KR102620797B1 - Blzf1 과발현 종양 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 BLZF1 억제제를 포함하는 BLZF1 과발현 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 위장관 기질종양에서 과발현된 BLZF1의 활성을 억제하여, 돌연변이 KIT 단백질의 발현을 억제할 수 있고, 또한 세포 성장을 억제할 수 있으므로 이에 따라 위장관 기질종양을 예방 또는 치료할 수 있다.
Description
본 발명은 BLZF1을 과발현하는 종양의 진단용 조성물 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
위장관 기질 종양 (GIST, Gastrointestinal stromal tumor)은 위장관 벽의 중간에 위치한 근육층에 존재하는 기질세포가 암세포로 변이를 일으켜 발생한다. 일반적으로 위암이나 대장암처럼 소화기에 발생하는 대부분의 암이 상피세포에서 유래하는 것과 달리 위장관 기질 종양은 근육층의 중간엽 유래 기질 세포로부터 생기는 암으로서, 식도, 위, 소장, 결장, 직장 등 위장관의 어디든 발생할 수 있고 원인과 위치, 전이 양상 등이 역시 일반적인 위암 및 소화기암과 다르다. 또한 뚜렷한 증상이 없기 때문에 정기검진이 무엇보다 중요한 질환 중 하나다.
GIST의 주요 병리기전은 KIT 유전자 돌연변이로 인한 c-KIT 단백질의 지속적인 활성화와 PDGFRα 유전자 돌연변이로 알려졌는데, 대부분의 GIST 에서 KIT 또는 PDGFRα 유전자 돌연변이가 발견되고, 이중 KIT 유전자 돌연변이가 75~80%로 매우 흔한 것으로 보고되었다.
c-KIT (KIT, CD117, 또는 줄기세포인자 수용체로 알려짐)는 III형 수용체로서 작용하는 145 kDa 막관통 티로신 키나아제 단백질이다. 염색체 4q11-21에 위치한 c-KIT 유전자는 줄기세포 인자(SCF, 줄기세포 성장인자, kit 리간드)를 리간드로 가지는 c-KIT 수용체 단백질을 암호화한다. c-KIT 수용체는 티로신-단백질 키나아제 활성을 가지며, 리간드인 SCF의 결합은 c-KIT를 자가인산화시키고 PI3K, GRB2, JAK2와 같은 하위 신호전달물질과 결합시켜 PI3K-AKT, MAPK-ERK, JAK-STAT 신호전달계와 같은 종양 유발 신호전달계를 동시다발적으로 활성화킨다. 단백질 티로신 키나아제에 의한 티로신 인산화는 세포 신호 전달에서 특히 중요하며, 증식, 생존, 분화, 아폽토시스, 부착, 침습성 및 이동과 같은 주요 세포 조절을 위한 신호 전달을 매개할 수 있는 것으로 알려져 있다.
c-KIT 발현 및 활성의 역할은 급성 백혈병 및 GIST 같은 혈액학적 종양 및 고형 종양에서 연구되어 왔다. 대부분의 GIST는 RTK인 c-KIT(GIST의 75~80%) 또는 PDGFRα(비-c-KIT 돌연변이된 GIST의 8%)를 암호화하는 유전자에서 1차 활성화 돌연변이를 가진다. 특히 GIST 환자의 대부분인 80% 정도에서 c-KIT 유전자의 기능 획득 돌연변이 (gain-of-function mutation)로 인해 c-KIT의 단백질 과발현 및 과인산화를 보인다. 1차 c-KIT 돌연변이 대부분은 exon11에 의해 암호화된 단백질의 막인접 영역(JM region: juxtamembrane region)에서 발생하며, 프레임 내 결실 또는 삽입, 미스센스 돌연변이(즉, V560D)로 이루어진다. c-KIT exon11 돌연변이는 GIST 환자의 약 65%에서 1차 돌연변이로 나타나며, 이러한 JM 도메인 돌연변이는 c-KIT 키나제의 자가억제 기작을 방해하여, GIST의 원인이 되는 키나아제를 자동적으로 활성화시키고 세포의 형질전환을 유발시킨다. 그 외 다른 1차 GIST-유발 c-KIT 돌연변이는 exon9(AY501-502 복제/삽입, 8%), exon13(돌연변이, 1%) 및 exon17(돌연변이, 1%)에 위치하는 것으로 알려져 있다.
