KR20220114238A - 암 전이 억제용 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암 중에서도 특히 자가포식작용이 활성화된 암의 전이를 효과적으로 억제할 수 있는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

암 전이 억제용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for inhibiting metastasis of cancer}
본 발명은 암 전이 억제용 약학 조성물에 관한 것이다.
폐암(lung cancer)은 남녀 모두의 성별에서 두 번째로 흔히 발생하는 암으로서, 모든 암에서 15%를 차지한다. 2011년 미국 암학회(American cancer society)의 보고에 따르면, 한 해 22만건 이상이 폐암으로 진단을 받으며, 이 중 약 70%가 사망에 이르는데 이는 암 사망 중에서 27%를 차지한다. 폐암 중에서 비소세포성 폐암(non-small lung cancer)은 상피성 암(carcinoma)의 일종으로 폐소성암(small lung cancer)이 아닌 모든 상피성 폐암(epithelial lung cancer)을 일컫으며, 폐암 전체의 약 85% 내지 90%를 차지한다. 비소세포성 폐암은 폐소성암에 비해 상대적으로 화학요법(chemotherapy)에 덜 민감하며, TNM 분류법에 기초하여 암의 단계를 나눈다: 종양의 크기(the size of tumor), 국소 림프절(reginal lymph node)로의 암 확산 정도 및 암 전이(metastasis)의 유무. 비소세포성 폐암의 치료에 있어서, 초기의 비전이성(non-metastatic) 비소세포성 폐암은 화학요법 및 방사선에 대한 민감도가 매우 낮기 때문에, 일반적으로 백금을 함유하는 시스플라틴(cisplatin)과 관련된 보조적인 화학요법(ancillary chemotherapy)와 함께 수술을 한다. 반면에 초기 단계를 지나, 전이성 비소세포성 폐암인 경우에는, 다양한 화학요법 및 방사선 치료가 사용된다. 비소세포성 폐암의 증상는 지속적인 기침, 흉부 통증, 체중감소, 손톱 손상, 관절 통증, 호흡의 단기화(shortness of breath) 등이 있으나, 비소세포성 폐암은 일반적으로 천천히 진행되기 때문에 초기에는 그 증상을 거의 보이지 않는다. 따라서, 비소세포성 폐암의 조기 발견 및 치료가 어려우며, 뼈, 간, 소장, 및 뇌 등 전신에 전이된 후에 발견할 가능성이 높다. 따라서, 높은 발병률과 사망률에도 불구하고 아직 비소세포성 폐암을 극복할 수 있는 어떠한 약물 또는 치료방법이 개발되지 않았으며, 그 필요성이 대두되고 있다. 비소세포성폐암은 암세포의 크기, 모양 및 화학적 구성에 따라 몇 가지 하위 종류로 나뉘며, 대표적으로는 선암(adenocarcinoma), 편평상피암(squamous cell carcinoma), 대세포암(large cell carcinoma)등이 있다. 선암은 전체 폐암의 40%이상을 차지할 정도로 가장 높은 빈도로 발생하는 폐암으로서, 폐의 바깥부위(outer region)에서 발견되며 다른 폐암보다 천천히 진행되는 경향이 있으나, 초기에 높은 전이 경향을 보이고 또한 높은 방사선 저항성을 보인다. 편평상피암은 전체 폐암의 25-30%를 차지하는 비소세포성 폐암의 한 종류로서, 기도(airway)를 이루고 있는 세포의 초기 단계(early version)에서 시작되며, 상기 암은 주로 흡연자에게서 높은 발병률을 보인다. 또한 전체 폐암의 10-15% 정도를 차지하는 대세포암은 폐의 어느 부위에서나 발병할 수 있으며, 그 진행속도가 소세포성 폐암(small cell lung cancer)과 유사할만큼 빠르기 때문에 그 치료는 현재까지도 난제로 떠오르고 있다.
암의 가장 중요한 생물학적 특성의 하나는 전이를 일으킬 수 있다는 것이며, 이는 암을 치료하는데 가장 큰 장애물로 여겨지고 있다. 실제로 모든 고형 종양 환자의 약 60%는 이미 원발종양 진단시 미세하게나마 임상적으로 전이된 암을 가지고 있으며, 대부분의 암환자들의 중요한 사망 원인이 암 전이임은 이미 잘 알려져 있다.
전이가 일어나는 과정 가운데 암의 국소조직의 침윤과 동반되어 나타나는 현상이 신생혈관형성인데, 여기에는 종양맥관형성인자 등이 관여하며, 종양에 의해 새로 생겨난 혈관들은 결함이 많기 때문에 암세포들에 의해 쉽게 침범된다. 또한, 암의 침습 및 전이 과정에는 조직의 기질 및 기저막에 유착하는데 필요한 라미닌 수용체와 같은 수많은 암세포 표면의 수용체들, 제 IV형 콜라게나제(collagenase), 플라스미노겐(plasminogen) 활성 인자 및 카텝신 D 등과 같은 정상조직의 간질을 용해시키는데 필요한 수많은 효소들, 성장인자, 자분비 운동인자(autocrine motility factor) 및 암 유전자 등의 발현이 필요하다.
현재까지 이러한 암 전이 억제 작용을 가지는 물질의 개발에 대한 기대는 매우 크지만, 실제로 암 전이 억제를 목적으로 한 물질의 개발예는 극히 적다. 황산화 다당류, N-디아조아세틸글리신 유도체, 노이라미니타제 및 피브로넥틴 분해효소(FNS) 등이 이러한 억제 작용을 갖는다고 보고되어 있지만 아직 그 실용화의 보고는 없으며 그들 자체가 암 전이 억제 효과를 갖는다는 보고도 없다. 따라서, 암의 전이를 효과적으로 억제할 수 있는 방법을 개발하면 암 전이에 의한 사망을 효과적으로 제어할 수 있는 유용한 치료법의 개발이 가능하게 된다.
본 발명의 일 목적은 암, 바람직하게는 자가포식작용(autophagy)이 활성화된 암에서의 전이를 억제할 수 있는 약학 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 암, 바람직하게는 자가포식작용(autophagy)이 활성화된 암의 전이 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 암, 바람직하게는 자가포식작용(autophagy)이 활성화된 암의 전이 억제제의 치료 반응성을 예측하기 위한 정보 제공 방법을 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 칼슘/칼모듈린 의존성 단백질 키나제 키나제 2(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase 2; CAMKK2) 및 ATP 시트르산 분해 효소(ATP citrate lyase; ACLY) 중 적어도 하나의 단백질의 활성 또는 발현 억제제; 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 억제제를 유효 성분으로 포함하는 암의 전이 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 CAMKK2 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산으로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 ACLY 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산으로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 CAMKK2 또는 ACLY 단백질의 활성 또는 발현 억제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "펩티드 미메틱스(Peptide Minetics)"는 상기 단백질을 억제하는 펩티드 또는 비펩티드이다. 비가수분해성 펩티드 유사체의 주요 잔기로는 β-턴 디펩티드 코어(Nagai et al. Tetrahedron Lett 26:647, 1985), 케토-메틸렌 슈도펩티드류, 아제핀, 벤조디아제핀, β-아미노알콜 및 치환 감마 락탐환 등을 사용하여 생성할 수 있다.
본 발명에서 상기 "앱타머(Aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)이다. 앱타머는 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)라는 앱타머 발굴 기술이 처음 개발된 이후(Ellington, AD and Szostak, JW., Nature 346:818-822, 1990), 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 많은 앱타머들이 계속해서 발굴되었다. 앱타머는 고유의 높은 친화성(보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 단일 항체와 비교가 되고, 특히 "화학 항체"라고 할 만큼 대체 항체로서의 높은 가능성이 있다.
본 발명에서 상기 "항체"는 단백질의 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다. 여기서, 상기 다클론 항체는 단백질을 동물에 주사하고, 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다. 또한, 상기 단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포주 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다.
또한, 본 발명에서는 상기 단백질에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 제조될 수 있다. 예를 들면 이들로 한정되는 것은 아니지만 F(ab')2 단편은 항체 분자를 펩신으로 분해시켜 제조할 수 있으며, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 방도로서, Fab 발현 라이브러리를 작게 하여 원하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편을 신속하고 간편하게 동정할 수 있다.
본 발명에서 상기 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질(solid substrate)에 결합될 수 있다. 고형 기질은 예를 들어 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드 등이 있다. 또한, 상기 합성수지에는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 및 나일론 등이 있다.
본 발명의 일 예시로 상기 CAMKK2 단백질의 활성 또는 발현 억제제는 STO-609, SGC-CAMKK2-1, KN62, KN93, AIP, ACS-I 및 버바민(berbamine) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로 상기 ACLY 단백질의 활성 또는 발현 억제제는 BMS303141, NDI-091143, SB-204990, ETC-1002, 라디시콜(radicicol), (-)-하이드록시스트르산((-)-hydroxycitric acid) 및 2-클로로-1,3,8-트리하이드록시-6-메틸안트론(2-chloro-1,3,8-trihydroxy-6-methylanthrone) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 CAMKK2 또는 ACLY를 암호화하는 유전자의 발현 억제제는 상기 유전자에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "안티센스 뉴클레오티드"는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다. 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포주흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.
본 발명에서 상기 "siRNA" 및 "shRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱 (silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운 (knockdown) 방법 또는 유전자 치료 방법으로 사용된다. shRNA는 단일 가닥의 올리고 뉴클레오티드 내에서 상보적인 서열간의 결합에 의해 헤어핀 (hairpin) 구조를 형성한 것이고, 생체 내에서 상기 shRNA는 다이서 (dicer)에 의해 절단되면서 21 내지 25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 이중 가닥의 올리고 뉴클레오티드인 siRNA가 되며, 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제할 수 있다. 따라서 shRNA 및 siRNA 중 어느 수단을 이용할 지는 당업자의 선택에 의해 결정될 수 있으며 이들이 표적으로 하는 mRNA 서열이 동일한 경우라면 유사한 발현 감소 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 CAMKK2 또는 ACLY 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 작용하여 이들 유전자(예; mRNA 분자)를 절단하여 RNA 간섭 (RNAi, RNA interference) 현상을 유도함으로써, 상기 CAMKK2 또는 ACLY 단백질을 억제할 수 있다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내 (in vitro) 전사를 이용한 siRNA의 합성법, 시험관 내 (in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중 가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법, shRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포 내 전달을 통한 발현법 및 PCR (polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트 (cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "리보자임(ribozyme)"은 촉매 활성을 갖는 RNA 분자를 말한다. 다양한 활성을 갖는 리보자임이 공지되어 있으며, CAMKK2 또는 ACLY 유전자의 리보자임은 공지된 또는 인공적으로 생성된 리보자임을 포함하며, 선택적으로 표적 특이적 RNA 절단 활성을 갖는 리보자임이 공지의 표준 기법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 자가포식작용(autophagy), 바람직하게는 거대자가포식작용(macroautophagy)이 활성화된 암으로, KRAS 유전자 및 LKB1 유전자 중 적어도 하나, 바람직하게는 KRAS 유전자, 보다 바람직하게는 KRAS 유전자 및 LKB1 유전자 모두에 돌연변이를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 자가포식작용이 활성화된 암에서는 Snail(Zinc finger protein SNAI1) 전사 인자의 아세틸화(acetylation)가 증가하고 이로 인하여 Snail이 안정화됨에 따라 암 세포가 상피 중간엽 전이 아형(epithelial-mesenchymal transition; EMT)으로 전환되며 암 전이가 촉진된다. 보다 상세하게는 자가포식작용 활성화 시 CAMKK2는 아세틸-CoA(acetyl-CoA) 합성에 필요한 시트레이트(citrate)의 공급을 촉진하고, ACLY는 이렇게 공급받은 시트레이트로부터 아세틸-CoA 합성을 촉매화한다. 이렇게 증가된 아세틸-CoA는 CBP/p300 효소에 의해 Snail에 결합함으로써 Snail의 아세틸화가 증가하게 된다. 따라서, 본 발명에서는 상기 CAMKK2 또는 ACLY 단백질의 활성 또는 발현 억제제, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 억제제를 사용함으로써 상기 Snail의 탈아세틸화가 증가하여 Snail이 불안정화되고 그로 인하여 EMT 아형의로의 전환이 억제되며 암 전이 또한 억제된다.
본 발명에서 상기 "자가포식작용(autophagy)"은 조절과정에서 불필요하거나 기능하지 않는 세포 구성성분을 자연적으로 분해하는 파괴 기제로, 암 발생 초기에서는 돌연변이, 세포의 손상정도, 여러 가지 스트레스가 비교적 낮은 편으로, 자가포식작용은 발암 요인을 제거하여 종양억제인자로 기여하는 반면, 암 진행 후기에서는 이미 형성된 종양이 악성으로 바뀌고 전이능력을 갖춘 암이 되는 과정에서는 빠른 세포분열 및 세포성장, 혈관신생반응이 극대화 되어있어 이를 위한 많은 양의 에너지 공급이 필요하여, 이 과정에서 자가포식작용은 암 세포의 ATP와 생체분자를 합성하기 위한 구성요소(building block) 획득을 도움으로써 종양촉진인자로 기여하는 바가 크다(Kimmelman, Alec C., and Eileen White. Cell metabolism 25.5 (2017): 1037-1043).
본 발명에서 상기 "거대자가포식작용(macroautophagy)"은 자가포식작용의 한 종류로, 세포는 이중막 소낭, 즉 "자가포식소포체(autophagosome)"를 세포질 주변에 형성한다. 이러한 자가포식소체는 결국 리소좀과 융합하여 그에 포함된 물질로, 예를 들면 불필요하거나 손상된 세포 소기관이나 세포질 단백질, 침윤성 미생물 등이 분해된다. 이렇게 분해된 물질들은 다시 세포질로 방출되어 스트레스성 조건 하에서도 세포 생존율을 유지하기 위해 에너지를 생산하거나 세포를 보호하는 작용을 한다. 한편, 이러한 자가포식소포체가 성숙되면 리소좀과 융합하여 자가포식용해소체(autophagolysosome)를 형성하고 산성가수분해효소에 의해 매개되는 산성환경에서 포집된 구성물을 분해시킨다.
본 발명에서, 상기 "돌연변이"는 기존 유전자의 염기 순서에 영구적인 변화가 있는 것으로, 염색체 구조나 수의 변화이거나 하나 또는 몇 개의 뉴클레오티드의 변화가 있는 것이라면 제한없이 포함될 수 있다. 구체적인 예를 들면, 상기 돌연변이는 결실(deletion), 중복(duplication), 역위(inversion), 전좌(translocation), 염기 치환(base substitution), 삽입(insertion) 및 융합(fusion)에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(Central nervous system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있고, 바람직하게는 폐암 또는 췌장암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "전이(metastasis)"란, 악성 종양이 발병한 장기에서 떨어진 다른 조직으로 전파한 상태를 말한다. 하나의 장기에서 시작한 악성 종양이 진행함에 따라 처음 발생한 원발 부위인 장기로부터 다른 조직으로 퍼져 나가는데, 이렇게 원발 부위로부터 다른 조직으로 퍼져 나가는 것을 전이라 할 수 있다. 전이는 악성 종양의 진행에 수반되는 현상이라고 할 수 있는데, 악성 종양 세포가 증식하고 암이 진행함에 따라 새로운 유전 형질을 획득하면서 전이가 일어날 수 있다. 새로운 유전 형질을 획득한 종양 세포가 혈관과 림프선으로 침입하고 혈액과 림프를 따라 순환하다가 다른 조직에 정착, 증식하게 되면 전이가 일어날 수 있다. 전이가 발생하는 조직에 따라, 간암, 신장암, 폐암, 위암, 대장암, 직장암, 췌장암 등 각종 암 질환이 유발될 수 있다. 본 발명의 조성물은 전이를 억제하여 암이 퍼지는 것을 예방 및 치료할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화되어 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등이 사용될 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등이 혼합되어 사용될 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(Elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수 회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항 응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명의 상기 비경구는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 분리된 생물학적 시료에 대하여 후보 물질을 처리하는 단계; 및
상기 후보 물질의 처리 후 상기 생물학적 시료에 대하여 CAMKK2 및 ACLY 중 적어도 하나의 단백질의 활성 또는 발현 수준을 측정하거나 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암 전이 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "스크리닝"이란, 여러 물질로 이루어진 후보군으로부터 목적으로 하는 어떤 특정한 성질을 갖는 물질을 특정한 조작 또는 평가 방법으로 선별하는 것이다.
본 발명에서 상기 분리된 생물학적 시료는 암이 유발되었거나 유발되지 않은 개체로부터 분리된 생물학적 시료일 수 있다. 구체적으로, 상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다 .
본 발명에서 상기 후보 물질은 천연 화합물, 합성 화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사 산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 CAMKK2 또는 ACLY 단백질의 활성 또는 발현 수준을 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면 상기 CAMKK2 또는 ACLY에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 바이오마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 바이오마커 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에 상기 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide". Science 254 (5037): 1497-1500]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명에서 상기 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명에서 상기 단백질의 활성 또는 발현 수준을 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 CAMKK2 또는 ACLY을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 CAMKK2 또는 ACLY을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명에서 상기 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "LNA(Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다 [J Weiler, J Hunziker and J Hall Gene Therapy (2006) 13, 496.502]. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다.
본 발명에서 상기 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 CAMKK2 또는 ACLY이나, 이를 암호화하는 유전자의 정보는 알려져 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.
