KR20220099285A - 암 진단용 조성물, 이를 포함하는 암 진단용 키트, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 암의 발생 여부를 측정하는 방법 - Google Patents
암 진단용 조성물, 이를 포함하는 암 진단용 키트, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 암의 발생 여부를 측정하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 암 진단용 조성물, 이를 포함하는 암 진단용 키트, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 암의 발생 여부를 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 암 진단용 조성물은, miR-146a 및 NRP2의 순환종양세포 또는 이의 모사 부유세포내에서 연관성에 기반하여 상기 세포들의 증식, 이동 및 침윤 과정의 메커니즘을 규명함으로써, 상기 miRNA-146a를 통한 암 발생을 억제할 수 있다. 따라서, 이를 암 진단 및 치료 등의 분야에 유용하게 사용할 수 있으며, 구체적으로는 암 진단용 키트, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 암의 발생 여부를 측정하는 방법에 유용하게 적용될 수 있다.
Description
본 발명은 암 진단용 조성물, 이를 포함하는 암 진단용 키트, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 암의 발생 여부를 측정하는 방법에 관한 것이다.
최근 들어, 전 세계적으로 암의 생성 및 치료와 관련된 유전자의 기능 연구를 통해 치료용 표적을 발굴하고 이들을 진단 및 치료제 개발에 이용하기 위한 연구를 진행하고 있다. 게놈 연구의 활성화와 함께 인간 유전자 DNA 칩 또는 프로테옴 분석 연구가 활발하게 이루어지고 암과 관련된 유전자가 대량 발굴됨에 따라 많은 유전자들의 목록과 관련 데이터베이스는 구축되어 있으나 대부분 이들 유전자들에 대한 세포 내에서의 구체적 생물학적 기능 및 암 관련성은 아직 연구되지 않았거나 불확실하여 실제 암 관련성 또는 진단 및 표적 유전자로서의 활용과 함께 나아가 암을 효과적으로 치료할 수 있는 유전자의 발굴에 상당한 어려움이 있다. 따라서 지금까지 밝혀진 암 관련 유전자 이외에도 새로운 유전자들의 발굴이 필요한 실정이다.
한편, 암 전이는 암 관련 사망의 주요 원인이며, 암 전이의 주요 기전인 혈관계를 통한 종양세포의 전파는 전형적인 국지질환에서 전신질환으로 전환되는 중요한 중간단계이다. 암 환자의 종양조직 1그램 (109 개의 세포)에서 매일 대략 3 ~ 4 × 109 개의 종양세포가 떨어져 나와 혈관 속으로 들어간다. 대부분의 이들 세포는 혈액 내 적대적 환경 속에서 대부분 제거되지만 106 ~ 107 개의 정상 말초혈액단핵세포(peripheral mononuclear blood cells, PBMC) 당 1개 정도의 극소수가 살아남게 되어 순환종양세포(Circulating Tumor Cells, CTCs)가 된다. 따라서 암 환자의 혈액 속에서 순환종양세포의 조기 검출과 분석은 전이질환으로의 전환을 모니터링함과 아울러 이를 방지하기 위한 중요한 전략이라고 할 수 있다.
혈액에서 순환종양세포를 검출하는 방법으로 기존에는 유세포 분석(flow cytometry), 자기 세포 분리법(magnetic cell separation), 이중전기영동(di-electrophoresis) 등의 방법이 제시되어 왔다. 하지만 수년간의 발전에도 불구하고 이러한 방법들은 여전히 연구분야에서만 유용할 뿐이고 효율성과 결과 재현성의 부족으로 인해 임상적 적용은 제한되고 있다.
특허문헌 1은, 전술한 순환종양세포를 이용하여 종양에 대한 질병 정보를 제공하는 기술에 대한 제안을 하고 있다.
보다 구체적으로, 특허문헌 1에 제안된 기술의 경우, 암 환자의 제1 단말로부터, 암 조직(tissue)의 유전자 데이터를 수신하는 단계; 기관의 제2 단말로부터, 상기 암 환자의 순환종양세포 유전자 데이터를 수신하는 단계; 상기 암 조직 유전자 데이터 및 상기 순환종양세포 유전자 데이터를 비교하여 종양 이질성(heterogeneity) 데이터를 생성하는 단계; 및 상기 종양 이질성(heterogeneity) 데이터를 상기 제1 단말 또는 상기 제2 단말에 송신하는 단계;를 포함하는, 순환종양세포 기반 종양 이질성 데이터 제공 방법에 대한 기술을 제안하고 있다.
그러나, 상기 제안된 특허문헌 1에 대한 기술은, 암 환자의 생물학적 시료로부터 암 조직의 유전자에 대한 분석과 종양 이질성에 대한 비교 분석이 필요하여, 암 발병에 대한 진단 및 확인을 위한 시간이 오래 걸리고, 암 전이와 관련된 명확한 바이오 마커를 포함하지 않으므로, 종양 자체에 대한 진단이라기 보다는 종양의 이질성에 대한 진단 또는 그에 대한 데이터 제공의 수준이라는 점에서 문제점이 있다.
따라서, 보다 명확하게 분자 유전학적인 수준에서 근본적으로 순환종양세포와 관련된 암 진단을 위한 기술의 필요성이 절실한 실정이다.
본 발명자들은 상기 언급한 종래 기술의 문제점을 해결을 위해 순환종양세포 모사 부유세포의 분자생물학적 특정을 변화시키는 miRNA를 확인하였고, 이를 통하여 상기 세포의 증식, 이동 및 침윤을 조절할 수 있는 특정 유전자 및 단백질과의 연관성을 확인함으로써 암 진단, 특히 전이 암 진단과 관련된 메커니즘을 규명하였다.