악성 종양에서 c-KIT 키나아제 활성화 억제의 임상적 중요성은 티로신 키나아제 수용체를 특이적으로 억제하는 Gleevec을 이용한 연구에서 입증되었다. Gleevec이 통상적인 화학요법에 일반적으로 내성을 나타내는 GIST에 대한 표적 치료를 통한 항종양 효과를 보인 것이다. 그러나, c-KIT 억제제인 Gleevec®의 경우, 이미 전이가 되었거나 수술이 불가한 GIST 환자에 대해 치료효과를 어느 정도 기대할 수 있지만, 완치는 드물고, 약 50%의 환자는 치료 후 2년 이내에 약물 내성이 발생하여 암이 재발하기 때문에 이를 극복할 수 있는 새로운 치료제 개발이 요구된다.
c-KIT에 존재하는 돌연변이 위치는 Gleevec®mesylate, Novartis Pharm.) 기반 치료에서 임상적으로 매우 중요한데 exon 11번 돌연변이 환자의 경우 초기 Gleevec 약물 반응성이 85% 수준으로 좋지만 exon 9번 돌연변이 환자의 경우 45%, exon 13 및 17번 돌연변이 환자의 경우 거의 약물 반응성을 보이지 않아 돌연변이 위치별 약물 치료 효과가 현저한 차이를 보인다. 이러한 돌연변이 위치별 약물 반응성 차이로 인해 현재 임상에서는 Gleevec 기반 GIST 치료의 한계점을 인정하고 있다.
전술한 것처럼 GIST는 돌연변이가 발생한 exon 위치에 따라서 약물 반응성이 애초에 없거나 또는 약물 치료 과정에서 Gleevec®에 대해 내성을 나타내는 경우가 빈번하다. Gleevec 치료 과정 중 발생하는 약물 내성은 c-KIT 유전자에 발생하는 2차 돌연변이에 의해 유도되며, 2차 돌연변이가 발생했을 경우에 대한 확실한 치료법은 아직 정립되지 않았다. Gleevec®치료 과정 중 재발한 GIST 환자들은 본래 가지고 있던 c-KIT 유전자의 1차 돌연변이에 추가하여 2차 돌연변이 발생으로 훨씬 더 공격적인 활성화 형태의 c-KIT 돌연변이 단백질을 갖게된다. 2차 돌연변이는 ATP 결합 포켓 (exon13: K642E, V654A; exon14: T670I) 및 활성화 루프 (exon17: N822K, D816H, D816V, D820A; exon18: A829P)에서 발견되는데, Gleevec이 ATP 결합 포켓에 결합하여 약물 활성을 나타내기 때문에 c-KIT의 이러한 2차 돌연변이체는 약물 내성을 유도한다.
Sutent®(Sunitinib malate, Pfizer)는 다중 RTK의 억제제, 특히 본 맥락에서의 c-KIT의 억제제이며, 2차 돌연변이로 인한 Gleevec 내성 c-KIT (e.g. ATP-결합 포켓 돌연변이체 V654A 및 T670I)을 저해할 수 있는 약제로 개발되었다. 그러나 GIST 환자 중 2차 돌연변이가 exon17에 의해 암호화된 c-KIT 촉매 도메인의 활성화 루프에 위치하는 D816H 및 D816V와 같은 위치에 발생할 경우는 수니티닙(Sunitinib)에 대해서도 내성을 나타내며, 임상에서 수니티닙의 전반적인 약물 반응성은 10% 내외로 큰 성과를 거두지는 못하고 있는 것으로 보고되었다.
Gleevec 내성 GIST 환자에게 활용하는 또 따른 multi kinase inhibitor인 레고라페닙(Regorafenib) 역시 치료 반응성을 보이는 환자가 5% 미만에 불과하며, 그마저도 약물 부작용이 매우 심하기 때문에 적극적 활용에 어려움을 겪고 있다. 따라서 수니티닙과 레고라페닙 모두 Gleevec에 내성을 보이는 GIST에 대한 현실적 대안이 아니다.