본 발명에서 상기 유전자의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 후보 물질의 처리 후 상기 생물학적 시료에서 측정된 CAMKK2 및 ACLY 중 적어도 하나의 단백질의 활성 또는 발현 수준이 감소하거나, 혹은 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준이 감소한 경우, 상기 후보 물질을 암 전이 억제제로 판별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 자가포식작용(autophagy), 바람직하게는 거대자가포식작용(macroautophagy)이 활성화된 암으로, KRAS 유전자 및 LKB1 유전자 중 적어도 하나, 바람직하게는 KRAS 유전자, 보다 바람직하게는 KRAS 유전자 및 LKB1 유전자 모두에 돌연변이를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(Central nervous system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있고, 바람직하게는 폐암 또는 췌장암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 KRAS 및 LKB1 중 적어도 하나의 유전자에 돌연변이 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 암 전이 억제제의 치료 반응성을 예측하기 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "목적하는 개체"란 암이 발병하였거나 발병 가능성이 높은 개체를 의미한다. 여기서, 상기 개체는 인간을 포함하는 포유 동물로, 예를 들면, 인간, 래트, 마우스, 모르모트, 햄스터, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 및 염소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 인간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료"는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함할 수 있으나, 바람직하게는 암 조직일 수 있다.
본 발명에서 상기 유전자의 돌연변이 여부를 검출하거나 상기 유전자의 발현 정도를 확인하는 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 및 RNA 시퀸싱으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 유전자의 돌연변이 여부를 검출하거나 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는, 상기 유전자 또는 상기 유전자의 전사체에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 유전자의 돌연변이 여부를 검출하기 위하여 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 발현 수준을 검출, 측정 또는 비교 분석하는 방법을 수행할 수 있고, 구체적으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 정보 제공 방법은 상기 생물학적 시료에서 Snail 단백질의 아세틸화(acetylation) 여부 또는 정도를 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 Snail 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 Snail 단백질의 아세틸화(acetylation) 여부 또는 정도를 검출하기 위한 방법은 웨스턴 블랏팅, 면역 침전(immunoprecipitation) 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 생물학적 시료에서 KRAS 및 LKB1 중 적어도 하나의 유전자에 돌연변이가 존재하고, 나아가서는 Snail 단백질의 아세틸화가 대조군에 비하여 증가된 경우 상기 암 전이 억제제의 치료 반응성이 높은 것으로 예측할 수 있다. 여기서, 상기 대조군이란 정상 개체에서의 대응되는 시료에서의 Snail 단백질의 아세틸화 수준이거나; 암이 발병하였거나 발병 가능성이 높은 개체에서의 대응되는 시료에서의 Snail 단백질의 아세틸화 수준, 또는 그 중앙값 또는 그 평균값이거나; KRAS 및 LKB1에 돌연변이가 존재하지 않는 암이 발병하였거나 발병 가능성이 높은 개체에서의 대응되는 시료에서의 Snail 단백질의 아세틸화 수준, 또는 그 중앙값 또는 그 평균값일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 암 전이 억제제는 CAMKK2 또는 ACLY 단백질의 활성 또는 발현 억제제, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 억제제일 수 있다.
본 발명에서 상기 CAMKK2 또는 ACLY 단백질의 활성 또는 발현 억제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예시로 상기 CAMKK2 단백질의 활성 또는 발현 억제제는 STO-609, SGC-CAMKK2-1, KN62, KN93, AIP, ACS-I 및 버바민(berbamine) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로 상기 ACLY 단백질의 활성 또는 발현 억제제는 BMS303141, NDI-091143, SB-204990, ETC-1002, 라디시콜(radicicol), (-)-하이드록시스트르산((-)-hydroxycitric acid) 및 2-클로로-1,3,8-트리하이드록시-6-메틸안트론(2-chloro-1,3,8-trihydroxy-6-methylanthrone) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 CAMKK2 또는 ACLY를 암호화하는 유전자의 발현 억제제는 상기 유전자에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 자가포식작용(autophagy), 바람직하게는 거대자가포식작용(macroautophagy)이 활성화된 암일 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(Central nervous system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있고, 바람직하게는 폐암 또는 췌장암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물을 이용하는 경우 자가포식작용이 활성화된 암에서의 암 전이를 효과적으로 억제할 수 있다.
도 1A는 HBEC30KT 유래 암 진행 세포주(HBEC30KT 세포, HBEC30KT-shTP53; HBEC-TP53 세포, HBEC30KT-shTP53/KRAS G12V; HBEC-K 세포, HBEC30KT-shTP53/KRAS G12V/shLKB1; HBEC-KL 세포)에서 매트리겔 침윤 어쎄이를 수행한 결과를 나타낸 것이다. 왼족 패널은 매트리겔 코팅된 트랜스웰 멤브레인에 침윤한 세포를 명시야 현미경으로 관찰한 사진(x 20)이고, 오른쪽 패널은 이를 정량화한 결과이다.
도 1B는 HBEC30KT 유래 암 진행 세포주에서 스크래치 상처 치료 어쎄이를 수행한 결과로 왼쪽 패널은 광 현미경으로 이동된 세포를 관찰한 사진(x 20)이고, 오른쪽 패널은 이를 정량화한 결과이다.
도 1C는 KRAS 돌연변이(K) 폐암 세포주와 KRAS 및 LKB1 공동 돌연변이(KL) 폐암 세포주에서 얻어진 총 세포 용해물에 대하여 웨스턴 블럿을 통해 각 단백질의 정상적 상태의 축적을 나타낸 것이다.
도 1D는 K 세포주와 KL 세포주의 매트리겔 침윤 어쎄이 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 1E는 KL 세포주(A549, NCI-H157, NCI-H647, HCC44)에 각 siRNA 처리 후 매트리겔 침윤 어쎄이 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 1F는 A549-luc 꼬리 정맥 주사 모델에서 SNAI1 넉다운 시 종양 전이에 미치는 영향을 확인한 결과로, SNAI1 넉다운되거나 되지 않은 A549-luc 세포를 누드 마우스의 정맥으로 주입하였다(n = 8 mice per group). 주사 후 4주 경과하였을 때 각 군에서의 생물 발광 이미지(왼쪽)와, 광 유동(photonic flux)을 통해 총 전이 정도를 분석한 결과(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 1G는 SNAI1 넉다운 군과 대조군에서 폐 절편의 H&E 염색 사진(위)과, 각 군에서의 폐에서 전이된 노듈의 수(아래)를 나타낸 것이다.
도 1H는 4개의 K 세포주(흑색)와 KRAS G12C 돌연변이를 포함하는 3개의 KL 세포주(적색)에서 AMG-510(0.01~10 uM) 처리 후 72시간 경과하였을 때 용량에 따른 세포 생존율의 변화를 나타낸 그래프이다. 도 1I는 3개의 KL 세포주에 대하여 AMG-510 (1 uM) 처리 후 매트리겔 침윤 어쎄이 분석 결과를 나타낸 것이다. 상위 패널은 명시야 현미경 사진을 나타낸 것이고, 하위 패널은 정량화한 결과이다.
도 1J는 해당 세포주에 AMG-510 (1 uM)를 48 시간 동안 처리한 뒤 웨스턴 블럿으로 각 단백질의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2A 및 2B는 HBEC30KT 유래 세포주로부터 얻어진 총 세포 용해물에 대하여 웨스턴 블럿을 통해 각 단백질 및 인산화-단백질의 정상적 상태의 축적을 나타낸 것이다.
도 2C는 3개의 독립적인 LUAD 코호트(TCGA, GSE41271, GSE72094)에서 EMT 전사 인자의 타겟 유전자 발현의 예후적 효과를 나타낸 것이다. TCGA-LUAD 시료에서 각 전사 인자와 현저히 양의 상관 관계(P<0.05, 스피어만 순위 상관 실험)를 보이는 유전자를 타겟 유전자로 선별하였다. 각 환자의 타겟 유전자의 단일 시료 유전자 세트 풍부 분석 스코어를 EMT 전사 인자 활성이 낮고 높은 구 환자군을 구별하기 위한 역치로 사용하였다.
도 2D는 KRAS siRNA를 형질 전환시킨 후 72 시간 경과하였을 때, 또는 LKB1 cDNA(1 ug)를 형질 전환시킨 후 24 시간이 경과하였을 때 Snail 단백질 수준에서 KRAS 결손 또는 전위 LKB1 발현의 효과를 웨스턴 블럿으로 확인한 것이다.
도 3A는 HBEC-K 세포주 및 HBEC-KL 세포주에서 H2DCFDA 프로브를 사용하여 ROS 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3B는 4개의 K 세포주와 KL 세포주에서 미토콘드리아 ROS 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3C는 HBEC-K 세포주 및 HBEC-KL 세포주에 150 uM H2O2를 6 시간 동안 처리한 뒤 실시간 PCR 분석을 통해 각 유전자의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3D는 HBEC-K 세포주 및 HBEC-KL 세포주로부터 얻어진 총 세포 용해물에 대하여 웨스턴 블럿을 통해 인산화-AMPK 단백질의 정상적 상태의 축적을 나타낸 것이다.
도 3E는 HBEC-KL 세포주에서 AMPK를 siRNA로 넉다운시킨 결과 웨스턴 블럿을 통해 Snail의 축적 정도를 확인한 결과(왼쪽)와, 매트리겔 침윤 어쎄이 분석을 통해 2D 침윤능을 분석한 결과(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 3F 및 3G는 HBEC-KL 세포주에 H2O2 또는 N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine; NAC)을 6시간 동안 처리한 뒤 웨스턴 블럿으로 p-AMPK, 총 AMPK 및 Snail 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3H는 HBEC-KL 세포주에 CDDO-ME NRF2 활성화제를 24 시간 동안 처리한 뒤 웨스턴 블럿으로 각 단백질의 발현 수준의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3I는 HBEC-K 세포주 및 HBEC-KL 세포주의 총 세포 용해물에 대하여 웨스턴 블럿을 통해 인산화-CAMKII 단백질의 정상적 상태의 축적을 나타낸 것이다.
도 3J는 HBEC-KL 세포주에 칼슘 킬레이터인 BAPTA 또는 칼모듈린 억제제인 칼미다졸리움을 1 시간 동안 처리한 뒤 각 단백질의 발현 수준의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3K는 HBEC-KL 세포주에서 shRNA로 CAMKK2를 유전적으로 넉다운시킨 뒤 Snail 발현 수준의 변화를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3L 및 3M은 HBEC-KL 세포주에 CAMM2 억제제인 STO-609(0, 25, 또는 50 uM)를 24시간 동안 처리한 뒤 Snail 축적 및 2D 침윤능의 변화를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과와 매트리겔 침윤 어쎄이를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3N은 KL 세포주에서 3D 배양 조건에서 KC 세포주 스페로이드의 침윤능에 CAMM2 억제제인 STO-609(0, 25 uM)의 역할을 나타낸 것이다. 25 uM STO-609 처리 후 침윤 길이의 변화를 비교하였다.
도 4A는 HBEC-K 세포주와 HBEC-KL 세포주에서 실시간 PCR 분석을 통해 각 유전자의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4B는 4개의 K 세포주와 KL 세포주에서 실시간 PCR 분석을 통해 각 유전자의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4C는 HBEC-K 세포주와 HBEC-KL 세포주에서 총 세포 용해물에 대하여 웨스턴 블럿을 수행해 정상적 상태에서의 p62 및 NRF2 단백질의 축적 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 4D는 HBEC-KL 세포주에서 전위 p62 발현이 Snail 단백질 발현에 미치는 영향을 확인한 것으로, 형질 전환 후 24 시간이 경과하였을 때 웨스턴 블럿으로 단백질 발현 수준을 확인하였다.
도 4E는 4개의 KL 세포주에 STO-609를 24 시간 동안 처리한 뒤 포스포-AMPK 및 Snail 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4F는 KL 세포주에 1 uM AMG-510 및/또는 50 uM STO-609를 처리한 뒤 웨스턴 블럿을 통해 Snail 단백질의 축적 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4G는 HBEC-KL 세포주에 STO-609를 24 시간 동안 처리한 뒤 스크래치 상처 치료 어쎄이를 수행하여 이동한 세포를 광 현미경으로 관찰한 사진(x 20)(위)과, 이를 정량화한 결과(아래)이다.
도 4H는 25 uM STO-609를 6일 동안 처리하기 전과 처리 후 종양 스피어의 3D 침윤능을 분석한 결과를 나타낸 것이다. 화살표는 침윤 앞쪽을 나타내는 것이며, 스케일 바는 200 um이다.
도 5A는 HBEC-KL 세포주에서 면역 형광을 통해 정상적 상태의 리소좀 및 자가포식작용 해소체를 검출한 것이다(스케일 바, 100 um). LC3B(녹색 점)는 자가포식소포체(autophagosomes)를 나타내고, LysoTracker(적색 점)은 리소좀(lysosomes)을 나타내며, DAPI는 핵을 시각화하는 데에 사용되었다.
도 5B는 HBEC-K 세포주와 HBEC-KL 세포주에서 50 uM의 클로로퀸(CQ)의 6 시간 처리에 따른 LC3 단백질의 웨스턴 블럿 결과를 나타낸 것이다.
도 5C는 일시적으로 CLEAR 모티프-유도 루시퍼라제 리포터 구조체(CLEAR motif-driven luciferase reporter construct)를 형질 전환시킨 HBEC-K 세포주와 HBEC-KL 세포주에서 정상적 상태의 상대적인 루시퍼라제 활성을 나타낸 것이다. 상대적인 루시퍼라제 강도는 HBEC 대조군 세포에 대한 배수 변화로 나타내었다.
도 5D 및 5E는 HBEC-KL 세포주에 TFEB-루시퍼라제 리포터 구조체를 안정적으로 형질 전환시킨 뒤 N-아세틸시스테인(NAC) 또는 50 uM STO-609를 24 시간 동안 처리한 후 상대적인 루시퍼라제 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5F 및 5G는 HBEC-KL 세포주에 대하여 siRNA 또는 클로로퀸(CQ)의 12 내지 48 시간의 처리로 자가포식작용을 억제시킨 뒤 상기 세포주의 총 세포 용해물에 있어서 Snail 단백질의 발현 수준의 변화를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5H 및 5I는 HBEC-KL 세포주에서 20 nM 보르테조밉의 존재 하에서 클로로퀸(CQ) 또는 STO-609 처리 후 Snail 단백질의 발현 수준의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5J는 HBEC-K 세포주와 HBEC-KL 세포주의 총 세포 용해물에 대하여 각 단백질의 정상적 상태에서의 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5K는 HBEC-KL 세포주에서 GSK3β 억제제인 CHIR99021(3 uM, 5 시간 동안 처리)를 50 uM 클로로퀸(CQ) 존재 하에서 처리한 뒤 Snail 단백질의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5L, 5M 및 5O는 HBEC-KL 세포주에서 CQ (lysomotropic weak base) 25 uM, 바필로마이신 A1(bafilomycin A1) (BafA1: V-ATPase 억제제) 10 nM, 보르트만닌(wortmannin) (Wort: PI3K 억제제) 1 uM, 및 살리페닐할라마이드(saliphenylhalamide) (Sali: V-ATPase inhibitor) 10 nM를 24 시간 동안 처리(L, O)하거나 siRNA를 처리하여 유전적 넉다운(M) 후 매트리겔 침윤성에의 미치는 영향을 나타낸 것이다. 도 5L 및 5M은 HBEC-KL 세포주, 도 5O는 HBEC-K 세포주에서의 매트리겔 침윤 어쎄이 결과를 나타낸 것이며, 왼쪽 패널에는 매트리겔 코팅된 트랜스웰 멤브레인을 통해 침윤한 세포의 명시야 현미경 사진을 나타내었고, 오른쪽 패널에는 정량적 분석 결과를 나타내었다.
도 5N은 3D 배양 조건에서 ATG5 siRNA 유전적 넉다운이 KL 세포주 스페로이드의 침윤성에 미치는 영향을 나타낸 것이다. ATG5 siRNA 유전적 넉다운 후 침윤 길이의 변화를 확인한 것이다.
도 6A는 HBEC-KL 세포주에서 N-아세틸시스테인(NAC) 또는 STO-609를 50 uM 클로로퀸(CQ) 존재 하에서 처리한 뒤 LC3 단백질의 발현 수준의 변화를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6B는 HBEC-KL 세포주에서 10 mM N-아세틸시스테인(NAC) 또는 50 uM STO-609를 24 시간 동안 처리한 뒤 mRFP-GFP-LC3 리소좀 전달 어쎄이 분석한 결과를 나타낸 것이다. 대표적 GFP-LC3, RFP-LC3 및 중첩 이미지를 나타내었다. 또한, 세포 당 적색 점(red puncta)(mRFP+/GFP-) 및 황색 점(yellow puncta)(mRFP+/GFP+)을 정량화 하여 그래프로 나타내었다(n = 15 세포/처리).
도 6C는 HBEC-KL 세포주에서 AMPK siRNA 중재 유전적 넉다운 시 TFEB 발현 수준에 미치는 영향을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6D 및 6E는 HBEC-KL 세포주에서 KRAS 결손 (D) 또는 전위 LKB1 발현 (E)이 TFEB 단백질에 미치는 영향을 확인한 것으로, KRAS siRNA 형질 전환 후 72 시간이 경과하였을 때, 그리고 LKB1 cDNA(1 ug) 형질 전환 후 24 시간이 경과하였을 때 웨스턴 블럿으로 확인하였다.
도 6F는 HBEC-KL 세포주에서 50 uM 클로로퀸(CQ)으로 24 시간 동안 처리하거나(왼쪽), 48 시간 동안 siRNA 유전적 넉다운 후(오른쪽) 실시간 PCR을 통해 SNAI1 유전자의 발현 수준의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6G는 HBEC-KL 세포주에서 50 uM 클로로퀸(CQ)을 24 시간 동안 처리한 뒤 Flag-Snail으로 형질 전환시킨 후 폴리유비퀴틴화된 Snail을 분석한 결과를 나타낸 것이다. 여기서 Snail은 항-Flag M2 친화 겔 (40 ul)에서 1 ug 시료로부터 면역 침전된 뒤 항-유비퀴틴 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 통해 폴리유비퀴틴화를 분석한 결과이다.
