KR20230092793A - 뇌종양 치료를 위한 글리세오플빈 병용요법 - Google Patents

뇌종양 치료를 위한 글리세오플빈 병용요법 Download PDF

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장창영
백선하
박순범
홍지희
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숙명여자대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 글리세오플빈(griseofulvin) 및 테모졸로마이드(temozolomide)를 포함하는 뇌종양 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것으로, 기존 테모졸로마이드(temozolomide)를 단독으로 사용할 경우 생존 기간 연장이 미미할 뿐만 아니라 테모졸로마이드(temozolomide) 저항성이 있는 환자에게는 효과가 적었으나, 글리세오플빈을 병용하므로써, 시너지 효과를 나타내어 더 나은 효과를 나타낼 수 있어 뇌종양 치료에 활용할 수 있다.

Description

뇌종양 치료를 위한 글리세오플빈 병용요법{Combination therapy with griseofulvin for encephaloma}
본 발명은 뇌종양 치료를 위한 글리세오플빈 병용요법을 제공한다.
교모세포종(Glioblastoma Multiforme)은 신경교세포에서 발생하는 뇌종양의 일종으로 뇌에서 발생하는 치명률이 가장 높은 악성종양이다. 보통 방사선 치료와 경구용 치료제인 테모졸로마이드(Temozolomide)를 뇌종양의 표준치료로 사용하고 있으며 약물 저항성으로 치료 효과가 미미한 상황이다. 테모졸로마이드는 DNA에 메틸기를 붙여주는 항암제로서, N7-meG 또는 O6-meG 등 손상 받은 DNA가 복구되지 못하여 double strand break을 발생시키고 결국 세포사멸을 일으키므로 암세포를 죽이게 된다. 이러한 기전을 근거로 테모졸로마이드의 저항성은 암세포가 메틸기를 제거해주는 O(6)-methylguanine-DNA methyltransferase(MGMT)를 과발현하여 획득하는 것으로 보고되고 있다. 저항성 극복 전략으로 MGMT 과발현의 원인으로 예상되는 MGMT 프로모터의 탈메틸화의 저해제를 병용하는 치료법의 개발이 진행중이다.
전체 뇌종양의 12~15% 정도를 차지하고 있는 교모세포종은 수술과 방사선, 항암제 치료를 해도 평균 생존 기간이 14개월에 불과해 새로운 치료제 개발이 시급한 상황이다.
1. 대한민국 공개특허 제10-2020-0094110호 (2020.08.06. 공개)
본 발명의 목적은 글리세오플빈(griseofulvin) 및 테모졸로마이드(temozolomide)를 포함하는 뇌종양 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 PCNT(pericentrin) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 뇌종양 예후예측용 바이오마커 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 PCNT(pericentrin) 단백질 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 뇌종양 예후예측용 바이오마커 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 검체와 정상 대조군으로부터 분리된 시료로부터 PCNT(pericentrin) 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 뇌종양 예후예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 (1) 뇌종양 환자의 검체로부터 분리된 시료로부터 PCNT(pericentrin) 단백질의 발현 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 (1)단계의 PCNT(pericentrin) 단백질의 발현 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 테모졸로마이드(temozolomide) 치료 시 병용될 글리세오플빈(griseofulvin)의 용량을 결정하는 단계를 포함하는, 뇌종양 치료용 테모졸로마이드 및 글리세오플빈 병용요법을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 글리세오플빈(griseofulvin) 및 테모졸로마이드(temozolomide)를 포함하는 뇌종양 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 PCNT(pericentrin) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 뇌종양 예후예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 PCNT(pericentrin) 단백질 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 뇌종양 예후예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 검체와 정상 대조군으로부터 분리된 시료로부터 PCNT(pericentrin) 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 뇌종양 예후예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 뇌종양 환자의 검체로부터 분리된 시료로부터 PCNT(pericentrin) 단백질의 발현 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 (1)단계의 PCNT(pericentrin) 단백질의 발현 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 테모졸로마이드(temozolomide) 치료 시 병용될 글리세오플빈(griseofulvin)의 용량을 결정하는 단계를 포함하는, 뇌종양 치료용 테모졸로마이드 및 글리세오플빈 병용요법을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 글리세오플빈(griseofulvin) 및 테모졸로마이드(temozolomide)를 포함하는 뇌종양 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것으로, 기존 테모졸로마이드(temozolomide)를 단독으로 사용할 경우 생존 기간이 길지 않았을 뿐 만 아니라 테모졸로마이드(temozolomide) 저항성이 있는 환자에게는 효과가 적었으나, 글리세오플빈을 병용하므로써, 시너지 효과를 나타내어 더 나은 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 인간 교모세포종 세포주인 U87 세포주와 U373 세포주에 10μM 테모졸로마이드를 24시간 처리하여 세포사멸이 유도될 때 다극성 방추사가 형성됨을 확인한 결과이다.
