KR102443953B1 - 항암제 내성 암 치료용 항암 보조제, 약학 조성물 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents

항암제 내성 암 치료용 항암 보조제, 약학 조성물 및 이를 포함하는 키트 Download PDF

Info

Publication number
KR102443953B1
KR102443953B1 KR1020200044834A KR20200044834A KR102443953B1 KR 102443953 B1 KR102443953 B1 KR 102443953B1 KR 1020200044834 A KR1020200044834 A KR 1020200044834A KR 20200044834 A KR20200044834 A KR 20200044834A KR 102443953 B1 KR102443953 B1 KR 102443953B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cancer
anticancer
dna replication
tristetraproline
ttp
Prior art date
Application number
KR1020200044834A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20210127012A (ko
Inventor
강태홍
Original Assignee
동아대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 동아대학교 산학협력단 filed Critical 동아대학교 산학협력단
Priority to KR1020200044834A priority Critical patent/KR102443953B1/ko
Priority to PCT/KR2021/000458 priority patent/WO2021210762A1/ko
Publication of KR20210127012A publication Critical patent/KR20210127012A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102443953B1 publication Critical patent/KR102443953B1/ko
Priority to US17/965,460 priority patent/US20230080252A1/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/243—Platinum; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 항암제 내성암 치료용 항암 보조제 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, DNA 복제 저해성 항암제에 대하여 내성을 나타내는 경우 또는 항암제의 효과를 극대화 시키기 위해 트리스테트라프롤린 활성을 억제하는 물질을 항암 보조제로 포함시켜 암 치료에 이용 가능하다. 또한, 본 발명은 DNA 복제 저해성 항암제에 대한 내성을 진단하는 조성물 키트 및 방법에 관한 것으로, 트리스테트라프롤린의 발현 정도를 측정하여 상기 항암제에 내성이 있는지 여부를 확인할 수 있다.