본 발명은 Gleevec에 좋은 약물 반응성을 보이는 초기 GIST 환자들 뿐만 아니라 2차 KIT 돌연변이가 발생하여 Gleevec에 대해 내성이 발생한 환자들을 대상으로 돌연변이 KIT을 억제할 수 있는 새로운 표적인자를 발굴한 것으로, 내성이 발생한 환자들에게 새로운 치료 선택지를 제시하고자 한다.
본 발명은 위장관 기질종양에 대한 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 위장관 기질종양의 진단 또는 예후예측을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. BLZF1 억제제를 포함하는 BLZF1 과발현 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 위 1에 있어서, 상기 BLZF1 과발현 종양은 유방암, 담관암, 확산성 거대 B 세포 림프종, 간암, 췌장 선암, 갈색 세포종, 부신경 절종, 피부 흑색종, 위선암, 흉선종으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, BLZF1 과발현 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
3. 개체로부터 분리된 시료의 BLZF1 또는 그 mRNA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 위장관 기질종양의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
4. 위 3에 있어서, 상기 BLZF1 또는 그 mRNA의 수준이 대조군의 발현 정도에 비해 높은 경우 위장관 기질종양일 확률이 높은 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는, 위장관 기질종양의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
5. 위 3에 있어서, 상기 BLZF1 또는 그 mRNA의 수준이 높을수록 위장관 기질종양의 예후가 나쁠 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는, 위장관 기질종양의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
6. BLZF1 또는 그 mRNA의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 위장관 기질종양의 진단 또는 예후 예측용 조성물.
7. 위 6에 있어서, 상기 BLZF1 또는 그 mRNA의 수준을 측정하는 물질은 BLZF1 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 항체로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 위장관 기질종양의 진단 또는 예후 예측용 조성물.
8. 시료의 BLZF1 또는 그 mRNA의 발현을 감소시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 BLZF1 과발현 종양 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
본 발명의 약학 조성물은 위장관 기질종양에서 과발현된 BLZF1의 활성을 억제하여, 돌연변이 KIT 단백질의 발현을 억제할 수 있고, 또한 세포 성장을 억제할 수 있으므로 이에 따라 위장관 기질종양을 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 GIST 세포주 (GIST430, GIST882)에서 KIT 단백질과 결합하는 골지체 상주 단백질을 규명하기 위해 면역침강법을 수행한 것으로, 골지체 구조에 중요한 것으로 보고된 BLZF1과 KIT이 결합하고 있음을 확인한 결과이다.
도 2는 GIST 세포주 (GIST430, GIST882)에 shBLZF1 처리 후, GM130, KIT 및 BLZF1의 발현을 공초점 형광 현미경 및 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과이다. 공초점 형광 현미경 이미지에서는 BLZF1은 골지체 마커(GM130) 및 돌연변이 돌연변이 KIT과 같은 영역에 위치하고 있음을 확인할 수 있고, BLZF1을 shRNA로 발현을 억제해주면 KIT 단백질의 발현이 감소하는 것은 공초점 형광 현미경 이미지 및 웨스턴 블로팅 결과에서 확인할 수 있다.
도 3은 정상형 또는 돌연변이형 KIT 단백질을 발현하는 다양한 암종에서 여러 골지체 관련 단백질 발현을 분석한 결과이다. 이 중 BLZF1은 GIST에서 선별적으로 발현이 높게 나타났다.
도 4는 BLZF1의 발현 억제를 통해 GIST 세포 성장을 억제할 수 있는지 세포 성장 분석(proliferation assay)을 수행한 결과로, GIST430, GIST882 세포주 모두에서 BLZF1을 shRNA로 발현 억제해주면 세포 성장이 극적으로 억제됨을 확인하였다.
도 5는 BLZF1 발현 환자군과 발현하지 않는 환자군의 생존확률을 나타낸 생존함수 그래프로, BLZF1를 발현하는 환자군의 경우, 생존률이 낮음을 확인하였다.
도 2는 GIST 세포주 (GIST430, GIST882)에 shBLZF1 처리 후, GM130, KIT 및 BLZF1의 발현을 공초점 형광 현미경 및 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과이다. 공초점 형광 현미경 이미지에서는 BLZF1은 골지체 마커(GM130) 및 돌연변이 돌연변이 KIT과 같은 영역에 위치하고 있음을 확인할 수 있고, BLZF1을 shRNA로 발현을 억제해주면 KIT 단백질의 발현이 감소하는 것은 공초점 형광 현미경 이미지 및 웨스턴 블로팅 결과에서 확인할 수 있다.