따라서, 본 발명은 암 진단용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은, 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은, 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은, 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암의 발생 여부를 측정하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 실시양태로서,
본 발명은, 세포내의 서열번호 1로 표시되는 miR-146a를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 세포는 순환종양세포(Circulating-tumor cell, CTC) 또는 이의 모사 부유세포(Circulating-tumor cell-mimicking suspension cell)인 것을 특징으로 하는, 암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 암은, 서열번호 2로 표시되는 NRP2의 과발현에 의하여 유도된 암인 것을 특징으로 하는, 암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 암은 뇌종양, 흑색종, 골수종, 비소세포성폐암, 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 및 이들의 전이로 인한 암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 miR-146a는 NRP2를 타겟하여 p38 신호전달 과정을 방해하는 것을 특징으로 하는, 암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 miR-146a은 상기 NRP2의 3' UTR 부위에 결합하여 상기 NRP2의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 암 진단용 조성물은 전이에 의한 암의 진단용 조성물인 것을 특징으로 하는, 암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 전술한 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는, 암 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은, miR-146a를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 암은 뇌종양, 흑색종, 골수종, 비소세포성폐암, 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 및 이들의 전이로 인한 암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 생물학적 시료 내 NRP2 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 발생 여부를 측정하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 생물학적 시료는 순환종양세포(Circulating-tumor cell, CTC) 또는 이의 모사 부유세포(Circulating-tumor cell-mimicking suspension cell)인 것을 특징으로 하는, 암의 발생 여부를 측정하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 NRP2 단백질의 발현 전 상기 NRP2의 mRNA 수준을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 암의 발생 여부를 측정하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 NRP2 단백질의 발현 억제제를 상기 생물학적 시료 내에 투입하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 암의 발생 여부를 측정하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 NRP2 단백질의 발현 억제제는, miR-146a인 것을 특징으로 하는, 암의 발생 여부를 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 암 진단용 조성물은, miR-146a 및 NRP2의 순환종양세포 또는 이의 모사 부유세포내에서 연관성에 기반하여 상기 세포들의 증식, 이동 및 침윤 과정의 메커니즘을 규명함으로써, 상기 miRNA-146a를 통한 암 발생을 억제할 수 있다. 따라서, 이를 암 진단 및 치료 등의 분야에 유용하게 사용할 수 있으며, 구체적으로는 암 진단용 키트, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 암의 발생 여부를 측정하는 방법에 유용하게 적용될 수 있다.
첨부된 도면은 해당 기술 분야의 통상의 기술자에게 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 기술적 사상이 이에 한정되는 것은 아니다.
도 1 및 도 2는, 본 발명에 따른 실험예 1에 대한 결과 일부를 나타낸 도이다.
도 3은, 본 발명에 따른 실험예 2에 대한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는, 본 발명에 따른 실험예 3에 대한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는, 본 발명에 따른 실험예 4에 대한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은, 본 발명에 따른 실험예 5에 대한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은, 본 발명에 따른 실험예 6에 대한 결과를 나타낸 도이다.
도 1 및 도 2는, 본 발명에 따른 실험예 1에 대한 결과 일부를 나타낸 도이다.
도 3은, 본 발명에 따른 실험예 2에 대한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는, 본 발명에 따른 실험예 3에 대한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는, 본 발명에 따른 실험예 4에 대한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은, 본 발명에 따른 실험예 5에 대한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은, 본 발명에 따른 실험예 6에 대한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 암 진단용 조성물을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은, 세포내의 서열번호 1로 표시되는 miR-146a를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하며, 이 경우, 상기 miR-146a가 발현 촉진제 또는 발현 억제제로 작용할 수 있는 단백질과 관련하여 상기 "단백질의 수준을 측정하는 제제"를 포함할 수 있다.
본 명세서상의 용어 "miR-146a"라 함은, "microRNA-146a"를 지칭하는 용어로 사용될 수 있다.
또한, 본 명세서상의 용어 "단백질의 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 단백질의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩 분석법(protein chip assay) 등의 방법에 사용되는 항체가 될 수 있다.
본 명세서상의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현 벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다.
상기 "항체 분자의 기능적인 단편"이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 예를 들어 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
또한, 본 명세서상의 용어 "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서는, 상기 "진단"은 암 질환의 발병 여부를 관찰 및 확인하는 것으로 해석될 수 있다.
상기 miR-146a는 서열번호 1의 서열로 표시될 수 있으며, 서열번호 1과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상 상동성을 갖는 서열일 수 있다.
본 발명에서, 상기 miR-146a, 즉 miRNA 핵산 분자는 18 내지 100nt(Nucleotide) 길이를 가질 수 있으며, 바람직하게는 19 내지 25nt 길이, 더욱 바람직하게는 21, 22 또는 23nt 길이를 가진다.
또한, 본 발명에서 사용되는 miR-146a는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, miR-146a 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실(Deletion), 치환(Substitution) 또는 삽입(Insertion)에 의해 변형되었지만, miR-146a 핵산분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(Variants)를 포함하는 개념이다. 본 발명에서는 상기 변이체를 모방체(Mimics)라고도 한다.
또한, 본 발명의 miR-146a는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. 성숙 miRNA 분자는 주로 단일 가닥으로 존재하지만, 전구체 miRNA 분자는 주로 이중 가닥 부분을 형성할 수 있는 적어도 부분적으로 자가-상보적인(예를 들어 스템- 및 루프-구조)이다. 또한, 본 발명의 핵산 분자는 RNA, DNA, PNA(Peptide nucleic acids) 또는 LNA(Locked nucleic acid) 같은 형태로 구성될 수 있다.
