JP2016185075A - 検体分析方法および検体分析装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】検体分析方法は、測定試料に熱を与えてDNAに変性を生じさせるS14の処理工程と、測定試料から生じる自家蛍光を抑制するブリーチング処理を行うS21の処理工程と、測定試料中の被検物質に蛍光色素を結合させるS16、S17の処理工程と、測定試料に光を照射して蛍光色素から生じる蛍光を撮像するS19の撮像工程と、を含む。S21のブリーチング工程の前にS14のDNA変性処理工程を行う。
【選択図】図1
Description
図1に示すように、検体分析方法は、病変組織から採取した測定試料に対する前処理工程として、脱パラフィン処理工程、賦活化処理工程、プロアテーゼ処理工程、DNA変性処理工程、ブロッキング処理工程、1次抗体処理工程、2次抗体処理工程および保存工程を実行する。各処理工程で用いる試薬等の具体的な処理内容は、後述の検証において示されている。ここでは、各処理工程における処理を包括的に説明する。
以下、本願発明者らが見出した手法を、検証とともに説明する。検証では、HER2遺伝子とともにCEP17を前処理工程において標識した。HER2遺伝子を標識する蛍光色素の励起波長は640nmであり、CEP17を標識する蛍光色素の励起波長は730nmである。核を染色する染料の励起波長は405nmである。HER2遺伝子を標識する蛍光色素は、波長640nmの光により消光し、波長405nmの光で活性化する。以下の検証では、HER2遺伝子を標識する蛍光色素を対象に、細胞から生じる自家蛍光の影響等の検討を行った。
検証では、以下の方法で前処理工程を行った。
ベンタナインフォームDual ISH HER2キット(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)を用い、HER2 Dual ISH3-in-1コントロールスライド(ventana)上のヒト乳癌細胞MCF7のFISH染色を実施した。
Dry Block Bath THB(アズワン)上で、65℃、20分間、コントロールスライドを乾燥させた。75℃で5分間、Ez Prepをスライド上に乗せ脱パラフィンを行った。この操作を5回繰り返した後、コントロールスライドをReaction Bufferに浸漬した。
Dry Block BathTHBを90℃にし、コントロールスライドにCC2を滴下し、10分間コンディショニングを行った。コントロールスライドが乾燥しないように、CC2は適宜追加した。この操作を3回行った後、コントロールスライドをReaction Bufferに4分間浸漬した。
コントロールスライド上にISH Protease IIを滴下し、カバーガラスを被せ、37℃のインキュベーターに入れた湿潤箱中で16分間酵素処理を行った。コントロールスライドを2×SSCに4分間、3回浸漬し洗浄した。
HybReadyとHER2 DNAカクテルプローブを混合した混合液を、コントロールスライドに滴下した後、カバーガラスを被せ、ペーパーボンドで封入した。Dry Block BathTHB上で95℃で20分間、コントロールスライドの乳癌細胞に対して熱変性を行った。その後、44℃のインキュベーターに入れた湿潤箱中で、コントロールスライドに対しオーバーナイトでハイブリダイゼーションを行った。コントロールスライドを62℃の2×SSCに4分間浸漬しストリンジェンシー洗浄を行った。この操作を3回繰り返した後、コントロールスライドをReactionBufferに浸漬した。
コントロールスライド上に1% BSA/Reaction bufferを滴下し、カバーガラスを被せ、37℃のインキュベーターに入れた湿潤箱中で20分間ブロッキングを行った。その後、コントロールスライドをReaction bufferに浸漬し、洗浄した。
Rabbit Anti DNP Abをと、Mouse Anti DIG Abをを混合した混合液を、コントロールスライドに滴下し、カバーガラスを被せ、37℃のインキュベーターに入れた湿潤箱中で20分間反応させた。その後、コントロールスライドReaction Bufferに3分間浸漬し、洗浄した。これを3回行った。