도 3은 정상형 또는 돌연변이형 KIT 단백질을 발현하는 다양한 암종에서 여러 골지체 관련 단백질 발현을 분석한 결과이다. 이 중 BLZF1은 GIST에서 선별적으로 발현이 높게 나타났다.
도 4는 BLZF1의 발현 억제를 통해 GIST 세포 성장을 억제할 수 있는지 세포 성장 분석(proliferation assay)을 수행한 결과로, GIST430, GIST882 세포주 모두에서 BLZF1을 shRNA로 발현 억제해주면 세포 성장이 극적으로 억제됨을 확인하였다.
도 5는 BLZF1 발현 환자군과 발현하지 않는 환자군의 생존확률을 나타낸 생존함수 그래프로, BLZF1를 발현하는 환자군의 경우, 생존률이 낮음을 확인하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 BLZF1 억제제를 포함하는 BLZF1 과발현 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다.
상기 BLZF1 억제제는 BLZF1 유전자(DNA 또는 mRNA) 또는 단백질의 발현을 억제(발현량 감소)하거나 그 발현을 완전히 제거하는 것을 의미하며, '완전히 제거하는 것'은 유전자 또는 단백질 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 것을 포함한다. BLZF1억제제는 BLZF1유전자 또는 단백질의 발현을 억제할 수 있는 모든 물질로서 물질의 타입이나 종류에 국한되지 않으며, 예를 들면 small molecule, T-DNA(transfer-DNA), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids), CRISPR/Cas9 뉴클레아제(nuclease), 항체 또는 화학물질 등일 수 있다. BLZF1 억제제로서 항체, 핵산 등 생물 유래 물질을 사용하는 경우에는, 그 해당 종 유래 물질을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물의 투여 대상이 인간인 경우, 인간 BLZF1 유전자에 대한 shRNA, siRNA 등의 핵산, 인간 BLZF1 단백질에 대한 항체 등을 사용할 수 있다. ShRNA의 구체적인 예를 들자면 서열번호 1의 shRNA(TAACTTGAAACCGCTCCATTT)를 사용할 수 있다.
상기 BLZF1 과발현 종양은 BLZF1의 mRNA 또는 단백질의 발현이 정상조직 또는 정상세포 대비 증가되어 있는 종양일 수 있으며, GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis, http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)에서 확인할 수 있는BLZF1과발현 종양은 예를 들면 유방암, 담관암, 확산성 거대 B세포 림프종, 간암, 췌장 선암, 갈색 세포종, 부신경 절종, 피부 흑색종, 위선암, 흉선종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 위장관 기질종양은 위장관 벽의 근육층에 위치한 근육의 수축 이완을 조절하는 세포, 즉 카잘세포가 변이를 일으켜 발생하는 희귀질환으로 기스트(GIST, Gastrointestinal stromal tumor)라고 불린다.
용어 "예방"은 BLZF1 과발현 종양을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
용어 "치료"는 BLZF1 과발현 종양 의심 및 발병 개체의 증상이 호전 되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 말한다.
본 발명 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태일 수 있다.
본 발명 약학 조성물은 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명 약학 조성물은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등일 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명 약학 조성물의 제형은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있으며, 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조될 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명 약학 조성물의 제형은 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제조될 수 있다.
제제화를 위한 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등일 수 있다.
본 발명 약학 조성물의 투여 경로는 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명 본 발명 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여 시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식이 선택될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
예를 들어, 본 발명 약학 조성물은 1일 0.0001 mg 내지 1000mg/kg 또는 0.001mg 내지 500mg/kg으로 투여될 수 있다. 본 발명 약학 조성물의 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 개체로부터 분리된 시료의 BLZF1 또는 그 mRNA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 위장관 기질종양의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공할 수 있다.
상기 시료는 개체로부터 분리된 것일 수 있고, 시료의 종류는 예를 들면 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 혈액 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개체는 위장관 기질종양이 발병하였거나 발병할 수 있는 모든 동물일 수 있고, 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 개체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics) (예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 개체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함할 수 있다.