도 2는 인간 교모세포종 세포주인 U87 세포주와 U373 세포주에 10μM 테모졸로마이드를 24시간 처리한 후 Plk1 항체와 centrin 항체로 염색하여 확인한 결과이다.
도 3은 U87과 U373 세포주에 약물을 24시간 처리한 후 PCNT(pericentrin) 항체와 베타-튜불린 항체로 염색하여 세포를 확인한 결과이다.
도 4는 7개의 교모세포종 세포주에 약물을 24시간 처리한 후에 항체 염색 후 세포를 관찰하여 다극성 방추사와 미정렬 염색체(unaligned chromosome)를 계수한 결과이다.
도 5는 교모세포종 세포주들의 추출물에 존재하는 PCNT(pericentrin)의 양을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.
도 6은 U87과 U373 세포주에 약물을 처리한 후 집락 형성 분석(colony formation assay)을 진행한 결과이다.
도 7은 교모세포종 세포주에 약물을 처리한 후 집락 형성 분석(colony formation assay)을 진행한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 글리세오플빈(griseofulvin) 및 테모졸로마이드(temozolomide)를 포함하는 뇌종양 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
상기 글리세오플빈(griseofulvin)의 농도는 0.0353mg/kg 내지 3.528mg/kg이고, 테모졸로마이드(temozolomide)의 농도는 0.971mg/kg 내지 1.94mg/kg일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 뇌종양은 신경교종, 저급 신경교종, 다형성신경교종, 교모세포종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 역형성 성상세포종, 희돌기 아교세포 종양 및 상의세포 종양으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 MGMT(O(6)-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼레이즈) 과발현된 환자에게 투여하기 위한 것일 수 있다.
상기 약학 조성물은 테모졸로마이드(temozolomide)가 중심체를 약화시켜 다극성 방추사(multipolar spindle)를 유도하여 세포사멸을 유도하고, 글리세오플빈(griseofulvin)이 중심체의 탈군집화(declustering)를 유도할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 투여량이 0.01 mg/kg 내지 200 mg/kg, 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 PCNT(pericentrin) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 뇌종양 예후예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 "바이오마커"는 뇌종양이 발생한 대상체의 조직 또는 세포를 정상 대조군의 조직 또는 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 대조군에 비하여 질환이 발생한 대상체의 조직 또는 세포에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 단백질 또는 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "예후 예측"은 질환의 경과 및 결과를 미리 예측하는 행위를 의미한다. 보다 구체적으로, 예후 예측이란 질환의 치료 후 경과는 환자의 생리적 또는 환경적 상태에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 환자의 상태를 종합적으로 고려하여 치료 후 병의 경과를 예측하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 목적상 상기 예후 예측은 암 환자의 치료 후, 질환의 경과 및 완치 여부를 미리 예상하여 암환자의 무병 생존율 또는 생존율을 예측하는 행위로 해석될 수 있다. 예를 들어, "예후가 좋다"라고 예측하는 것은 치료 후 암 환자의 무병 생존율 또는 생존율이 높은 수준을 나타내어, 암 환자가 치료될 가능성이 높다는 것을 의미하고, "예후가 나쁘다"라고 예측하는 것은 치료 후 암 환자의 무병 생존율 또는 생존율이 낮은 수준을 나타내어, 암 환자로부터 암이 재발하거나 또는 암으로 인하여 사망할 가능성이 높다는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 PCNT(pericentrin) 단백질 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 뇌종양 예후예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
상기 제제는 프라이머, 프로브, 항체, 펩타이드 및 앱타머로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “프라이머”란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “프로브”란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 “항체”는 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 PCNT에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
본 발명에서 사용된 용어 “펩타이드”는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한, 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 “앱타머”는 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한종류의 단일 가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 검체와 정상 대조군으로부터 분리된 시료로부터 PCNT(pericentrin) 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 뇌종양 예후예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 뇌종양 환자의 검체로부터 분리된 시료로부터 PCNT(pericentrin) 단백질의 발현 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 (1)단계의 PCNT(pericentrin) 단백질의 발현 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 테모졸로마이드(temozolomide) 치료 시 병용될 글리세오플빈(griseofulvin)의 용량을 결정하는 단계를 포함하는, 뇌종양 치료용 테모졸로마이드 및 글리세오플빈 병용요법을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 (1)단계의 PCNT(pericentrin) 단백질 또는 유전자 발현 수준이 대조군에 비해 과발현된 경우, 병용될 글리세오플빈(griseofulvin)의 용량은 0.0176mg/kg 내지 0.352mg/kg으로 결정할 수 있다.