Alexa Fluor 647F(ab’)2fragment of goat anti-rabbit IgG (H+L) (Life Technologies, A-21246)、Alexa Fluor 750 Goat Anti Mouse IgG(H+L) (Life Technologies,A-21037)、Hoechst 33342(Life Technologies, H1399, をPBSに希釈して保存したもの)を1%BSA/Reactionbufferで希釈した混合液を、コントロールスライドに滴下し、カバーガラスを被せ、37℃のインキュベーターに入れた湿潤箱中で20分間反応させた。その後、コントロールスライドをTBSTに5分間浸漬し洗浄した。この操作を3回行った。
コントロールスライドを精製水に浸漬し洗浄した。この操作を2回行った後、コントロールスライドを37℃のインキュベーターで15分間乾燥させ、観察まで4℃の暗所にて保存した。
検証1では、上記処理による前処理工程において、ブリーチング工程を行うタイミングを変えて自家蛍光の抑制状態を確認した。検証1では、3つの実施例1〜3で自家蛍光の抑制効果を確認できたが、2つの比較例では、一度抑制された自家蛍光が回復したことが確認された。実施例1〜3および比較例1、2では、以下のようにブリーチング工程を行った。
プロテアーゼ処理工程前にコントロールスライドにReaction bufferを滴下し、カバーガラスで封入した。その後、コントロールスライドを蛍光顕微鏡にセットして蛍光画像を取得した後、波長640nmのレーザ光を470W/cm2のパワーで2分間コントロールスライドに照射してブリーチング処理を行った。プロテアーゼ処理後に再度同一視野で蛍光画像を取得した。
ブロッキング処理工程前にコントロールスライドにReaction bufferを滴下し、カバーガラスで封入した。その後、コントロールスライドを蛍光顕微鏡にセットして実施例1とは異なる視野にて蛍光画像を取得した後、波長640nmのレーザ光を470W/cm2のパワーで2分間コントロールスライドに照射してブリーチング処理を行った。ブロッキング処理後に再度同一視野で蛍光画像を取得した。
実施例2で観察を行った視野について、一次抗体処理後に再度蛍光画像を取得した。
賦活化処理工程前にコントロールスライドにReaction bufferを滴下し、カバーガラスで封入した。その後、コントロールスライドを蛍光顕微鏡にセットして実施例1〜3とは異なる視野にて蛍光画像を取得した後、波長640nmのレーザ光を470W/cm2のパワーで2分間コントロールスライドに照射してブリーチング処理を行った。賦活化処理後に再度同一視野で蛍光画像を取得した。
実施例1で蛍光画像を取得した視野について、DNA変性処理工程を行った後に再度蛍光画像を取得した。
図6(a)は、比較例1の検証結果を示す図である。図6(a)の左端の画像は、コントロールスライドのヒト乳癌細胞に対して脱パラフィン処理工程を行った後、賦活化処理工程を行う前にコントロールスライドを撮像した撮像画像である。図6(a)の左端の撮像画像に示すように、脱パラフィン処理後の乳癌細胞では自家蛍光が撮像された。撮像画像上の白く光る部分が自家蛍光である。
検証2では、加熱温度と自家蛍光の回復度との関係を検討した。検証2では、ブリーチング処理の後、コントロールスライドの温度を3つの温度に同じ時間維持し、その後、自家蛍光の回復度を確認した。検証2では、コントロールスライドのヒト乳癌細胞に対して脱パラフィン処理工程のみを行った後、ブリーチング処理を行った。ブリーチング処理では、平行光を視野絞りで絞ってコントロールスライドに一定時間照射した。ブリーチング処理の前後において、それぞれ、コントロールスライドを蛍光顕微鏡で撮像して自家蛍光の撮像画像を取得した。その後、コントロールスライドを所定の温度に一定時間維持した後に再び蛍光顕微鏡で自家蛍光を撮像した。撮像に用いた蛍光顕微鏡には、図3に示す位相板110は含まれていない。
同様にして、破線の丸内の異なる8カ所について、自家蛍光回復率を算出し、計9カ所について平均と標準偏差を求めた。図8(b)、(c)の場合も同様の方法で、9カ所の自家蛍光回復率の平均と標準偏差を算出した。
検証3では、前処理工程においてブリーチング処理を行った場合と行わなかった場合とで、解析工程において蛍光色素からの蛍光の検出度合いがどのように変化するかを検討した。