도 6H는 HBEC-KL 세포주에 50 uM 클로로퀸(CQ) 처리 후 각 단백질의 발현 수준의 변화를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6I는 KL 세포주에서 ATG5 및 TFEB siRNA 유전적 넉다운 후 웨스턴 블럿으로 Snail 발현 수준의 변화를 확인한 결과와 매트리겔 침윤 어쎄이로 침윤능의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6J는 HBEC-KL 세포주에 50 uM 클로로퀸(CQ)을 24 시간 처리한 뒤 스크래치 상처 치료 어쎄이를 수행한 결과를 나타낸 것으로, 왼쪽 패널은 광현미경으로 이동된 세포를 분석한 것이고(x 20), 오른쪽 패널은 그 결과를 정량화한 것이다.
도 6K는 종양 세포 스피어의 3D 침윤 이미지를 나타낸 것으로, 적색 원은 스페로?役? 코어를 나타내고, 화살표는 침윤 전방을 나타낸 것이다(스케일 바: 200 um).
도 7A는 CCLE(Cancer Cell Line Encyclopedia) 대사체 데이터에서 정상적 상태의 정상 조건에서 14개의 KRAS/LKB1 공동 돌연변이 폐암 세포주(KL)와 31개의 KRAS 돌연변이 폐암 세포주(K)에서 발현되는 225개의 대사체의 볼케이노 플롯을 나타낸 것으로, 적색 점은 KL 세포주에서 통계적으로 높게 발현되는 대사체를 나타내고, 청색 점은 낮게 발현되는 대사체를 나타낸 것이다. 또한, 오른쪽은 KL 세포주에서 높게 상향 조절된 11개의 대사체의 세포주 특이적 발현 수준을 나타낸 히트맵을 나타낸 것이다.
도 7B는 HBEC-K 세포주와 HBEC-KL 세포주에서 정상적 상태의 아세틸-CoA의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 7C 및 7D는 HBEC-KL 세포주에서 각 유전적 넉다운 후 아세틸-CoA의 발현 수준의 변화를 나타낸 것이다.
도 7E는 HBEC-KL 세포주에 50 uM 클로로퀸(CQ)의 존재 하에 8 mM 메틸 피루베이트(methyl pyruvate; MP), 3 mM a-케토-글루타레이트(a-keto-glutarate; MOG), 또는 200 uM 로시글리타존(rosiglitazone)의 24 시간 처리 후 시트레이트 발현 수준의 변화를 확인한 것이다.
도 7F는 HBEC-KL 세포주에 MP/MOG/로시글리타존 및 클로로퀸(CQ)의 조합 처리 후 웨스턴 블럿을 통해 Snail 단백질의 축적 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7G는 HBEC-K 세포주에 2 uM 라파마이신 처리 후 웨스턴 블럿을 통해 각 단백질의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7H는 포유동물 세포에서 아세틸-CoA 대사 작용을 설명한 도면이다.
도 7I 및 7J는 HBEC-KL 세포주에서 ACLY 및 ACSS2 siRNA 중재 넉다운 시 아세틸-CoA 발현 수준과 매트리겔 침윤성에의 영향을 나타낸 것이다.
도 7K는 HBEC-KL 세포주에서 10mM 아세테이트 처리 및/또는 ACSS2 siRNA 중재 넉다운 시 매트리겔 침윤성에의 영향을 나타낸 것이다.
도 7L은 HBEC-KL 세포주에서 CS 및 IDH1 siRNA 중재 넉다운 시 시트레이트 발현 수준에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 7M은 HBEC-KL 세포주에서 8 mM MP의 존재 하에서 CS 및 ACLY siRNA 중재 넉다운 시 Snail 축적에 미치는 영향(왼쪽)과, 3 mM MOG 존재 하에서 CS, IDH1, 및 ACLY siRNA 중재 넉다운 시 Snail 축적에 미치는 영향(오른쪽)을 나타낸 것이다.
도 7N은 HBEC-KL 세포주에서 3 mM MOG 존재 하에서 50 uM 클로로퀸(CQ) 처리와 함께 IDH1 siRNA 중재 넉다운 시 Snail 축적에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 7O는 HBEC-KL 세포주에서 ACACA siRNA 중재 넉다운 시 매트리겔 침윤성 및 세포 이동능에의 영향을 확인한 것이다.
도 7P는 CBP 억제제인 C646(25 uM) 및/또는 10 mM 아세테이트 처리 시 매트리겔 침윤성에의 영향을 나타낸 것이다.
도 8A는 HBEC-KL 세포주에서 ATG5 siRNA 중재 넉다운 군과 음성 대조군 사이 대사체를 비교한 결과를 나타낸 것이다. 원형의 색은 대사체의 상대적 수준을 나타낸 것이고, 황색 선은 KL 세포주에서 상향 조절된 대사체를 나타낸 것이다(도 7A).
도 8B는 HBEC-K 세포주, 및 HBEC-KL 세포주에서 정상적 상태의 시트레이트 수준을 나타낸 것이다.
도 8C는 HBEC-KL 세포주에 ATG5 siRNA 중재 넉다운 시 시트레이트 수준의 변화를 나타낸 것이다.
도 8D 및 8E는 HBEC-KL 세포주와 KL 세포주에서 50 uM 클로로퀸(CQ) 처리 후 대조군 대비 아세틸-CoA 수준의 배수 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8F는 HBEC-KL 세포주에 50 uM STO-609 처리 후 시트레이트 발현 수준의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8G는 KL 세포주에서 ACLY 및 ACSS2 유전적 넉다운 후 매트리겔 침윤능의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다. 왼쪽 패널에는 매트리겔 코팅된 트랜스웰 멤브레인을 통해 침윤한 세포의 명시야 현미경 사진을 나타내었고, 오른쪽 패널에는 정량적 분석 결과를 나타내었다.
도 8H는 HBEC-KL 세포주에서 10 mM 아세테이트를 24 시간 동안 처리한 후 매트리겔 침윤능의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8I는 KL 세포주에서 ACACA siRNA 중재 넉다운 후 매트리겔 침윤능의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8J 및 8K는 HBEC-KL 세포주(위) 및 KL 세포주(아래)에서 CREBBP siRNA siRNA 중재 넉다운 후 매트리겔 침윤능의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8L은 HBEC-KL 세포주에서 50 uM C646의 24 시간 처리 후 매트리겔 침윤능의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9A는 HBEC-K 세포주 및 HBEC-KL 세포주에서 정상적 상태의 총 단백질 아세틸화 수준(왼쪽)과 아세틸화된 Snail의 수준을 면역 침전-면역 블럿으로 확인한 결과(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 9B 및 9C는 HBEC-KL 세포주에서 50 uM 클로로퀸(CQ)의 처리 또는 유전적 넉다운 후 아세틸화된 Snail의 수준을 면역 침전-면역 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9D는 2 uM 라파마이신(5 시간 처리) 및/또는 ACLY siRNA 중재 넉다운 후 웨스턴 블럿으로 Snail 단백질의 발현 수준을 확인한 결과(왼쪽)와, 베타-액틴에 대한 Snail의 정량적 농도 분석 결과(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 9E는 HBEC-KL 세포주(왼쪽) 및 KL 세포주(오른쪽)에서 CBP 억제제인 C646(25 uM)의 2 시간 처리 후 각 단백질의 발현 수준의 변화를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다. 또한, HBEC-KL 세포주에 25 uM C646의 2 시간 처리 후 실시간 PCR을 통해 SNAI1 유전자의 발현 수준의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9F는 HBEC-KL 세포주(왼쪽) 및 KL 세포주(오른쪽)에서 CREBBP siRNA를 72 시간 동안 처리한 뒤 웨스턴 블럿으로 Snail 단백질의 발현 수준의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9G는 HBEC-KL 세포주에서 3 uM HDAC 억제제인 SAHA(vorinostat)를 15 시간 처리한 후 각 단백질의 발현 수준의 변화를 확인한 결과(위)와, 3 uM SAHA를 15 시간 처리한 뒤 아세틸화된 Snail의 수준을 면역 침전-면역 블럿으로 확인한 결과(아래)를 나타낸 것이다.
도 9H는 HBEC-KL 세포주에 SNAI1 siRNA 중재 넉다운 및/또는 SAHA 처리 후 매트리겔 침윤능 어쎄이 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9I는 HBEC-KL 세포주에 3 uM SAHA 및 50 uM 클로로퀸(CQ)을 24 시간 동안 처리한 뒤 웨스턴 블럿으로 Snail 단백질의 축적 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9J는 K 세포주에서 전위 야생형 또는 아세틸-결손 Snail(K146R, K187R)의 형질 전환 후 24 시간 경과하였을 때에 웨스턴 블럿으로 Snail 단백질의 수준을 확인한 결과(왼쪽)와, 동일 조건 하에서 매트리겔 침윤성을 분석한 결과(중간), 그리고 두 실험에서 바 플롯(오른쪽)을 나타낸 결과이다.
도 9K는 A549 세포에 야생형 Snail (pFLAG-Snail WT) 또는 아세틸화 결손 Snail 돌연변이 (pFLAG-SnailK146R)의 형질 전환 및/또는 25 uM C646의 처리 후 인산화/아세틸화 또는 K48 폴리유비퀴틴화된 Snail 분석을 면역 침전-면역 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9L은 A549 세포에 HA-유비퀴틴 및 야생형 Snail (pFLAG-Snail WT) 또는 아세틸화 결손 Snail 돌연변이 (pFLAG-SnailK146R)의 형질 전환 및/또는 25 uM C646의 2 시간 처리(왼쪽) 및/또는 3 uM SAHA의 5 시간 처리(오른쪽) 후 폴리유비퀴틴화된 Snail 분석을 면역 침전-면역 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10A는 HBEC-KL 세포주에서 아세테이트를 농도별로 24 시간 동안 처리한 뒤 웨스턴 블럿으로 Snail 단백질의 발현 수준의 변화(왼쪽)를 확인한 것과, 10 mM 아세테이트를 24 시간 동안 처리한 뒤 실시간 PCR로 SNAI1 유전자의 발현 수준의 변화(오른쪽)를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10B는 HBEC-KL 세포주에서 ACACA siRNA를 48 시간 동안 처리한 뒤 웨스턴 블럿으로 Snail 단백질의 발현 수준의 변화(왼쪽)를 확인한 것과, 동일 처리 후 실시간 PCR로 SNAI1 유전자의 발현 수준의 변화(오른쪽)를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10C는 HBEC-KL 세포주에서 10 mM 아세테이트를 24 시간 동안 처리한 뒤 웨스턴 블럿으로 총 단백질 아세틸화 정도를 확인한 결과(왼쪽)와, 동일 조건 하에서 아세틸화된 Snail을 면역 침전-면역 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10D는 HBEC-KL 세포주에서 ACLY siRNA 중재 넉다운을 48 시간 동안 처리한 뒤 웨스턴 블럿으로 총 단백질 아세틸화 정도를 확인한 결과(왼쪽)와, 동일 조건 하에서 아세틸화된 Snail을 면역 침전-면역 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10E는 HBEC-KL 세포주에서 ACLY 억제제인 BMS-301341, NDI-091143, 및 SB-204990를 농도 별로 각각 24 시간, 24 시간, 2 시간 동안 처리하고 20 nM 보르테조밉 3 시간 처리 후 Snail 단백질의 축적 정도(위)와, 50 uM BMS3013141의 24 시간 처리, 1 uM NDI-091143의 24 시간 처리, 및 20 uM SB-204990의 2 시간 처리 후 매트리겔 침윤능의 변화(아래)를 확인한 결과를 나타낸 것이다. 위쪽 패널에는 매트리겔 코팅된 트랜스웰 멤브레인을 통해 침윤한 세포의 명시야 현미경 사진을 나타내었고, 아래쪽 패널에는 정량적 분석 결과를 나타내었다.
도 10F는 HBEC-KL 세포주에서 CAMKK2 shRNA 중재 넉다운 또는 50 uM STO-609 48 시간 처리 후 총 단백질의 아세틸화 정도를 확인한 결과(위)와, 50 uM STO-609 48 시간 처리 후 아세틸화된 Snail을 면역 침전-면역 블럿으로 확인한 결과(아래)를 나타낸 것이다.
도 10G 및 10H는 HBEC-KL 세포주에서 50 uM 클로로퀸(CQ) 24 시간 처리 또는 TFEB/ATG5 siRNA 48 시간 처리 후 총 단백질 아세틸화 정도를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10I는 HBEC-K 세포주에서 라파마이신을 5 시간 동안 처리한 뒤 총 단백질 아세틸화 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10J는 HBEC-K 세포주에서 2 uM 라파마이신 5 시간 처리(왼쪽) 또는 전위 TFEB 발현 24 시간 처리(오른쪽) 후 각 단백질의 발현 수준의 변화를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다. pS6 및 S6는 mTOR 활성 마커이고, LC3는 자가포식작용 유동 마커에 해당한다.
도 10K는 HBEC-KL 세포주에서 2 uM 라파마이신 처리 후 아세틸화된 Snail을 면역 침전-면역 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10L은 HBEC-KL 세포주에서 SAHA(3 uM) 및/또는 100 uM 사이클로헥사마이드 처리 후 웨스턴 블럿을 통해 Snail 발현 수준의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11A는 CLEAR 모티프-유도 루시퍼라제 리포터 구조체(CLEAR motif-driven luciferase reporter construct)를 일시적으로 형질 전환시킨 HBEC-K 세포주에서 전위 TFEB 또는 아세틸-결손 TFEB4KR 발현되도록 24 시간 동안 형질 전환시킨 뒤 루시퍼라제 활성의 변화를 측정(왼쪽)하고, 동일 조건 하에서 3 uM SAHA를 5 시간 동안 처리한 후 루시퍼라제 활성 변화를 측정(오른쪽)한 결과를 나타낸 것이다.
도 11B는 HBEC-K 세포주에서 50 uM 클로로퀸(CQ) 존재 하에서 전위 TFEB 또는 아세틸-결손 TFEB[4KR] 발현되도록 24 시간 동안 형질 전환시킨 뒤 웨스턴 블럿으로 LC3-II 발현 수준의 변화를 확인하고(왼쪽), HSP90에 대한 정량적인 농도 분석을 한 결과(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 11C는 HBEC-K 세포주 및 HBEC-KL 세포주에서 정상적 상태의 TFEB 및 포스포-TFEB (Ser211) 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과(왼쪽)와, 아세틸화된 TFEB의 수준을 면역 침전-면역 블럿으로 확인한 결과(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 11D는 HBEC-K 세포주 및 HBEC-KL 세포주에서 정상적 상태의 TFEB를 항-TFEB 항체(녹색)를 사용하여 면역 형광(스케일바, 25 um)으로 분석한 결과(왼쪽)와, 4개의 독립된 실험으로 상기한 세포주에서 핵내 TFEB가 존재하는 세포의 수를 정량화한 결과(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 11E는 HBEC-KL 세포주에서 10mM 아세테이트의 24 시간 처리 또는 3 uM SAHA의 5 시간 처리 후 면역 형광으로 TFEB 발현 수준을 분석한 결과(스케일바, 25 um)(왼쪽)와, 4개의 독립된 실험으로 상기한 세포주에서 핵내 TFEB가 존재하는 세포의 수를 정량화한 결과(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 11F는 CLEAR 모티프-유도 루시퍼라제 리포터 구조체(CLEAR motif-driven luciferase reporter construct)를 안정적으로 형질 전환시킨 HBEC-KL 세포주에서 10mM 아세테이트의 24 시간 처리 또는 3 uM SAHA의 5 시간 처리 후 루시퍼라제 활성 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11G는 HBEC-KL 세포주에서 50 uM 클로로퀸(CQ)의 존재 하에서 10mM 아세테이트의 24 시간 처리 또는 3 uM SAHA의 5 시간 처리 후 웨스턴 블럿으로 LC3-II 축적을 확인한 결과(왼쪽)와, 베타-액틴에 대한 정량적인 농도 분석을 한 결과(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 11H는 HBEC-KL 세포주에 10mM 아세테이트의 24 시간 처리 또는 3 uM SAHA의 15 시간 처리 후 mRFP-GFP-LC3 리소좀 전달 어쎄이를 수행한 결과를 나타낸 것으로, 대표적 GFP-LC3, RFP-LC3 및 중첩 이미지를 나타내었다. 또한, 세포 당 적색 점(red puncta)(mRFP+/GFP-) 및 황색 점(yellow puncta)(mRFP+/GFP+)을 정량화 하여 그래프로 나타내었다(n = 15 ~ 30 세포/처리).