상기 (1)단계의 PCNT(pericentrin) 단백질 또는 유전자 발현 수준이 대조군에 비해 저발현된 경우, 병용될 글리세오플빈(griseofulvin)의 용량은 0.0176mg/kg 내지 0.352mg/kg으로 결정할 수 있다.
본 발명에서 “과발현”은 대조군에 비해 PCNT(pericentrin) 단백질 또는 유전자 발현 수준이 50 내지 200% 증가한 경우를 의미하며, “저발현”은 대조군에 비해 PCNT(pericentrin) 단백질 또는 유전자 발현 수준이 20 내지 50% 감소한 경우를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 등은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 등에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 등은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시 예 1> 테모졸로마이드 처리에 따른 다극성 방추사가 형성 여부 및 세포사멸을 일으키는 기전 확인
(1) 면역형광현미경검사 (Immunofluorescence microscopy)
용매(DMSO)와 테모졸로마이드를 24시간 처리한 세포를 -20℃에서 100% 에탄올에 20분 고정시켰다. 20분이 지나면 PBS-BT(PBS, 3% BSA, 0.1% Triton X-100)를 넣어 30분 실온에 두었다. 30분 후 PCNT(pericentrin)과 베타-튜불린 항체로 30분 동안 염색했다. 30분 후 PBS-BT로 3번 워싱 후, Alexa Fluor 594 또는 488이 연결된 2차 항체로 30분 염색했다. 30분 후 PBS-BT로 3번 워싱하고, DNA는 DAPI로 염색하고 Mowiol(Polyvinyl alcohol)을 이용하여 슬라이드 글라스에 붙여주었다. 사진은 Zeiss Axiovert 200 M microscope을 통해 찍었고, AutoVisualizer v9.1로 이미지화했다.
(2) 결과
인간 교모세포종 세포주인 U87 세포주와 U373 세포주에 10μM 테모졸로마이드를 24시간 처리하여 세포사멸이 유도될 때, 도 1에 따르면, 다극성 방추사가 형성되는 것을 확인하였다. 이러한 현상은 유전자 손상반응의 상위 인산화효소인 ATR 저해제(NU6027)와 CHK1 저해제(UCN-01))에 의해 억제되었고, ATM의 저해제(KU55933)에 의해서는 테모졸로마이드에 의한 다극성 방추사 형성을 막지는 못했다. 그러므로 테모졸로마이드에 의한 다극성 방추사 형성은 ATR과 CHK1에 의해 유도됨을 알 수 있다.
<실시 예 2> 테모졸로마이드 처리에 따른 미성숙 중심립 분리 현상 확인
(1) 면역형광현미경검사 (Immunofluorescence microscopy)
용매(DMSO)와 테모졸로마이드를 24시간 처리한 세포를 -20℃에서 100% 에탄올에 20분 고정시켰다. 20분이 지나면 PBS-BT(PBS, 3% BSA, 0.1% Triton X-100)를 넣어 30분 실온에 두었다. 30분 후 Plk1 항체와 centrin 항체로 염색했다. 30분 후 PBS-BT로 3번 워싱 후, Alexa Fluor 594 또는 488이 연결된 2차 항체로 30분 염색했다. 30분 후 PBS-BT로 3번 워싱하고, DNA는 DAPI로 염색하고 Mowiol(Polyvinyl alcohol)을 이용하여 슬라이드 글라스에 붙여주었다. 사진은 Zeiss Axiovert 200 M microscope을 통해 찍었고, AutoVisualizer v9.1로 이미지화했다.
