KR20130093354A - Ｈｄａｃ６의 간암 진단용 마커 및 치료제로서의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간암 진단용 마커로서의 HDAC6 (Histone deacetylase 6)의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 HDAC6 유전자 또는 단백질을 이용한 간암 진단용 마커, 이를 이용한 간암 진단용 키트, 및 간암의 진단 방법에 관한 것이고, 또한 HDAC6 유전자의 발현을 회복시켜 간암을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법 및 상기 물질을 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 HDAC6 유전자는 비-간암의 조직 또는 세포에 비해 간암의 조직 또는 세포에서 발현양이 감소되는 것으로 확인됨에 따라 HDAC6 유전자를 간암 진단용 마커로 사용할 경우 간암을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있으며, 나아가 간암 치료제로 이용될 수 있다.

Description

ＨＤＡＣ６의 간암 진단용 마커 및 치료제로서의 용도{Use of HDAC６ as a diagnostic marker and therapeutic agent of hepatocellular carcinoma}

본 발명은 간암을 조기에 효과적으로 진단 및 예측할 수 있는 신규한 간암 진단용 마커, 간암 진단용 키트, 상기 간암 진단용 마커를 이용한 간암의 진단 방법, 상기 마커 물질을 이용한 간암 치료용 조성물 및 이의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

간암은 전 세계적으로 다섯 번째로 빈발하는 암이지만 그로 인한 사망률은 3위에 해당하는 공격적인 암이다(Ahn J, Flamm SL. Hepatocellular carcinoma. Dis Mon 2004;50:556-573). 치료목적의 수술은 단지 15%에서 25% 정도의 환자에게만 가능하고 대부분의 간암 환자들은 국부적으로 진행하거나 전이되는 질병들에 의해 비교적 단기간 내에 사망한다(Roberts LR, Gores GJ. Hepatocellular carcinoma: molecular pathways and new therapeutic targets. Semin Liver Dis 2005;25:212-225). 간암의 주요 원인으로 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus), C형 간염 바이러스(hepatitis C virus), 및 아플라톡신 B1(aflatoxin B1) 등이 잘 알려져 있다. 하지만, 지난 20년간 간암 환자의 전체적인 생존율은 크게 증가하지 않았고, 간암의 발달(development) 및 진전(progression) 기작은 여전히 잘 알려져 있지 않은 상태이다(Bruix J, et al. Focus on hepatocellular carcinoma. Cancer Cell 2004;5:215-219). 지금까지, 분자표적치료(molecular targeted therapy)가 성숙한 간암의 치료에 효과적인 것으로 나타났지만(Shen YC, Hsu C, Cheng AL. Molecular targeted therapy for advanced hepatocellular carcinoma: current status and future perspectives. J Gastroenterol;45:794-807), 어떻게 이러한 유전적 변화가 간암 환자들 개개인에게 관찰되는 임상적 특징들을 야기하는지는 불명확하다.

HDACs (Histone deacetylases)는 종종 보조억제자(corepressors)나 다중-단백질 전사복합체(multi-protein transcriptional complexes)들에 의해 유전자 프로모터에 붙을 수 있으며, 그곳에서 DNA에 직접 결합하지 않고 크로마틴(chromatin) 변형을 통해 전사를 조절한다(Thiagalingam S, Cheng KH, Lee HJ, Mineva N, Thiagalingam A, Ponte JF. Histone deacetylases: unique players in shaping the epigenetic histone code. Ann N Y Acad Sci 2003;983:84-100). 암호화된 사람 HDACs는 18개가 있으며, 이들은 클래스 I (HDAC 1, 2, 3 및 8), 클래스 II (HDAC 4, 5, 6, 7, 9 및 10), 클래스 III (SIRT 1-7), 및 클래스 IV (HDAC11) 효소들로 분류된다(Yang XJ, Seto E. The Rpd3/Hda1 family of lysine deacetylases: from bacteria and yeast to mice and men. Nat Rev Mol Cell Biol 2008;9:206-218). 히스톤 아세틸화 효소(acetyltransferases) 및 HDACs 모두 세포 증식, 분화 및 세포주기 조절에 관여한다는 사실이 알려져 있다(Witt O, Deubzer HE, Milde T, Oehme I. HDAC family: What are the cancer relevant targets? Cancer Lett 2009;277:8-21). 또한, HDACs의 병리학적 활성 및 조절감소(deregulation)가 암, 면역질환, 및 근이영양증(muscular dystrophy)과 같은 여러 질병들을 야기할 수 있다는 사실이 보고되었다(Yang XJ, Seto E. HATs and HDACs: from structure, function and regulation to novel strategies for therapy and prevention. Oncogene 2007;26:5310-5318). 하지만, HDACs의 암 발달에의 관여에도 불구하고, 암 발달의 조절과정에서 개별적인 HDACs가 수행하는 구체적인 역할들은 아직 밝혀져 있지 않다.

HDAC6는 HDACs의 클래스 IIb 패밀리 멤버이고, 미세소관(MTs)과 관련 있는 세포질내 탈아세틸화효소(cytoplasmic deacetylase)로 작용하며, 알파-튜뷸린(α-tubulin)을 탈아세틸화시킨다(Hubbert C, Guardiola A, Shao R, Kawaguchi Y, Ito A, Nixon A, et al. HDAC6 is a microtubule-associated Mis18α. Nature 2002;417:455-458). 반면에, 미세소관-관련 HDAC6는 리소좀에 의한 단백질 분해 경로에서 핵심적인 구성요소이며, 잘못 접히거나 폴리-유비퀴틴화된 단백질들과 직접적으로 반응하여 아그레좀(aggresome) 형성/오토파지(autophagy)를 통해 리소좀-매개 단백질 분해과정을 거치도록 한다(Kawaguchi Y, Kovacs JJ, McLaurin A, Vance JM, Ito A, Yao TP. The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress. Cell 2003;115:727-738, Boyault C, Zhang Y, Fritah S, Caron C, Gilquin B, Kwon SH, et al. HDAC6 controls major cell response pathways to cytotoxic accumulation of protein aggregates. Genes Dev 2007;21:2172-2181). 최근에는 HDAC6가 오토파고좀(autophagosome) 성숙을 조절하여 오토파고좀-리소좀 융합 단계에서 오토파지(autophagy) 조절에 관여한다는 사실이 밝혀졌다(Lee JY, Koga H, Kawaguchi Y, Tang W, Wong E, Gao YS, et al. HDAC6 controls autophagosome maturation essential for ubiquitin-selective quality-control autophagy. EMBO J;29:969-980). 또한 HDAC6가 아그레좀 단백질 분해 과정에서 잘못 접힌 단백질들의 수송에 중요한 역할을 함으로써, 세포를 단백질 응집체의 유해한 효과로부터 방어한다는 사실이 보고되었다(Kwon S, Zhang Y, Matthias P. The deacetylase HDAC6 is a novel critical component of stress granules involved in the stress response. Genes Dev 2007;21:3381-3394). 또한 HDAC6는 여러 핵심적인 세포 기능 조절을 통해 여러 암들의 상피-중간엽 전이(epithelial-mesenchymal transition)를 조절하는 것으로 보고되었으며(Lee YS, Lim KH, Guo X, Kawaguchi Y, Gao Y, Barrientos T, et al. The cytoplasmic deacetylase HDAC6 is required for efficient oncogenic tumorigenesis. Cancer Res 2008;68:7561-7569, Shan B, Yao TP, Nguyen HT, Zhuo Y, Levy DR, Klingsberg RC, et al. Requirement of HDAC6 for transforming growth factor-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition. J Biol Chem 2008;283:21065-21073), HDAC6의 발현이 종양 변환(oncogenic transformation), 비정착적 증식(anchorage-independent proliferation), 및 종양 공격성(tumor aggressiveness)과 관련이 있다는 사실을 뒷받침하는 여러 증거들이 있다.

또한, 유전적 제거 또는 특정 siRNA 단편에 의한 HDAC6의 불활성화는 종양 변환에 대한 저항성을 증가시키고 시험관 및 생체 내 실험 모두에서 사람 유방 및 자궁암 세포주의 성장을 감소시킨다고 보고되었다(Sakuma T, Uzawa K, Onda T, Shiiba M, Yokoe H, Shibahara T, et al. Aberrant expression of histone deacetylase 6 in oral squamous cell carcinoma. Int J Oncol 2006;29:117-124, Rey M, Irondelle M, Waharte F, Lizarraga F, Chavrier P. HDAC6 is required for invadopodia activity and invasion by breast tumor cells. Eur J Cell Biol;90:128-135). 추가로, 다양한 종양 및 세포주에서의 HDAC6의 상향조절(up-regulation)은 HDAC6가 암에서 중요한 역할을 할 것이라는 점을 보여주었다.

하지만, 본 발명자들의 전사체(transcriptome) 분석 데이터에 따르면 HDAC6는 정상조직과 비교해서 간암에서 하향조절(down-regulation)을 나타내었으며, 사람 간암 조직에서의 HDAC6의 초기 분석 결과에 따르면 간암에서 HDAC6의 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명자들은 간 종양발생과정에서의 HDAC6의 종양 억제자로서의 생물학적 기능을 밝히기 위하여, 조직 마이크로어레이(TMA) 분석방법을 이용하여 종양 및 정상 조직에서의 HDAC6 발현을 측정하였다. 그 결과 HDAC6 과발현은 간암 세포에서 Beclin 1/LC3-II 의존적 오토파지(autophagy)가 일어나도록 오토파지 JNK/c-Jun 활성 신호전달 경로를 거쳐 전-오토파지(pro-autophagic) 세포사멸을 매개한다는 사실을 밝히고 본 발명을 완성하게 되었다. 또한 HDAC6의 종양 억제 활성은 안정적으로 HDAC6를 과발현하는 세포주를 사용한 생체 내 실험을 통해서도 확인되었다.

본 발명의 목적은 HDAC6(Histone deacetylase 6) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질로 이루어진 간암 진단용 마커를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 HDAC6 유전자의 수준 또는 HDAC6 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 HDAC6 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계를 포함하는 간암 예측 및 진단방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 간암을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 HDAC6를 이용한 간암 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 HDAC6 (Histone deacetylase 6) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 HDAC6 단백질로 이루어진 간암 진단용 마커를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 HDAC6 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 HDAC6 (Histone deacetylase 6) 유전자의 수준 또는 HDAC6 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 HDAC6 유전자의 수준을 측정하는 물질은 HDAC6 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 HDAC6 단백질의 수준을 측정하는 물질은 HDAC6 단백질을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다.