도 11I는 HBEC-KL 세포주에서 10mM 아세테이트를 24 시간 처리한 뒤 각 단백질의 발현 수준의 변화를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과(왼쪽, 가운데)와, 동일 조건 하에서 아세틸화된 TFEB의 수준을 면역 침전-면역 블럿으로 확인한 결과(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 11J는 HBEC-KL 세포주에 3 uM SAHA를 18 시간 처리한 뒤 각 단백질의 발현 수준의 변화를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과(왼쪽, 가운데)와, 동일 조건 하에서 아세틸화된 TFEB의 수준을 면역 침전-면역 블럿으로 확인한 결과(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 11K는 HBEC-KL 세포주에 10mM 아세테이트의 24 시간 처리(n=2) 또는 3 uM SAHA의 15 시간 처리(n=3) 후 TFEB 유전자의 발현 수준의 변화를 실시간 PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11L은 HBEC-KL 세포주에서 ACLY 발현을 siRNA-중재 넉다운 시킨 뒤 아세틸화된 TFEB의 수준을 면역 침전-면역 블럿으로 확인한 결과(왼쪽)와, CLEAR 모티프-유도 루시퍼라제 리포터 구조체(CLEAR motif-driven luciferase reporter construct)를 안정적으로 형질 전환시킨 HBEC-KL 세포주에서 상기와 같이 ACLY 발현을 넉다운시킨 뒤 2 uM 라파마이신을 5 시간 동안 처리한 후 루시퍼라제 활성을 측정한 결과(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 11M은 HBEC-KL 세포주에 10mM 아세테이트의 24 시간 처리 또는 3 uM SAHA의 15 시간 처리와 함께 1 uM FK506를 1시간 동안 처리한 후 각 단백질의 축적 정도를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과(왼쪽)와, CLEAR 모티프-유도 루시퍼라제 리포터 구조체(CLEAR motif-driven luciferase reporter construct)를 안정적으로 형질 전환시킨 HBEC-KL 세포주에서 동일 조건 하에서 상대적 루시퍼라제 활성의 변화를 측정한 결과(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 11N은 HBEC-KL 세포주에 50 uM STO-609를 24 시간 동안 처리한 뒤 아세틸화된 TFEB의 수준을 면역 침전-면역 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11O는 HBEC-KL 세포주에 10mM 아세테이트의 24 시간 처리 또는 3 uM SAHA의 15 시간 처리와 함께 50 uM 클로로퀸(CQ)을 24 시간 동안 처리한 뒤 TFEB 단백질의 축적 정도를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12A는 CCLE 대사체 데이터를 이용하여 41개의 췌장암 세포주와 710개의 비-췌장암 세포주 및 비-폐암 세포주 사이의 시트레이트 발현 수준을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 12B는 췌장암 세포주에 100 uM 클로로퀸(CQ)를 24 시간 동안 처리한 뒤 Snail 및 아세틸 히스톤 H3의 축적 정도를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12C는 췌장암 세포주에 100 uM 클로로퀸(CQ)를 24 시간 동안 처리한 뒤 매트리겔 침윤능의 변화를 확인한 결과로, 매트리겔 코팅된 트랜스웰 멤브레인을 통해 침윤한 세포의 명시야 현미경 사진(위)과, 이를 정량화한 결과(아래)를 나타낸 것이다.
도 12D는 췌장암 세포주에 100 uM 클로로퀸(CQ)를 24 시간 동안 처리한 뒤 아세틸-CoA의 발현 수준의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12E는 췌장암 세포주에 100 uM 클로로퀸(CQ)를 24 시간 동안 처리한 뒤 아세틸화된 Snail의 면역 침전-면역 블럿 결과를 나타낸 것이다.
도 12F는 췌장암 세포주에서 ACLY siRNA-중재 넉다운 후 Snail 축적의 변화를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12G는 췌장암 세포주에서 ACLY siRNA-중재 넉다운 후 매트리겔 침윤능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12H는 췌장암 세포주에 아세틸-결핍 Snail(K146R 또는 K187R)의 전위 발현 후 Snail 단백질의 발현 수준의 변화를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과(왼쪽)와, 매트리겔 침윤능을 분석한 결과(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 13A는 폐 선암 조직 마이크로어레이에서 핵내 Snail 단백질의 예후적 효과를 확인한 것이다. 환자는 핵 단백질의 발현 수준에 따라 두 군으로 분류하였다(양성 염색된 세포의 중앙 강도와 퍼센티지의 곱). X축은 핵의 낮은 Snail 단백질 발현 스코어 군에서의 퍼센트 역치를 나타낸다. 오른쪽에서 적색 및 청색 원점은 각각 위험 비율(hazard ratio)이 1 초과(나쁜 예후의 높은 핵 내 Snail 단백질 발현 스코어 군) 및 1 이하(좋은 예후의 높은 핵 내 Snail 단백질 발현 스코어 군)를 의미한다(오른쪽). 카플란-마이어 분석은 오른쪽 패널의 화살표 부분에서의 87개의 폐 선암 저발현군과 고발현군에서 외과적 수술에 따르는 전체적 생존 기간의 평가를 나타낸 것이다(왼쪽).
도 13B는 87 LUAD 조직에서 총 및 핵내 아세틸-라이신, 총 및 핵내 Snail 및 LAMP2 단백질 발현 수준을 IHC로 분석한 결과를 나타낸 것이다(스케일바: 20 um, 100 um).
도 13C는 도 13A의 핵내 Snail 저발현군과 고발현군에서 핵내 아세틸-라이신 및 LAMP2 발현 수준을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 13D는 A549-luc 세포주에서 50 uM STO-609를 24 시간 동안 처리한 뒤 아세틸화된 Snail의 수준을 면역 침전-면역 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 13E는 A549-luc 꼬리 정맥 주입 모델에서 암 전이에 대한 STO-609 역할을 나타낸 것이다. A549-luc 세포를 누드 마우스의 정맥을 통해 주입한 뒤 비히클 또는 STO-609 (25mg/kg 및 100mg/kg qd)를 주입 하루 뒤부터 28일간 주입하였다. 주입 후 4주 경과하였을 때에 생물발광 이미지를 촬영한 사진을 나타낸 것이다(위). 그리고 총 전이 부하(metastasis burden)을 광 유동(photonic flux)으로 분석한 결과를 나타낸 것이다(아래).
도 13F는 비히클 또는 STO-609 (100mg/kg qd)를 주입한 폐 절편을 H&E 염색한 사진을 나타낸 것이다. 적색 화살표는 전이 노듈을 의미한다(스케일바 4 mm).
도 13G는 비히클 및 STO-609 (25 mg/kg 또는 100 mg/kg) 투여 군의 폐에서 전이된 노듈의 수를 나타낸 것이다.
도 13H는 A549-luc 꼬리 정맥 주입 모델에서 암 전이에 대한 BMS303141 역할을 나타낸 것이다. A549-luc 세포를 누드 마우스의 정맥을 통해 주입한 뒤 비히클 또는 BMS303141(100mg/kg q.d.)를 주입 하루 뒤부터 20 일간 주입하였다. 주입 후 3주 경과하였을 때에 생물발광 이미지를 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 13I는 비히클 및 BMS303141 투여 군에서 총 전이 부하(metastasis burden)을 광 유동(photonic flux)으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 13J는 폐 절편의 H&E 염색 사진을 나타낸 것으로, 적색 화살표는 전이 노듈을 의미한다(스케일바 2 mm).
도 13K는 폐암에서 자가포식작용 유도 전이의 예측 모델을 나타낸 것이다.
도 14A는 폐 선암 조직 마이크로어레이에서 총 Snail 발현의 예후적 효과를 나타낸 것이다. 오른쪽에서 적색 및 청색 원점은 각각 위험 비율(hazard ratio)이 1 초과 및 1 이하를 의미한다. 카플란-마이어 분석은 오른쪽 패널의 화살표 부분에서의 87개의 폐 선암 저발현군과 고발현군에서 외과적 수술에 따르는 전체적 생존 기간의 평가를 나타낸 것이다.
도 14B는 도 14A의 총 Snail 저발현군과 고발현군에서 핵내 아세틸-라이신 및 LAMP2 발현 수준을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
세포주
Michael A. White (UT Southwestern Medical Center, Texas, USA)로부터 HBEC30 유사체 세포 진행 시리즈 세포주(HBEC30KT, HBEC-TP53, HBEC-K, 및 HBEC-KL 세포주) 및 11개의 인간 NSCLC 세포주(A549, HCC44, NCI-H157, NCI-H647, NCI-H460, NCI-H1155, NCI-H358, NCI-H441, HCC461, NCI-H2030, NCI-H2122)를 수득하였다. 3개의 인간 NSCLC 세포주(Calu-1, NCI-H1373, HCC1171) 및 췌장암 세포주(pancreatic cancer cell line)는 한국 세포주 은행(KCLB)에서 구입하였다. 3개의 췌장암 세포주(KP4, KP4-1, and PK-59)는 Riken으로부터 구입하였고, A549-루시퍼라제 세포주는 JCRB 세포 은행에서 수득하였다.
배지 및 시약
0.02 mg/ml 인슐린, 0.01 mg/ml 트랜스퍼린, 25 nM 소디움 셀레네이트, 50 nM 하이드로코르티손, 10 mM HEPES, 1 ng/ml EGF, 0.01 mM 에탄올아민, 0.01 mM O-포스포리에탄올아민, 0.1 nM 트리아이오도티로닌, 2 mg/ml BSA, 0.5 mM 소디움 피루베이트로 보충된 RPMI 1640 [GIBCO, 2.05 mM L-glutamine] 배지인 ACL4에 2% 소 태아 혈청(GIBCO 16000-044)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, 15140122)을 보충한 배지를 HBEC30KT 진행 시리즈를 배양하기 위하여 사용하였다. NSCLC 세포주와 췌장암 세포주는 각각 5% (v/v) 및 10% (v/v) 소 태아 혈청(GIBCO 16000-044)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, 15140122)으로 보충된 RPMI-1640 배지(Gibco, 11875-093)에서 37 ℃에서 5% CO2 조건 하에서 유지하였다. A549-루시퍼라제 세포주는 10% (v/v) 소 태아 혈청(GIBCO 16000-044) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, 15140122)으로 보충된 MEM alpha (Gibco, 12561-056)에서 37 ℃에서 5% CO2 조건 하에서 유지하였다.
웨스턴 블럿
세포를 수확한 뒤 PBS로 세척하고 아이스 상에서 프로테아제 및 포르파타제 억제제 칵테일(GenDEPOT)을 포함하는 RIPA 버퍼로 용혈 시켰다. 15 분 배양 후 세포 용해액을 15,000 rpm으로 4 ℃에서 10분간 원심분리 하였다. 단백질 농도는 Bradford assay (Bio-rad, 500-0006)로 측정하였다. 총 단백질의 동량을 SDS 겔 전기동에 놓고 PVDF 막(Bio-rad)에 이동시켰다. 막은 5% 탈지유로 상온에서 1시간 동안 블러킹하고 0.1% Tween-20을 포함하는 버퍼에서 1차 항체로 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 이어서, 막을 Tween-PBS 버퍼로 3회 세척하고 0.1% Tween-20을 포함하는 블러킹 버퍼에서 희석된 2차 항체를 이용하여 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서 Tween-TBS를 이용하여 막을 10분씩 3회 세척하였다. ImageJ 소프트웨어를 이용하여 웨스턴 블럿의 덴시토메트리(densitometry)를 측정하였다.
세포 처리
자가포식작용의 억제를 위하여, 세포를 50 μM의 클로로퀸(chloroquine (Sigma, C6628))으로 12 내지 24 시간 동안 처리하였다. 자가포식작용 활성화를 위해서는, 세포를 2 μM 라파마이신(rapamycin)(Selleckchem, S1039)으로 5시간 동안 처리하였다. 세포 간 ROS의 조절은 N-아세틸-시스테인(10mM) (Sigma, A7250), 과산화수소 용액(100 μM ~ 200 μM) (Sigma, 216763), 또는 CDDO-ME NRF2 활성화제(50nM,100nM) (Sellckchem, S8078)로 4 내지 24 시간 동안 수행하였다. 세포 간 칼슘 신호 조절은 BAPTA-AM (20 μM) (Sigma, A1076) 또는 칼미다졸리움 클로라이드(2.5 μM) (Sigma, C3930)를 이용하여 1시간 동안 수행하였다. Snail 단백질 아세틸화를 조절하기 위하여 C646 (25 μM) (Sigma, SML0002), 커큐민 (10 μM) (Selleckchem, S1848) CBP/p300 억제제 또는 보리노스텟 (3 μM) (Selleckchem, S1047) HDAC 억제제를 18 내지 24 시간 동안 처리하였고, Snail 단백질 인산화를 조절하기 위하여 CHIR99021 GSK3b 억제제(3 μM) (Sigma, SML1046)를 24 시간 동안 처리하였다. TFEB 단백질 인산화를 위하여 타크로리무스(1 μM) (Selleckchem, S5003)를 1시간 동안 처리하였다. 영양분 보충을 위하여, 세포를 10 mM 농도의 소디움 아세테이트(Sigma, S2889), 8 mM의 메틸 피루베이트(Sigma, 371173), 또는 3 mM의 디메틸 2-옥소글루타레이트(Sigma, 349631)로 24시간 동안 처리하였다. ACLY 억제제 처리는 50 μM의 BMS303141 (Selleckchem, S0277)를 세포에 24 시간 동안 처리하였고, PPARr 아고니스트인 로시글리타존(rosiglitazone) (Selleckchem, S2556)은 200 μM의 농도로 세포에 24 시간 동안 처리하였다. CAMKK2 억제제인 STO-609 (Sigma, S1318)는 25 μM 또는 50 μM의 농도로 24 시간 동안 세포에 처리하였고, KRASG12C 억제제인, AMG-510 (Selleckchehm 8830)는 세포에 100nM 또는 1μM의 농도로 48 시간 동안 처리하였다. siRNA 처리 시 세포에 각 siRNA를 40 내지 50 nM의 농도로 처리하고 Lipofectamine RNAiMax (Thermo Fisher Scientific, 13778150)를 함께 처리하여 형질 전환시킨 뒤 48 내지 72 시간 후에 세포를 실험에 사용하였다. cDNA 처리 시 6-웰 플레이트에서 세포에 각 cDNA를 1 내지 2 μg의 농도로 처리하고 Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific, 11668019)을 처리하여 형질 전환시킨 뒤 24 시간 경과 후 세포를 실험에 사용하였다.
면역 침전
면역 침전을 위해 Co-IP 버퍼(40 mM HEPES, pH 7.4, 120 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.3% CHAPS (Sigma, 10810118001), 10 mM 피로포스페이트(pyrophosphate) (Sigma, 221368), 10 mM 글리세로포스페이트(glycerophosphate) (Sigma, G9422), 50 mM NaF, 포스파타제 및 프로테아제 억제제 혼합물)와 동량의 용해물을 혼합하였다. 세포 용해물 (1 μg 단백질)을 항-FLAG®M2 Affinity Gel (Sigma, A2220) 또는 항-아세틸-라이신 항체 코팅 아가로스(ImmuneChem Pharmaceuticals, ICP0388)에서 4 ℃ 온도 조건 하에서 밤새 배양하였다. 면역 침전물은 그후 IP 버퍼에서 3회 세척하고 면역 침전된 복합체를 IP 버퍼에서 5분간 끓이면서 녹여 분리하였다. SDS-PAGE 전기영동, 니트로셀룰로스 막으로의 이동 및 블러킹 후 막을 IgG를 검출하기 위한 1차 항체 및 2차 항체(VeriBlot for IP Detection Reagent (HRP) (Abcam, #ab131366), 및 항-마우스 IgG for IP (HRP) (Abcam, #ab131368))로 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 3회 세척 후 막을 2차 항체로 배양하였다. 밴드 시그널은 ECL 웨스턴 블럿 기질 키트(Pierce, 32106)로 강화시켰다.
아세틸-CoA 측정
세포 내 아세틸-CoA 수준은 PicoProbe 아세틸-CoA 어쎄이 키트 (Biovision, K317)를 이용하여 pmol 범위에서 계산되었다. 형광 수준은 Envision Multimode Plate Reader (PerkinElmer 2105-0010, Waltham, MA, USA)로 Ex/Em=535/589 nm를 이용하여 측정되었다. 모든 리딩에서 배경을 교정한 뒤 각 시료의 값을 결정하고 각 시료의 단백질 농도로 정규화 하였다.
시트레이트 어쎄이
세포 내 시트레이트 수준은 시트레이트 어쎄이 키트(Biovision, K655)를 이용하여 pmol 범위로 계산되었다. 초음파 후 10 kDa 분자량 컷오프 스핀 컬럼을 이용하여 상층액에서 단백질을 제거한 뒤 효소 혼합물, 디벨로퍼(developer) 및 시트레이트 프로브를 포함하는 50 μl 시트레이트 반응 혼합물로 상온에서 30분 간 배양하였다. 시트레이트 함량은 Envision Multimode Plate Reader (PerkinElmer 2105-0010, Waltham, MA, USA)로 OD 570 nm를 읽어 측정하였다. 모든 리딩에서 배경을 교정한 뒤 각 시료의 값을 결정하고 각 시료의 단백질 농도로 정규화 하였다.
인-비트로 침윤 어쎄이
2D 침윤 어쎄이는, 삽입물을 300 μg/ml 매트리겔 (Corning, 354234)로 전-코팅을 하였다. 트립토판 블루 염색약(Bio-Rad, 1450013)으로 염색한 뒤, 8-um-공극 세포-배양 삽입물(Costar, 3422) 당 1x105 생세포를 0.5% ACL 배지에 접종하였다. 10% ACL 배지를 삽입물의 바깥에 첨가하였다. 폐암 및 췌장암 세포주의 경우 1% RPMI 배지에 접종한 뒤, 20% RPMI 배지를 삽입물 바깥에 첨가하였다. 플레이트를 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후 삽입물을 3.7% PFA로 고정하고, 세척한 뒤 0.4% 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 상위 막을 세척하고 건조하였다.
3D 스페로이드 세포 침윤 어쎄이의 경우, Cultrex 3D 스페로이드 세포 침윤 어쎄이(R&D Systems, 3500-096-K)를 사용하여 수행하였다. 간단히는, 1Х 스페로이드 형성 ECM 용액에 재부유시킨 세포를 96-웰 플레이트의 웰당 4,000 생세포로 접종하고, 스페로이드 형성을 위해 37 ℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 스페로이드가 형성되면 침윤 매트릭스에 끼워 넣고 STO-609 (Sigma, S1318) 또는 DMSO를 포함하는 배양 배지로 보충한 뒤 3일간 배지 교체를 통해 재처리하였다. 3D 스페로이드 침윤 어쎄이 플레이트를 7일 동안 배양한 뒤 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 스페로이드 침윤 정도를 정량화 하였다. 이를 위해 각 웰 당 스페로이드 경계로부터 가장 먼 거리에 있는 3개의 독립적인 돌출부를 측정한 뒤 스페로이드 침윤성을 비교하기 위한 분석에 사용하였다.