BLZF1 mRNA 또는 단백질을 검출하여, 시료 내 BLZF1 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있다. BLZF1 를 검출하는 물질은 예를 들면 BLZF1-특이적 프라이머, 프로브, 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
BLZF1 검출은 상기 검출하는 물질을 이용하여 당 분야에 공지된 방법으로 수행될 수 있으며, 예를 들면 중합효소 연쇄반응, 웨스턴 블로팅, 면역염색, 면역 전기영동, 단백질 면역 침전, 효소 결합 면역 침강 분석법, 액체 크로마토그래피 등을 이용하여 검출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명의 위장관 기질종양의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법은 상기 BLZF1 또는 그 mRNA의 수준이 대조군의 발현 정도에 비해 높은 경우 위장관 기질종양일 확률이 높은 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 대조군은 위장관 기질종양을 진단받은 환자의 정상 조직이거나 정상형 또는 돌연변이형 KIT를 발현하는 위장관 기질종양 이외 종양의 세포주 또는 환자 조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 위장관 기질 종양 이외 종양의 세포주는 선양낭성암종, 난소암, 피부암, 유방암, 소세포폐암(small cell lung carcinoma), 대장암 및 혈액암(Leukemia)으로부터 유래될 수 있으며, 예를 들면, H69, H128, H209, Kasumi-1, HMC-1, K562, LS174T, Colo320DM, DLD-1일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명의 위장관 기질종양의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법은 상기 BLZF1 또는 그 mRNA의 수준이 높을수록 위장관 기질종양의 예후가 나쁠 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 예후는 전체생존기간(overall survival)과 무사건생존기간(event free survival)을 포함하는 개념으로, 예후가 나쁘다는 것은 전체생존기간이 짧거나 재발 또는 다른 질병의 발병 등의 사건없이 생존하는 기간이 짧다는 것을 의미할 수 있으며, 본 발명에서 예후가 나쁠 가능성이 높은 것으로 판단하는 것은 BLZF1 또는 그 mRNA의 수준이 높을수록 생존기간이 짧을 가능성, 즉 짧은 생존기간을 나타낼 확률이 높을 것으로 판단할 수 있음을 의미한다.
본 발명은 위장관 기질종양의 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 진단 또는 예후 예측용 조성물은 BLZF1 또는 그 mRNA의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 것으로 BLZF1 또는 그 mRNA의 수준을 측정하는 물질 및 측정 방법은 전술한 바와 같다.
본 발명의 진단 또는 예후 예측용 조성물은 위장관 기질종양을 진단하거나 진단 이후 예후를 예측하는데 사용될 수 있으며, 그에 따라 적합한 치료 요법을 선택하고 적용하는데 있어서 BLZF1 또는 그 mRNA의 수준을 측정한 결과가 활용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 BLZF1 과발현 종양 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
상기 스크리닝 방법은 시료의 BLZF1 또는 그 mRNA의 발현을 감소시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 BLZF1 또는 그 mRNA의 발현을 감소시키는 물질은 BLZF1의 발현을 직접적 또는 간접적으로 억제할 수 있는 모든 물질을 말하며, BLZF1의 발현을 조절하여 BLZF1 과발현 종양의 세포 증식, 분열 또는 분화 등을 억제할 수 있는 모든 물질을 의미한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 실험 방법
(1) 세포 배양
GIST430, GIST430(V654A) 세포주는 Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)에 15%의 supplemented with 15% fetal calf serum과 1%의 penicillin/streptomycin를 혼합한 배지를 이용하였고, GIST882 세포주는 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 배지에 15%의 fetal bovine serum (FBS)와 1%의 penicillin/streptomycin를 혼합한 배지, GIST48 세포주는 IMDM 배지에 15% FBS와 1%의 penicillin/streptomycin를 혼합하여 37 ℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 대장암 세포주 Colo320DM, DLD-1, LS174T, H69, H128, H209은 RPMI 배지에 10% FBS와 1%의 penicillin/streptomycin를 혼합한 배지를 이용하였고, Kasumi-1 세포주는 RPMI 배지에 20% FBS와 1%의 penicillin/streptomycin를 혼합한 배지, HMC-1, K562 세포주는 IMDM 배지에 10% FBS와 1%의 penicillin/streptomycin를 혼합하여 37 ℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다.