또한, 본 발명은 (a) 생물학적 시료에 존재하는 HDAC6 (Histone deacetylase 6) 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 대조군 시료의 HDAC6 유전자의 발현양 또는 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는 간암 예측 및 진단방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 HDAC6 유전자의 발현양 또는 HDAC6 단백질의 양을 측정하는 방법은, 이에 제한되는 것은 아니나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역블랏(immunoblot) 분석, 면역조직화학염색법, 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군중에서 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은, (a) HDAC6 (Histone deacetylase 6) 유전자 또는 HDAC6 단백질을 포함하는 간암 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 HDAC6 유전자의 발현양, HDAC6 단백질의 양 또는 HDAC6 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, HDAC6 유전자의 발현양, HDAC6 단백질의 양 또는 HDAC6 단백질의 활성이 증가되는 경우에 상기 시료는 간암의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 간암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 HDAC6 유전자의 발현양, HDAC6 단백질의 양 또는 HDAC6 단백질의 활성을 측정하는 방법은, 이에 제한되는 것은 아니나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역블랏(immunoblot) 분석, 면역조직화학염색법, 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군중에서 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 HDAC6 (Histone deacetylase 6) 또는 이의 발현을 촉진하는 물질을 포함하며, JNK-매개 Beclin 1 경로(JNK-mediated Beclin 1 pathway)를 활성화시켜 오토파지(autophagy)에 의한 세포사멸을 촉진하는 기작을 갖고 있는 것을 특징으로 하는 간암 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 HDAC6 유전자는 정상 조직 또는 세포에 비해 간암의 조직 또는 세포에서 그 발현양이 감소되는 것을 확인하였다. 따라서 HDAC6 유전자를 간암 진단용 마커로 사용할 경우 간암을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있으며, 나아가 간암 치료제의 개발을 위한 표적으로 활용할 수 있다.

도 1은 사람 간암 조직 및 간암 세포주에서 HDAC6 발현의 하향조절 또는 제거를 보여준다. (A) 간암 종양전 결절(preneoplastic nodules)의 마이크로어레이 분석에 기초한 HDAC6 mRNA의 유전자 발현. (LGDN, low-grade dysplastic nodule; HGDN, highgrade dysplastic nodule; G1-3, Edmondson grades I~III.) P값은 unpaired t test (*P = 0.0124, **P = 0.0001, ***P < 0.0001; two-tailed)를 이용하여 산출했다. (B) 사람 간암 및 인접한 비-종양 조직에서의 HDAC6 발현을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. (T, 간암 조직; N, 인접한 비-종양 조직) 알파-튜뷸린 및 GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 를 로딩 컨트롤(internal loading controls)로 사용하였다. (C) 조직 마이크로어레이에 로딩한 사람 간암 및 인접한 비-종양 조직 쌍에서 HDAC6에 대한 면역조직화학 염색. (a) HDAC6에 대해 강하게 염색된 대표적인 비-종양 간세포. (b) HDAC6에 대해 약한 양성 염색을 보인 간암의 예(원본 배율 ×200). (D) 노던 및 웨스턴 블랏 분석에 의한 사람 간암 세포주에서의 내생적 HDAC6 발현. RNA 및 단백질 로딩을 조절하기 위해 베타-액틴 프로브(β-Actin probe) 및 GAPDH를 각각 사용하였다. 각각의 실험은 적어도 2반복씩 수행하였다.
도 2는 Hep3B 세포에서 HDAC6의 에토픽 발현이 카스파아제-비의존적인 세포사멸을 유도한다는 것을 보여준다. (A) 세포를 대조군(None), 빈 벡터(Mock), 또는 1㎍의 HDAC6 발현벡터(pcDNA_HDAC6)로 형질도입시켰다. 왼쪽 패널은 HDAC6 및 아세틸화된 알파 튜뷸린(Ac-α-tubulin)의 수준을 웨스턴 블랏 분석으로 측정한 것이다. 알파-튜뷸린을 로딩 컨트롤로 사용하였다. 오른쪽 패널은 HDAC6를 과발현하는 Hep3B 세포의 대조군(Mock 또는 None)에 대한 성장률을 보여준다. 세포 수는 트립판 블루를 이용한 핵 염색으로 측정하였다. 데이터는 세 번의 독립된 실험들의 평균과 표준편차로 표시하였다. (B) 세포증식률을 A570에서의 MTT 흡광도로 측정하였다. 데이터는 세 번의 독립된 실험들의 평균±표준편차로 나타내었다(unpaired student t test, *P < 0.05 vs. Mock). (C) 대조군(None), 빈 벡터(Mock), 또는 1 또는 2 ㎍의 HDAC6 발현벡터(pcDNA_HDAC6)로 형질도입 시킨 Hep3B 세포들의 유세포분석 결과. FITC-표지된 Annexin V-양성 세포들(오른쪽 위와 오른쪽 아래)을 세포사멸 세포로 간주하였다. 두 번의 독립적인 실험들을 수행하였다. (D) 대조군(None), 빈 벡터(Mock), 또는 1 또는 2 ㎍의 HDAC6 발현벡터(pcDNA_HDAC6)로 형질도입시킨 Hep3B 세포들에서 세포사멸 단백질에 대한 웨스턴 블랏 분석. 알파-튜뷸린을 로딩 컨트롤로 사용하였다. (E) 세포주기 분포를 측정하기 위해 유세포분석을 사용하였다. 대조군(None), 빈 벡터(Mock), 또는 1㎍의 HDAC6 발현벡터(pcDNA_HDAC6)로 형질도입 시킨 Hep3B 세포들을 수집하여 PI로 염색하였다. (F) 대조군(None), 빈 벡터(Mock), 또는 1 또는 2 ㎍의 HDAC6 발현벡터(pcDNA_HDAC6)로 형질도입 시킨 Hep3B 세포에서 세포주기 단백질의 발현을 측정하기 위해 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. 알파-튜뷸린을 로딩 컨트롤로 사용하였다.
도 3은 Hep3B 세포에서 HDAC6의 에토픽 발현이 오토파지에 의한 세포사멸을 유도한다는 것을 보여준다. (A) 세포들을 대조군(None), 빈 벡터(Mock), 또는 1 또는 2 ㎍의 HDAC6 발현벡터(pcDNA_HDAC6)로 형질도입시켰다. 왼쪽 패널은 HDAC6, LC3B-II, 및 아세틸화된 알파-튜뷸린(Ac-α-tubulin)의 수준을 웨스턴 블랏 분석으로 측정한 것이다. 오른쪽 패널은 densitometric 분석으로 알파-튜뷸린 대 LC3B-II 비율을 측정한 것이다. 평균 LC3-II 밴드 강도를 평균 알파-튜뷸린 밴드 강도에 대해 표준화하였다(unpaired student's t test, *P < 0.05 vs. Mock). (B) Hep3B 세포들을 5 mM 의 3-MA 를 첨가하거나 첨가하지 않고 1시간 동안 전처리한 후, 1㎍의 HDAC6 발현벡터(pcDNA_HDAC6)를 형질도입 시켰다. LC3B-II 의 수준은 웨스턴 블랏 분석으로 측정하였다. 균등한 단백질 로딩을 확인하기 위해 막을 알파-튜뷸린에 대해 탐지하였다. 위 실험은 반복적으로 수행되었고 유사한 결과들을 얻었다. (C) 상기 (B)에서와 같은 방법으로 세포들을 전처리하고 형질도입시켰다. 살아 있는 세포들을 트립신화하고 형질도입 24시간 후에 트립판 블루 염색으로 수를 세었다. 표시된 결과들은 3번의 독립적인 실험들의 평균이며 에러 막대는 평균값의 표준편차를 나타낸다(unpaired student's t test, *P < 0.05 vs. Mock, **P < 0.05 vs. pcDNA_HDAC6). (D) 상기 (B)에서와 같은 방법으로 Hep3B 세포들을 전처리하고 형질도입시킨 후, 고정하고, 투명화하고(permeabilized), LC3B 항체로 면역염색하고, 형광현미경으로 관찰하였다. 관찰된 이미지에서, 녹색 형광은 오토파고좀의 LC3-FITC 염색을 나타내며, 파랑 형광은 Hoechst-염색된 핵을 나타낸다. 세포질 내의 LC3-FITC 염색의 패턴은 확산형(diffuse)에서 주로 점(punctate)/수포(vesicular)형으로 바뀌었다.
도 4는 간암 세포주에서 HDAC6가 오토파지에 의한 세포사멸을 유도한다는 것을 보여준다. 위쪽 패널, (A) HepG2, (B) SNU182, (C) SNU368, 및 (D) SNU 449 세포들을 대조군(None), 빈 벡터(Mock), 또는 1㎍의 HDAC6 발현벡터(pcDNA_HDAC6)로 형질도입. 간암 세포주의 증식률은 A570 에서의 MTT 흡광도로 측정하였다. 에러 막대는 적어도 3반복으로 수행한 실험들의 표준편차를 보여준다. 모든 측정은 3반복으로 수행하였으며, 각각의 실험들은 적어도 2번씩 반복하였다. 아래쪽 패널, 웨스턴 블랏 분석으로 측정한 LC3B-II 변환 수준. 알파-튜뷸린을 로딩 컨트롤로 사용했다. 실험은 반복적으로 수행했다.
도 5는 HDAC6의 지속적인 과발현이 시험관 및 생체 내 실험에서 Hep3B 세포의 종양생성 능력을 소멸시킨다는 사실을 보여준다. (A) 안정적인 HDAC6 과발현 세포주를 본 발명의 실시예에 기재한 바와 같이 확립하였다. 좌측 패널, 면역블랏(immunoblot) 분석은 지속적인 HDAC6 과발현을 보여주며, 이것은 HDAC6 과발현 세포주(Hep3B_HDAC6 클론 #1 및 클론 #2) 대 대조군(Hep3B_Mock)에서의 알파-튜뷸린의 저아세틸화에 의해 확인된다. 우측 패널, 확립된 HDAC6 과발현 세포주(Hep3B_Mock, Hep3B_HDAC6 클론 #1 및 #2)의 세포성장 분석. MTT 어세이를 통해 상대적인 성장률을 측정하였다. 데이터는 세 번의 실험의 평균과 표준편차로 나타내었다. (B) 면역형광현미경은 LC3 스팟 분포가 HDAC6 과발현 세포(Hep3B_HDAC6 클론 #1)에서 달라짐을 보였다. 위 실험은 2반복으로 수행되었고 유사한 결과가 나왔다. (C) 투과전자현미경으로 관찰한 (a) 대조군(Mock) 및 (b) HDAC6 과발현 세포(Hep3B_HDAC6 클론 #1)의 정상 성장 조건 하에서의 미세구조. 화살표는 오토파고좀(autophagosomes) 또는 오토파고리소좀(autophagolysosomes)과 같은 오토파지 액포(autophagic vacuoles)의 존재를 의미한다. (c-d) 화살표로 나타낸 영역은 더 높은 배율에서 나타낸 것이고 오토파고좀과 오토파고리소좀의 상세 구조를 보여준다. 실험은 3반복으로 수행하였다. (D) 빈 벡터(Mock) 또는 (Hep3B_HDAC6 클론 #1 및 #2)를 안정적으로 발현하는 Hep3B 세포의 종양세포 성장률. 종양의 크기는 캘리퍼스(calipers)를 사용하여 3차원적으로 측정하였다. 종양의 부피(㎣)는 길이×/ 2 로 계산하였다. 표준 에러막대는 평균의 표준편차를 나타낸다. (E) 각각의 시간 지점에서의 마우스 모습(위)과 절개한 종양(아래). (F) 종양에서 발현된 HDAC6, Beclin 1, 및 아세틸화된 알파-튜뷸린(Ac-α-tubulin)의 웨스턴 블랏 분석. 결과는 임의로 선택한 이종이식 종양에서의 HDAC6 수준, 알파-튜뷸린의 아세틸화 상태, 및 Beclin 1 발현을 나타낸다.
도 6은 HDAC6 과발현이 Beclin 1 발현을 상향조절함으로써 오토파지를 활성화시킨다는 것을 보여준다. (A) 좌측 패널, Beclin 1 발현을 대조군(Hep3B_Mock) 및 HDAC6 과발현 세포주(Hep3B_HDAC6 클론 #1 및 #2)에서 웨스턴 블랏 분석으로 조사하였다. 20 uM 의 세라미드(ceramide)를 24시간 처리한 Hep3B 세포를 Beclin 1 도입에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. 우측 패널, 그래프 막대는 LC3B-II 대 α-tubulin 비율을 나타낸다(unpaired student's t test, *P < 0.05 vs. Mock). (B) 좌측 패널, HDAC6 과발현 세포(Hep3B_HDAC6 클론 #1)들을 대조군(None), 100 nM의 scrambled siRNA (Scr), 또는 100 nM 또는 200 nM 의 HDAC6-특이적 siRNA로 형질도입 시켰다. 그 후 Beclin 1 및 LC3B-II 발현수준을 웨스턴 블랏 분석으로 측정하였다. 우측 패널, 그래프 막대는 Beclin 1 대 α-tubulin 비율을 나타낸다(unpaired student's t test, *P < 0.05 vs. Scr). (C) 좌측 패널, 오토파지를 막기 위해 HDAC6를 안정적으로 발현하는 Hep3B 세포주 (Hep3B_HDAC6 Clone #1 및 #2) 및 빈 벡터(Hep3B_Mock)를 형질도입한 세포들에 5 mM 3-MA 를 처리하였다. Beclin 1 및 LC3B-II 의 발현수준을 면역블랏팅으로 측정하였다. 우측 패널, 그래프 막대는 Beclin 1 대 α-tubulin 비율을 보여준다(unpaired student's t test, *,**P < 0.05 vs. None in Hep3B_HDAC6 Clone #1 및 #2 ). (D) 좌측 패널, 대조군(Hep3B_Mock) 및 HDAC6 과발현 세포주(Hep3B_HDAC6 Clone #1 및 #2)를 100 nM scrambled siRNA (Scr) 또는 100 nM Beclin 1-특이적 siRNA로 형질도입시켰다. Beclin 1 및 LC3B-II 의 발현수준을 웨스턴 블랏 분석으로 측정하였다. 우측 패널, 그래프 막대는 LC3-II 대 α-tubulin 비율을 보여준다(unpaired student's t test, *,**P < 0.05 vs. Scr in Hep3B_HDAC6 Clone #1 및 #2 ). 알파-튜뷸린을 모든 실험에서 로딩 컨트롤로 사용하였다. 단백질 밴드들의 신호 강도는 세 번의 독립적인 웨스턴 블랏 실험의 이미지들로부터 스캔해서 정량했다. 모든 실험에서, Beclin 1및 LC3-II 밴드의 평균 강도는 평균 알파-튜뷸린 밴드의 강도에 대해 표준화하였다.
도 7은 간암 세포에서 HDAC6 매개 Beclin 1-의존적 오토파지에 의한 JNK/c-Jun 활성을 보여준다. (A) 대조군 (Hep3B_Mock) 및 HDAC6 과발현 세포주(Hep3B_HDAC6 Clone #1 및 #2)에서 JNK, phospho-JNK (p-JNK), c-Jun 및 phospho-c-Jun (p-c-Jun)의 발현수준을 면역블랏팅으로 측정하였다. (B) HDAC6 과발현 세포(Hep3B_ HDAC6 Clone #1)를 대조군(None), 100 nM scrambled siRNA (Scr), 또는 50 nM 또는 100 nM HDAC6-특이적 siRNA로 형질도입 시켰다. HDAC6-특이적 siRNA로 형질도입한 후에 면역블랏팅으로 HDAC6, JNK, phospho-JNK (p-JNK), c-Jun, phospho-c-Jun (p-c-Jun), Beclin 1, 및 LC3B-II 단백질의 발현수준을 측정하였다. (C) JNK 신호전달을 억제하기 위해 대조군(Hep3B_Mock) 및 HDAC6 과발현 세포 클론(Hep3B_HDAC6 Clone #1)에 10 uM의 SP600125를 처리하거나 처리하지 않고, HDAC6, JNK, phospho-JNK (p-JNK), c-Jun, phospho-c-Jun (p-c-Jun), Beclin 1 및 LC3B-II 단백질의 발현 수준을 면역블랏팅으로 측정하였다. 균등한 로딩을 확인하기 위해 모든 막 블랏은 알파-튜뷸린에 대해 재탐침(reprobed)되었다.
도 8은 HDAC6가 ROS 축적에 미치는 영향을 보여준다. (A) Hep3B 세포들을 각각 처리하지 않거나(None), 빈 mock 벡터(Mock), 1 및 2㎍의 pcDNA 3.1-HDAC6 발현벡터(pcDNA_HDAC6)로 48시간 동안 형질도입시켰다. 그 후 세포들을 H2DCFDA로 30분간 염색하고, 세포 ROS 수준을 유세포 분석기로 관찰하였다. (B) 그래프 막대는 대조군(None)과 비교한 ROS의 상대적인 수준을 나타낸다.