면역 형광
세포를 코팅된 유리 커버슬립에 접종한 뒤 ACL 배지에서 48 시간 동안 유지시켰다. 세포를 PBS로 3회 세척한 뒤 3.7% 파라포름알데히드에서 10분 간 배양하며 고정시켰다. 이후 세포를 PBS로 3회 세척한 뒤 0.1% 트리톤 X-100를 포함하는 PBS에 10분 동안 세포 투과 과정(permeabilization)을 거쳤다. PBS로 3회 세척 후 시료를 0.1% 트리톤 X-100 및 5% 염소 혈청을 포함하는 PBS로 상온에서 30분간 블러킹하였다. 시료를 1차 항체(1:150)와 함께 배양한 뒤 항-토끼/마우스 Alexa Fluor 488/568 2차 항체(Thermo Fisher Scientific, A-11001, 11004, 11008, 11011) 및 ProLong?? Gold Antifade Mountant with DAPI (Thermo Fisher Scientific, P36931)와 함께 배양하였다. 63x oil objective가 갖춰진 Axio Imager M2 현미경(Carl Zeiss, Stockholm, Sweden)으로 촬영하고, ZEN 버전 3.0 소프트웨어로 분석하였다.
qRT-PCR
siRNA 형질전환(post-transfection) 후 72시간 경과하였을 때, 그리고 화학적 처리 후 12 내지 24시간 경과하였을 때, 총 RNA를 RNeasy miniprep 키트 (QIAGEN, 74134)로 분리하였다. TOPscriptTM cDNA 합성 키트(Enzynomics, EZ0054)를 이용하여 상보적 DNA(cDNA)를 합성한 뒤 TOPreal?? qPCR 2X PreMIX (SYBR Green with low ROX) (Enzynomics, RT501M)로 qRT-PCR을 수행하였다. RNA 정규화를 위하여 GAPDH 및 베타-액틴(Beta-actin)을 사용하였다. qRT-PCR은 StepOne Plus (Applied Biosystems) 장비로 수행하였다.
플라스미드 설계
Snail 라이신(K)의 아르기닌(R)으로의 돌연변이 컨스트럭트는 SNAI1 코딩 서열에 부위 특이적 변이를 통해 센스 돌연변이(sense mutation)를 도입하여 제작하였다. 야생형 Snail 발현 벡터는 Origene으로부터 구입하여 돌연변이 주형으로 사용하였다. 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다: Snail K146R F: 5'- CTC TGA GGC CAG GGA TCT CCA GG -3' 및 R: 5'- AGC TGG GCC AGC TGC TTG -3'. Snail K187R F: 5'- AAC CTG CGG GAG GGC CTT CTC TAG-3' 및 R: CCG CAG ACG CAG GGC AGC -3'. Snail의 Lys146 및 Lys187 각각을 돌연변이 시켰다.
UPLC Q-TOF MS
ATG5 및 음성 대조군 siRNA 형질 전환은 각 군당 5개의 100cm2 디쉬에서 수행하였다. 48 시간 배양 후 시료를 사용하였고, 배지는 가능한 최대로 흡입한 뒤 세포를 5ml 차가운 PBS (no Mg2+/Ca2+)로 세척하였다. PBS의 진공 흡입 후, 디쉬 당 1ml 80% 메탄올 (-80 ℃)을 첨가하여 대사체를 추출한 뒤 용해물은 세포 스크래퍼(cell scraper)로 수집하고, 드라이아이스 상 Eppendorf 튜브로 이동시켰다. 냉실에서 10분간 볼텍싱 후 13,300g 으로 4 ℃에서 10분 간 원심분리하여 불용성 잔해를 제거한 뒤 상층액을 드라이아이스 상의 Eppendorf 튜브로 이동시킨 뒤 LC-MS 분석 전에 풀링된 추출액을 -80 ℃에서 저장하였다.
Waters AcquityTM Ultra Performance LC 시스템 (Waters MS Technologies, Manchester, UK)을 이용하여 UPLC 분석을 수행하였다. ACQUITY UPLC BEH C18 컬럼 (100 mm Х 2.1 mm, 1.7 μm) 상에서 40 ℃의 컬럼 온도에서 크로마토그래피 분리를 수행하였다. 이동상은 용매 A (0.1% 포름산 수용액, v/v) 및 용매 B (메탄올 내 0.1% 포름산, v/v)로 이루어진다. 최적화된 UPLC 용해 조건은 다음과 같다: 0.0-1.5 분, 1% B; 1.5-6.5 분, 10-20% B; 6.5-9.0 분, 20-70% B; 9.0-12.0 분, 70-99% ; 12.0-16.0 분,-99%; 17.0-20.0 분, 1%. 유동 속도는 0.3 mL/min로 설정하고 주입 부피는 5 ul로 설정하였으며, 용출액은 SYNAPTTM G2 Quadrupole Time-of-flight 매스 스펙트로미터(Waters, Manchester, UK)에 스며들도록 하였다. 양성 전기분무 모드를 위하여, 모세관(capillary voltage) 및 콘 전압(cone voltage)을 각각 3.1 kV 및 40 V로 설정하였다. 음성 전기분무 모드를 위하여, 모세관(capillary voltage) 및 콘 전압(cone voltage)을 각각 -2.5 kV 및 40 V로 설정하였다. 탈용매화 가스는 350 ℃ 온도에서 800 L/h로 설정되었고, 콘 가스(cone gas)는 50 L/h, 소스 온도(source temperature)는 120 ℃로 설정하였다.
동물 실험
7 내지 9주된 BALB／c-nu Slc 마우스를 SLC, Inc. (Shizuoka, Japan)로부터 구입하여 사용하였다. 마우스의 꼬리 정맥을 통하여 A549-luc 세포 (#JCRB1414) 또는 SNAI1 shRNA-중재 넉다운 A549-luc 세포를 3~4.5 x 106 세포로 주입하였다. 3 내지 4주 경과 후, 생물 발광 이미징(bioluminescence imaging) 분석을 통해 전이 여부를 모니터링 하였다. 보다 상세하게는 D-루시페린 (75 mg/kg) (PerkinElmer, 122799)을 마우스의 복강 내로 주입한 뒤 복위 자세에서 IVIS 이미징 시스템(IVIS　200, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)을 이용하여 이미지를 얻었다. 병태조직학적 분석을 위하여 폐 조직을 수득하였다. 이미지는 시중에 판매되는 소프트웨어(ImageScope; Aperio Technologies)를 이용하여 분석하였다. STO-609 효능 실험은, 주입한 날 STO-609(25 mg, 100mg/kg/day)를 마우스에 경구 투여하였다. BMS303141 효능 실험은 주입한 날 BMS303141 (100mg/kg/day)를 마우스에 경구 투여하였다.
루시퍼라제 리포터 어쎄이
CLEAR 모티프-유도 루시퍼라제 리포터 구조체(CLEAR motif-driven luciferase reporter construct)를 안정적으로 발현하는 TFEB 리포터를 안정적으로 발현하는 HBEC-KL 세포주는 Lenti-5x CLEAR Rluc-CMV-mCherry-T2A-Puro를 발현하는 렌티바이러스 입자를 형질 도입한 뒤 퓨로마이신 선별을 통해 수득하였다. 각 처리 후 루시퍼라제 활성은 Renilla Luciferase Assay System (Promega, E2810)을 이용하여 확인하였다. 다른 세포주(HBEC30KT, HBEC-K, 및 HBEC-KL)와의 TFEB 리포터 활성을 비교하기 위하여, pGL4.70 5X CLEAR Rluc 및 pGL4.14 Fluc 벡터를 일시적으로 공동 형질 전환시킨 뒤 정규화된 루시퍼라제 활성을 Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, E1910)으로 측정하였다.
ROS 어쎄이
CM-H2DCFDA (Thermo Fisher Scientific, C6827)를 사용하여 세포 내 ROS를 검출하였다. 상세하게는 각 세포주별 5,000 세포를 접종한 뒤 1일 후 세포를 CM-H2DCFDA로 37 ℃에서 30분간 염색하고 EBSS로 배지 교체를 수행하였다. Varioskan Flash Spectral Scanning Multimode Reader (Thermo Fisher Scientific 4.00.53)를 이용하여 Ex/Em=485/535 nm로 형광을 검출하였다. 모든 리딩에서 배경을 교정하고, 각 시료의 값을 결정한 뒤 CTG 어쎄이 값으로 정규화 하였다. MitoSox Mitochondrial Superoxide indicator (Thermo Fisher Scientific, M36008)를 사용하여 미토콘드리아 ROS를 검출하였다. 각 세포주 당 3,000 내지 7,000 세포를 초기에 접종한 뒤 1일 경과 후 세포를 MitoSOX로 37 ℃에서 20분 간 배양한 뒤 EBSS로 배지를 교체하였다. Varioskan Flash Spectral Scanning Multimode Reader (Thermo Fisher Scientific 4.00.53)를 이용하여 Ex/Em=510/580 nm로 형광을 검출하였다. 모든 리딩에서 배경을 교정하고, 각 시료의 값을 결정한 뒤 CTG 어쎄이 값으로 정규화 하였다.
멀티플렉스 형광 면역조직화학(multiplex fluorescent immunohistochemistry)
92명의 폐암 환자 유래 인간 폐 선종 조직 마이크로어레이의 인간 TMA 파라핀 절편은 US Biomax로부터 구입하였다. 면역조직화학 분석을 위하여 파라핀 절편으로부터 파라핀을 제거하고 재수화한 뒤 끓인 10mM 소디움 시트레이트 pH6로 항원 복구(antigen retrieval)를 수행하였다. BOND Epitope Retrieval Solution 2 키트(Leica Biosystems, AR9640)를 이용하여 에피토프 복구(epitope retrieval)를 수행하였다. OPAL 7-Color automation IHC 키트(Akoya, NEL82100KT), TSA dyes 520 (LAMP2, Rabbit polyclonal anti-LAMP2 Atlas Antibodies Cat# HPA029100: RRID: AB_10795022, 1:1200), 690 (Acetyl lysine, Rabbit polyclonal anti-acetyl lysine Cell Signaling Technology Cat#9441: RRID: AB_331805, 1:400), 620 (Snail, Rabbit polyclonal anti-Snail Atlas Antibodies Cat#HPA069985: RRID: AB_2732146, 1:300) 및 spectral DAPI를 사용하여 면역 형광 신호를 시각화 하였다. 염색된 슬라이드를 HIGHDEF® IHC fluoromount (Enzo, ADI-950-260-0025)로 커버슬립하고 Vectra® 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System (PerkinElmer)을 이용하여 스캐닝 하였다. 이미지 데이터를 얻기 위하여, inForm Advanced 이미지 분석 소프트웨어(version 2.2, PerkinElmer)를 이용하여 색 분리, 세포 세분화(cell segmentation), 및 세포 표현형화(cell phenotyping)를 수행하였다. 분석을 위하여, 각 마커별 양성으로 분류된 세포의 중앙 강도를 퍼센티지로 곱하여 대표 값을 산출하였다.
공공 유전자 발현 데이터의 정규화 및 전처리
TCGAbiolinks R package를 이용하여 TCGA (The Cancer Genome Atlas) LUAD (Lung Adenocarcinoma) 시료의 유전자 발현을 직접 내려받은 뒤 log2(FPKM + 1)로 FPKM 값을 변형시키고, 시료에서 z-스코어로 전환시켰다. 유전자 발현 마이크로어레이 데이터세트(GEO accession GSE41271, GSE72094)를 내려받고 log2-변형시켰다.
공공 암 세포주 데이터
CCLE (Cancer Cell Line Encyclopedia)에서 폐 선암종 세포주의 돌연변이 및 대사체 데이터는 CCLE 데이터 포탈(https://portals.broadinstitute.org/ccle)에서 내려 받았다. KRAS에서 미스센스 돌연변이를 포함하고, LKB1에서 비-침묵성 돌연변이를 포함하는 세포주를 "KL 세포주"라고 하였다. KRAS 돌연변이는 포함하지만 LKB1에서는 아무런 돌연변이를 포함하지 않는 세포를 "K 세포주"라고 하였다.
통계적 분석
모든 통계적 실험은 R 통계 소프트웨어(ver. 4.0.0)를 사용하여 수행하였다. 양측 검정 스튜던트 t-검정(two-sided Student's t-test)을 수행하였다. 두 변수 사이의 관계를 평가하기 위하여 스피어만 순위 상관 검정(spearman rank correlation test)을 수행하였다.
전사 인장 활성의 예측
TCGA-LUAD에서 각 전사 인자의 발현과 유의적 상관 관계(P<0.05, spearman rank correlation test)를 보이는 유전자들만 타겟으로 간주하였다. 양성 상관 관계를 보이는 유전자를 상향 조절된 것으로 보고, 음성 상관 관계를 보이는 유전자는 하향 조절된 것으로 보았다. 각 시료에 대하여, 전사 인자의 타겟 유전자로 유전자-세트 풍부 분석(single-sample GSEA, ssGSEA)의 변형 버전을 수행하였다. 각 전사 인자의 활성은 상향 조절된 유전자의 ssGSEA 스코어에서 하향 조절된 유전자의 ssGSEA 스코어를 빼면서 계산하였다.
생존 분석
LUAD 코호트(TCGA, GSE41271, GSE72094)로부터 임상적 데이터를 수집하였다. 각 시료 별 유전자 발현 수준 또는 ssGSEA 스코어에 근거하여, 시료를 두 군으로 분류한 뒤 Kaplan-Meier 생존 평가자를 이용하여 예후를 예측하고, log-순위 검정을 이용하여 유의한 차이를 평가하였다. 예후의 방향을 정의하고자 위험 비율(Hazard ratio; HR)을 계산하고, HR이 0 초과이고, 유전자 발현 또는 ssGSEA 스코어가 높은 값인 경우 예후가 나쁜 것으로 예측하였다.
TMA 생존 분석을 위하여, 면역조직화학에 의한 총 또는 핵 Snail 단백질 발현의 순위를 매긴 뒤 낮은 군과 높은 군으로 결정하기 위하여 역치 값으로 사용하였다. 발현 수준이 낮은 군과 높은 군에서 총 생존 기간의 차이는 로그 순위 검정에 의해 평가하였다.
KRAS 및 LKB1 공동 돌연변이 위암 세포주에서 Snail에 의한 세포 침윤성 및 항암 치료의 내성 증가
정상 인간 기도 상피 세포(human bronchial epithelial cells; HBECs)로부터 p53 억제(HBEC30KT-shTP53; HBEC-TP53 세포), KRAS G12V 발현(HBEC30KT-shTP53/KRAS G12V; HBEC-K 세포) 및 LKB1 억제(HBEC30KT-shTP53/KRAS G12V/shLKB1; HBEC-KL 세포)를 통해 암 진행을 유도한 뒤(도 2A), 다양한 폐암 세포주에서의 EMT(epithelial to mesenchymal transition) 아형 관련 단백질의 발현 수준을 확인한 결과, KRAS와 LKB1 모두에 돌연변이가 있는 위암 세포주(HBEC-KL 세포)에서는 상피성 마커인 E-cadherin의 감소하는 반면 중간엽성 마커인 vimentin의 수준은 증가하였는 바(도 2B), EMT 아형에 해당함을 볼 수 있고, 세포 침윤성과 이동성이 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 1A, 1B). KRASmut (K; NCI-H1155, NCI-H358, NCI-H441, HCC461) 및 KRASmut/LKB1mut (KL; A549, NCI-H157, NCI-H647, HCC44, NCI-H460) 폐암 세포주에서 EMT 전사 인자로 알려진 Snail, Slug, Zeb1 및 Twist의 발현 수준을 확인한 결과, K 세포주 및 HBEC-K 세포주에 비하여 KL 세포주 및 HBEC-KL 세포주에서 Snail의 발현 수준이 가장 많이 증가된 것을 확인할 수 있었다(도 2B, 1C). K 세포주와 KL 세포주에서 세포 침윤성의 정도에도 큰 차이를 보였는데, 이는 Snail 발현 수준의 차이와 상관 관계가 있는 것으로 볼 수 있다(도 1D). 관련하여 SNAI1 타겟 유전자의 발현 수준은 독립적인 코호트에서 생존 기간과 관련하여 나쁜 예후를 보이는 반면, 다른 전사 인자들은 일관성이 없는 결과를 보이거나 반대의 결과를 보이고 있다(도 2C). 추가의 실험을 통해 발암성 KRAS와 LKB1 결손이 모두 Snail 발현 수준을 유지하는 데에 필수적임을 알 수 있었다(도 2D). 게다가 SNAI1의 넉다운 시 다양한 KL 세포주의 침윤성이 현저히 억제되는 것을 확인할 수 있었다(도 1E). SNAI1 넉다운시킨 A549 세포를 꼬리의 정맥을 통해 주입시킨 암 전이 마우스 모델에서 공벡터를 주입한 대조군에 비하여 암 전이가 감소하였는 바, 이로부터 인-비보에서 Snail이 암 전이를 촉진하는 것을 알 수 있었다(도 1F, 1G).
KRAS 및 LKB1의 돌연변이가 항암 치료의 내성을 유도하는 지 확인하기 위하여, KRAS-G12C 돌연변이를 갖는 3개의 KL NSCLC 세포주의 항암 치료(KRAS(G12C) 억제제인 AMG-510)에 대한 내성 여부를 확인한 결과, H2122 세포주의 경우 고농도(10 umol/L)에서도 완전한 내성을 보였고, 그 외의 HCC44 및 H2030 세포주의 경우 세포 증식 억제 효과가 매우 미미한 수준에 불과한 것을 확인할 수 있었다(도 1H). AMG-510 처리 시 치료 효과가 미미할 뿐만 아니라, 3개의 KL 세포주 중 2개에서는 Snail의 발현 수준 증가와 함께 세포 침윤성 또한 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 1L, 1J).