(2) 웨스턴 블랏
웨스턴 블랏 수행을 위해 protease 저해제를 포함하는 Passive lysis buffer를 활용하여 세포를 용해시켜준 후 해당 lysate를 얻어 전기 영동을 수행한 후(premade gel 사용, Invitrogen) 멤브레인으로 transfer 해주었다(iBlot2 system). 이후 nonfat dried milk나 5% BSA 용액으로 블로킹해준 후 1차 항체와 4 ℃로 밤새 결합시켜준다. 워싱 후 2차 항체를 상온에서 1시간 결합시켜준 후 충분히 워싱하여 잔여 항체를 제거하고 LAS4000 시스템을 활용하여 이미지를 분석한다. 사용된 항체는 c-KIT (DAKO), BLZF1 (Novus Biologicals), GAPDH (Trevigen), Phospho-IRE1alpha (Invitrogen), IRE1alpha, phosphor-PERK, PERK, CHOP, HSP70, HSP90, GRP94, BIP, LC3 (Cell signaling)이다.
(3) 면역 세포 화학 염색
이미징 디쉬(imaging dish)에 배양한 세포를 워싱한 후 4% paraformaldehyde 또는 100% 메탄올로 고정시킨다. 이후 0.2% Triton X-100으로 세포막 투과를 유도하고 1차 항체를 4도에서 오버나잇으로 인큐베이션한다. 2차 항체를 상온에서 1시간 인큐베이션한 후 충분히 워싱하고 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) 염색하여 공초점 현미경을(Carl zeiss, LSM710) 이용하여 이미징을 수행한다.
(4) 통계분석
BLZF1의 발현에 따른 무병생존기간은 SPSS 소프트웨어를 활용하여 분석하였고 Mann-Whitney tests, Student’s t-tests, Fisher’s exact tests, or chi-square tests가 사용되었다. MTT 어세이 결과의 통계 분석은 one-way analysis of variance (ANOVA) with a post hoc test (Bonferroni) 방법을 통해 분석하였고 데이터는 표준 오차 막대를 포함하여 제시되었다.
(5) 세포성장분석 어세이
각 세포주를 96-well plate에 104cells/well이 되도록 seeding 하고 연세유전체센터에서 구입한 shBLZF1 발현 벡터 (clone ID: TRCN000043235524, shBLZF1 서열: TAACTTGAAACCGCTCCATTT)를 lentivirus particle로 만들어 형질도입하였다. 이후, 세포를 37 ℃, 5% CO2 incubator에서 72시간 배양한 후에 살아있는 세포 수의 측정을 위해 MTT ([3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl-) 2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay를 수행하였다. MTT 용액을 배양 배지에서 최종 농도 0.5mg/ml가 되도록 각각의 well에 추가한 후 37 ℃, 5% CO2 incubator에서 4시간 배양하였다. 배양 후 용액을 완전히 제거하고 DMSO를 100μl씩 넣어 20분 동안 상온에서 배양하여 세포를 lysis함과 동시에 살아있는 세포에 의해 생성된 자주색의 MTT metabolite (결정성)을 용해하였다. DMSO에 용해된 MTT metabolite의 양을 ELISA Plate Reader로 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
2. 실험 결과
(1) GIST에서의 KIT 단백질의 위치 및 안정성을 조절하는 골지체 단백질 규명
골지체 단백질 중 기능이 알려져 있으며, 암과의 연관성이 밝혀진 골지체 상주 단백질 10종(GBF1, GM130, Golgin97, TGN38, GRASP65, GRASP55, BLZF1, STX3, STX6 및 GOLPH3)에 대하여 돌연변이 KIT 단백질과 면역 침강을 수행하였다. 그 결과 KIT과 결합하는 단백질로 BLZF1 (Golgin-45)를 찾았다(도 1). BLZF1은 골지체에 단백질을 고정(tethering)하는 역할을 하는 것으로 알려져 있어 돌연변이 KIT 단백질을 골지체에 고정시켜주는 역할을 할 것으로 판단된다.