Description

항암제 내성 암 치료용 항암 보조제, 약학 조성물 및 이를 포함하는 키트 {Anti-cancer adjuvant and pharmaceutical Composition for treating anticancer drugs resistance cancer and kit comprising the same}
본 발명은 항암제 내성 암 치료용 항암 보조제, 약학 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.
유전자의 불안정성은 암의 주요 유발원으로써, DNA 손상 반응의 결함 또는 복제 스트레스 증가로 인해 발생된다. 복제 스트레스는 복제 분기점 진행이 지연 또는 정지되거나, DNA 합성이 지연 또는 정지되어 발생할 수 있으며, 일반적으로 ssDNA의 신장부를 형성한다. ssDNA 결합 단백질인 RPA(복제 단백질 A, replication protein A)에 의해 결합된 ssDNA는 ATR 키나아제의 활성화를 위한 신호 플랫폼을 생성한다.
정지된 복제 분기점 구조의 완전성을 유지하기 위해 ATR은 CHK1을 인산화 및 활성화하여 세포 주기를 억제한다. ATR-CHK1 경로는 복제 분기점의 속도를 줄이고, 새로운 복제분기점 생성을 억제하여 세포가 스트레스를 해소하고, DNA 합성을 다시 시작할 수 있는 추가 시간을 제공한다. 정지된 복제 분기점의 확인, 안정화 및 재시작에 있어 ATR-CHK1 경로의 기능은 잘 확립되어 있다. 그럼에도 불구하고, ATR-CHK1의 활성조절과 ATR-CHK1 경로에 영향을 미치는 요인은 여전히 연구 중에 있다.
Claspin은 ATR을 통한 CHK1 활성의 필수 요소로, 복제분기점이 정지되거나 DNA 절제 시, RPA로 코팅된 ssDNA에서 CHK1과 ATR 사이의 물리적인 상호작용을 중재한다. 또한 Claspin은 복제 복합체의 주요 구성요소로서 DNA 중합효소, MCM helicase, CDC 45를 포함한 다수의 핵심 단백질과 상호작용 하기 때문에, 세포주기의 복제기(S phase)에서 효율적으로 복제 분기점이 진행하도록 돕는다. 실제로 Claspin이 고갈되면 정상적인 복제 분기점 속도가 상당히 감소하고, 정지된 복제 분기점 수는 상당히 증가하며, 궁극적으로 Claspin이 녹아웃된 마우스 배아의 치사를 초래한다. Claspin 활성이 세포 주기 의존적으로 조절되는 것은 잘 알려져 있지만, 복제 스트레스를 받는 동안 Claspin 단백질의 양적 조절에 대한 연구결과는 아직 보고되어있지 않다.
세포 주기 진행 중, 유비퀴틴-프로테오좀을 통한 단백질의 분해는 Claspin 발현을 조절하는 주요 메커니즘 중 하나로 입증되었다. 그러나 Claspin의 전사, 전사 후 조절 또는 복제 스트레스 반응과 관련된 다른 주요 체크 포인트 요인에 대해서는 거의 알려져 있지 않다.
mRNA 안정성에 대한 전사 후 조절 방식은 세포 안밖의 자극에 즉각적으로 반응하기 위해 필요하다. TTP(tristetraprolin)는 표적 mRNA의 3'-untranslated 영역(3'UTR)에서 아데노신과 유리딘이 함유(ARE, adenosine-and-uridine-rich element)된 DNA에 직접 결합할 수 있는 아연 핑거(zinc finger) 단백질이다. TTP는 일반적으로 poly A tail를 급속히 축소하기 위한 exosome 복합체를 불러옴으로써 이러한 mRNA가 분해될 수 있도록 촉진하지만, 표적 mRNA의 안정성과 분해를 증가시킬 수도 있다. TTP 결핍 마우스에서는 염증성 사이토카인인 TNF-a의 지속적인 상향조절로 인해 관절염, 피부염, 악액증, 자가면역증, 골수 과형성증 등의 복합적 염증성 증후군이 발생한다. 즉각-반응 유전자(immediate early gene)에 속하는 TTP는 mitogen과 같은 다양한 자극에 의해 발현이 유도된다.
최근의 연구는 또한 TTP가 p53 의존적으로 doxorubicin 처리에 반응하여 빠르게 증가된다는 것을 보여준다. 반면, 복제스트레스반응(RSR, replication stress response) 동안 암세포에서 TTP가 잠재적으로 어떤 역할을 하는지는 아직 확인되지 않았고, 본 연구에서는 RSR 동안에 TTP의 중요한 기능을 확인했다. ATR-CHK1 활성화가 게놈 안정성을 유지하기 위해 Claspin mRNA의 안정화를 필요로 하는데, 이를 위해서는 DNA 손상시 TTP의 발현 증가가 필요하다. 본 연구는 TTP가 Claspin mRNA 안정성을 전사 후 조절 방식(post-transcriptional regulation)으로 조절하는 ATR-CHK1 경로의 새로운 조절 메커니즘을 제시한다.
한국등록특허 제1036207호
본 발명의 목적은 DNA 복제 저해성 항암제에 대한 내성 암 치료용 항암 보조제 및 이를 포함한 약학 조성물을 제공함에 있다.
본 발명의 목적은 DNA 복제 저해성 항암제 내성 진단을 위한 조성물 및 키트를 제공함에 있다.
본 발명의 목적은 DNA 복제 저해성 항암제 내성 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공함에 있다.
1. 트리스테트라프롤린 억제제를 포함하는 DNA 복제 저해성 항암제 내성암의 항암 보조제.
2. 위 1에 있어서, 상기 트리스테트라프롤린 억제제는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 siRNA인, 항암 보조제.
3. 위 1에 있어서, 상기 DNA 복제 저해성 항암제는 5-플루오로우라실, 젬시타빈 또는 시스플라틴인, 항암 보조제.
4. 위 1에 있어서, 상기 암은 폐암 또는 대장암인, 항암 보조제
5. 위 1에 있어서, 상기 항암 보조제는 DNA 복제 저해성 항암제와 병용 투여용인, 항암 보조제.
6. 트리스테트라프롤린 억제제; 및 DNA 복제 저해성 항암제를 포함하는 DNA 복제 저해성 항암제 내성암 치료용 약학 조성물.
7. 위 6에 있어서, 상기 트리스테트라프롤린 억제제는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 siRNA인, 약학 조성물.
8. 위 6에 있어서, 상기 DNA 복제 저해성 항암제는 5-플루오로우라실, 젬시타빈 또는 시스플라틴인, 약학 조성물.
9. 위 6에 있어서, 상기 암은 폐암 또는 대장암인, 약학 조성물.