본 발명자들은 세포질내 탈아세틸화효소인 HDAC6가 JNK 활성 Beclin 1 의존적 경로를 거쳐 카스파아제(caspase)-비의존적 오토파지(autophagy)에 의한 세포사멸을 매개함으로써 사람 간암 세포에서 종양 억제제로 기능할 수 있음을 밝혔다. HDAC6의 발현은 간암에서 억제되거나 상실되며, 본 발명의 실시예에 따르면, HDAC6의 에토픽(ectopic) 발현은 시험관 및 생체 실험 모두에서 종양 성장을 억제하였다. 또한, 간암 세포에서 HDAC6는 JNK/c-Jun 신호전달 경로를 활성화시켜, Beclin 1/LC3B-II 의존적 오토파지를 활성화시켰다. 이러한 발견들은 간암 발병기작에서 HDAC6가 중요한 역할을 한다는 것을 보여주며, HDAC6가 간암 치료에 있어 중요한 치료 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.

라이신(lysine)에 의한 히스톤의 아세틸화는 크로마틴 컨포메이션 (conformation) 및 유전자 발현의 주된 후성학적(epigenetic) 조절요소이다. 히스톤 아세틸화의 동적인 특성은 히스톤 아세틸화효소(acetyltransferase)의 활성과 HDAC 효소들 사이의 균형에 의해 결정된다(Thiagalingam S, et al. Histone deacetylases: unique players in shaping the epigenetic histone code. Ann N Y Acad Sci 2003;983:84-100). HDACs는 유전자 전사, 단백질 발현, 단백질-단백질 상호작용, 단백질의 세포내 위치지정(localizations), 및 세포 신호전달과 같은 다양한 세포 활동에 관여한다(Witt O, et al. HDAC family: What are the cancer relevant targets? Cancer Lett 2009;277:8-21). HDACs가 암의 발병 및 진전과 관련이 있는 여러 단백질들의 발현 및 활성을 조절한다는 증거들이 축적되고 있다(Marks P, Rifkind RA, Richon VM, Breslow R, Miller T, Kelly WK. Histone deacetylases and cancer: causes and therapies. Nat Rev Cancer 2001;1:194-202, 및 Glozak MA, Seto E. Histone deacetylases and cancer. Oncogene 2007;26:5420-5432). 여러 연구들에서 특정 HDAC 패밀리 멤버가 일부 종양들에서 이상 발현되고 암 세포의 징표를 조절하는 비-부수적인 기능을 갖고 있음이 밝혀졌다(Witt O, et al, 2009 및 Marks P, et al, 2001). 비정상적인 HDAC 활성이 종양형성 과정에서 시작되었으므로, 히스톤 아세틸화 상태를 변형시켜 비정상적으로 발현이 멈춘 종양 억제제 유전자들의 재발현을 촉진할 수 있는 HDAC 억제제를 개발하려는 상당한 노력이 투입되었다.

또한, HDAC6는 다수의 사람 암 세포주 및 마우스 종양 모델에서 과발현된다는 사실이 밝혀졌다. 또한, HDAC6는 암 세포가 생존하고 형질을 나타내기 위해 필요한 많은 신호전달 경로에서 중요한 역할을 하기 때문에 치료의 목표물로 여겨져 왔다(Aldana-Masangkay GI, Sakamoto KM. The role of HDAC6 in cancer. J Biomed Biotechnol;2011:875824). 예를 들어, HDAC6 발현은 구강 편평세포(squamous cell) 암(Sakuma T, et al. Aberrant expression of histone deacetylase 6 in oral squamous cell carcinoma. Int J Oncol 2006;29:117-124), 사람 유방암 조직(Yoshida N, et al. Prediction of prognosis of estrogen receptor-positive breast cancer with combination of selected estrogenregulated genes. Cancer Sci 2004;95:496-502), 및 급성 골수성 백혈병 세포(Bradbury CA, et al. Histone deacetylases in acute myeloid leukaemia show a distinctive pattern of expression that changes selectively in response to deacetylase inhibitors. Leukemia 2005;19:1751-1759) 등에서 상향조절되는 것으로 보고되었다.

하지만, 지금까지 사람 간암에서는 HDAC6의 생물학적 기능을 상세히 분석한 연구가 없었다. 본 발명자들은 이전 연구를 통해 사람 간암에서 병리조직학적 단계 사이에 나타나는 대규모의 유전자 발현 변화를 조사하였다(Nam SW, et al. Molecular changes from dysplastic nodule to hepatocellular carcinoma through gene expression profiling. Hepatology 2005;42:809-818). 이 실험의 마이크로어레이 데이터에 기초하여, 종양전 병변(preneoplastic lesions), 이형성결절(dysplastic nodules), 및 Edmoson's grades I~III 의 간암 세포에서의 HDAC6 발현을 재조사함으로써(도 1A), 본 발명자들은 HDAC6가 간암에서 하향조절된다는 것과, 다양한 간암 세포주에서도 하향조절 또는 소멸한다는 것을 발견하였다(도 1B-D). 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 HDAC6가 간암 생성과정에서 항-종양 기능을 갖고 있다고 생각하게 되었다. 또한, 본 발명자들은 HDAC6의 에토픽 발현이 세포주기 진행이나 세포자살(apoptosis)에 영향을 미치지 않고 간암 세포의 성장과 증식을 억제한다는 사실을 밝혔다(도 2). 결론적으로 위 결과들은 간암 발병과정에서 HDAC6가 종양 억제제로 작용한다는 것을 암시하므로, 암의 발달 및 진전에 있어서의 HDAC6의 종양 형성 기능에 관한 이전의 보고들과 배치된다.