検証例3においても、上述の前処理工程を行った。検証例3では、2次抗体処理工程前にコントロールスライドを顕微鏡にセットし、3通りの操作でブリーチング処理を行った。すなわち、操作1では、波長405nmのレーザ光を130W/cm2のパワーで2分間コントロールスライドに照射した。操作2では、波長514nmのレーザ光を200W/cm2のパワーで2分間コントロールスライドに照射した。操作3では、波長640nmのレーザ光を1100W/cm2のパワーで10分間コントロールスライドに照射する操作である。各操作では、互いに異なる3つの視野に対してレーザ光の照射を行った。
前処理工程で準備したコントロールスライドに対し、以下の組成のマウントメディウム50μLをスライドに滴下後、カバーガラスを被せ、マニキュアで固定した。
1M Tris (pH 7.4)5 μL
1M NaCl1 μL
25% glucose40 μL
2-mercaptoethanol1 μL
5000 U/mL Glucose Oxidase1 μL
1000 μg/mL catalase1 μL
H2O51 μL
撮像準備工程で準備したコントロールスライドを顕微鏡にセットし、ブリーチング処理で光照射した部位について、波長640nmのレーザ光を露光時間15msecで照射しながら蛍光画像を500枚取得した。露光時のレーザ光のパワーは690W/cm2とした。なお、画像取得時には、図3の撮像部100と同様、顕微鏡の鏡体と蛍光検出用のカメラとの間に位相板を設置し、蛍光が2点に分割される条件で撮像を行った。
撮像工程で取得した500枚の画像の内、500枚目に取得した画像について、一つの視野の中心に存在する任意の3つの細胞の核について、それぞれ核内に収まる任意の範囲を円で囲み、円内の蛍光強度の標準偏差を算出した。この作業をブリーチング処理工程で光照射した他の2つの視野についても行い、計9細胞の標準偏差を得た。続いてこの9カ所の標準偏差について、平均と標準偏差を算出した。
操作1〜3において光を照射しなかった部位についても、波長640nmのレーザ光をパワーで露光時間15msecで照射しながら、蛍光画像を500枚取得した。露光時のレーザ光のパワーは690W/cm2とした。この場合も、位相板を用いて撮像を行った。
図10(a)において、右側のグラフが操作1によりレーザ光を照射した部位から取得した核内蛍光強度の標準偏差の平均値であり、左側のグラフが操作1によりレーザ光を照射しなかった部位から取得した核内蛍光強度の標準偏差の平均値である。各グラフの頂上には、核内蛍光強度の標準偏差の標準偏差を示すバーが示されている。操作1では、ブリーチング処理によりレーザ光を照射した部位の方が非照射部位よりも標準偏差の平均値が低かった。すなわち、レーザ光を照射した部位の方が非照射部位よりも蛍光強度のバラつきが小さく、蛍光色素からの蛍光が分離良く検出されていることが分かる。
検証4では、蛍光色素の蛍光に対する自家蛍光の影響について検討した。
検証例4においても、上述の前処理工程を行った。検証例4では、2次抗体処理工程前にコントロールスライドを顕微鏡にセットし、波長514nmのレーザ光を200W/cm2のパワーで5分間照射してブリーチング処理を行った。撮像準備工程は、上記検証3と同様に行った。
撮像準備工程で準備したコントロールスライドを顕微鏡にセットし、ブリーチング処理で光照射した部位について、波長640nmのレーザ光を690W/cm2で5秒間照射した後、露光時間15msecで照射しながら蛍光画像を30枚取得した。なお、画像取得時には、図3の撮像部100と同様、顕微鏡の鏡体と蛍光検出用のカメラとの間に位相板を設置し、蛍光が2点に分割される条件で撮像を行った。
ブリーチング処理において光を照射しなかった部位についても、波長640nmのレーザ光を690W/cm2で5秒間照射した後、露光時間15msecで照射しながら蛍光画像を30枚取得した。この場合も、位相板を用いて撮像を行った。
図11(a)、(b)は、それぞれ、ブリーチング処理を行った場合の撮像画像とブリーチング処理を行わなかった場合の撮像画像である。図11(a)、(b)では、便宜上、輝点のペアを示すための白丸が撮像画像に追加されている。
上記検証結果に基づいて、本実施形態に係る検体分析装置1は、たとえば図12のように構成され得る。
100 … 撮像部
200 … 解析部
300 … 前処理部