(2) 결과
인간 교모세포종 세포주인 U87 세포주와 U373 세포주에 10μM 테모졸로마이드를 24시간 처리한 후 Plk1 항체와 centrin 항체로 염색하고 DNA는 DAPI로, Merge는 세 가지 염색하여 관찰한 결과, 도 2에 따르면, 테모졸로마이드에 의해 중심체에서 미성숙 중심립 분리(premature centriole disengagement)을 확인하였다.
<실시 예 3> 글리세오플빈 및 테모졸로마이드 병용처리에 의한 다극성 방추사 형성 여부 확인
(1) 면역형광현미경검사 (Immunofluorescence microscopy)
용매(DMSO)와 테모졸로마이드를 24시간 처리한 세포를 -20℃에서 100% 에탄올에 20분 고정시켰다. 20분이 지나면 PBS-BT(PBS, 3% BSA, 0.1% Triton X-100)를 넣어 30분 실온에 두었다. 30분 후 Plk1 항체와 centrin 항체로 염색했다. 30분 후 PBS-BT로 3번 워싱 후, Alexa Fluor 594 또는 488이 연결된 2차 항체로 30분 염색했다. 30분 후 PBS-BT로 3번 워싱하고, DNA는 DAPI로 염색하고 Mowiol(Polyvinyl alcohol)을 이용하여 슬라이드 글라스에 붙여주었다. 사진은 Zeiss Axiovert 200 M microscope을 통해 찍었고, AutoVisualizer v9.1로 이미지화했다.
(2) 카운팅(Counting)
중기(Metaphase) 단계인 세포 100개 중 다극성인 세포의 개수를 세어 그 비율을 계산했고, 동일한 실험을 3번 반복하여 총 300개의 세포를 카운팅하였다.
(3) 결과
U87과 U373 세포주에 약물을 24시간 처리한 후 PCNT(pericentrin) 항체와 베타-튜불린 항체로 염색하여 세포를 관찰하였다. 그 결과, 도 3 및 도 4에 따르면, U87 세포주와 U373 세포주에 10μM 테모졸로마이드를 24시간 처리하면 다극성 방추사가 낮은 비율로 형성되고, 글리세오플빈은 U87에 0.1μM, U373에 10μM 처리하면 다극성 방추사가 형성되지 않는다. 하지만 테모졸로마이드와 글리세오플빈을 병용처리 시 다극성 방추사 형성 비율과 가짜 양극성 방추사(pseudo-bipolar spindle)가 급격히 증가(50%)되는 것으로 보아 병용효과(synergistic effect)가 있다는 것을 알 수 있었다. U373 세포주에는 글리세오플빈에 의해 미정렬 염색체(unaligned chromosome)도 발생함을 확인하였다.
<실시 예 4> 교모세포종 세포주들의 추출물에 존재하는 PCNT(pericentrin)의 양 확인
(1)웨스턴블롯
교모세포종 세포주들을 LAP200 lysis buffer(50mM Hepes, pH 7.4, 200mM KCl, 0.3% NP-40, 10% glycerol, 1mM EGTA, 1mM MgCl2, 0.5mM DTT, 0.5μM microcystin, 10μg/ml each of leupeptin, pepstatin 및 chymostatin)를 이용해 용해시켰다. 각 세포 용해액은 SDS-PAGE 젤을 이용하여 단백질들을 분리하였고, 젤에 있는 단백질들을 막(membrane)에 옮긴 뒤 PCNT, MAD2, MGMT 및 Actin 항체로 검출하여 단백질의 발현 정도를 비교했다.
(2) 결과
그 결과, 도 4 및 도 5에 따르면, PCNT 단백질의 발현량이 높은 U87, U251, LN428, T98G 및 Snb19 세포주의 경우 0.1μM 글리세오플빈의 병용처리로 다극성 방추사와 가짜 양극성 방추사가 유도되었지만, PCNT 단백질의 발현량이 낮은 U373, F98 및 HT22 세포주는 10μM의 글리세오플빈을 병용처리해야 다극성 방추사와 가짜 양극성 방추사가 유도됨을 확인하였다. 또한, Mad2 및 MGMT도 비교분석한 결과 표현형과의 상관관계는 없었음을 확인하였다.
PCNT(pericentrin) 단백질 발현량이 글리세오플빈에 대한 교모세포증 세포들의 내성과 비례하는 현상을 발견하였으며 PCNT 단백질의 발현량이 낮을수록 높은 농도의 글리세오플빈이 다극성 방추사 유도와 세포사멸에 필요하므로, PCNT 단백질을 뇌종양 환자의 예후예측인자(prognostic factor)로 활용할 수 있음을 확인하였다.