HDAC6는 미세소관 및 액틴 세포골격과 연결될 수 있는 세포질에만 위치한다. 또한, HDAC6는 단백질 응집의 세포내 관리에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 다른 HDAC 패밀리 멤버와 달리, HDAC6는 유비퀴틴-결합 활성을 가지며 미세소관 및 F-액틴 세포골격 모두와 관련이 있다(Hubbert C, et al. HDAC6 is a microtubule-associated deacetylase. Nature 2002;417:455-458 및 Zhang X, Yuan Z, Zhang Y, Yong S, Salas-Burgos A, Koomen J, et al. HDAC6 modulates cell motility by altering the acetylation level of cortactin. Mol Cell 2007;27:197-213). 최근에, HDAC6가 오토파고좀과 리소좀의 융합을 조절하여, 진핵생물에서 진화적으로 보존되어 있는 단백질-분해 경로이며, 영양분이 제한된 조건에서 세포 생존에 필수적인 오토파지를 조절한다는 보고가 있었다(Lee JY, et al. HDAC6 controls autophagosome maturation essential for ubiquitin-selective quality-control autophagy. EMBO J;29:969-980 및 Levine B, Klionsky DJ. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev Cell 2004;6:463-477). 종양 발달의 초기 단계 동안에는 오토파지가 종양 성장을 억제하며, 종양 치료 중에 많은 세포들에서 오토파지에 의한 세포사멸이 일어난다(Levine B. Cell biology: autophagy and cancer. Nature 2007;446:745-747). 본 발명의 일실시예에서 HDAC6의 에토픽 발현은 LC3B-II 전환을 촉진시키고 살아 있는 Hep3B 세포수를 감소시켰으며, 이것은 오토파지의 특이적 억제제인 3-MA에 의해 억제되었다(도 3). 또한, 유사한 결과를 다른 간암 세포주(도 4)와 생체 내 마우스 종양 이종이식 실험에서(도 5D 및 E) 얻었다. 오토파지는 다양한 경로를 갖고 있으며 암과 많은 다른 질병들에서 흔히 오토파지 신호전달 경로의 이상이 발견되었다. 역설적으로 오토파지가 세포 생존과 암 발달 과정에서 그리고 암 치료에서 세포 사멸을 촉진한다는 사실이 보고되었으나(Rosenfeldt MT, Ryan KM. The multiple roles of autophagy in cancer. Carcinogenesis;32:955-963), 본 발명의 실시예는 HDAC6가 간암에서 오토파지에 의한 세포사멸을 활성화시킴으로써 종양 억제제로서 기능한다는 것을 보여준다.

mTOR (mammalian target of rapamycin), AIF (apoptosis-inducing factor), ROS (reactive oxygen species), and the CDK (cyclin-dependent kinase) 경로를 포함한 많은 신호전달 경로들이 오토파지를 조절하는데 중요한 역할을 한다(Levine B, Klionsky DJ, 2004). 이것이 HDAC6-유도 오토파지를 매개하는 기작의 기초가 되는지를 알아보기 위하여, 본 발명자들은 Hep3B 세포에서 HDAC6의 에토픽 발현에 의한 ROS 유도를 조사하였다. 하지만, HDAC6 과발현은 H2DCFDA-기반 유세포 분석에서는 발견되지 않았다(도 8). 한편, JNK의 활성이 Beclin 1 발현을 매개할 수 있고, 이것은 암 세포의 오토파지에 의한 세포사멸에 있어 핵심적인 역할이라는 것이 알려져 있다(Li DD, Wang LL, Deng R, Tang J, Shen Y, Guo JF, et al. The pivotal role of c-Jun NH2-terminal kinase-mediated Beclin 1 expression during anticancer agents-induced autophagy in cancer cells. Oncogene 2009;28:886-898). 본 발명의 일실시예에 따르면 마우스 종양 조직에서 Beclin 1이 HDAC6 과발현 Hep3B 세포로부터 유도되었다(도 5F). Beclin 1은 오토파지에 의한 분해를 위해 세포질로부터 단백질을 결합시키거나 막 구성물에 오토포지 경로를 제공하는데 중요한 역할을 할 수 있으며(Liang XH, et al. Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin 1. Nature 1999;402:672-676), 또한 포유동물에서 오토파지 및 세포자살(apoptosis)의 중요한 '분자 스위치'가 될 수 있다(Kang R, Zeh HJ, Lotze MT, Tang D. The Beclin 1 network regulates autophagy and apoptosis. Cell Death Differ;18:571-580). 또한, Beclin 1 기능이상이 암을 포함한 여러 질병들에서 관찰되고 있으며, 따라서 세포의 매크로오토파지를 촉진함으로써 종양 억제제로 기능할 수 있다고 생각된다. Beclin 1의 종양-억제효과가 오토파지에 의한 세포사멸과 연관될 수 있지만, 어떻게 오토파지에 의한 세포사멸 과정에서 Beclin 1 발현이 조절되는지는 아직 밝혀져 있지 않다. 본 발명의 일실시예에서 Hep3B 세포에서의 HDAC6 과발현은 잠재적인 오토파지 유도제인 세라미드(ceramide)와 유사한 방식으로 Beclin 1 발현을 촉진시켰다. 대조적으로, HDAC6의 siRNA 사일런싱(silencing)은 Beclin 1 유도 및 오토파지를 차단했고, 이것은 감소된 LC3B-II 전환으로 확인할 수 있었다(도 6A 및 B). Beclin 1 유도와 HDAC6-유도 오토파지 사이의 관련은 3-MA가 HDAC6 과발현 세포에서 Beclin 1 발현을 억제한다는 사실에 의해 더욱 강화되었다(도 6C).

암 세포의 오토파지 조절 기작에 관한 이전의 연구들은 오토파지가 class II PI3K, 단백질 키나아제 mTOR, 세포외 신호-조절 키나아제(kinase), 및 p38 경로와 같은 다양한 신호전달 경로에 의해 조절된다는 것을 보고하였다(Levine B. Cell biology: autophagy and cancer. Nature 2007;446:745-747). 오토파지에 있어 JNK의 역할에 관한 이러한 연구들은 암세포에서 항암제-유도 오토파지를 조사함으로써 수행되었고(Li DD, Wang LL, Deng R, Tang J, Shen Y, Guo JF, et al. The pivotal role of c-Jun NH2-terminal kinase-mediated Beclin 1 expression during anticancer agents-induced autophagy in cancer cells. Oncogene 2009;28:886-898), 그것은 세라미드(ceramide)에 의한 JNK 경로의 활성이 Beclin 1 발현을 증가시킨다는 것을 보여주었다. 따라서, 본 발명자들은 간암 세포에서 HDAC6가 JNK 경로를 활성화시키고 Beclin 1 의존적 오토파지를 매개한다는 가설을 세웠다. 이와 관련하여 본 발명자들은 HDAC6-유도 오토파지에서 JNK 경로활성과 Beclin 1 발현 사이의 관계에 중점을 두었다. 본 발명의 일실시예에서, 간암 세포주에서 HDAC6-유도 오토파지 동안에 JNK 경로가 활성화되고, 이것은 Beclin 1 발현을 유도한다는 것을 보였다. 반면에, JNK-특이적 억제제인 SP600125 및 HDAC6를 표적으로 하는 siRNA는 Beclin 1 상향조절(up-regulation) 및 오토파지 유도를 저해하였다(도 6B 및 7C). 또한, 본 발명의 일실시예에서 c-Jun 역시 HDAC6-유도 오토파지에 대응한 Beclin 1 조절과 관계된다는 것을 보였다(도 7). 이러한 결과들은 간암의 HDAC6-유도 오토파지에 있어 Beclin 1 발현을 조절하는 새로운 기작을 제시한다. HDAC6가 직접적으로 JNK/c-Jun 신호전달을 활성화시키는지는 아직 불명확하지만, 간암 세포에서 HDAC6 과발현이 JNK 매개 Beclin 1 발현을 통해 오토파지 세포사멸을 야기하는 것은 분명하다.

이러한 점들을 종합하면, 본 발명은 간암에서 HDAC6 발현이 억제되거나 상실되고, HDAC6의 에토픽 발현은 오토파지 세포사멸을 촉진하고 JNK-매개 Beclin 1 경로를 활성화함으로써 시험관 및 생체 실험에서 종양 성장을 억제한다는 사실을 보여준다. 따라서 본 발명은 처음으로 HDAC6가 간암 발병 과정에서 카스파아제(caspase)-독립적인 오토파지 세포사멸을 활성화시킴으로써 종양 억제자로 기능한다는 것을 설명하며, 따라서 HDAC6의 간암 치료제로서의 임상적 가능성을 제시한다.

따라서 본 발명은 HDAC6(Histone deacetylase 6) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 HDAC6 단백질로 이루어지는 간암 진단용 마커를 제공한다.

본 발명에서, 상기진단이라는 용어는 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 간암 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 간암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 진단은 간암 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 간암의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.

또한, 상기 진단용 마커(diagnosis marker)란 간암의 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비하여 간암의 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 간암 진단용 마커는 정상 세포에 비해 간암의 세포에서 발현양이 감소하는 HDAC6 유전자 또는 단백질일 수 있으며, 바람직하게 상기 HDAC6 유전자는 서열번호 1로 기재된 염기서열을 갖는다.

또한, 본 발명은 HDAC6 유전자의 수준 또는 HDAC6 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 HDAC6 유전자의 수준은, 바람직하게 HDAC6 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 HDAC6 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 HDAC6 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 서열번호 1로 나타내는 HDAC6 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.

본 발명에서 상기프라이머란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 HDAC6 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다. 상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.

본 발명에서, 상기프로브라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 HDAC6 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 HDAC6 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 기술한 바와 같이 간암을 진단할 수 있는 마커 단백질로서 HDAC6 단백질이 규명되었으므로, 상기 단백질을 이용하여 항체를 생성하는 방법은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 HDAC6 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol . Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

또한, 본 발명은 HDAC6 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 간암 진단용 키트에 포함되는 간암 진단용 조성물은 HDAC6 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.

본 발명의 간암 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 간암 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

또한, 본 발명은 HDAC6 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, HDAC6 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

또한, 본 발명은 HDAC6 유전자의 발현수준 또는 HDAC6 단백질 수준을 측정하여 간암을 진단하는 방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은 (a) 생물학적 시료에 존재하는 HDAC6 (Histone deacetylase 6) 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 대조군 시료의 HDAC6 유전자의 발현양 또는 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 상기에서 HDAC6 유전자의 발현수준 또는 HDAC6 단백질 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 간암 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 HDAC6 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.

상기 HDAC6 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 HDAC6 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 HDAC6 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 HDAC6 mRNA 발현양 또는 단백질의 양과 간암 환자 또는 간암 의심환자에서의 HDAC6 mRNA 발현양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현양의 정도를 대조군과 비교함으로써 간암의 발병여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.

나아가 본 발명은 (a) HDAC6(Histone deacetylase 6) 유전자 또는 HDAC6 단백질을 포함하는 간암 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 HDAC6 유전자의 발현양, HDAC6 단백질의 양 또는 HDAC6 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, HDAC6 유전자의 발현양, HDAC6 단백질의 양 또는 HDAC6 단백질의 활성이 증가되는 경우에 상기 시료는 간암의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 간암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 따르면, 먼저 HDAC6 유전자 또는 단백질을 포함하는 간암 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킬 수 있다. 여기서 상기시료는 HDAC6 유전자의 발현양, HDAC6 단백질의 양 또는 HDAC6 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 시료가 처리된 세포에서 HDAC6 유전자의 발현양, HDAC6 단백질의 양 또는 HDAC6 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, HDAC6 유전자의 발현양, HDAC6 단백질의 양 또는 HDAC6 단백질의 활성이 증가되는 것이 측정되면 상기 시료는 간암을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판정될 수 있다.