본 발명의 상기 핵산분자는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 miRNA 핵산 분자 그 자체뿐만 아니라, 세포 내에서 본 발명의 miRNA의 발현율을 증가시킬 수 있는 기타의 물질, 예를 들어 화합물, 천연물, 신규 단백질 등을 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 조성물 내 miR-146a 핵산 분자는 세포 내 발현을 위한 벡터에 포함되어 제공될 수 있다.
본 발명의 miR-146a 핵산 분자는 DNA 및 DEAE-덱스트란의 복합체, DNA 및 핵단백질의 복합체, DNA 및 지질의 복합체 등의 다양한 형질전환 기술을 이용하여 세포 내로 도입시킬 수 있는데, 이를 위해 상기 miR-146a 핵산 분자는 세포 내로의 효율적인 도입을 가능하게 하는 전달체 내에 포함된 형태일 수 있다. 상기 전달체는 바람직하게는 벡터이며, 바이러스 벡터 및 비바이러스벡터 모두 사용 가능하다. 바이러스 벡터(Viral vector)로서 예를 들면, 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(Retrovirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 허피스바이러스(Herpes virus) 및 아비폭스바이러스(Avipox virus) 벡터 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 miR-146a 핵산 분자를 포함하는 벡터는 선별 마커를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 본 명세서상의 용어 "선별 마커(Selection marker)"라 함은, miR-146a 핵산분자가 도입되어 형질 전환된 세포의 선별을 용이하게 하기 위한 것일 수 있다. 본 발명의 벡터에서 사용할 수 있는 선별 마커로는, 벡터의 도입 여부를 용이하게 검출 또는 측정할 수 있는 유전자라면, 특별히 한정되지 않으나, 대표적으로 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들, 예를 들어 GFP(녹색 형광 단백질), 퓨로마이신(Puromycin), 네오마이신(Neomycin: Neo), 하이그로마이신(Hygromycin: Hyg), 히스티디놀 디하이드로게나제(Histidinol dehydrogenasegene: hisD) 및 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Guanine phosphosribosyltransferase: Gpt) 등이 있으며, 바람직하게는 GFP(녹색 형광 단백질) 및 퓨로마이신 마커를 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 조성물 내 miR-146a 핵산분자는 세포에 도입된 형태로 제공될 수 있다.
본 명세서상의 용어 "도입"이라 함은, 형질감염(Transfection) 또는 형질도입(Transduction)에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미할 수 있다. 형질감염은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(Infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명은, 상기 세포가 순환종양세포(Circulating-tumor cell, CTC) 또는 이의 모사 부유세포(Circulating-tumor cell-mimicking suspension cell)인 것을 특징으로 하는, 암 진단용 조성물을 제공한다.
본 명세서상의 용어, "순환종양세포(Circulating-tumor cell, CTC)"라 함은, 원발 종양에서 분리되어 혈류로 흘러 들어가는 종양 세포로, 원래 종양에서 다른 위치로 퍼져나가 암의 전이를 주도하는 세포를 포함하는 의미일 수 있다. 또한, 본 명세서상의 용어, "순환종양세포의 모사 부유세포(Circulating-tumor cell-mimicking suspension cell)"라 함은, 전술한 순환종양세포와 유사한 특성을 갖는 부착성 세포(adherent cell)를 제외한 배지에 부유하면서 살아가는 세포들을 모두 포함하는 의미일 수 있다.
본 발명에 따른 암 진단용 조성물은, 순환종양세포 또는 이의 모사 부유세포내에서 연관성에 기반하여 상기 세포들의 증식, 이동 및 침윤 과정의 메커니즘을 규명한 것으로부터 완성되었다.
또한, 본 발명에 따른 암 진단용 조성물이 진단할 수 있는 상기 암은, 특별히 제한되는 것은 아니고, 예를 들어 뇌종양, 흑색종, 골수종, 비소세포성폐암, 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 및 이들의 전이로 인한 암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 암일 수 있다.
또한, 상기 본 발명에 따른 암 진단용 조성물이 진단할 수 있는 상기 암은, 서열번호 2로 표시되는 NRP2의 과발현에 의하여 유도된 암일 수 있다.
본 명세서상의 용어, "NRP2(Neuropilin2)" 다양한 세포 유형에 의해 발현되고, NRP2 유전자 의해 암호화 또는 코딩될 수 있는 NRP2 단백질 또는 NRP2 단백질 수용체를 포함하는 의미할 수 있다.
본 발명에 따른 암 진단용 조성물에 포함된, 상기 miR-146a는 전술한 NRP2를 타겟하여 p38 신호전달 과정을 방해한다. 보다 구체적으로, 상기 miR-146a은 상기 NRP2의 3' UTR 부위에 결합하여 상기 NRP2의 발현을 억제할 수 있다. 이러한 메커니즘에 대한 내용은 후술하는 실험예 등에서 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따른 암 진단용 조성물은 전이에 의한 암의 진단용 조성물일 수 있다.
상기 전이에 의한 암은, 예를 들어 전술한 바와 같이, 뇌종양, 흑색종, 골수종, 비소세포성폐암, 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 필요한 경우, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제가 상기 miR-146a로부터 발현되는 단백질 또는 NRP2 단백질의 발현을 상기 miR-146a로부터 발현되는 단백질 또는 NRP2 단백질 발현 전 mRNA 수준에서 억제할 수 있는 발현 억제제를 포함할 수 있다.
