機透明化溶液に浸漬する工程が、灌流工程なしの自動化または半自動化されたプロセスにおいて実施される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 前記有機透明化溶液が、ベンジルアルコールと安息香酸ベンジルとの混合物(BABB)であり、
前記方法が、該有機透明化溶液を調製する工程を含み、該調製が、有機透明化溶液の屈折率が前記試料の組織型の屈折率と同一になるかまたは類似するような、ベンジルアルコールと安息香酸ベンジルとの比を選択することを含む、
前記請求項のいずれか一項記載の方法。 - 前記試料が、少なくとも0.5cm3、または少なくとも0.75cm3、または少なくとも1cm3の体積を有する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 前記試料が、該試料が前記第1の固定溶液を用いて固定される前に、既に、レポータータンパク質、または染色されたバイオマーカー、薬物、もしくは代謝物質を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- − 透明化された前記組織試料の染色された部分構造の3Dプロットを、光シート蛍光顕微鏡を使用して生成する工程(116)
をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。 - − 第1の固定溶液(202)を用いて固定(102)された、固定された組織試料を受け取ること;
− 固定された該組織試料を、該試料の膨張を誘導するのに適したカオトロピック剤を含む脱脂溶液(204)に浸漬すること(104);
− 該組織試料を1種または複数種の染色溶液(206)を用いて染色すること(108);
− 染色された該組織試料を、該試料の収縮を誘導するのに適した有機脱水溶液(210)中で洗浄および脱水すること(112);ならびに
− 固定された該組織試料を有機透明化溶液(212)に浸漬すること(114)
のために構成されている、光学分析用の生体組織試料を調製するための自動化または半自動化されたシステム(302、352)。 - − 脱脂溶液(204)、1種もしくは複数種の染色溶液(206)、第2の固定溶液(208)、有機脱水溶液(120)、および有機透明化溶液(212)を含む複数の溶液の各々のための試薬容器を含み;
− 試料輸送手段(211)と、試薬容器のうちの1個にそれぞれ連結された複数個の試料容器(C1〜C6)とを含み、請求項14に従って前記試料が該複数の溶液の各々に少なくとも1回浸漬されるよう、半自動的もしくは完全自動的に試料輸送を調整するように構成されているか;または
− 該試薬容器のうちの1個および試料容器(C0)にそれぞれ連結された1個もしくは複数個のポンプ(213)を含み、請求項14に従って前記試料が該複数の溶液の各々に少なくとも1回浸漬されるよう、該ポンプを調整するように構成されている、
請求項14記載の自動化または半自動化されたシステム(302、352)。 - − 5体積%〜30体積%、好ましくは5体積%〜15体積%の少なくとも1種のカオトロピック剤と、5〜30体積%の少なくとも1種の界面活性剤とを含む脱脂溶液;および
− 有機透明化溶液
を含む、1種または複数種の組織試料を調製するためのキット(214、216、218、220、222)。 - 前記カオトロピック剤が、非イオン性カオトロピック剤またはグアニジウム、具体的には、グアニジウム塩の形態で提供されるグアニジウムである、請求項16記載のキット。
- 前記カオトロピック剤が、尿素またはチオ尿素である、請求項16〜17のいずれか一項記載のキット。
- 前記脱脂溶液が、5〜30体積%、好ましくは10〜25体積%、好ましくは15〜25体積%、より好ましくは20〜25体積%のアミノアルコール、具体的には、N,N,N',N',-テトラキス(2-ヒドロキシプロピル)エチレンジアミンをさらに含む、請求項16〜18のいずれか一項記載のキット。
- 前記少なくとも1種の界面活性剤が、少なくとも2種の異なる界面活性剤の組み合わせ、具体的には、トリエタノールアミン(TEA)とツイーン(Tween-)80との組み合わせである、請求項16〜18のいずれか一項記載のキット。
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