상기에서 HDAC6 유전자의 발현양, HDAC6 단백질의 양 또는 HDAC6 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역블랏(immunoblot) 분석, 면역조직화학염색법, 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)등을 이용하여 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 HDAC6 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 HDAC6 단백질의 발현 및 활성을 증가시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 또는 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 본 발명의 HDAC6 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 또는 siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드란 용어는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 HDAC6 mRNA에 상보적이고 HDAC6 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, HDAC6 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.

또한, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 "siRNA라는 용어는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.

본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(HDAC6 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(DRG2 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 HDAC6 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.

또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.

또한, 유전자 특이적인 siRNA를 포함하는 본 발명의 조성물은 siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제에는 일반적으로 핵산 유입을 촉진하는 제제를 사용할 수 있으며, 이러한 예로는, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI: polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수 있다.

또한, 상기 HDAC6 단백질의 발현 및 활성을 증가시키는 물질로서 HDAC6 단백질에 특이적인 항체를 사용할 경우, 상기 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 항체와 결합될 수 있는 치료제로는 이에 제한되지는 않으나, 131I, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 125I, 186Re, 188Re, 177Lu, 153Sm, 123I, 111In 등과 같은 방사성핵종(radionuclide); 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin), 및 인터페론과 같은 림포카인(lympokine) 등의 생물학적 반응 변형체 또는 약물; 리신, 아브린, 디프테리아 등과 같은 독소; 이형기능성 항체(heterofunctional antibodies), 즉 다른 항체와 결합되어서 그 복합체가 암 세포와 효능 세포(예를 들면, T 세포와 같은 K 세포(killer cell) 모두에 결합하는 항체; 및 자연적인, 즉, 비-연관 또는 비-복합된 항체와 결합될 수 있다.

상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 투여란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.

또한, 상기에서 유효량 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

실험재료 및 방법

<1-1> 조직 샘플 및 조직 마이크로어레이 분석

9개의 냉동 간암(HCCs) 및 그에 대응하는 9명의 간암 환자들로부터 얻은 주변(background) 정상 간 조직 샘플을 본 발명의 실시예에서 사용하였다. 모든 경우에서 주변 간 샘플들은 만성 간염에 걸렸었고 모든 샘플들에서 HBV가 검출되었다. 사람 조직의 이용에 대한 승인은 카톨릭대학교 IRB 로부터 받았으며(IRB No. CUMC09U117), 위 9명의 환자들의 동의를 얻었다. 분자적 실험에 앞서 위 냉동 조직을 액체질소에서 미세 가루로 갈아서 보존하였다. 조직 마이크로어레이(tissue microarray; TMA) 제작을 위하여, 포르말린 고정, 파라핀-포매 간 샘플들 중 총 32개의 간 샘플들(32개의 간세포 암 및 대응되는 정상 간 조직들)을 준비했다. 0.6 mm 직경의 스타일렛(stylet)을 사용하여 각각의 기증(donor)-종양 블럭에서 2반복의 종양 조직 및 정상 간 조직 샘플들을 뚫어서 수용(recipient) 파라핀 블록에 놓았다.

<1-2> HDAC6 에 대한 면역조직화학염색

간암 샘플들의 HDAC6 단백질 수준을 측정하기 위하여, 조직 마이크로어레이 샘플 상에서 HDAC6에 대한 모노클로날 항체 (1:100, Santa Cruz, Delaware, CA)를 사용하여 면역조직화학 염색을 수행하였다. 면역염색에 앞서, 조직 마이크로어레이(TMA) 슬라이드에서 파라핀을 제거하고 DI 수까지의 단계적 에탄올 시리즈를 사용하여 수화시켰다. 내생적 퍼옥시다아제(peroxidase) 활성은 3% 과산화수소-메탄올 버퍼에서 5분간 배양시켜 차단하였다. 끓는 구연산 나트륨 버퍼(pH 6.0)를 함유한 스티머(steamer)에 슬라이드를 20분간 둠으로써 항원을 회복시켰다. 그 후 슬라이드를 HDAC6에 대한 모노클로날 항체로 4℃에서 오버나잇 배양하고, 비오틴화(biotinylated) 염소 항-마우스 항체(1:500; Sigma, St Louis, MO)를 처리하고, 퍼옥시다아제(peroxidase)-연결 아비딘-비오틴 복합체(avidin-biotin complex)로 배양한 뒤, 디아미노벤지딘(diaminobenzidine)을 처리하고, 메이어 헤마톡실린(Mayer's hematoxylin)으로 가볍게 대조염색(counterstain)하였다. 음성 대조군으로, 슬라이드를 동일한 방법으로 처리하였으나 1차 항체를 비-면역 혈청으로 대체하였다.

<1-3> 세포배양

사람 간암 세포주 HepG2, Hep3B, PLC/PRF/5, SNU-182, SNU-387, SNU-423, 및 SNU-449를 American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA)으로부터 구입하였으며, 사람 간암 세포주 SNU-354 및 SNU-368을 한국세포주은행(KCLB, Korea)에서 구입하였다. 상기 세포들을 10% 소태아혈청(Sigma, St Louis, MO) 및 1 mg/ml 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen, Grand Island, NY)을 첨가한 RPMI 1640 또는 DMEM 배지에 보관하였다. N-아세틸-D-스핑고신(N-acetyl-D-sphingosine) (ceramide), 3-메틸아데닌(methyladenine) (3-MA), 및 SP600125 을 Sigma사에서 구입하였다.

<1-4> 안정적으로 HDAC6 를 과발현하는 세포주의 확립( Establishment )

전장 사람 HDAC6 cDNA를 준비하고 HindIII- EcoRI 제한효소를 사용하여 pcDNA 3.1(Invitrogen) 벡터에 접합시켰다. 모든 형질도입(transfection)에는 Lipofectamine 2000을 생산자의 지시(Invitrogen)에 따라 사용하였고, 0.5mg/ml G418 (Geneticin, Invitrogen)을 사용하여 안정적인 형질도입체를 선별하였다. 개별적인 콜로니로 성장하는 단일 세포들을 접시에서 제거하고 24-웰 플레이트에 옮겼다. 그 후 리버젼(reversion)을 막기 위해 각각의 세포주를 동일한 G418을 사용하여 확장시켰다.

HDAC6 과발현은 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다.

<1-5> 웨스턴 블랏 분석

세포들을 얼음 냉각시킨 PBS로 씻고, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 10 mM Na2P2O7, 1 mM Na3VO4, 1 mM 페닐메틸-설포닐 플루오라이드(phenylmethyl-sulfonyl fluoride), 5 ug/ml 류펩틴(leupeptin), 및 5 ug/ml 아프로티닌(aprotinin)을 함유한 프로테아제(protease) 억제제(Roche, Indianapolis, IN)에 녹였다. 그 후 위 용해물을 원심분리하고 그 단백질 함량을 정량하였다. SDS-PAGE (10~15% 젤)로 동일한 양의 단백질(10~20 ug/레인)을 분리하고 폴리비닐리덴 디플루오라이드막(polyvinylidene difluoride membranes)에 옮겼다(Bio-rad, Hercules, CA). 아세틸화된 알파-튜뷸린, 알파-튜뷸린, HDAC6, 및 세포자살 및 오토파지 관련 항체들을 Santa Cruz and Cell Signaling (Danvers, MA)사에서 구입하였다. 연결된 항체들을 검출하기 위해 Immobilon™ Western blotting detection system (Millipore, MA)을 사용하였다. 막을 LAS 3000 (Fuji Photo Film Co. Ltd, Tokyo)에 노출시켰다.

<1-6> 세포증식 측정

세포들을 10% FBS를 함유한 RPMI 1640 배지에서 1×10⁵세포/웰의 농도로 6-웰 플레이트에 넣고, 16~18 시간 동안 두었다. 형질도입(transfection) 4시간 후에, 배지를 교체된 10% FBS를 함유한 신선한 RPMI 1640 배지로 교체하였다. 그 후 세포들을 5 mg/ml 의 MTT-[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 용액(Sigma)으로 1시간 동안 배양하였다. 입수한 짙은 파란색의 포르마잔(formazan) 산물을 DMSO (dimethyl sulfoxide) (Sigma)에 녹이고 VICTOR3™ Multilabel plate reader (PerkinElmer, Boston, MA)를 사용하여 흡광도를 측정하였다.

<1-7> 세포자살( Apoptosis ) 측정

세포자살(apoptosis) 수준을 정량하기 위해 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, San Diego, CA)을 사용하였다. 간략히, 세포들을 트립신화(trypsinized)하고, 찬 PBS로 두 번 씻은 후, 1X 결합 버퍼(binding buffer)로 1×10⁶ 세포/㎖의 농도로 재현탁(resuspension)시켰다. 그 후 위 세포 현탁액을 (1×10⁵ 세포를 포함하도록) 100 ㎕씩 5㎖ 배양튜브에 담고 5㎕ 아넥신(annexin) V-FITC 및 10 ㎕ PI (propidium iodide) 용액을 첨가하였다. 어두운 곳에서 실온으로 15분간 배양시킨 뒤, 400㎕의 1X 결합버퍼(binding buffer)를 각각의 튜브에 첨가하고, FACSCalibur 유세포분석기(BD Biosciences)를 사용하여 세포자살 부분을 측정하였다.

<1-8> 세포주기 분석

형질도입 후 48시간 째 세포들을 트립신화(trypsinization)시켜 수득하고, 찬 PBS로 세척한 뒤, 70% 알콜에서 -20℃로 1일간 고정시키고, 찬 PBS로 두 번 세척한 뒤, 100 ㎍/㎖의 RNase A를 함유한 PBS에서 37℃로 30분간 배양시켰다. 핵은 50 ㎍/㎖의 프로피디움 요오드화물(propidium iodide) (PI)로 염색했고, 염색된 세포 분획은 FACSCalibur 유세포분석기(BD Biosciences)를 사용하여 측정하였다. 데이터는 Cell-Quest FACS 분석 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다.

<1-9> siRNA 에 의한 HDAC6 및 Beclin 1의 넉다운 ( Knock - Down )

ON-TARGET plus SMART pool human siRNA (HDAC6 및 Beclin 1) 및 Silencer Negative Control siRNA (scrambled siRNA)를 Dharmacon 사(Lafayette, CO) 및 Ambion 사(Austin, TX)에서 각각 구입하였다. 안정적인 HDAC6 과발현 Hep3B 세포들을 trypsin/EDTA를 사용하여 수득하고, 60 mm 접시에 1.5×10⁵ 세포를 평판하고, 배양기에서 오버나잇으로 자라게 하였다. 평판배양 후 16~18시간 째, 세포들을 100 nmol/L 및/또는 200nmol/L HDAC6 및 Beclin 1-특이적 siRNA를 함유한 250㎕의 Opti-MEM (Invitrogen)으로 형질도입(transfection)시켰다. 형질도입은 6㎕의 리포펙타민 2000(lipofectamine 2000) 시약(Invitrogen)을 생산자의 지시에 따라 사용하여 수행하였다. 형질도입 후 4~6시간째, 배지를 10% FBS (Lonza, Basel, Switzerland)를 함유한 신선한 RPMI 1640 배지로 교체하였다.