(2) KIT와 BLZF1의 세포내 결합 위치 분석 및 shBLZF1 처리에 따른 KIT 발현 소실 규명
공초점 현미경 형광염색을 통해 BLZF1은 골지체 마커인 GM130과 함께 골지체에 존재한다는 사실을 확인하였고 동시에 BLZF1과 돌연변이 KIT 단백이 같은 위치에 존재함을 확인하였다. 이 때 BLZF1 shRNA 처리를 통해 발현을 억제해주면 골지체에 존재하던 돌연변이 KIT 단백질이 사라지는 것을 확인하였다 (도2). 또한 웨스턴블랏을 통해서 분석하였을 때도 BLZF1의 발현을 억제해주면 돌연변이 KIT 단백의 발현이 감소되었다. 이러한 결과들은 결과 (1)에서 제시한 BLZF1이 돌연변이 KIT 단백질을 골지체에 고정시켜주는 역할을 할 것이라는 연구 결과를 추가로 뒷받침한다.
(3) KIT 단백질을 발현하는 다양한 암종 중 GIST 특이적 BLZF1 과발현 규명
정상형 KIT 단백을 발현하는 소세포폐암(SCLC) 및 대장암과 돌연변이형 KIT 단백을 발현하는 혈액암(Leukemia) 및 GIST 세포주 패널에서 연구 결과 (1)에서 분석하였던 골지체 상주 단백질 10종의 발현을 분석하였다. 그 결과 BLZF1이 GIST에서 특이적으로 과발현되어있는 것을 확인하였고, 이는 BLZF1이 GIST 특이적 진단 및 치료 표적 단백질로 활용될 수 있음을 검증한 것이다.
(4) BLZF1 억제에 따른 GIST 세포 성장 억제
앞선 연구 결과 (2)에서 BLZF1을 shRNA 처리를 통해 발현을 억제해줄 경우 KIT 단백 발현 소실이 유도되었기 때문에 shBLZF1 처리에 따른 세포 성장 분석을 수행하였다. shRNA를 처리해준 후 72시간이 지난 후 세포 생존성을 비교한 결과 약 70~80% 정도의 강한 종양 억제능을 확인할 수 있었다 (도 4).
(5) BLZF1 발현에 따른 GIST 환자의 생존 기간 분석
50케이스의 GIST 환자 조직에서 BLZF1의 발현을 분석한 결과, BLZF1의 발현이 높을수록 무병생존기간이 짧아지는 경향성이 나타났다. 이는 BLZF1이 GIST 환자에서 예후 예측 마커로 활용 가능함을 나타낸다.
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<120> Pharmaceutical composition for preventing or treating BLZF1
overexpressed tumor
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<211> 21
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
taacttgaaa ccgctccatt t 21
Claims (8)
- BLZF1 억제제를 포함하는 BLZF1 과발현 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
상기 BLZF1 억제제는 서열번호 1의 shRNA를 포함하고,
상기 BLZF1 과발현 종양은 위장관 기질종양인 것인, 조성물.
- 삭제
- 개체로부터 분리된 시료의 BLZF1 또는 그 mRNA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 위장관 기질종양의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
- 청구항 3에 있어서, 상기 BLZF1 또는 그 mRNA의 수준이 대조군의 발현 정도에 비해 높은 경우 위장관 기질종양일 확률이 높은 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는, 위장관 기질종양의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
- 청구항 3에 있어서, 상기 BLZF1 또는 그 mRNA의 수준이 높을수록 위장관 기질종양의 예후가 나쁠 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는, 위장관 기질종양의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
- BLZF1 또는 그 mRNA의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 위장관 기질종양의 진단 또는 예후 예측용 조성물.
- 청구항 6에 있어서, 상기 BLZF1 또는 그 mRNA의 수준을 측정하는 물질은 BLZF1 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 항체로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 위장관 기질종양의 진단 또는 예후 예측용 조성물.
- 시료의 BLZF1 또는 그 mRNA의 발현을 감소시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 BLZF1 과발현 종양 치료제 후보물질의 스크리닝 방법으로서,
상기 BLZF1 과발현 종양은 위장관 기질종양인 것인, 방법.
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| Chinese Clinical Oncology. 2015. Vol.20(12), pp.1099-1102. |
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