본 명세서상의 용어 "mRNA 수준에서 억제할 수 있는"이란, 시료에 포함된 표적 유전자의 발현 여부를 확인하기 위하여, 상기 표적 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준을 억제한다는 의미일 수 있으며, 이에 사용되는 제제로는 바람직하게는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA;RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 또는 프라이머를 의미할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 명세서상의 용어 "프라이머"란, 통상적인 의미의 프라이머와 동일한 의미로서, 예를 들어 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미하고, 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 일컫는 용어이다. 이러한 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다.
본 명세서상의 용어 "프로브"란, 통상적인 의미의 프로브와 동일한 의미일 수 있고, 예를 들어 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미할 수 있고, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링(labeling)될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 키트가 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 암 또는 상기 암으로부터 전이된 암 질환의 발병이 의심되는 환자의 시료로부터 miR-146a가 발현 촉진제 또는 발현 억제제로 작용할 수 있는 단백질에 대한 단백질의 수준을 측정하여 암 질환의 발병 여부를 확인함으로써 암 질환을 진단하는데 사용될 수 있으며, 특별히 제한되지는 않으나, 상기 miR-146a가 발현 촉진제 또는 발현 억제제로 작용할 수 있는 단백질의 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다.
본 명세서상의 용어 "시료"란, 암 질환 환자로부터 분리되어 miR-146a가 발현 촉진제 또는 발현 억제제로 작용할 수 있는 단백질의 발현 수준을 측정하는 직접적인 대상을 의미하고, 예를 들어 암 환자의 조직 시료 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 키트는 miR-146a가 발현 촉진제 또는 발현 억제제로 작용할 수 있는 단백질을 측정하기 위한 단백질 칩 분석용 키트가 될 수 있는데, 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다.
상기 기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있으며, 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC, RITC 등이 될 수 있고, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 될 수 있다.
또한, 본 발명은, miR-146a를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 암의 경우에도, 전술한 바와 같이, 뇌종양, 흑색종, 골수종, 비소세포성폐암, 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 및 이들의 전이로 인한 암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말 셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
즉, 본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 파두 추출물 또는 이의 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 파두 추출물 또는 이의 분획물의 양을 기준으로 0.0001㎎/㎏ 내지 100㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 6회 투여될 수 있다.
본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명은, 또한, 생물학적 시료 내 NRP2 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 발생 여부를 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 암의 발생 여부를 측정하는 방법은 전술한 본 발명에 따른 암 진단용 조성물을 사용하여 암의 발생 여부를 측정하는 방법에 관한 것으로, 이미 전술한 설명과 동일한 경우에는 생략하기로 한다.
상기 생물학적 시료는 순환종양세포(Circulating-tumor cell, CTC) 또는 이의 모사 부유세포(Circulating-tumor cell-mimicking suspension cell)일 수 있다.
또한, 본 발명은, 상기 NRP2 단백질의 발현 전 상기 NRP2의 mRNA 수준을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 암의 발생 여부를 측정하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 NRP2 단백질의 발현 억제제를 상기 생물학적 시료 내에 투입하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 암의 발생 여부를 측정하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 NRP2 단백질의 발현 억제제는, miR-146a인 것을 특징으로 하는, 암의 발생 여부를 측정하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실험 방법]
1. 세포 배양
MDA-MB-468 유방암 세포는 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하되, 배지로는 RPMI-1640에 10% 소태아혈청(FBS)을 첨가한 것을 사용하였다. 순환종양세포 모사 MDA-MB-468 부유세포는 부착세포에 0.1㎍/㎖ nocodazole을 16시간 동안 처리하여 세포 분열이 동시에 발생되도록 하였다. 이후 세포를 회수하여 PBS로 세척 후 비접착디쉬(Coring)에 유지하였다. 실험에 사용된 MDA-MB-468 부유세포의 계대는 160 이상의 세포를 사용하였고, HeLa 세포는 DMEM에 10% FBS(소태아혈청), 1% 페니실린-스트렙토마이신, mycozap을 첨가한 배지에서 배양하였다.
2. Small-RNA, mRNA 시퀀싱 분석
MDA-MB-468 부착세포와 부유세포에서 추출한 전체 RNA에서 Theragen Etex를 통해 small RNA 시퀀싱을 진행하였다. 데이터는 Theragen Etex 생물정보학팀에 의해 분석되었다. 발현 차이를 보이는 miRNA-mRNA 상호작용의 분석을 진행하였다. mRNA 시퀀싱을 재분석하여 log2 차이를 이용하여 부착세포와 부유세포의 발현 패턴 차이를 확인하였다.
3. 형질주입
MDA-MB-468에서 siRNA, miRNA mimic(유사체)는 lipofectamine RNAiMAX 제품을 이용하여 형질주입 48시간 후에 걷었다. HeLa는 plasmid, miRNA mimic을 Lipofectamine 2000을 이용하여 형질주입을 진행하였다. SEMA3C (R&D systems)는 starvation 24시간 뒤에 50ng/㎖로 사용하였다.
4. 유전자 발현 분석
miRNeasy RNA isolation kit를 사용하여 전체 RNA를 추출한 다음 TaqMan miRNA Reverse Transcription kit를 사용해 역전사시켰다. miRNA 실시간 중합효소연쇄반응은 TaqMan Universal Master Mix II, no UNG 제품을 이용하여 수행하였고 miR-146a는 Taqman probe로 검출하였다. 데이터는 소형 리보핵산 48을 대조군으로 사용하여 정규화를 진행하였다.