<1-10> 형광현미경 관찰

세포들을 폴리-L-라이신 코팅 유리 커버슬립 위에서 RPMI/10% FBS로 평판배양한 후, 빈 mock HDAC6 발현벡터나 대상벡터를 형질도입하였다. 그 후 세포들을 PBS로 씻고, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 용액으로 실온에서 10분간 고정시킨 후, PBS로 씻고, 0.2% Triton X-100로 15분간 투명화(permeabilization)시켰다. 비특이적 결합부위를 PBS에서 4% 소 혈청 알부민으로 차단한 후에, 세포들을 3번 씻고, 4℃에서 LC3B 항체(1:100)로 오버나잇 배양하고, Alexa Fluor 488-연결 2차 항체(1:1000, Invitrogen)를 1시간 동안 실온에서 처리하였다. 그 후 세포들을 PBS로 씻고, 핵이 보이도록 10 ㎍/㎖ Hoechst 33342로 대조염색(counterstain)하고(1:5000), Gel/Mount 용액(Biomeda, Foster City, CA)으로 마운트(mount)하였다. 모든 이미지들은 Zeiss Axio Imager wide field 형광현미경(Carl Zeiss MicroImaging, Oberkochen, Germany)을 사용하여 얻었고 AxioVision 4.3 소프트웨어로 분석하였다.

<1-11> 투과전자현미경( Transmission Electron Microscopy ) 관찰

안정적으로 HDAC6를 과발현하는 Hep3B 세포들을 플라스틱 플라스크에서 단일막(monolayer)으로 배양하고, 0.1M PBS에 4% paraformaldehyde, 2.5% glutaraldehyde을 overnight 고정시켰다. 그 후 세포들을 1% osmium tetroxide post-fixation 시키고, 50-100% 알콜 시리즈로 탈수시키고, 0.5% 아세트산 우라늄(uranyl acetate)으로 염색하고, Poly/Bed 812 resin (Pelco, Redding, CA)에 포매한 후, 중합시켰다. Ultracut S (Leica, Wetzetlar, Germany)를 사용하여 샘플들을 절단하고, 초박절편(ultrathin sections)을 1% uranyl acetate 및 0.2% lead citrate로 염색하였다. 세포들은 투과전자현미경(transmission electron microscope) (JEM-1010, Tokyo)으로 관찰 및 촬영하였다.

<1-12> 종양 이종이식 실험( Tumor Xenograft Assay )

이종이식 종양발생 시험(xenograft tumorigenesis assays)을 위해, 상술한 대상 세포주들에서 1×10⁷ 세포를 0.2 ㎖ PBS (phosphate buffer saline) (PH 7.4) 및 matrigel matrix (BD Biosciences)와 혼합하였다. 그 후 세포 현탁액(suspensions)을 4주령된 수컷 누드 마우스에 피하주사하였다. 그룹 1은 mock을 도입한 Hep3B 세포를 주사하였고, 그룹 2 및 3은 HDAC6를 안정적으로 과발현하는 Hep3B 클론 1 및 2를 도입한 세포를 주사하였다. 마우스의 주사 부위의 종양 형성 여부를 일주일에 두 번씩 조사하였다. 종양의 부피는 0.5 × 길이(L) × 너비² (W²)의 식을 사용하여 계산하였다. 각각의 실험군은 5마리의 마우스로 구성되고, 종양의 성장은 캘리퍼스(calipers)를 사용하여 직교하는 세 방향의 종양의 크기를 측정하여 정량하였다. 결과는 종양 부피의 평균으로 표시하였고, 95% 신뢰구간을 갖는다.

<1-13> ROS 측정

Hep3B 세포들을 각각 5 ×10⁵ 의 농도로 60-mm 접시에 평판하고, 오버나잇으로 부착되게 한 후, 형질도입시켰다. 그 후 세포에 10 uM의 5-(and-6)-carboxy-2`,7`-dichlorodihydrofluorescein diacetate (carboxy-H2DCFDA; Invitrogen, Carls bad, CA)이 포함된 PBS를 30분간 처리하고, CellQuestPro 소프트웨어가 장착된 FACSCalibur (BD Biosciences, San Diego, CA)로 유세포분석을 수행하였다.

<1-14> 통계분석

간암 조직 마이크로어레이의 면역조직화학 염색은 카이-스퀘어 테스트로 검증하였다. 세포계수(cell counting), 증식측정(proliferation assay), 및 상대적인 단백질 수준 결과는 세 번의 실험의 평균 ± 표준편차(SD)를 계산하거나 Prism 4.00 (GraphPad Software)의 unpaired two tailed Student t test 를 사용하여 분석하였다. P 값 < 0.05 를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

< 실시예 2>

HDAC6 발현이 간암 성장에 미치는 영향

많은 종류의 암 세포주에서 HDAC6의 과발현이 보고되었고, 이는 다수의 발암(oncogenic) 세포주들의 변형된(transformed) 형질을 유지하는데 필요한 것으로 알려졌다(Aldana-Masangkay GI, Sakamoto KM. The role of HDAC6 in cancer. J Biomed Biotechnol;2011:875824). 하지만, 앞서 본 발명자들이 간암 발병 동안의 대규모 전사체 변화에 기초한 마이크로어레이 분석으로 HDAC6 발현을 분석한 결과(Nam SW, Park JY, Ramasamy A, Shevade S, Islam A, Long PM, et al. Molecular changes from dysplastic nodule to hepatocellular carcinoma through gene expression profiling. Hepatology 2005;42:809-818), 종양발현 전의 병변(lesions)과 비교하여 간암 부위에서 HDAC6는 상당히 하향조절(down-regulated)되었다(도 1A). 따라서 HDAC6의 이상발현을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 사람 간암 조직에서 HDAC6의 이뮤노블랏(immunoblot) 분석을 수행하였다. 도 1B에서와 같이, HDAC6는 선택된 모든 간암에서 대조군인 비-간암 조직들에 비해 상당히 하향조절된 것으로 나타났다. 또한, 이러한 HDAC6 발현 감소와 일치하게, 간암에서 매우 아세틸화된 형태의 알파-튜뷸린(α-tubulin)의 축적을 관찰하였다.

간암에서 HDAC6 발현이 하향조절되는 것을 확인하기 위해, 본 발명자들은 HCC TMA를 이용하여 면역조직화학염색법으로 HDAC6 발현을 측정하였다. 면역염색 결과는 표 1과 같고, 대표적인 면역염색 결과물을 도 1C에 나타내었다.

간암 조직 마이크로어레이 내의 HDAC6에 대한 면역조직화학염색 결과

파라미터(parameters)	정상	HCC(간암)
		P=0.0009*
Weak or absent	2 (6.3%)	15 (46.9%)
Moderate	29 (90.6%)	17 (53.1%)
Strong	1 (3.1%)	0 (0%)
Total	32 (100%)	32 (100%)

- 정상 및 암 조직 샘플에서 다른 면역조직화학 스코어의 수 및 백분율

* 카이-스퀘어 테스트

실험한 모든 간암 조직에서 HDAC6는 대부분 세포질에 위치하였다. 실험한 32개의 정상적인 간세포 샘플들 중에, 30개 (93.7%) 는 HDAC6 발현에 대해 중간(moderate) 또는 강한(strong) 면역양성 반응을 보인 반면, 실험한 32개 간암 중 15개 (46.9%) 는 약하게(weak) 염색되거나 음성이었다. 또한, 간암(HCC)은 HDAC6에 대해 강하게 염색된 경우가 없었다. 또한 간모세포종(hepatoblastoma)이나 간암(hepatocellular carcinoma)에서 처음 확립된(established) 9개의 서로 다른 간암 세포주(HepG2, Hep3B, PLC/PRF/5, SNU182, SNU354, SNU368, SNU387, SNU423 및 SNU449)에서 HDAC6의 내생적(endogenous) 발현을 노던 및 웨스턴 블랏 분석으로 측정하였다(도 1D). 몇몇의 예외는 있었으나, 예상한대로 사람 간암 세포주들은 상대적으로 낮은 HDAC6 발현을 나타냈다(도 1D). 이러한 결과는 암 발생 과정에서 HDAC6의 조절이 완화(deregulation)되었음을 보여준다.

이러한 간암발병 과정에서의 HDAC6 발현 감소가 미치는 생물학적 영향을 알아보기 위해, 전장(full-length) 사람 HDAC6 cDNA (pcDNA_HDAC6)를 제작하고 Hep3B 간암 세포에 도입하였다(알파-튜뷸린(α-tubulin)의 저아세틸화(hypoacetylation)를 검출함으로써 HDAC6의 기능적 과발현을 확인하였다). 그 후 HDAC6 과발현 Hep3B 세포들의 성장률을 측정한 결과, pcDNA_HDAC6 도입 세포가 대조군(mock 도입 또는 Hep3B 모 세포주)더 낮은 성장률을 나타내었다(도 2A). 유사하게, MTT 측정결과 HDAC6의 에토픽(ectopic) 발현도 세포 증식의 상당한 억제를 나타냈다(도 2B). 이러한 성장억제 효과는 부분적으로 HDAC6 복구에 의한 세포 성장 조절의 손상에 의해 설명될 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 HDAC6가 세포주기 분포(distribution) 및 Hep3B 세포의 세포자살에 미치는 영향을 조사하였다. 도 2C에서와 같이, Annexin V 염색 세포의 유세포분석(flow cytometry) 결과 대조군(비- 또는 mock 도입) 세포들에 비해 유의할 만한 세포자살 유도 결과는 나타나지 않았다. 또한, HDAC6 과발현은 AIF, Bax, 또는 Apaf-1과 같은 전-세포자살 종(pro-apoptotic species)의 발현에도 영향을 미치지 않았고, (세포자살의 징표인) caspase-3나 PARP 절단도 일으키지 않았다(도 2D). 다음으로, 본 발명자들은 PI-염색 HDAC6 도입세포에서 유세포 분석으로 세포주기 분석을 수행하였는데, 대조군 세포와 비교할 때 세포주기 이동에 있어서 유의할 만한 변화는 관찰되지 않았다(도 2E). 유사하게, 에토픽 과발현 HDAC6는 p15INK4B, p21WAF1/Cip1, 또는 사이클린-의존적 키나아제 2(cyclin-dependent kinase 2) 와 같은 세포주기 단백질의 발현에 영향을 미치지 않았다(도 2F). 이러한 결과들은 HDAC6 과발현이 카스파아제(caspase)-독립적 세포 사멸에 의해 매개될 수 있는 유사분열 결함을 유도한다는 것을 의미한다.