이를 통해 KRAS 및 LKB1 돌연변이 암에서 KRAS(G12C) 억제제는 제한된 치료 효과를 보이며 암 전이가 촉진되는 것을 알 수 있었다. 또한, KRAS/LKB1 돌연변이 폐암 세포에서 Snail 발현 수준의 증가는 세포 침윤성을 높이고 항암 치료에 대한 내성을 유발시키는 것을 알 수 있었다.
KRAS/LKB1 공동 돌연변이 암 세포에서 증가된 ROS에 의한 Snail 안정성 증가 및 침윤성 증가
K(KRASmut, 야생형 LKB1), HBEC-K(KRASmut, P53mut, 야생형 LKB1), KL(KRASmut, 야생형 LKB1) 및 HBEC-KL(KRASmut, P53mut, LKB1mut) 세포주에서 ROS 발현 수준을 비교해 본 결과, HBEC-K 및 K 세포주에 비하여 KL 및 HBEC-KL 세포주에서 ROS가 높은 발현 수준을 보였으나(도 3A, 3B), 항산화 유전자의 발현 수준은 현저히 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 4A, 4B). 산화적 스트레스의 증가는 AMPK를 활성화시켜 미토콘드리아 ROS 생산을 제한하므로, KL 폐암 세포주에서도 ROS 수준의 증가가 AMPK를 활성화시키는지 확인해 본 결과, HBEC-KL 세포에서 포스포-AMPK T172의 발현 수준이 증가된 것을 확인할 수 있었다(도 3C). 또한, siRNA를 통한 AMPK 넉다운 시 침윤성이 감소하는 것을 확인할 수 있었는 바(도 3D), HBEC-KL 세포에서 ROS 유도 AMPK 활성화는 침윤성을 증가시키는 것을 알 수 있었다. KL 세포에서 안정적인 상태의 ROS 수준의 조절이 AMPK 활성화에 영향을 미치는 지 확인한 결과, T172에서 H2O2 처리에 의해 AMPK 인산화 및 Snail의 발현이 증가되었으나, N-아세틸 시스테인(NAC) 처리를 통해서는 AMPK 인산화 및 Snail의 발현은 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 3E, 3F).
비스트레스성 조건에서는 Kelch-유사 ECH 관련 단백질 1(Kelch-like ECH-associated protein1; Keap1)이 E3 유비퀴틴 리가제에 대한 어댑터처럼 작용하여 NF-E2-관련 인자 2(NF-E2-related factor 2; Nrf2)의 프로테오좀 분해를 촉진한다. 반면, 산화적 스트레스성 조건에서는 증가된 p62가 Keap1 결합을 위해 Nrf2와 경쟁하여 Nrf2 및 이의 타겟 유전자의 전사적 활성을 안정화시킨다. 그런데 KL 세포주에서 산화적 스트레스성 조건 하에서 p62가 유도되지 않았고(도 3G 왼쪽), 따라서 항산화 효소의 유도가 감소되지 않았다(도 3G 오른쪽). 관련하여 KEAP1 길항제인 CDDO-ME의 처리에 의해 NRF2 활성화로 인하여 포스포-AMPK T172의 수준이 감소되었다(도 3H). 게다가 KL 세포주에서 p62 발현에 의해 Snail의 발현이 감소되었다(도 4C). 이로부터 KL 세포주에서 p62 억제로 인하여, 정상적 상태의 ROS 수준은 높게 유지되며 NRF2-의존성 항산화 반응의 손상을 일으키는 것을 알 수 있었다.
세포 에너지-스트레스에서 AMPK 활성화는 LKB1에 의해 중재되는 반면, ROS 유도 AMPK 활성화는 CAMKK 활성화를 통해 세포 간 칼슘의 증가에 의해 이루어지는 것이 알려져 있으므로, KL 세포에서 CAMKK 활성화가 AMPK 활성화를 유도하는 지 확인한 결과, HBEC-KL 세포에서 세포 간 칼슘 수준에 대한 바이오마커로 볼 수 있는 포스포-CAMKII T286의 수준이 증가된 것을 확인할 수 있었다(도 3I). 또한, 칼슘 킬레이터인 BAPTA와 칼모듈린 억제제인 칼미다졸리움(calmidazolium)에 의한 칼슘 시그널 억제가 AMPK 인산화 및 Snail의 발현 수준을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(도 3J). 더욱이, HBEC-KL 및 KL 세포에서 유전적 및 화학적 CAMKK2 억제가 ROS 또는 칼슘 시그널 억제와 같이 포스포-AMPK T172 및 Snail 발현 수준을 감소시키는 것을 볼 수 있었다(도 3K, 3L, 4D). 또한, AMG-510에 의해 Snail의 발현 수준의 비정상적인 증가가 STO-609에 의해 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 4E). 결국 CAMKK 억제 시 2D 및 3D 침윤성 및 세포 이동성이 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 3M, 4F, 4G, 3N).
이로부터, KL 폐암 세포에서 손상된 항산화 방어능에 의한 ROS 수준의 증가가 ROS/Ca2+-CAMKK-AMPK 경로의 활성화를 연장시키고 이로 인해 Snail의 발현 수준이 증가하며, 세포 침윤성 또한 증가하는 것을 알 수 있었다.
GSK3β로부터 독립적인 Snail 단백질의 안정화를 통한 CAMKK-AMPK 의존성 자가포식용해소체(autophagolysosome)의 활성화에 의한 침윤성 증가
HBEC-KL 세포에서 LysoTracker-양성 세포의 81%는 LC3로 중첩(co-localization)되는 것을 확인할 수 있었는 바(도 5A), 상기 세포의 대다수가 자가포식용해소체임을 알 수 있었다. 실제로 클로로퀸(chloroquine; CQ)으로 리소좀 기능을 억제한 결과 LC3-II의 높은 수준이 축적되었는 바(도 5B), HBEC-KL 세포는 높은 기준의 자가포식 유동(basal autophagic flux)을 갖는 것을 알 수 있었다. KL 세포에서 자가포식 유동은 ROS/CAMKK 신호에 의해 증가되는 것을 확인할 수 있었고, 이는 NAC (ROS 스캐빈져) 및 STO-609 (CAMKK 억제제) 처리 시 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 6A, 6B).
HBEC-KL 세포주에서 자가포식 유동의 적어도 일부는CLEAR 활성 증가에 의한 것임을 확인할 수 있었다(도 5C). 전사인자 EB (Transcription factor EB; TFEB)가 CLEAR 네트워크의 주된 조절자에 해당하는데, PRKAA1 (AMPKa1)의 유전적 넉다운 시 TFEB가 감소되는 것을 확인할 수 있었고(도 6C), KRAS 및 LKB1의 원암 돌연변이는 TFEB 수준을 유지하는데 필요한 것을 확인할 수 있었다(도 6D, 6E). 또한, ROS 억제 및 CAMKK 억제 시 CLEAR 활성이 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 5D, 5E). 이를 통하여, 활성화된 ROS/Ca2+-CAMKK-AMPK 신호 경로는 CLEAR 네트워크의 TFEB 중재 활성화를 통해 자가포식작용을 활성화시키는 것을 알 수 있었다.
다음으로 자가포식작용의 결정적 조절자에 해당하는 ULK1, ATG5, 및 TFEB의 유전적 넉다운이나 클로로퀸(CQ)에 의한 자가포식작용 억제 시 Snail 단백질의 발현 수준이 감소되었으나(도 5F, 5G), mRNA 발현 수준에는 변화가 없는 것을 확인할 수 있었다(도 6F). 이를 통해 자가포식작용은 Snail을 안정화시키는 것을 알 수 있었다. 한편, 프로테아좀 억제제인 보르테조밉(bortezomib)을 함께 처리하자 클로로퀸(CQ) 또는 STO-609에 의한 Snail 감소가 회복되었다(도 5H, 5I). Snail의 ser11, ser100 및 ser96 인산화 시 유비퀴틴화(ubiquitination)에 의해 프로테아좀 분해가 가능하게 되는데, Snail 유비퀴틴화 시 자가포식작용 억제 정도가 증가되었는 바, 이로부터 Snail 단백질의 안정성은 자가포식작용의 억제 정도를 변화시키는 것을 알 수 있었다(도 6G).
Snail 인산화는 GSK3β에 의해 조절되는데, 자가포식용해소체에 의해 조절되는 Snail 단백질의 안정성이 GSK3β 활성에 의존하는 지 확인하였다. KL 세포에서는 총 GSK3β 및 활성화된 GSK3β (phospho-GSK3β Y216)의 발현 수준이 증가하지 않았는 바(도 5J), 이로부터 KRAS/LKB1 공동 돌연변이는 GSK3β 활성에 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다. 또한, GSK3β 억제제인 CHIR99021는 자가포식작용 억제 조건에서 베타-카테닌이나, 다른 인산화 기질의 발현 수준은 회복시키는 반면 Snail 단백질의 수준을 회복시키지 않았다(도 5K). 또한, 포스포-GSK3β Y216 발현은 자가포식작용 억제 정도를 증가시키지 않았다(도 6H). 이를 통해 자가포식작용해소체에 의한 Snail 단백질 안정성은 GSK3β 활성화에 의존하지 않음을 알 수 있었다.
자가포식작용의 말기 단계에서 암의 성장을 촉진시키는 역할이 EMT 촉진 및 Snail 안정화를 통한 침윤성에 기인한 것인 지 확인하기 위하여, HBEC-KL 세포주 및 KL 세포주에서 다양한 약제 또는 유전적 넉다운을 통해 자가포식작용을 억제시킨 결과, 세포의 침윤성 및 이동성이 감소하였고(도 5L, 5M, 6I, 6J, 6K, 5N), HBEC-K 세포주에서 mTOR 억제제인 라파마이신(rapamycin)을 통해 자가포식작용을 활성화시킨 결과, 침윤성이 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 5O). 이를 통해 자가포식작용은 암 세포의 침윤성에 필수적인 것을 알 수 있었다. 또한, 자가포식작용 해소체의 CAMKK-AMPK 의존성 활성화는 Snail 안정화를 통해 KL 암 세포주의 침윤성을 증가시키는 것을 알 수 있었다.
KL 세포에서 자가포식작용에 의해 증가된 아세틸-CoA에 따른 침윤성 증가
CCLE 대사체 데이터세트를 분석한 결과, K 세포(N = 30)에 비하여 KL 암 세포주(N = 14)에서 225개의 대사체 중 -NADP, 안트라닐산(anthranillic acid), 글루타씨온(glutathione), 헥사놀리카르니틴(hexanolycarnitine), GABA (gamma-Aminobutyric acid), 호모시스테인(homocysteine), 시트레이트(citrate), 카르니틴(carnitine), 프로피오닐카르니틴(propionlycarnitine), 및 디메틸글라이신(dimethylglycine)이 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. LC-MS(liquid chromatography and mass spectrometry) 분석 결과, 상기 10개의 대사체 중 글루타씨온, GABA, 시트레이트 및 디메틸글라이신의 발현 수준이 자가포식작용 억제 시 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었는 바(도 7A, 8A), 이를 통해 상기 대사체들은 KL 세포주에서 증가된 자가포식작용에 의해 공급되는 것을 알 수 있었다. 글루타씨온은 세포의 산화환원 항상성을 유지하는 주된 환원력(reducing power)으로 ROS가 증가된 KL 암 세포에서 중요한 역할을 할 것으로 예상된다. 이와 함께, 증가된 GABA와 디메틸글라이신은 각각 글루타씨온의 전구체에 해당하는 글루타메이트 및 글라이신을 통해 기능을 할 것이다. 한편, 시트레이트는 아세틸-CoA의 전구체로, 전립선암, 유방암, 간세포 암에서 침윤 및 전이 등을 조절하는 것으로 알려져 있는 바, 자가포식작용-유도 시트레이트의 공급이 세포 내 아세틸-CoA의 수준을 높이고 이로써 KL 세포의 침윤성이 증가하는 지 확인한 결과, HBEC-K 세포에 비하여 HBEC-KL 세포에서 시트레이트 및 아세틸-CoA의 수준이 증가된 것을 확인할 수 있었다(도 7B, 8B). 또한, HBEC-KL 세포주와 KL 세포주에서 CAMKK 억제뿐만 아니라 자가포식작용의 억제 시 시트레이트 및 아세틸-CoA의 발현 수준이 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 8C, 7C, 8D, 8E, 7D). 세포 내 시트레이트는 주로 피루베이트와 a-케토글루타레이트(a-ketoglutarate)에 의해 합성되는데, 이들의 세포 투과성 형태인 메틸 피루베이트(methyl pyruvate; MP) 및 디메틸-2-옥소글루타레이트(dimethyl-2-oxoglutarate; MOG)의 전달은 시트레이트 및 Snail 수준에 대한 클로로퀸(CQ)의 영향을 완전히 바꾸어 놓는다(도 7E, 7F). 같은 맥락으로, HBEC-K 세포에서 라파마이신에 의한 자가포식작용의 활성화는 시트레이트 및 아세틸-CoA 수준을 증가시킨다(도 7G). 이를 통해, KL 세포는 활성화된 자가포식작용에 의한 시트레이트의 공급을 통해 아세틸-CoA를 높은 수준으로 유지하는 것을 알 수 있었다.
시트레이트는 미토콘드리아 시트레이트 합성 효소(mitochondrial citrate synthase; CS) 및 시토졸 이소시트레이트 디하이드로제네이크 1(isocitrate dehydrogenase 1; IDH1)의 두 경로로 합성될 수 있다. 아세틸-CoA는 ATP 시트르산 분해 효소(ATP citrate lyase; ACLY)에 의해 시트레이트로부터 합성되거나 아세틸-CoA 합성효소 2(Acetyl-CoA synthetase 2; ACSS2)에 의해 아세테이트로부터 합성된다. 이후 아세틸-CoA는 지질 물질을 합성하기 위한 전구체로 사용되거나 단백질 아세틸화를 위한 아세틸기 공여자로 기능을 한다. 시트레이트-아세틸-CoA와 KL 세포의 침윤성 사이 상관 관계를 증명하기 위하여, 상기 효소들을 siRNA로 넉다운하여 KL 세포의 침윤성 변화를 확인하였다. ACLY 및 ACSS2 넉다운 시 아세틸-CoA 수준이 감소되었고(도 7I), HBEC-KL 세포와 KL 세포에서 침윤성이 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 7J, 8G). KL 세포에서 아세테이트 처리 시 침윤성이 증가하는 반면(도 8H), ACSS2 넉다운 시 침윤성이 감소되었는 바(도 7K), 침윤형으로 유도하기 위하여 아세테이트는 ACSS2를 통하여 아세틸-CoA로 전환되는 것을 알 수 있었다. 더욱이, siCS 및 siIDH1도 시트레이트 수준을 비슷한 정도로 감소시켰는 바(도 7L), KL 세포에서 미토콘트리아 의존성 경로(CS)와 비의존성 경로(IDH1) 모두 시트레이트 풀에 작용하는 것을 알 수 있었다. Snail 단백질의 발현 수준 또한 siCS 및 siIDH1에 의해 감소하여(도 7M), CS의 직접적 기질로 작용하는 MP와 IDH1 및 CS의 직접적 또는 간접적 기질로 작용하는 MOG가 감소된 Snail의 발현 수준을 회복시킬 수 있는 지 실험하였다. 그 결과, MP에 의해서는 siCS에 의해 감소된 Snail 발현 수준이 증가되지 않은 반면, MOG에 의해서는 siIDH1에 의해 감소된 Snail의 발현 수준이 다시 회복된 것을 확인할 수 있었다. 이로써, MOG는 미토콘드리아 TCA 사이클을 통해 IDH1을 우회하지만, MP는 CS를 우회하는 데에 제한된 것을 알 수 있었다(도 7M). 클로로퀸(CQ) 처리 조건에서도 이러한 회복 패턴은 동일하게 관찰되었는 바, CQ 처리 조건은 미토콘드리아 의존성 공급에 큰 영향을 가하지 않는 것을 알 수 있었다(도 7N). 하지만 MOG 보충 조건에서 ACLY가 감소되는 경우 Snail 수준은 다시 회복되지 않았다(도 7M). 이로써, KL 세포에서 아세테이트 및 시트레이트 모두 경로와 관계없이 아세틸-CoA의 공급원으로 작용하며, 아세틸-CoA는 KL 세포의 침윤성을 증가시키는 데에 핵심적인 대사체로 작용하는 것을 알 수 있었다.
아세틸-CoA는 지방 합성 및 단백질 아세틸화에 주로 사용되는데(도 7H), 아세틸-CoA 중재 지방산 합성이 세포 침윤성을 조절하는 지 확인하기 위하여 아세틸-CoA 카복실라제(acetyl-CoA carboxylase 1; ACC1)를 억제하였다. 하지만, HBEC-KL 세포주 및 KL 세포주에서 아세틸-CoA 발현 수준을 증가시키는 ACC1를 억제하여도 침윤성이 증가하였는 바, 지방산 합성이 침윤형 유도에 주된 요인에 해당하지는 않음을 알 수 있었다(도 7O, 8I). 반면에 CBP (CREB-binding protein)의 넉다운 시 침윤성이 감소하였고(도 8J, 8K), CBP 아세틸트렌스퍼라제의 화학적 억제 역시 아세테이트의 침윤성에 대한 영향을 감소시켰다(도 8L, 7P). 이로부터 자가포식작용의 활성화는 아세틸-CoA 전구체를 생성하고, 타겟 단백질의 아세틸화를 통해 KRAS/LKB1 공동 돌연변이 폐암 세포에서 침윤성이 증가되는 것을 알 수 있었다.