추출된 mRNA를 qPCRBIO cDNA Synthesis Kit 제품으로 역전사 시켰다. 실시간 중합효소연쇄반응은 qPCRBIO SyGreen Mix Hi-ROX 제품을 사용하여 수행하였다. 리보솜 18S가 대조군으로 사용되었다.
5. 웨스턴 블랏
MDA-MB-468은 단백질 분해효소와 인산가수분해효소 억제제가 포함된 RIPA 버퍼로 용해하였다. 이후 13000RPM, 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 단백질을 추출하였다. 단백질 정량은 Pierce BCA Protein assay kit를 사용하였다. 동일한 양의 단백질을 SDS-폴리아크릴 아미드젤 전기영동하였고, polyvinyl-difluoride(PVDF) 멤브레인에 옮겼다. 0.2% PBST에 3% 소혈청알부민(BSA)으로 1시간 처리 후 1차 항체에서 흔들며 익일까지 넣어두었다. 사용한 1차 항체는 NRP2(1:800, R&D systems), p38(1:1000, Cell signaling), phosphor-p38(Thr180/Tyr18)(1:800, Cell signaling), GAPDH(1:10000, Cell signaling)이었다. HRP가 결합된 2차 항체(1:4000, Cell Signaling), (1:4000, Abcam)과 화학발광 검출 방법을 사용하여 단백질 양을 검출하였다.
6. 세포침윤 어세이(Cell invasion assay)
24웰 플레이트 (8.0㎛ 구멍 사이즈; SPL)의 위쪽 틀에 마트리젤(Coring)을 혈청이 없는 배지(serum free media)에 희석하여 코팅하였다. 형질 주입된 세포들을 혈청이 없는 배지로 위쪽 틀에 깔았으며 아래쪽 틀에는 혈청 있는 배지를 넣음. 48시간 내지 72시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양 후 위쪽 틀의 배지를 제거하고 PBS로 세척하였다. 4% 포름알데하이드로 세포를 고정시키고 100% 메탄올로 세포 투과성 과정을 거쳤다. 20% 메탄올에 희석한 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 세포 염색 후 ImageJ를 이용하여 코팅된 막을 침윤한 세포의 수를 측정하였다. SEMA3C 효과를 보기 위한 세포침윤 어세이에서는 SEMA3C를 배지를 제거하기 24시간 전에 처리하였다.
7. 세포이동 어세이(Cell migration assay)
MDA-MB-468 부착세포는 12웰 플레이트에 SPLScar 블럭(SPL)를 이용하여 각 틀 안에 깔았다. 그 다음날 블록 제거 후 10% 소태아혈청이 포함된 배지에 배양하였다. 세포가 이동한 거리는 카메라가 달린 현미경으로 찍었으며 정해진 시간마다 촬영하였고, 이 경우 이동 거리는 ImageJ를 이용하여 계산하였다.
8. 세포증식 어세이 (Cell proliferation assay)
형질주입된 MDA-MB-468세포를 6웰 플레이트에 깔았다. 2일 내지 3일 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양 후 PBS 세척, 0.25% trypsin EDTA(웰진)를 37℃에서 2분 동안 처리 후 중화하여 trypan blue를 이용하여 세포의 수를 정해진 날 마다 측정하였다. SEMA3C 효과를 보기 위해, 세포는 혈청이 없는 배지로 깔았으며 24시간 동안 SEMA3C 처리 후 같은 방법으로 세포의 수를 측정하였다. 이 경우, 10% 소태아혈청이 양성조절인자로 사용되었다.
WST-1 실험은, 형질주입된 MDA-MB-468 부착세포를 96웰 플레이트에 한 웰당 1 × 104개의 세포를 깔았다. 2일 내지 3일 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양 후 WST-1 시약인 EZ-Cytox(대일랩) 10㎕를 30분 동안 37℃에서 처리하였다. 그 후 450㎚파장에서 흡광도를 정해진 날 마다 각각 측정하였다.
9. 루시퍼레이즈 리포터 어세이(Luciferase reporter assay)
3′UTR 루시퍼레이즈 리포터 어세이로 miR-146a가 결합할 것으로 예측되는 seed 시퀀스가 포함된 Human NRP2 3’UTR (3075bp) 부분을 psiCHECK-2 벡터의 NotI, XhoI 사이트에 클로닝하였다. NRP2의 seed 시퀀스 AGTTCTC는 QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent)를 이용하여 AACTCTA(Mutant #1), AATCACC(Mutant #2)으로 돌연변이를 일으켰다. HeLa에 루시퍼레이즈 리포터 벡터와 miR-146a mimic, negative control miRNA을 lipofectamine 2000(Invitrogen)을 이용하여 형질주입하였다. 48시간 후 세포를 용해하여 루시퍼레이즈 활성을 Dual-Luciferase Reporter Assay kit (Promega)로 측정하였다.
10. In silico 분석
Kaplan-Meier plotter의 데이터셋에서 NRP2의 발현에 따른 유방암 환자의 전반적인 생존(overall survival)과 먼 거리 전이가 없는 생존(distant metastasis-free survival)에 대해 분석하였다.
11. 통계분석
모든 실험은 최소 3번 진행하였고, 분석은 GraphPad Prism 5.0 software을 사용하였다. Unpaired two-tailed Student’s t-test를 사용하였고 p<0.05의 값을 유의미하다고 판단하였다.