<실시예 3>

HDAC6 발현의 회복에 따른 오토파지 세포 사멸의 활성화

간암 세포에서 HDAC6 발현의 감소와 에토픽하게 발현되는 HDAC6에 의한 성장 억제를 관찰하였기 때문에, 본 발명자들은 HDAC6가 조절 받지 않는 종양 세포의 성장에 기능적으로 관여할 것이라 생각하였다. 하지만, HDAC6 과발현은 세포주기 조절 또는 세포자살(apoptosis)에 영향을 미치지 않았다. 유비퀴틴-결합 탈아세틸화효소 (ubiquitin-binding deacetylase)인 HDAC6가 단백질 응집체(aggregates)를 표적으로 하는 기본적인 오토파지(autophagy)의 핵심적인 구성요소이며 미토콘드리아에 손상을 입힌다는 발견(Lee JY, et al. HDAC6 controls autophagosome maturation essential for ubiquitin-selective quality-control autophagy. EMBO J;29:969-980)으로부터, 본 발명자들은 HDAC6의 에토픽 발현이 간암에서 오토파지에 의한 세포 사멸을 유발하는지 알아보았다. 오토파지는 진화적으로 보존적인 단백질 분해 과정이며, 세포에 따라 세포 생존 또는 사멸에 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, LC3 의 PE (phosphatidylethanolamine)-연결형(conjugated form) (LC3-II), (Atg8로도 알려진) 미세소관(microtubule) 연관 단백질 1 경쇄(light chain) 3의 총량이 오토파고좀(autophagosomes)의 수와 깊은 관련이 있다는 사실이 알려져 있다(Levine B. Cell biology: autophagy and cancer. Nature 2007;446:745-747).

본 발명에서는, Hep3B 세포에서 HDAC6의 에토픽 발현이 LC3B-I 의 LC3B-II 로의 전환을 상당히 증가시킨다는 것을 보였다(도 3A). 반면에, 3-메틸아데닌 (methyladenine) (3-MA; 오토파지의 특이적 억제제)의 전-처리는 암 세포에서 HDAC6 과발현에 의한 LC3B-I 의 LC3B-II 로의 전환을 억제했다(도 3B). 이러한 결과에 일치하게, 3-MA 전-처리에 의해 에토픽한 HDAC6 발현에 의한 세포 생존률 감소는 효과적으로 차단되었다(도 3C). 또한, LC3B에 대한 면역형광염색은 HDAC6 과발현이 세포질 전체에 균일하게 분포된 고리 모양 점들을 발생시킨 것을 보여주는데, 이는 LC3 와 오토파고좀 막 사이의 관련을 나타내고, 이러한 관련은 3-MA에 의해 완전히 차단된다(도 3D). 이러한 결과들은 HDAC6 발현의 회복이 간암 세포에서 오토파지에 의한 세포사멸을 활성화시킨다는 것을 보여준다.

다음으로, 상기 결과들을 일반화하기 위해, 본 발명자들은 HDAC6가 4개의 서로 다른 간암 세포주에 미치는 영향을 실험하였다. 본 발명자들은 노던 및 웨스턴 블랏 분석 결과 HDAC6를 거의 발현하지 않거나 전혀 발현하지 않은 HepG2, SNU182, SNU368, 및 SNU449 세포주를 선정하였다(도 1D). 각각의 세포주는 pcDNA_HDAC6와 함께 형질도입(transfection) 되었다. 도 4에서와 같이, HDAC6 과발현 세포들의 성장률은 대조군(비- 또는 mock 도입 세포들) 보다 낮았다. 또한, Hep3B 세포에 대한 앞선 관찰 결과들과 일치하게, HDAC6를 과발현하는 모든 세포주는 증가된 LC3B-II 전환을 보였으며, 이는 HDAC6의 카스파아제(caspase)-독립적 오토파지 세포 사멸에 의한 종양억제자로서의 기능을 시사한다.

<실시예 4>

HDAC6의 과발현에 따른 Hep3B 세포의 생체 내 종양 형성 감소

HDAC6의 안정적인 과발현이 간암 발병을 억제하는지를 알아보기 위하여, 본 발명자들은 HDAC6를 안정적으로 과발현하는 두 개의 세포주(Hep3B_HDAC6 클론 #1 및 #2)를 확립하였다. 세포에서 아세틸화된 알파-튜뷸린의 감소를 검출하여 활성적인 HDAC6의 과발현을 확인하였다(도 5A, 좌측). 또한 위 세포들은 mock-도입 세포(Hep3B_Mock) 보다 더 낮은 성장률을 나타냈다(도 5A, 우측). 또한, 면역형광 분석 결과 HDAC6 과발현 세포(Hep3B_HDAC6)에서 LC3B의 축적을 관찰할 수 있었고, 대조군 세포(Hep3B_Mock)에서는 LC3B의 축적을 거의 관찰할 수 없었다(도 5B). HDAC6의 안정적인 과발현이 오토파지에 의한 세포사멸을 야기시키는지 알아보기 위하여, 본 발명자들은 TEM (transmission electron microscopy)을 이용하여 세포의 초미세구조(ultra structures)를 관찰하였다. 예상한 바와 같이, 약 40-45%의 Hep3B_HDAC6 세포들이 오토파지 액포(autophagic vacuoles)를 나타냈고, 그 중 일부는 더 큰 세포질 액포를 형성하기 위해 뭉쳤으며(도 5C-b), 더 높은 배율에서 대부분의 액포들이 전자집중물질(electron dense material)과 분해된 세포소기관들을 함유한 것을 관찰하였다(도 5C-c 및 d). 대조적으로, 대조군 세포들(Hep3B_Mock)에서는 적은 수의 액포를 관찰하였고, 이들은 전자집중물질 또는 분해된 세포소기관들을 갖고 있지 않았다(도 5C-a).

마지막으로, HDAC6 과발현이 생체 내에서(in vivo) 종양 억제 효과를 갖고 있는지 알아보기 위하여, 본 발명자들은 위 확립된 세포주들(Hep3B_HDAC6 클론 #1 및 #2)을 마우스(athymic nude mice)에 피하주사하였다. 주사 후 45일째, Mock 도입 세포(Hep3B_Mock)를 주사한 동물들에서 종양이 검출되었다. 반면에, Hep3B_HDAC6 클론 #1 또는 #2 세포들을 주사한 동물에서는 종양이 주사 후 55일째 검출되었다(도 5D). 또한, 전체적인 종양 성장은 Hep3B_Mock 세포들보다 Hep3B_HDAC6 세포들에서 상대적으로 상당히 낮았으며(P ≤ 0.05) (도 5D), 안락사 시켰을 때의 평균적인 종양 부피는 Hep3B_Mock 그룹에서 보다 Hep3B_HDAC6 그룹에서 훨씬 더 작았다(P ≤ 0.05) (도 5E). 또한, 안정적으로 형질도입한 세포들을 처리한 동물들의 종양 조직에서 HDAC6의 과발현 및 알파-튜뷸린의 감소된 아세틸화를 확인하였다(도 5F). 또한, Hep3B_HDAC6 그룹에서 종양 조직의 증가된 Beclin 1 발현을 관찰하였으며, Beclin 1이 오토파지의 초기 단계에 관여하여, 오토파지 소포의 결정화(nucleation) 및 세포질로부터 단백질의 결합(recruitment)을 촉진한다는 사실을 확립하였다(Kihara A, et al. Beclin-phosphatidylinositol 3-kinase complex functions at the trans-Golgi network. EMBO Rep 2001;2:330-335). 또한, Beclin 1 발현이 오토파고좀 생성과 직접적으로 관련이 있으며, Beclin 1이 항세포자살(antiapoptotic) Bcl-2 패밀리 멤버 Bcl-2 및 Bcl-xL와 상호작용한다는 사실이 보고되었다(Liang XH, Jackson S, Seaman M, Brown K, Kempkes B, Hibshoosh H, et al. Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin 1. Nature 1999;402:672-676). 따라서, 본 발명은 Hep3B 세포에서 HDAC6 과발현이 Beclin 1 및 LC3-II 경로의 활성을 통해 오토파지에 의한 세포 사멸을 매개한다는 사실을 보여준다.