301、302、304、307、307 … 処理ユニット
Claims (15)
- 測定試料に熱を与えてDNAに変性を生じさせるDNA変性処理工程と、
前記測定試料から生じる自家蛍光を抑制するブリーチング工程と、
前記測定試料中の被検物質に蛍光色素を結合させる標識工程と、
前記測定試料に光を照射して前記蛍光色素から生じる蛍光を撮像する撮像工程と、を含み、
前記ブリーチング工程の前に前記DNA変性処理工程を行う、検体分析方法。 - 前記測定試料に対する賦活化処理工程をさらに備え、
前記ブリーチング工程の前に前記賦活化処理工程を行う、請求項1に記載の検体分析方法。 - 前記測定試料に対する脱パラフィン処理工程をさらに備え、
前記ブリーチング工程の前に前記脱パラフィン処理工程を行う、請求項1または2に記載の検体分析方法。 - 前記ブリーチング工程は、前記測定試料に光を照射して前記測定試料から生じる前記自家蛍光を抑制する、請求項1ないし3の何れか一項に記載の検体分析方法。
- 前記撮像工程により得られた撮像画像を処理して前記被検物質を検出する解析工程をさらに含む、請求項1ないし4の何れか一項に記載の検体分析方法。
- 前記測定試料は、乳癌の病変組織から採取した細胞であり、
前記被検物質は、HER2遺伝子である、請求項1ないし5の何れか一項に記載の検体分析方法。 - 前記蛍光色素は、Alexa Fluor 647である、請求項6に記載の検体分析方法。
- 前記蛍光色素は、励起用の光が照射されると蛍光が励起される活性状態と、前記励起用の光が照射されても蛍光が励起されない不活性状態と、にスイッチング可能であり、
前記撮像工程は、前記蛍光色素を消光させる不活性化処理と、消光された前記蛍光色素のうち一部の前記蛍光色素を活性化する活性化処理と、測定試料に前記励起用の光を照射して前記蛍光を撮像する撮像処理と、を含む、請求項1ないし7の何れか一項に記載の検体分析方法。 - 測定試料に含まれる被検物質を撮像するための前処理を前記測定試料に施す前処理部と、
前記前処理部により前処理が施された前記測定試料を撮像する撮像部と、
前記撮像部により得られた撮像画像を処理して前記被検物質を抽出する解析部と、
を備え、
前記前処理部は、
前記測定試料に熱を与えてDNAに変性を生じさせるDNA変性処理を行う処理ユニットと、
前記測定試料に自家蛍光を抑制するためのブリーチング処理を行う処理ユニットと、
前記測定試料中の被検物質に蛍光色素を結合させる標識処理を行う処理ユニットと、を含み、
前記DNA変性処理を行う処理ユニットは、前記ブリーチング処理を行う処理ユニットよりも先に前記測定試料に処理を行い、
前記撮像部は、
前記前処理が施された前記測定試料に光を照射して前記蛍光色素から生じる蛍光を撮像する、検体分析装置。 - 前記測定試料に対して賦活化処理を行う処理ユニットをさらに備え、
前記賦活化処理を行う処理ユニットは、前記ブリーチング処理を行う処理ユニットよりも先に前記測定試料に処理を行う、前記請求項9に記載の検体分析装置。 - 前記測定試料に対して脱パラフィン処理を行う処理ユニットをさらに備え、
前記脱パラフィン処理を行う処理ユニットは、前記ブリーチング処理を行う処理ユニットよりも先に前記測定試料に処理を行う、請求項9または10に記載の検体分析装置。 - 前記ブリーチング処理を行う処理ユニットは、前記測定試料に光を照射して前記測定試料から生じる前記自家蛍光を抑制する、請求項9ないし11の何れか一項に記載の検体分析装置。
- 前記測定試料は、乳癌の病変組織から採取した細胞であり、
前記被検物質は、HER2遺伝子である、請求項9ないし12の何れか一項に記載の検体分析装置。 - 前記蛍光色素は、Alexa Fluor 647である、請求項13に記載の検体分析装置。
- 前記蛍光色素は、励起用の光が照射されると蛍光が励起される活性状態と、前記励起用の光が照射されても蛍光が励起されない不活性状態と、にスイッチング可能であり、
前記撮像部は、前記蛍光色素を消光させる不活性化処理と、消光された前記蛍光色素のうち一部の前記蛍光色素を活性化する活性化処理と、測定試料に前記励起用の光を照射して前記蛍光を撮像する撮像処理と、を実行する、請求項9ないし14の何れか一項に記載の検体分析装置。
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