[실험예]
[실험예 1] mRNA와 small RNA 시퀀싱
순환종양세포 모사 부유세포의 분자생물학적 특성을 변화시키는 miRNA를 알아내기 위해 MDA-MB-468 부착세포와 부유세포에 대해서 small RNA 시퀀싱을 진행하여, 도 1 및 도 2에 나타내었다.
이하 도 1 및 2를 참조하여 설명한다.
부유세포에서 증가된 46개, 감소된 43개의 miRNA가 결과로 나타났고(그림 1A), 이 결과들 중에 아래 표 1과 같이 증가된 5개, 감소된 6개의 miRNA들이 유의미한 발현 정도의 변화를 보였다.
miRNA | Log2 Fold Change | p-value |
Upregulated miRNA | - | |
miR-187 | 3.90 | 1.92E-41 |
miR-224 | 1.27 | 9.69E-06 |
miR-488 | 5.38 | 1.91E-03 |
miR-582 | 2.63 | 1.01E-03 |
miR-1298 | 4.53 | 4.43E-02 |
Downregulated miRNA | - | |
miR-135a | -2.21 | 1.46E-05 |
miR-146a | -5.00 | 3.33E-16 |
miR-149a | -1.60 | 2.06E-12 |
miR-181d | -1.35 | 2.58E-06 |
miR-486 | -1.49 | 8.06E-04 |
miR-1271 | -2.48 | 2.57E-04 |
특히, miR-146a가 가장 큰 감소폭을 보였다(그림 1B). 다음으로 miRNA의 타깃을 찾기 위해 RNA 시퀀싱을 분석하였고, 부유세포에서 증가된 209개, 감소된 392개의 유전자가 나타났으며(그림 1C), 증가된 209개의 유전자를 이용한 GO(gene ontology) 분석을 통해 순환종양세포 모사 부유세포에서 semaphorin-plexin 신호전달 과정이 상당히 향상되어 있다는 것을 확인하였다(그림 1D). 또한, Semaphorin-plexin 신호전달 과정에 관여하는 24개의 증가된 유전자를 확인하였다(그림 1E). 또한, 하기 표 2와 같이, mRNA와 miRNA 시퀀싱의 통합적인 분석을 통해 부유세포에서 발현이 증가되어 있고, TargetScan의 결과로 3’UTR에 miR-146a의 부착부위가 있다고 예상되는 6개의 유전자가 miR-146a와 큰 연관성을 보인다고 확인하였다(그림 1F).
Symbol | Gene Name | Log2 Fold Change |
STC1 | Stanniocalcin 1 | 1.20 |
SBSPON | Somatomedin B and thrombospondin type 1 domain containing | 2.20 |
RIMS2 | Regulating synaptic membrane exocytosis 2 | 1.54 |
RCSD1 | RCSD domain containing 1 | 1.98 |
NRP2 | Neuropilin 2 | 3.02 |
MAPT | Microtubule associated protein tau | 3.30 |
표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 이 유전자들 중에서 NRP2와 STC1이 semaphorin-plexin 신호전달 과정에 관여했고, NRP2는 큰 발현 정도의 증가를 보였다.
또한, miR-146a와 NRP2의 부유세포에서 역상관관계, 즉, 부유세포에서 감소되어 있는 miR-146a와 증가되어 있는 NRP2의 발현 패턴을 보였다(그림 1G).
본 실험예 1의 결과들로부터, RNA와 miRNA의 시퀀싱을 통해 순환종양세포 모사 유세포의 분자생물학적 형질과 관련된 가능성 있는 타깃들을 확인하였다.
[실험예 2] NRP2와 miR-146a의 역상관적 발현 패턴의 확인
실험예 1로부터 MDA-MB-468 부유세포는 부착세포와 비교하여 증가된 NRP2와 감소된 miR-146a의 발현을 보임을 확인하였다.
이를 보다 구체적으로 NRP2와 miR-146a의 역상관적 발현 패턴을 확인하기 위해, MDA-MB-468 부착세포와 부유세포에서 real-time quantitative PCR과 웨스턴 블랏을 진행하였다.
이에 대한 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, mRNA와 단백질 수준에서 모두 부유세포에서 NRP2가 증가되어 있었고(그림 2A 및 2B), 반면 miR-146a의 발현 정도는 부유세포에서 급격하게 감소하였다(그림 2C).
본 실험예 2의 결과들로부터, NRP2와 miR-146a가 부착세포와 부유세포에서 강력한 역상관관계를 나타낸다는 것을 확인하였다.
[실험예 3] NRP2와 miR-146a의 직접적인 상관 관계 확인
miR-146a가 직접적으로 NRP2의 발현을 조절하는지 알아보기 위해, 먼저 NRP2 mRNA의3’UTR에 miR-146a의 부착 부위가 있는지 분석하였다.
이에 대한 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, miR-146a의 seed 서열이 NRP2의 3’UTR에 부착하는 부위가 2곳이 있는 것을 확인했으며 이는 miR-146a가 NRP2의 중요 조절자로서 역할을 함을 알 수 있었다(그림 3A). 다음으로, wild type의 NRP2 3’UTR 벡터와 miR-146a 유사체를 함께 형질주입하자, 루시퍼레이즈 정도가 확연히 감소하였지만, miR-146a가 부착된다고 예측되는 두 곳의 서열을 모두 바꾼 mutant type을 형질주입한 표본에서는 루시퍼레이즈 정도가 변하지 않았음을 확인하였다(그림 3B). 또한, 부유세포에서 miR-146a 과발현은 NRP2의 mRNA와 단백질의 발현을 모두 감소시켰다(그림 3C 및 3D). 이러한 결과들로부터, miR-146a가 부유세포에서 NRP2를 직접적으로 조절한다는 것을 확인하였다.