<실시예 5>

HDAC6에 의한 c-Jun NH-2-Terminal Kinase-Mediated Beclin 1 발현 경로를 통한 오토파지의 활성화

최근의 연구들은 다양한 세포 유형들에서 오토파지 과정 동안 Beclin 1의 유도가 발생한다는 사실을 밝혔다. 하지만, 어떻게 Beclin 1 발현이 조절되는지는 아직 밝혀지지 않았다(Chu CT, Zhu J, Dagda R. Beclin 1-independent pathway of damage-induced mitophagy and autophagic stress: implications for neurodegeneration and cell death. Autophagy 2007;3:663-666). 간암 세포의 오토파지 과정에서 HDAC6가 Beclin 1 발현을 유도하는지 알아보기 위하여, 본 발명자들은 HDAC6를 안정적으로 발현하는 Hep3B 세포들에서 Beclin 1 및 LC3B-II 의 발현을 조사하였다. 도 6A에서와 같이, HDAC6 과발현 세포들은 Hep3B_Mock 세포들에서보다 훨씬 더 많은 Beclin 1 및 LC3B-II 를 발현하였다. HDAC6가 오토파지에 미치는 이러한 효과는 잠재적으로 위 세포주의 오토파지에 의한 세포사멸을 유도하는 세라미드(ceramide)를 세포들에 처리함으로써 확인하였다. Hep3B_HDAC6 세포의 오토파지 과정 동안의 HDAC6에 의한 Beclin 1 유도를 확인하기 위하여, HDAC6를 그것을 향하는 siRNA로 불활성화시켰다. 예상한대로, HDAC6 넉다운(knockdown)은 Beclin 1 발현과 LC3B-I 의 LC3B-II 로의 전환을 상당히 억제시켰다(도 6B). 또한 본 발명자들은 HDAC6 과발현 세포에서 3-MA 의 영향을 조사하였다. 도 5C에서와 같이, 3-MA를 처리한 Hep3B_HDAC6 세포들은 Beclin 1 및 LC3B-II 발현을 억제하였다. Beclin 1이 HDAC6-유도 오토파지에서 핵심적인 역할을 하는지 알아보기 위하여, 본 발명자들은 Beclin 1 넉다운이 HDAC6-매개 오토파지에 미치는 영향을 알아보았다. 도 5D에서와 같이, HDAC6 과발현 세포(Hep3B_HDAC6 클론 #1 및 #2)에서 Beclin 1 넉다운은 LC3B-II 생성을 상당히 억제하였다. 전체적으로, 위 결과들은 HDAC6가 간암 세포들에서 Beclin 1 및 LC3-II 프로세싱 의존적 오토파지를 통해 종양 억제 효과를 보인다는 것을 나타낸다. 최근의 연구들은 그 기작은 밝히지 못했지만 JNK가 오토파지 과정에서 활성화되고, 이것은 오토파고좀 형성에 필요하다는 사실을 밝혔다(Scherz-Shouval R, Shvets E, Fass E, Shorer H, Gil L, Elazar Z. Reactive oxygen species are essential for autophagy and specifically regulate the activity of Atg4. EMBO J 2007;26:1749-1760). 또한, 항암제에 의한 JNK-매개 Beclin 1 발현의 활성이 암 세포에서 오토파지에 의한 세포사멸을 유도한다는 사실이 밝혀졌다(Li DD, Wang LL, Deng R, Tang J, Shen Y, Guo JF, et al. The pivotal role of c-Jun NH2-terminal kinase-mediated Beclin 1 expression during anticancer agents-induced autophagy in cancer cells. Oncogene 2009;28:886-898). 본 발명은 HDAC6-유도 오토파지 과정에서 Beclin 1 발현이 상당히 상향조절된다는 사실을 보여준다(도 6). 처음 본 발명자들은 HDAC6 과발현 세포들에서 JNK 경로가 활성화되는지를 알아보기 위하여 p-JNK (phosphorylated-JNK) 수준을 조사하였다. 도 7A에서와 같이, p-JNK 수준은 대조군(Hep3B_Mock) 세포들에 비해 HDAC6 과발현 세포(Hep3B_HDAC6 클론 #1및 #2)에서 상향조절되었다. 또한 본 발명자들은 JNK의 표적 기질인 전사인자 c-Jun의 인산화가 HDAC6 과발현 세포에서 증가되었다는 것을 발견하였다. JNK 활성화가 HDAC6-매개 오토파지 과정에서 Beclin 1 발현에 관계되고 필요한 것인지를 알아보기 위하여, siRNA를 이용하여 HDAC6 발현을 억제시켰다. 예상한대로, HDAC6 넉다운은 JNK 및 c-Jun의 기본적인 수준을 변화시키지 않고 JNK 및 c-Jun의 인산화를 감소시켰으며 Beclin 1 상향조절 및 LC3B-II 형성을 억제하였다(도 6B). 마지막으로, 본 발명자들은 JNK-특이적 억제제인 SP600125 가 Beclin 1의 상향조절(upregulation) 및 HDAC6 유도 오토파지를 억제하는지 알아보았다. 도 7C에서와 같이, SP600125 처리는 HDAC6 과발현 세포들에서 Beclin 1 상향조절과 LC3B-II 변환을 억제하였다. 종합적으로, 위 결과들은 HDAC6가 간암 세포들에서 JNK 매개 Beclin 1 경로를 통하여 오토파지에 의한 세포사멸을 유도한다는 것을 보여준다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> Use of HDAC6 as a diagnostic marker and therapeutic agent of hepatocellular carcinoma <130> np11-1265 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 3648 <212> DNA <213> HDAC6 cDNA sequence <400> 1 atgacctcaa ccggccagga ttccaccaca accaggcagc gaagaagtag gcagaacccc 60 cagtcgcccc ctcaggactc cagtgtcact tcgaagcgaa atattaaaaa gggagccgtt 120 ccccgctcta tccccaatct agcggaggta aagaagaaag gcaaaatgaa gaagctcggc 180 caagcaatgg aagaagacct aatcgtggga ctgcaaggga tggatctgaa ccttgaggct 240 gaagcactgg ctggcactgg cttggtgttg gatgagcagt taaatgaatt ccattgcctc 300 tgggatgaca gcttcccgga aggccctgag cggctccatg ccatcaagga gcaactgatc 360 caggagggcc tcctagatcg ctgcgtgtcc tttcaggccc ggtttgctga aaaggaagag 420 ctgatgttgg ttcacagcct agaatatatt gatctgatgg aaacaaccca gtacatgaat 480 gagggagaac tccgtgtcct agcagacacc tacgactcag tttatctgca tccgaactca 540 tactcctgtg cctgcctggc ctcaggctct gtcctcaggc tggtggatgc ggtcctgggg 600 gctgagatcc ggaatggcat ggccatcatt aggcctcctg gacatcacgc ccagcacagt 660 cttatggatg gctattgcat gttcaaccac gtggctgtgg cagcccgcta tgctcaacag 720 aaacaccgca tccggagggt ccttatcgta gattgggatg tgcaccacgg tcaaggaaca 780 cagttcacct tcgaccagga ccccagtgtc ctctatttct ccatccaccg ctacgagcag 840 ggtaggttct ggccccacct gaaggcctct aactggtcca ccacaggttt cggccaaggc 900 caaggatata ccatcaatgt gccttggaac caggtgggga tgcgggatgc tgactacatt 960 gctgctttcc tgcacgtcct gctgccagtc gccctcgagt tccagcctca gctggtcctg 1020 gtggctgctg gatttgatgc cctgcaaggg gaccccaagg gtgagatggc cgccactccg 1080 gcagggttcg cccagctaac ccacctgctc atgggtctgg caggaggcaa gctgatcctg 1140 tctctggagg gtggctacaa cctccgcgcc ctggctgaag gcgtcagtgc ttcgctccac 1200 acccttctgg gagacccttg ccccatgctg gagtcacctg gtgccccctg ccggagtgcc 1260 caggcttcag tttcctgtgc tctggaagcc cttgagccct tctgggaggt tcttgtgaga 1320 tcaactgaga ccgtggagag ggacaacatg gaggaggaca atgtagagga gagcgaggag 1380 gaaggaccct gggagccccc tgtgctccca atcctgacat ggccagtgct acagtctcgc 1440 acagggctgg tctatgacca aaatatgatg aatcactgca acttgtggga cagccaccac 1500 cctgaggtac cccagcgcat cttgcggatc atgtgccgtc tggaggagct gggccttgcc 1560 gggcgctgcc tcaccctgac accgcgccct gccacagagg ctgagctgct cacctgtcac 1620 agtgctgagt acgtgggtca tctccgggcc acagagaaaa tgaaaacccg ggagctgcac 1680 cgtgagagtt ccaactttga ctccatctat atctgcccca gtaccttcgc ctgtgcacag 1740 cttgccactg gcgctgcctg ccgcctggtg gaggctgtgc tctcaggaga ggttctgaat 1800 ggtgctgctg tggtgcgtcc cccaggacac cacgcagagc aggatgcagc ttgcggtttt 1860 tgctttttca actctgtggc tgtggctgct cgccatgccc agactatcag tgggcatgcc 1920 ctacggatcc tgattgtgga ttgggatgtc caccacggta atggaactca gcacatgttt 1980 gaggatgacc ccagtgtgct atatgtgtcc ctgcaccgct atgatcatgg caccttcttc 2040 cccatggggg atgagggtgc cagcagccag atcggccggg ctgcgggcac aggcttcacc 2100 gtcaacgtgg catggaacgg gccccgcatg ggtgatgctg actacctagc tgcctggcat 2160 cgcctggtgc ttcccattgc ctacgagttt aacccagaac tggtgctggt ctcagctggc 2220 tttgatgctg cacgggggga tccgctgggg ggctgccagg tgtcacctga gggttatgcc 2280 cacctcaccc acctgctgat gggccttgcc agtggccgca ttatccttat cctagagggt 2340 ggctataacc tgacatccat ctcagagtcc atggctgcct gcactcgctc cctccttgga 2400 gacccaccac ccctgctgac cctgccacgg cccccactat caggggccct ggcctcaatc 2460 actgagacca tccaagtcca tcgcagatac tggcgcagct tacgggtcat gaaggtagaa 2520 gacagagaag gaccctccag ttctaagttg gtcaccaaga aggcacccca accagccaaa 2580 cctaggttag ctgagcggat gaccacacga gaaaagaagg ttctggaagc aggcatgggg 2640 aaagtcacct cggcatcatt tggggaagag tccactccag gccagactaa ctcagagaca 2700 gctgtggtgg ccctcactca ggaccagccc tcagaggcag ccacaggggg agccactctg 2760 gcccagacca tttctgaggc agccattggg ggagccatgc tgggccagac cacctcagag 2820 gaggctgtcg ggggagccac tccggaccag accacctcag aggagactgt gggaggagcc 2880 attctggacc agaccacctc agaggatgct gttgggggag ccacgctggg ccagactacc 2940 tcagaggagg ctgtaggagg agctacactg gcccagacca cctcggaggc agccatggag 3000 ggagccacac tggaccagac tacgtcagag gaggctccag ggggcaccga gctgatccaa 3060 actcctctag cctcgagcac agaccaccag acccccccaa cctcacctgt gcagggaact 3120 acaccccaga tatctcccag tacactgatt gggagtctca ggaccttgga gctaggcagc 3180 gaatctcagg gggcctcaga atctcaggcc ccaggagagg agaacctact aggagaggca 3240 gctggaggtc aggacatggc tgattcgatg ctgatgcagg gatctagggg cctcactgat 3300 caggccatat tttatgctgt gacaccactg ccctggtgtc cccatttggt ggcagtatgc 3360 cccatacctg cagcaggcct agacgtgacc caaccttgtg gggactgtgg aacaatccaa 3420 gagaattggg tgtgtctctc ttgctatcag gtctactgtg gtcgttacat caatggccac 3480 atgctccaac accatggaaa ttctggacac ccgctggtcc tcagctacat cgacctgtca 3540 gcctggtgtt actactgtca ggcctatgtc caccaccagg ctctcctaga tgtgaagaac 3600 atcgcccacc agaacaagtt tggggaggat atgccccacc cacactaa 3648

Claims (11)

1. HDAC6(Histone deacetylase 6) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 HDAC6 단백질로 이루어진 간암 진단용 마커.
2. 제1항에 있어서,
   상기 HDAC6 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 간암 진단용 마커.
3. HDAC6 (Histone deacetylase 6) 유전자의 수준 또는 HDAC6 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 키트.
4. 제3항에 있어서,
   상기 HDAC6 유전자의 수준을 측정하는 물질은 HDAC6 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 간암 진단용 키트.
5. 제3항에 있어서,
   상기 HDAC6 단백질의 수준을 측정하는 물질은 HDAC6 단백질을 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 간암 진단용 키트.
6. (a) 생물학적 시료에 존재하는 HDAC6 (Histone deacetylase 6) 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및
   (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 대조군 시료의 HDAC6 유전자의 발현양 또는 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는 간암 예측 및 진단을 위한 정보제공방법.
7. 제6항에 있어서,
   상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 간암 예측 및 진단을 위한 정보제공방법.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
   상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역블랏(immunoblot) 분석, 면역조직화학염색법, 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 간암 예측 및 진단을 위한 정보제공방법.
9. (a) HDAC6 (Histone deacetylase 6) 유전자 또는 HDAC6 단백질을 포함하는 간암 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계;
   (b) 상기 HDAC6 유전자의 발현양, HDAC6 단백질의 양 또는 HDAC6 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
   (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, HDAC6 유전자의 발현양, HDAC6 단백질의 양 또는 HDAC6 단백질의 활성이 증가되는 경우에 상기 시료는 간암의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 간암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법.
10. 제9항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역블랏(immunoblot) 분석, 면역조직화학염색법, 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 간암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법.
11. HDAC6 (Histone deacetylase 6) 또는 이의 발현을 촉진하는 물질을 포함하며, JNK-매개 Beclin 1 경로(JNK-mediated Beclin 1 pathway)를 활성화시켜 오토파지(autophagy)에 의한 세포사멸을 촉진하는 기작을 갖고 있는 것을 특징으로 하는 간암 치료용 조성물.

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