KL 세포에서 자가포식작용 유도 아세틸-CoA의 CBP-중재 Snail 아세틸화를 통한 침윤성 증가
KL 암 세포에서 Snail의 발현 수준이 세포 침윤성과 높은 상관 관계를 보였고(도 1D, 1E), 시트레이트 경로의 변화에 의해 상기 Snail 발현 수준 또한 변화하는 것을 확인할 수 있었다(7F, 7M). 아세틸-CoA 유도 침윤성이 Snail에 의해 조절되는 지 확인하기 위하여, 아세틸-CoA 풍부도의 변화에 따른 Snail 발현 수준의 변화를 확인하였다. 아세테이트 보충 및 ACACA 유전적 넉다운 시 Snail mRNA 발현 수준에는 영향이 없었으나, 단백질의 발현 수준이 증가하였다(도 10A, 10B). 추가로, 아세테이트 보충 시 아세틸화된 Snail의 수준도 증가한 반면(도 10C), 시트레이트를 아세틸-CoA로 변환시키는 효소인 ACLY의 유전적 넉다운 시 단백질 아세틸화 및 아세틸화된 Snail의 수준이 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 10D). 또한, ACLY 억제제인 BMS303141, NDI-091143 및 SB-204990 처리 시 Snail 및 매트리겔 침윤이 감소되었으나, 프로테아좀 억제제인 보르테조밉과 함께 처리하자 상기 ACLY 억제제에 의한 Snail 감소가 회복되는 것을 확인할 수 있었다(도 10E). 이를 통해 아세틸-CoA는 Snail 아세틸화를 유도하고 이로써 유비퀴틴화를 억제함으로써 안정성이 증가되는 것을 알 수 있었다.
이러한 결과와 일치하게, HBEC-K 세포주와 비교하여 HBEC-KL 세포주에서 단백질 아세틸화가 증가되었고, 아세틸화된 Snail 수준 또한 증가되었다(도 9A). KL 세포주에서 아세틸-CoA 공급책으로 활성화된 자가포식작용이 기능을 하므로, 상위 조절자인 CAMKK2의 유전적 및 화학적 억제는 아세틸화된 Snail 수준뿐만 아니라 전반적 단백질의 아세틸화를 감소시키는 것을 볼 수 있었다(도 10F). 마찬가지로 클로로퀸(CQ) 또는 siATG5/TFEB에 의한 자가포식작용의 억제 시 동일한 효과가 나타났다(도 10G, 10H, 9B, 9C). 반면, HBEC-K 세포에서 mTOR 억제 및/또는 전위적 TFEB 발현에 의해 자가포식작용의 활성화 시 단백질 아세틸화, 아세틸화된 히스톤 H3, 핵-시토졸 아세틸-CoA 수준에 반응하는 대표적 단백질들과 아세틸 Snail의 수준이 모두 증가하였다(도 10I, 10J, 10K). 게다가 ACLY-감소된 KL 세포에서는 자가포식작용 활성화에 의한 Snail의 증가가 관찰되지 않았다(도 9D). 이로부터 활성화된 자가포식작용-유도 아세틸-CoA는 Snail의 아세틸화를 증가시키는 것을 알 수 있었다.
아세틸트렌스퍼라제 CBP는 아세틸-CoA를 이용하여 Snail을 아세틸화하고, 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 분류 1,2는 Snail을 디아세틸화하는데, HBEC-KL 세포주 및 KL 세포주에서 siRNA-중재 CBP (siCREBBP) 넉다운 시 Snail 발현 수준이 감소하였고(도 9E, 9F), 이는 mRNA 수준에서는 아무런 변화가 없는 것을 볼 때 일부 단백질의 안정성이 감소함에 의한 것임을 알 수 있었다(도 9E). 한편, HDAC 억제제인 SAHA (vorinostat) 처리 시 아세틸화된 Snail 수준이 증가하고 매트리겔-침윤 정도가 증가하였으나(도 9G), SNAI1 넉다운 시 반대의 양상을 보였다(도 9H). 이로부터 HDAC 억제제에 의한 세포 침윤의 증가는 Snail에 의존하는 것임을 알 수 있었다. SAHA-유도 Snail 안정화의 적어도 일부는 단백질 합성 보다는 Snail-아세틸화에 의해 조절되는 것을 볼 수 있었다(도 10L). 또한, 클로로퀸(CQ)에 의한 Snail 감소가 SAHA 처리 시 회복되었는데, 이로써 자가포식작용이 Snail 아세틸화를 유도하는 것을 다시금 확인할 수 있었다(도 9I). Snail에 아세틸화되어 진화적으로 보존된 2개의 라이신 잔기(K146, K187)가 존재하는데, 이러한 아세틸화 결손 Snail (Snail-K146R and Snail-K187R)에서는 침윤성이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었는 바, Snail 아세틸화는 KL 세포주의 침윤성 증가에 필요함을 알 수 있었다(도 9J). CBP 억제제인 C646을 통한 야생형 Snail의 탈아세틸화 시 K48 다유비퀴틴화(polyubiquitination)와 일치하게 인산화가 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 9K 왼쪽). 반면, SAHA에 의한 야생형 Snail의 아세틸화는 감소된 K48 다유비퀴틴화(polyubiquitination)와 일치하게 인산화가 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 9L 왼쪽). 하지만, C646 및 SAHA 모두 K146R Snail의 인산화 및 아세틸화에는 영향을 미치지 않았다(도 9K 오른쪽, 도 9L 오른쪽).
이로부터, 자가포식작용-유도 아세틸 CoA는 CBP-중재 Snail 아세틸화를 통해 KL 세포의 침윤성을 증가시키는 것을 알 수 있었다.
TFEB 아세틸화의 증가로 인한, 자가포식작용 활성화를 위한 양성 피드백 루프의 촉진
일반적으로, LKB1의 손실에 의해 활성화된 라파마이신 복합체 1의 포유류 타겟(mammalian target of rapamycin complex 1; mTORC1)은 TFEB 인산화를 통해 CLEAR 활성을 억제하는 것으로 알려져 있으므로, KL 세포주에서 CLEAR 활성 억제를 예측할 수는 없었다. 따라서, KL 세포주에서의 CLEAR 활성화에는 TFEB 아세틸화가 관여할 것으로 가정하였다. TFEB의 아세틸화의 전사 조절 활성에의 영향을 확인하기 위하여, WT TFEB와 아세틸화-결손 TFEB[4KR]를 과발현한 뒤 CLEAR 활성을 측정하였다. 실제로 HBEC-KL 세포주에서 아세틸화-결핍 TFEB[4KR] 돌연변이의 경우 CLEAR 활성이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 11A 왼쪽). 게다가 TFEB[4KR] 돌연변이는 SAHA 처리에 비해 반응성이 떨어지는 것을 볼 수 있었다(도 11A 오른쪽). 일관되게, TFEB[4KR] 돌연변이는 야생형에 비하여 감소된 자가포식작용 활성을 보였다(도 11B). 이로부터 아세틸화가 TFEB 기능을 활성화시키는 것을 알 수 있었다.
HBEC-KL 세포주에서 전반적으로 단백질의 아세틸화가 증가되어 있다는 사실에 기반하여(도 9A), 아세틸-CoA 풍부가 TFEB를 아세틸화 시켜 자가포식작용 해소체 시스템을 증가시키는 것으로 가정하였다. HBEC-KL 세포주에서 세린 211번 위치에서 TFEB 인산화가 높게 관찰되었으나, HBEC-K 세포에 비하여 HBEC-KL 세포주에서 아세틸화된 TFEB의 수준이 높게 확인되었다(도 11C). 겉보기에 상충하는 TFEB 변형의 결과를 확인하기 위하여, HBEC-K 세포주와 HBEC-KL 세포주에서 TFEB 위치화를 비교하였다. 그 결과, HBEC-KL 세포주에서 증가된 CLEAR 활성과 일치하게(도 5C), 핵 내 위치화된 TFEB가 높은 수준으로 확인되었다(도 11D). 이러한 결과와 일치하게, 아세테이트 및 SAHA는 핵-위치화된 TFEB의 수준, CLEAR 활성 및 자가포식작용 유동을 증가시켰다(도 11E, 11F, 11G, 11H). 한편, 아세테이트 및 SAHA에 의해 아세틸화된 TFEB, 인산화된 TFEB 및 총 TFEB 단백질 수준은 증가하였지만, mRNA 수준에는 큰 변화가 없었는 바(도 11I, 11J, 11K), 아세틸-TFEB는 프로테아좀 분해로부터 보호되는 것을 알 수 있었다. 아세테이트 및 SAHA 처리에 의해도 포스포-RPS6(p-S6) 수준이 일정하게 유지되는 것으로부터 인산회 TFEB의 증가는 mTORC1 활성과 무관한 것을 알 수 있었다(도 11I, 11J).
TFEB 인산화 및 아세틸화가 동시에 일어나므로(도 11C, 11L, 11J), 각 변형을 다양한 방식으로 조절하였고, 그에 따른 TFEB 활성 변화를 평가하였다. HBEC-KL 세포주에서 ACLY 유전적 넉다운에 의해 아세틸화된 TFEB가 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 11L, 왼쪽). 이러한 조건에서, TFEB 인산화를 억제하는 mTOR 억제제인 라파마이신도 CLEAR 활성을 회복시키지는 못하였다(도 11L, 오른쪽). 반면에 칼시뉴린 억제제인 FK506는 포스포-TFEB를 증가시켜 CLEAR 활성을 감소시켰다(도 11M, 왼쪽). 이러한 조건 하에서 아세테이트 및 SAHA를 처리하자 FK506의 효과가 극복되어 CLEAR 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 11M, 오른쪽). 이로부터 TFEB 인산화는 주로 시토졸 유지 vs. 핵내 위치화를 통해 그 활성을 조절함으로써 기능하는 반면, TFEB 아세틸화는 핵내 위치하는 활성화된 형태와 시토졸 내 위치하는 비활성화된 형태의 TFEB가 동시에 증가되어 프로테아좀 분해로부터 안정화됨으로써 기능을 하는 것을 알 수 있었다. TFEB 활성에 있어서는 전자가 더 우세하지만, 증가된 TFEB 활성화는 TFEB 인산화가 증가된 조건에서 자가포식작용/리소좀을 활성화시킬 수 있다.
다음으로, 자가포식작용 억제가 양성 피드백 고리(positive feedback loop)를 손상시키는 지 확인하였다. 도 11N에서 보는 바와 같이, STO-609는 아세틸화된 TFEB를 효과적으로 감소시킨다. 반면에 아세테이트 및 SAHA는 클로로퀸(CQ) 처리 조건에서 감소된 TFEB 단백질 수준을 부분적으로 회복시켰다(도 11O). 이러한 결과는 TFEB 아세틸화가 총 TFEB 단백질 활성을 유지시키는 데에 관련이 있다는 것과 일치하였다. 이러한 결과로부터 자가포식작용-유래 아세틸-CoA는 TFEB 활성화를 통해 자가포식작용 활성화에 기인하는 것을 알 수 있었다.
KRAS 돌연변이 췌장암 세포에서 자가포식작용/아세틸-CoA/아세틸-Snail 축(axis) 관련 침윤성의 증가
KRAS-돌연변이 췌장관 세포암은 자가포식작용 및 미세포음작용(micropinocytosis)에의 의존성이 증가된 것을 특징으로 하는데, KL 세포와 생리학적으로 유사한 KRAS-돌연변이 췌장암 세포주에서도 앞선 실험에서의 논리가 동일하게 적용되는 지 확인하기 위하여 이하의 실험을 수행하였다. CCLE 대사체 데이터를 분석한 결과 다른 암 세포와 비교하여 췌장암 세포주에서 시트레이트가 높은 수준으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 12A). KRAS-돌연변이 췌장암 세포에서 자가포식작용/아세틸-CoA/아세틸-Snail 축을 확인한 결과, 클로로퀸(CQ)에 의한 자가포식작용 억제 시 아세틸-CoA, 아세틸화된 Snail 및 2D 매트리겔 트랜스웰 침윤이 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 12B, 12C, 12D, 12E). 또한, ACLY 유전적 넉다운 시에도 Snail 발현 수준과 침윤성이 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 12F, 12G). 또한, KL 세포주에서와 같이, 췌장암 세포에서 아세틸화 결손 Snail(Snail-K146R and Snail-K187R)은 대조군에 비하여 침윤성이 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 12H, 12I). 즉, KL 세포와 KRAS-돌연변이 췌장암 세포 모두에서 아세틸-CoA는 침윤성을 높이는 데에 직접적 하위의 주된 대사체에 해당하는 것을 알 수 있었다.
조직 마이크로어레이를 통한 자가포식작용/아세틸-CoA/아세틸-Snail 축(axis) 검증 및 인-비보에서 약학적 억제제를 통한 KL 세포의 전이성 억제
폐암 환자의 생존 데이터와 종양 조직 마이크로어레이(TMA)를 통해 자가포식작용/아세틸-CoA/아세틸-Snail 축을 임상적으로 검증하였다. 총 Snail 및 핵 Snail 강도는 TMA 코호트의 나쁜 예후(짧은 전체생존기간)와 관련도가 높았다(도 13A, 13B, 14A). 게다가 높은 총 Snail 및 핵 Snail 강도를 보이는 종양 조직에서 핵 아세틸-라이신(핵 아세틸-CoA의 마커), 총 아세틸-라이신(세포 내 아세틸-CoA 마커) 및 LAMP2(자가포식용해소체 마커) 모두 매우 높은 강도를 보였는 바(도 13C, 14B), 인간 폐암 조직에서 자가포식작용/아세틸-CoA/아세틸-Snail 축이 온전히 존재하는 것을 알 수 있었다.
인-비보에서 이러한 자가포식작용/아세틸-CoA/아세틸-Snail의 전-전이성 역할을 확인하기 위하여, A549 발현 루시퍼라제를 마우스 꼬리 정맥을 통해 주입하여 폐 전이가 유도된 마우스 모델을 이용하였다. 인-비트로에서 A549 루시퍼라제 세포주에서 STO-609는 아세틸화된 Snail을 감소시켰는데(도 13D), 인-비보에서도 STO-609 처리군(25mg/kg, 100mg/kg, qd, p.o. 28일 연속)은 비히클-처리군에 비하여 총 전이 정도(total metastasis burden) 및 총 폐 전이 수가 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 13E, 13F, 13G). ACLY 억제제인 BMS303141 (100mg/kg, qd p.o 20일 연속)을 처리한 결과 총 전이 정도가 감소하였는 바(도 13H, 13I, 13J), 인-비보에서도 자가포식작용/아세틸-CoA 축의 억제는 항-전이 효과를 발휘하는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해, KL 폐암뿐만 아니라 췌장암과 같은 자가포식작용이 활성화된 다른 종류의 암종에서도 자가포식작용 유도 아세틸-CoA 및 Snail 아세틸화는 전이 및 악성화의 주된 기작으로 작용할 것임을 알 수 있었다. 더 나아가 이러한 축의 약학적 억제를 통해 다양한 전이성 암의 치료 효과를 기대할 수 있다.