또한, 유방암의 전이와 관련이 있다고 알려진 p38 MAPK의 인산화 형태인 p-p38(Phosphorylated p38)이 부유세포에서 증가되어 있음을 확인하였다(그림 3E). 또한, miR-146a 과발현 후 부유세포에서 p-p38의 정도가 감소하였고(그림 3F), p-p38의 활성화는 NRP2의 하위 신호전달을 활성화시키는 리간드 중 하나인 SEMA3C 처리 후에는 증가되었으며(그림 3G), SEMA3C에 의해 유도된 p-p38은 miR-146a에 의해 감소되었음을(그림 3H) 확인하였다. 이러한 결과들로부터, miR-146a가 NRP2를 타깃으로 p38 신호전달 과정의 조절에 중요한 역할을 한다고 확인하였다.
본 실험예 3의 결과들로부터, MiR-146a는 직접적으로 NRP2를 타킷하고 SEMA3C-유도 p38 인산화를 조절함을 확인하였다.
[실험예 4] NRP2의 순환종양세포내에서의 역할 확인
NRP2의 구체적인 역할을 알아보기 위해 NRP2를 녹다운하여 실험하였다.
이에 대한 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5를 참조하면, NRP2 mRNA와 단백질 수준 모두 MDA-MB-468 부착세포와 부유세포에서 NRP2의 siRNA 형질주입 후 현저하게 감소하였다(그림 4A 및 4B).
다음으로 NRP2 녹다운 후 부착세포와 부유세포에서 어떤 영향을 미치는지 알아보았고, 부착세포와 부유세포 모두 NRP2 siRNA 처리 후 분열하는 세포의 수가 감소하였으며(그림 4C 및 4D), 부유세포의 침윤 능력을 확인하였다. 또한, 이 경우 부유세포는 부착세포보다 확연히 증가된 침윤 능력이 있었음을 확인하였다(그림 4E). 또한, NRP2 녹다운 후 부유세포의 침윤 능력은 두드러지게 감소하였고(그림 4F), 부착세포에서 NRP2 siRNA 처리 후 이동도 억제되었다(그림 4G). 이러한 결과로부터, NRP2 발현의 조절은 유방암 환자의 치료 전략 중 하나로 활용할 수 있음을 확인하였다.
본 실험예 4의 결과들로부터, NRP2의 녹다운은 MDA-MB-468 세포의 증식, 이동 및 침윤을 억제함을 확인하였다.
[실험예 5] MiR-146a의 순환종양세포내에서의 역할 확인
유방암의 악화에 관해 NRP2 발현의 조절인자인 miR-146a의 구체적인 역할을 확인하기 위한 실험을 진행하였다.
이에 대한 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6을 참조하면, miR-146a 과발현 후 MDA-MB-468 부유세포에서 침윤하는 세포의 수가 현저하게 감소하였고(그림 5A), miR-146a 유사체 형질주입 후 부착세포의 이동이 억제되었다(그림 5B).
본 실험예 5에서는, SEMA3C에 의해 유도된 침윤에 대해 miR-146a가 어떤 영향을 주는지 구체적으로 알아보았다.
그 결과, 부유세포에서 SEMA3C에 의해 증가된 침윤 능력이 miR-146a의 과발현으로 인해 감소하였고(그림 5C), miR-146a는 SEMA3C에 의해 유도된 증식도 억제하였으며(그림 5D), 이 경우 10% 소태아혈청이 양성조절인자로 사용되었다. 이러한 결과들로부터, miR-146a가 SEMA3C 유도 침윤과 증식을 부유세포에서 억제하는 역할을 한다는 것을 확인하였고, miR-146a의 순환 유방암 세포를 억제하는 중요한 요소로서의 가능성이 있음을 확인하였다.
본 실험예 5의 결과들로부터, miR-146a는 MDA-MB-468 부유세포에서 SEMA3C에 의해 유도된 전이촉진 형질을 억제함을 확인하였다.
[실험예 6] NRP2 과발현과 유방암의 상관 관계 확인
유방암 환자의 생존과 관련된 NRP2의 역할을 알아보기 위해 유방암 환자의 데이터를 TCGA(The Cancer Genome Atlas)에서 분석을 진행하였다.
이에 대한 결과는, 도 7에 나타내었다.
NRP2의 발현과 관련하여 전반적인 생존에는 유의미한 차이가 없었지만, 높은 NRP2의 발현 패턴을 보이는 유방암 환자는 먼 거리 전이가 없는 생존 기간이 짧았음을 확인하였다(그림 6A 및 6B). 이로부터 NRP2가 유방암 환자의 재발을 예측하는 바이오 마커로서의 역할을 할 수 있음을 확인하였고, 이러한 분석 결과들은 miR-146a와 NRP2가 치료 전략으로 사용될 수 있는 가능성이 있음을 나타낸 것이다.