<실시 예 5> 글리세오플빈 및 테모졸로마이드 병용처리에 의한 집락 (colony) 형성 확인
(1) 집락 형성 분석(Human Colony Forming cell assay)
Methylcellulose-based media를 각 군별로 15ml 코니컬 튜브에 2ml씩 분주해놓았다. 각 군에 맞게 글리세오플빈 및 테모졸로마이드를 넣고 잘 섞어준 다음 20분 기다렸다. 이때 점도가 높아서 생기는 media의 기포가 제거되었다. 20분 후 각 세포주를 각 군(대조군, 테모졸로마이드군, 글리세오플빈군 및 병용처리군)에 5.0 x 10²개의 세포를 넣고 섞어준 다음 다시 20분을 기다려 기포를 제거했다. 주사기를 이용해 정확히 1.5ml를 6웰 플레이트에 기포 없이 천천히 넣어주었다. 웰 사이사이에 멸균된 물(H2O)을 넣어준다. 14 내지 16일 정도 37℃, 5% CO2 환경에서 배양시킨 뒤 집락을 관찰했다.
(2) 결과
그 결과, 도 6 및 7에 따르면, 대조군, 테모졸로마이드군 및 글리세오플빈군에 비해 테모졸로마이드 및 글리세오플빈을 병용처리한 군에서의 집락의 개수가 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (12)

  1. 글리세오플빈(griseofulvin) 및 테모졸로마이드(temozolomide)를 포함하는 뇌종양 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 글리세오플빈(griseofulvin)의 농도는 0.0353mg/kg 내지 3.528mg/kg이고, 테모졸로마이드(temozolomide)의 농도는 0.971mg/kg 내지 1.94mg/kg인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 뇌종양은 신경교종, 저급 신경교종, 다형성신경교종, 교모세포종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 역형성 성상세포종, 희돌기 아교세포 종양 및 상의세포 종양으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 약학 조성물은 MGMT (O(6)-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼레이즈) 과발현된 환자에게 투여하기 위한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 약학 조성물은 테모졸로마이드(temozolomide)가 중심체를 약화시켜 다극성 방추사(multipolar spindle)를 유도하여 세포사멸을 유도하고, 글리세오플빈(griseofulvin)이 중심체의 탈군집화(declustering)를 유도하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  6. PCNT(pericentrin) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 뇌종양 예후예측용 바이오마커 조성물.
  7. PCNT(pericentrin) 단백질 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 뇌종양 예후예측용 바이오마커 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 제제는 프라이머, 프로브, 항체, 펩타이드 및 앱타머로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 뇌종양 예후예측용 바이오마커 조성물.
  9. 검체와 정상 대조군으로부터 분리된 시료로부터 PCNT(pericentrin) 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 뇌종양 예후예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
  10. (1) 뇌종양 환자의 검체로부터 분리된 시료로부터 PCNT(pericentrin) 단백질의 발현 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (2) 상기 (1)단계의 PCNT(pericentrin) 단백질의 발현 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
    (3) 테모졸로마이드(temozolomide) 치료 시 병용될 글리세오플빈(griseofulvin)의 용량을 결정하는 단계를 포함하는, 뇌종양 치료용 테모졸로마이드 및 글리세오플빈 병용요법을 위한 정보를 제공하는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 (1)단계의 PCNT(pericentrin) 단백질 또는 유전자 발현 수준이 대조군에 비해 과발현된 경우, 병용될 글리세오플빈(griseofulvin)의 용량은 0.0176mg/kg 내지 0.352mg/kg으로 결정하는 것을 특징으로 하는, 뇌종양 치료용 테모졸로마이드 및 글리세오플빈 병용요법을 위한 정보를 제공하는 방법.
  12. 청구항 10에 있어서,
    상기 (1)단계의 PCNT(pericentrin) 단백질 또는 유전자 발현 수준이 대조군에 비해 저발현된 경우, 병용될 글리세오플빈(griseofulvin)의 용량은 0.0176mg/kg 내지 0.352mg/kg으로 결정하는 것을 특징으로 하는, 뇌종양 치료용 테모졸로마이드 및 글리세오플빈 병용요법을 위한 정보를 제공하는 방법.
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