이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Pharmaceutical composition for inhibiting metastasis of cancer <130> PDPB204309 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 588 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Ser Cys Val Ser Ser Gln Pro Ser Ser Asn Arg Ala Ala Pro 1 5 10 15 Gln Asp Glu Leu Gly Gly Arg Gly Ser Ser Ser Ser Glu Ser Gln Lys 20 25 30 Pro Cys Glu Ala Leu Arg Gly Leu Ser Ser Leu Ser Ile His Leu Gly 35 40 45 Met Glu Ser Phe Ile Val Val Thr Glu Cys Glu Pro Gly Cys Ala Val 50 55 60 Asp Leu Gly Leu Ala Arg Asp Arg Pro Leu Glu Ala Asp Gly Gln Glu 65 70 75 80 Val Pro Leu Asp Thr Ser Gly Ser Gln Ala Arg Pro His Leu Ser Gly 85 90 95 Arg Lys Leu Ser Leu Gln Glu Arg Ser Gln Gly Gly Leu Ala Ala Gly 100 105 110 Gly Ser Leu Asp Met Asn Gly Arg Cys Ile Cys Pro Ser Leu Pro Tyr 115 120 125 Ser Pro Val Ser Ser Pro Gln Ser Ser Pro Arg Leu Pro Arg Arg Pro 130 135 140 Thr Val Glu Ser His His Val Ser Ile Thr Gly Met Gln Asp Cys Val 145 150 155 160 Gln Leu Asn Gln Tyr Thr Leu Lys Asp Glu Ile Gly Lys Gly Ser Tyr 165 170 175 Gly Val Val Lys Leu Ala Tyr Asn Glu Asn Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala 180 185 190 Met Lys Val Leu Ser Lys Lys Lys Leu Ile Arg Gln Ala Gly Phe Pro 195 200 205 Arg Arg Pro Pro Pro Arg Gly Thr Arg Pro Ala Pro Gly Gly Cys Ile 210 215 220 Gln Pro Arg Gly Pro Ile Glu Gln Val Tyr Gln Glu Ile Ala Ile Leu 225 230 235 240 Lys Lys Leu Asp His Pro Asn Val Val Lys Leu Val Glu Val Leu Asp 245 250 255 Asp Pro Asn Glu Asp His Leu Tyr Met Val Phe Glu Leu Val Asn Gln 260 265 270 Gly Pro Val Met Glu Val Pro Thr Leu Lys Pro Leu Ser Glu Asp Gln 275 280 285 Ala Arg Phe Tyr Phe Gln Asp Leu Ile Lys Gly Ile Glu Tyr Leu His 290 295 300 Tyr Gln Lys Ile Ile His Arg Asp Ile Lys Pro Ser Asn Leu Leu Val 305 310 315 320 Gly Glu Asp Gly His Ile Lys Ile Ala Asp Phe Gly Val Ser Asn Glu 325 330 335 Phe Lys Gly Ser Asp Ala Leu Leu Ser Asn Thr Val Gly Thr Pro Ala 340 345 350 Phe Met Ala Pro Glu Ser Leu Ser Glu Thr Arg Lys Ile Phe Ser Gly 355 360 365 Lys Ala Leu Asp Val Trp Ala Met Gly Val Thr Leu Tyr Cys Phe Val 370 375 380 Phe Gly Gln Cys Pro Phe Met Asp Glu Arg Ile Met Cys Leu His Ser 385 390 395 400 Lys Ile Lys Ser Gln Ala Leu Glu Phe Pro Asp Gln Pro Asp Ile Ala 405 410 415 Glu Asp Leu Lys Asp Leu Ile Thr Arg Met Leu Asp Lys Asn Pro Glu 420 425 430 Ser Arg Ile Val Val Pro Glu Ile Lys Leu His Pro Trp Val Thr Arg 435 440 445 His Gly Ala Glu Pro Leu Pro Ser Glu Asp Glu Asn Cys Thr Leu Val 450 455 460 Glu Val Thr Glu Glu Glu Val Glu Asn Ser Val Lys His Ile Pro Ser 465 470 475 480 Leu Ala Thr Val Ile Leu Val Lys Thr Met Ile Arg Lys Arg Ser Phe 485 490 495 Gly Asn Pro Phe Glu Gly Ser Arg Arg Glu Glu Arg Ser Leu Ser Ala 500 505 510 Pro Gly Asn Leu Leu Thr Lys Lys Pro Thr Arg Glu Cys Glu Ser Leu 515 520 525 Ser Glu Leu Lys Glu Ala Arg Gln Arg Arg Gln Pro Pro Gly His Arg 530 535 540 Pro Ala Pro Arg Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Val Arg Gly Ser Pro 545 550 555 560 Cys Val Glu Ser Cys Trp Ala Pro Ala Pro Gly Ser Pro Ala Arg Met 565 570 575 His Pro Leu Arg Pro Glu Glu Ala Met Glu Pro Glu 580 585 <210> 2 <211> 1101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Ala Lys Ala Ile Ser Glu Gln Thr Gly Lys Glu Leu Leu Tyr 1 5 10 15 Lys Phe Ile Cys Thr Thr Ser Ala Ile Gln Asn Arg Phe Lys Tyr Ala 20 25 30 Arg Val Thr Pro Asp Thr Asp Trp Ala Arg Leu Leu Gln Asp His Pro 35 40 45 Trp Leu Leu Ser Gln Asn Leu Val Val Lys Pro Asp Gln Leu Ile Lys 50 55 60 Arg Arg Gly Lys Leu Gly Leu Val Gly Val Asn Leu Thr Leu Asp Gly 65 70 75 80 Val Lys Ser Trp Leu Lys Pro Arg Leu Gly Gln Glu Ala Thr Val Gly 85 90 95 Lys Ala Thr Gly Phe Leu Lys Asn Phe Leu Ile Glu Pro Phe Val Pro 100 105 110 His Ser Gln Ala Glu Glu Phe Tyr Val Cys Ile Tyr Ala Thr Arg Glu 115 120 125 Gly Asp Tyr Val Leu Phe His His Glu Gly Gly Val Asp Val Gly Asp 130 135 140 Val Asp Ala Lys Ala Gln Lys Leu Leu Val Gly Val Asp Glu Lys Leu 145 150 155 160 Asn Pro Glu Asp Ile Lys Lys His Leu Leu Val His Ala Pro Glu Asp 165 170 175 Lys Lys Glu Ile Leu Ala Ser Phe Ile Ser Gly Leu Phe Asn Phe Tyr 180 185 190 Glu Asp Leu Tyr Phe Thr Tyr Leu Glu Ile Asn Pro Leu Val Val Thr 195 200 205 Lys Asp Gly Val Tyr Val Leu Asp Leu Ala Ala Lys Val Asp Ala Thr 210 215 220 Ala Asp Tyr Ile Cys Lys Val Lys Trp Gly Asp Ile Glu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Pro Phe Gly Arg Glu Ala Tyr Pro Glu Glu Ala Tyr Ile Ala Asp Leu 245 250 255 Asp Ala Lys Ser Gly Ala Ser Leu Lys Leu Thr Leu Leu Asn Pro Lys 260 265 270 Gly Arg Ile Trp Thr Met Val Ala Gly Gly Gly Ala Ser Val Val Tyr 275 280 285 Ser Asp Thr Ile Cys Asp Leu Gly Gly Val Asn Glu Leu Ala Asn Tyr 290 295 300 Gly Glu Tyr Ser Gly Ala Pro Ser Glu Gln Gln Thr Tyr Asp Tyr Ala 305 310 315 320 Lys Thr Ile Leu Ser Leu Met Thr Arg Glu Lys His Pro Asp Gly Lys 325 330 335 Ile Leu Ile Ile Gly Gly Ser Ile Ala Asn Phe Thr Asn Val Ala Ala 340 345 350 Thr Phe Lys Gly Ile Val Arg Ala Ile Arg Asp Tyr Gln Gly Pro Leu 355 360 365 Lys Glu His Glu Val Thr Ile Phe Val Arg Arg Gly Gly Pro Asn Tyr 370 375 380 Gln Glu Gly Leu Arg Val Met Gly Glu Val Gly Lys Thr Thr Gly Ile 385 390 395 400 Pro Ile His Val Phe Gly Thr Glu Thr His Met Thr Ala Ile Val Gly 405 410 415 Met Ala Leu Gly His Arg Pro Ile Pro Asn Gln Pro Pro Thr Ala Ala 420 425 430 His Thr Ala Asn Phe Leu Leu Asn Ala Ser Gly Ser Thr Ser Thr Pro 435 440 445 Ala Pro Ser Arg Thr Ala Ser Phe Ser Glu Ser Arg Ala Asp Glu Val 450 455 460 Ala Pro Ala Lys Lys Ala Lys Pro Ala Met Pro Gln Asp Ser Val Pro 465 470 475 480 Ser Pro Arg Ser Leu Gln Gly Lys Ser Thr Thr Leu Phe Ser Arg His 485 490 495 Thr Lys Ala Ile Val Trp Gly Met Gln Thr Arg Ala Val Gln Gly Met 500 505 510 Leu Asp Phe Asp Tyr Val Cys Ser Arg Asp Glu Pro Ser Val Ala Ala 515 520 525 Met Val Tyr Pro Phe Thr Gly Asp His Lys Gln Lys Phe Tyr Trp Gly 530 535 540 His Lys Glu Ile Leu Ile Pro Val Phe Lys Asn Met Ala Asp Ala Met 545 550 555 560 Arg Lys His Pro Glu Val Asp Val Leu Ile Asn Phe Ala Ser Leu Arg 565 570 575 Ser Ala Tyr Asp Ser Thr Met Glu Thr Met Asn Tyr Ala Gln Ile Arg 580 585 590 Thr Ile Ala Ile Ile Ala Glu Gly Ile Pro Glu Ala Leu Thr Arg Lys 595 600 605 Leu Ile Lys Lys Ala Asp Gln Lys Gly Val Thr Ile Ile Gly Pro Ala 610 615 620 Thr Val Gly Gly Ile Lys Pro Gly Cys Phe Lys Ile Gly Asn Thr Gly 625 630 635 640 Gly Met Leu Asp Asn Ile Leu Ala Ser Lys Leu Tyr Arg Pro Gly Ser 645 650 655 Val Ala Tyr Val Ser Arg Ser Gly Gly Met Ser Asn Glu Leu Asn Asn 660 665 670 Ile Ile Ser Arg Thr Thr Asp Gly Val Tyr Glu Gly Val Ala Ile Gly 675 680 685 Gly Asp Arg Tyr Pro Gly Ser Thr Phe Met Asp His Val Leu Arg Tyr 690 695 700 Gln Asp Thr Pro Gly Val Lys Met Ile Val Val Leu Gly Glu Ile Gly 705 710 715 720 Gly Thr Glu Glu Tyr Lys Ile Cys Arg Gly Ile Lys Glu Gly Arg Leu 725 730 735 Thr Lys Pro Ile Val Cys Trp Cys Ile Gly Thr Cys Ala Thr Met Phe 740 745 750 Ser Ser Glu Val Gln Phe Gly His Ala Gly Ala Cys Ala Asn Gln Ala 755 760 765 Ser Glu Thr Ala Val Ala Lys Asn Gln Ala Leu Lys Glu Ala Gly Val 770 775 780 Phe Val Pro Arg Ser Phe Asp Glu Leu Gly Glu Ile Ile Gln Ser Val 785 790 795 800 Tyr Glu Asp Leu Val Ala Asn Gly Val Ile Val Pro Ala Gln Glu Val 805 810 815 Pro Pro Pro Thr Val Pro Met Asp Tyr Ser Trp Ala Arg Glu Leu Gly 820 825 830 Leu Ile Arg Lys Pro Ala Ser Phe Met Thr Ser Ile Cys Asp Glu Arg 835 840 845 Gly Gln Glu Leu Ile Tyr Ala Gly Met Pro Ile Thr Glu Val Phe Lys 850 855 860 Glu Glu Met Gly Ile Gly Gly Val Leu Gly Leu Leu Trp Phe Gln Lys 865 870 875 880 Arg Leu Pro Lys Tyr Ser Cys Gln Phe Ile Glu Met Cys Leu Met Val 885 890 895 Thr Ala Asp His Gly Pro Ala Val Ser Gly Ala His Asn Thr Ile Ile 900 905 910 Cys Ala Arg Ala Gly Lys Asp Leu Val Ser Ser Leu Thr Ser Gly Leu 915 920 925 Leu Thr Ile Gly Asp Arg Phe Gly Gly Ala Leu Asp Ala Ala Ala Lys 930 935 940 Met Phe Ser Lys Ala Phe Asp Ser Gly Ile Ile Pro Met Glu Phe Val 945 950 955 960 Asn Lys Met Lys Lys Glu Gly Lys Leu Ile Met Gly Ile Gly His Arg 965 970 975 Val Lys Ser Ile Asn Asn Pro Asp Met Arg Val Gln Ile Leu Lys Asp 980 985 990 Tyr Val Arg Gln His Phe Pro Ala Thr Pro Leu Leu Asp Tyr Ala Leu 995 1000 1005 Glu Val Glu Lys Ile Thr Thr Ser Lys Lys Pro Asn Leu Ile Leu Asn 1010 1015 1020 Val Asp Gly Leu Ile Gly Val Ala Phe Val Asp Met Leu Arg Asn Cys 1025 1030 1035 1040 Gly Ser Phe Thr Arg Glu Glu Ala Asp Glu Tyr Ile Asp Ile Gly Ala 1045 1050 1055 Leu Asn Gly Ile Phe Val Leu Gly Arg Ser Met Gly Phe Ile Gly His 1060 1065 1070 Tyr Leu Asp Gln Lys Arg Leu Lys Gln Gly Leu Tyr Arg His Pro Trp 1075 1080 1085 Asp Asp Ile Ser Tyr Val Leu Pro Glu His Met Ser Met 1090 1095 1100 <210> 3 <211> 264 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Pro Arg Ser Phe Leu Val Arg Lys Pro Ser Asp Pro Asn Arg Lys 1 5 10 15 Pro Asn Tyr Ser Glu Leu Gln Asp Ser Asn Pro Glu Phe Thr Phe Gln 20 25 30 Gln Pro Tyr Asp Gln Ala His Leu Leu Ala Ala Ile Pro Pro Pro Glu 35 40 45 Ile Leu Asn Pro Thr Ala Ser Leu Pro Met Leu Ile Trp Asp Ser Val 50 55 60 Leu Ala Pro Gln Ala Gln Pro Ile Ala Trp Ala Ser Leu Arg Leu Gln 65 70 75 80 Glu Ser Pro Arg Val Ala Glu Leu Thr Ser Leu Ser Asp Glu Asp Ser 85 90 95 Gly Lys Gly Ser Gln Pro Pro Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Ser Ser 100 105 110 Phe Ser Ser Thr Ser Val Ser Ser Leu Glu Ala Glu Ala Tyr Ala Ala 115 120 125 Phe Pro Gly Leu Gly Gln Val Pro Lys Gln Leu Ala Gln Leu Ser Glu 130 135 140 Ala Lys Asp Leu Gln Ala Arg Lys Ala Phe Asn Cys Lys Tyr Cys Asn 145 150 155 160 Lys Glu Tyr Leu Ser Leu Gly Ala Leu Lys Met His Ile Arg Ser His 165 170 175 Thr Leu Pro Cys Val Cys Gly Thr Cys Gly Lys Ala Phe Ser Arg Pro 180 185 190 Trp Leu Leu Gln Gly His Val Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe 195 200 205 Ser Cys Pro His Cys Ser Arg Ala Phe Ala Asp Arg Ser Asn Leu Arg 210 215 220 Ala His Leu Gln Thr His Ser Asp Val Lys Lys Tyr Gln Cys Gln Ala 225 230 235 240 Cys Ala Arg Thr Phe Ser Arg Met Ser Leu Leu His Lys His Gln Glu 245 250 255 Ser Gly Cys Ser Gly Cys Pro Arg 260

Claims (26)

  1. 칼슘/칼모듈린 의존성 단백질 키나제 키나제 2(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase 2; CAMKK2) 및 ATP 시트르산 분해 효소(ATP citrate lyase; ACLY) 중 적어도 하나의 단백질의 활성 또는 발현 억제제; 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 억제제를 유효 성분으로 포함하는 암의 전이 억제용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단백질의 활성 또는 발현 억제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 CAMKK2 단백질의 활성 또는 발현 억제제는 STO-609, SGC-CAMKK2-1, KN62, KN93, AIP, ACS-I 및 버바민(berbamine)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 ACLY 단백질의 활성 또는 발현 억제제는 BMS303141, NDI-091143, SB-204990, ETC-1002, 라디시콜(radicicol), (-)-하이드록시스트르산((-)-hydroxycitric acid) 및 2-클로로-1,3,8-트리하이드록시-6-메틸안트론(2-chloro-1,3,8-trihydroxy-6-methylanthrone)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    유전자의 발현 억제제는 상기 유전자에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는, 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 암은 자가포식작용(autophagy)이 활성화된 암인, 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 암은 KRAS 및 LKB1 중 적어도 하나에 돌연변이를 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(Central nervous system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종인, 약학적 조성물.
  9. 분리된 생물학적 시료에 대하여 후보 물질을 처리하는 단계; 및
    상기 후보 물질의 처리 후 상기 생물학적 시료에 대하여 칼슘/칼모듈린 의존성 단백질 키나제 키나제 2(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase 2; CAMKK2) 및 ATP 시트르산 분해 효소(ATP citrate lyase; ACLY) 중 적어도 하나의 단백질의 활성 또는 발현 수준을 측정하거나 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암 전이 억제제의 스크리닝 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함하는, 스크리닝 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 후보 물질은 천연 화합물, 합성 화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사 산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 스크리닝 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 단백질의 활성 또는 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 스크리닝 방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 스크리닝 방법.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 단백질의 활성 또는 발현 수준을 측정하는 방법은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의하는, 스크리닝 방법.
  15. 제9항에 있어서,
    상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의하는, 스크리닝 방법.
  16. 제9항에 있어서,
    상기 후보 물질의 처리 후 상기 생물학적 시료에서 측정된 CAMKK2 및 ACLY 중 적어도 하나의 단백질의 활성 또는 발현 수준이 감소하거나, 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준이 감소한 경우, 상기 후보 물질을 암 전이 억제제로 판별하는 단계를 더 포함하는, 스크리닝 방법.
  17. 제9항에 있어서,
    상기 암은 자가포식작용(autophagy)이 활성화된 암인, 스크리닝 방법.
  18. 제9항에 있어서,
    상기 암은 KRAS 및 LKB1 중 적어도 하나에 돌연변이를 포함하는 것인, 스크리닝 방법.
  19. 제9항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(Central nervous system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종인, 스크리닝 방법.
  20. 암이 발병하였거나 발병 가능성이 높은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 KRAS 및 LKB1 중 적어도 하나의 유전자에 돌연변이 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 암 전이 억제제의 치료 반응성을 예측하기 위한 정보 제공 방법으로,
    상기 암 전이 억제제는 칼슘/칼모듈린 의존성 단백질 키나제 키나제 2(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase 2; CAMKK2) 및 ATP 시트르산 분해 효소(ATP citrate lyase; ACLY) 단백질의 활성 또는 발현 억제제, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 억제제인, 정보 제공 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 유전자에 돌연변이 존재 여부를 검출하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 및 RNA 시퀸싱으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 정보 제공 방법.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 유전자에 돌연변이 존재 여부를 검출하기 위한 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 정보 제공 방법.
  23. 제20항에 있어서,
    상기 정보 제공 방법은 상기 생물학적 시료에서 Snail 단백질의 아세틸화(acetylation) 여부 또는 정도를 검출하는 단계를 더 포함하는, 정보 제공 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 생물학적 시료에서 KRAS 및 LKB1 중 적어도 하나의 유전자에 돌연변이가 존재하고, Snail 단백질의 아세틸화가 대조군에 비하여 증가된 경우 상기 암 전이 억제제의 치료 반응성이 높은 것으로 예측하는, 정보 제공 방법.
  25. 제20항에 있어서,
    상기 암은 자가포식작용(autophagy)이 활성화된 암인, 정보 제공 방법.
  26. 제20항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(Central nervous system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종인, 정보 제공 방법.
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