본 실험예 6의 결과들로부터, 증가된 NRP2의 발현은 유방암 환자의 좋지 않은 예후와 연관성을 보임을 확인하였다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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Ala Gly Ala Gly Ala Thr Cys Gly Cys Gly Ala Gly Cys Gly Ala Gly
1 5 10 15
Gly Cys Ala Cys Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys
20 25 30
Gly Gly Cys Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Ala Thr Cys Cys
35 40 45
Thr Cys Ala Gly Cys Cys Gly Cys Ala Cys Ala Gly Ala Cys Ala Cys
50 55 60
Thr Cys Gly Gly Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Thr
65 70 75 80
Gly Ala Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Cys Gly Cys Cys Ala Gly Cys
85 90 95
Gly Ala Ala Cys Thr Cys Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys
100 105 110
Thr Cys Gly Cys Thr Cys Ala Cys Thr Cys Cys Cys Ala Gly Gly Cys
115 120 125
Gly Ala Thr Cys Cys Cys Ala Gly Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys
130 135 140
Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly
145 150 155 160
Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys
165 170 175
Ala Gly Cys Thr Thr Cys Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Ala Gly Ala
180 185 190
Cys Thr Cys Cys Cys Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Gly Gly Cys Thr
195 200 205
Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Cys Gly Gly Gly Thr Gly Thr Ala Gly
210 215 220
Cys Cys Gly Thr Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Cys
225 230 235 240
Cys Cys Gly Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Cys Cys Cys Gly
245 250 255
Gly Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Gly
260 265 270
Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys Gly Cys Cys Thr Thr Cys Cys Ala Cys
275 280 285
Thr Cys Gly Gly Gly Cys Thr Gly Thr Cys Cys Gly Gly Cys Gly Gly
290 295 300
Cys Gly Gly Cys Thr Gly Cys Cys Thr Cys Cys Gly Cys Cys Cys Gly
305 310 315 320
Thr Gly Thr Gly Thr Cys Cys Gly Thr Cys Ala Ala Gly Gly Gly Thr
325 330 335
Gly Cys Cys Gly Cys Gly Gly Gly Ala Thr Gly Thr Gly Thr Gly Thr
340 345 350
Cys Ala Gly Thr Thr Thr Ala Cys Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly Ala
355 360 365
Gly Ala Thr Cys Ala Cys Ala Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Cys Thr
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Gly Ala Thr Gly Cys
385 390 395 400
Cys Cys Ala Ala Gly Gly Cys Ala Ala Gly Thr Cys Thr Thr Gly Gly
405 410 415
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420 425 430
Thr Ala Thr Cys Ala Thr Thr Ala Thr Thr Gly Thr Thr Ala Cys Gly
435 440 445
Cys Thr Thr Gly Gly Cys Thr Thr Thr Cys Gly Gly Gly Ala Ala Ala
450 455 460
Thr Ala Cys Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Ala Thr Thr Thr Gly Thr
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Cys Cys Cys Gly Gly Cys Thr Thr Gly Thr Thr Cys Cys Cys Thr Cys
565 570 575
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580 585 590
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610 615 620
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625 630 635 640
Ala Gly Ala Cys Ala Ala Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Gly Gly Ala
645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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690 695 700
Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala
705 710 715 720
Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Cys Ala Cys Ala Ala Ala
725 730 735
Gly Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ala Cys Ala Ala Gly Ala Ala Ala Cys
740 745 750
Cys Thr Ala Cys Gly Ala Ala Cys Cys Cys Ala Gly Cys Thr Cys Thr
755 760 765
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770 775 780
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785 790 795 800
Thr Thr Cys Cys Thr Cys Thr Cys Ala Cys Cys Thr Gly Gly Gly Thr
805 810 815
Thr Thr Thr Cys Thr Thr Ala Gly Cys Cys Cys Thr Cys Thr Ala Cys
820 825 830
Thr Thr Thr Thr Cys Ala Ala Gly Ala Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly
835 840 845
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850 855 860
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900 905 910
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Cys Ala Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys
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965 970 975
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Ala Thr Ala Ala Ala Cys Ala Thr Thr Ala Thr Ala Cys Cys Ala Gly
6645 6650 6655
Ala Gly Ala
Claims (16)
- 세포내의 서열번호 1로 표시되는 miR-146a를 포함하는 암 진단용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 세포는 순환종양세포(Circulating-tumor cell, CTC) 또는 이의 모사 부유세포(Circulating-tumor cell-mimicking suspension cell)인 것을 특징으로 하는, 암 진단용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 암은, 서열번호 2로 표시되는 NRP2의 과발현에 의하여 유도된 암인 것을 특징으로 하는, 암 진단용 조성물.
- 제 3 항에 있어서, 상기 암은 뇌종양, 흑색종, 골수종, 비소세포성폐암, 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 및 이들의 전이로 인한 암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 진단용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 miR-146a는 NRP2를 타겟하여 p38 신호전달 과정을 방해하는 것을 특징으로 하는, 암 진단용 조성물.
- 제 5 항에 있어서, 상기 miR-146a은 상기 NRP2의 3' UTR 부위에 결합하여 상기 NRP2의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 암 진단용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 암 진단용 조성물은 전이에 의한 암의 진단용 조성물인 것을 특징으로 하는, 암 진단용 조성물.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 암 진단용 키트.
- 제 8 항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는, 암 진단용 키트.
- miR-146a를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 10 항에 있어서, 상기 암은 뇌종양, 흑색종, 골수종, 비소세포성폐암, 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 및 이들의 전이로 인한 암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 생물학적 시료 내 NRP2 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 발생 여부를 측정하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 순환종양세포(Circulating-tumor cell, CTC) 또는 이의 모사 부유세포(Circulating-tumor cell-mimicking suspension cell)인 것을 특징으로 하는, 암의 발생 여부를 측정하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 NRP2 단백질의 발현 전 상기 NRP2의 mRNA 수준을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 암의 발생 여부를 측정하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 NRP2 단백질의 발현 억제제를 상기 생물학적 시료 내에 투입하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 암의 발생 여부를 측정하는 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 NRP2 단백질의 발현 억제제는, miR-146a인 것을 특징으로 하는, 암의 발생 여부를 측정하는 방법.
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Patent Citations (1)
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