10. 트리스테트라프롤린 유전자 또는 그 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 DNA 복제 저해성 항암제 내성 진단용 조성물.
11. 위 10에 있어서, 상기 물질은 서열번호 4 및 5로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 조성물.
12. 위 10에 있어서, 상기 항암제는 5-플루오로우라실, 젬시타빈 또는 시스플라틴으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 조성물.
13. 위 10 내지 12 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 DNA 복제 저해성 항암제 내성 진단용 키트.
14. 진단 대상으로부터 분리된 시료 내의 트리스테트라프롤린 유전자 또는 그 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 DNA 복제 저해성 항암제 내성 진단을 위한 정보 제공 방법.
15. 위 14에 있어서, 상기 진단 대상은 폐암 또는 대장암 환자인, 방법.
16. 위 14에 있어서, 상기 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 또는 뇨로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
17. 위 14에 있어서, 상기 항암제는 5-플루오로우라실, 젬시타빈 또는 시스플라틴으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 방법.
18. 위 14에 있어서, 상기 측정된 발현 수준이 대조군 대비 높으면 상기 진단 대상이 DNA 복제 저해성 항암제 내성이 대조군 대비 높다고 판단하는, 방법.
본 발명의 트리스테트라프롤린 억제제를 포함하는 항암 보조제는 DNA 복제 저해성 항암제를 사용하는 환자군에서, 항암제에 내성이 생긴 암 환자의 치료에 사용되어 항암 치료 효과를 극대화 시킬 수 있다.
본 발명의 트리스테트라프롤린 억제제; 및 DNA 복제 저해성 항암제를 포함하는 약학 조성물은 DNA 복제 저해성 항암제를 사용하는 환자군에서, 항암제에 내성이 생긴 암 환자의 치료에 사용되어 항암 치료 효과를 극대화 시킬 수 있다.
본 발명의 DNA 복제 저해성 항암제 내성 진단용 조성물, 키트 및 방법은 항암제의 치료 반응성을 효과적으로 예측할 수 있으며, 암 환자에 대한 선택적, 개별적 항암제 치료가 가능하게 한다.
도 1은 실시예 1에 대응되는 것으로, 도 1a는 20 J/m2 UV-C를 조사하고, 표식항체로 면역 블로팅 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 도 1b는 A549 세포를 siRNA 저항성 TTP로 발현되는 벡터로 도입시켜 20 J/m2 UV-C를 조사하고, 표식항체로 면역 블로팅 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 도 1c는 대조군 또는 UV를 처리한 세포를 표식항체로 면역 염색한 것으로, Hoechst 33342로 염색된 핵은 원형의 점선으로 묘사한 것이다. 도 1d는 도 1c의 UV 처리한 데이터에서 p-CHK1 양성 세포의 비율을 수량화 한 것이다. 도 1e는 표지된 억제제로 처리한 세포를 UV 조사 후 2시간 동안 고정시킨 후, anti-p-CHK1 항체로 면역 염색한 것이다. 각각 실험에서 p-CHK1 양성 세포의 비율을 확인하기 위해 100개 이상의 세포들을 무작위로 선택하였다. 도 1f는 siCTRL(대조군, 10nM control siRNA) 또는 siTTP로 도입된 세포를 DMSO 또는 4mM HU로 2시간 동안 처리한 후, 특정 시간 동안 방출시켜 면역 블로팅한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 2에 대응되는 것으로, 도 2a는 siCTRL 또는 siTTP가 도입된 A549세포는 라벨링 절차 사이에 UV-C(20J/m2)의 노출 유무에 관계없이 순차적으로 ldU(red)에 20분 동안, CldU(green)에 40분 동안 펄스 라벨링하였고, DNA fiber 분석 결과를 나타낸 것이다. ldU에 대한 CldU의 비율은 활성화된 복제 분기점을 통해 계산하였다. 도 2b는 siCTRL, siTTP 또는 siTTP의 조합으로 도입된 A549 세포들과 siRNA 저항성 TTP가 발현된 벡터로 도입된 A549 세포에서, ldU로 펄스 라벨링하였고, 2시간동안 4mM HU로 처리하고, 6시간동안 CldU 존재 하에 HU block으로부터 방출된 것이다. ssDNA(blue)는 ssDNA 특이적 항체로 표지 되었으며, 정지된 분기점의 비율은 빨간색만으로 표시된 부분(정지된 분기점)의 수를 빨간색, 초록색으로 표시된 부분(각각 정지된 분기점, 재시작된 분기점)을 모두 더한 총 수로 나누어 계산하였다. 최소 200개의 개별 DNA fiber에 대해 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 2c는 siCTRL, siTTP 또는 siTTP의 조합으로 도입된 A549 세포들과 siRNA 저항성 TTP가 발현된 벡터로 도입된 A549 세포에서, 2시간동안 4mM HU로 처리하고, 일정 기간 방출한 뒤, 마지막 1시간 동안은 EdU로 펄스 라벨링 한 것이다. S상 진행의 복구는 HU 처리한 것으로부터 방출된 후 6시간에서 EdU 양성 세포의 비율로 제시된다. 각 실험에서 100개 이상의 세포를 무작위로 선정하여 EdU- 양성 세포의 비율을 정하였다. 도 2d는 siCTRL 또는 siTTP로 도입된 A549 세포는 순차적으로 IdU와 CldU로 펄스 라벨이 부착된 후, 6시간 동안 4mM HU로 처리하고, DNA fiber 분석을 했다. CldU 대 IdU 비율은 활성화된 복제 분기점의 길이로부터 계산하였다(red-green). 실험 조건 당 200개 이상의 섬유의 중간 값은 빨간색 막대로 표시된다. 통계적 분석은 Mann-Whitney 테스트를 이용하여 수행되었다.
도 3은 실시예 3에 대응되는 것으로, 도 3a는 siCTRL 또는 siTTP로 도입한 A549 세포를 actinomycin D가 없는 조건에서 일정 시간 동안 처리하여, 표식유전자의 mRNA 레벨을 qRT-PCR에 의해 분석한 것이다. 도 3b는 기본벡터 또는 siRNA 저항성 TTP가 발현된 벡터를 도입한 A549 세포 는 actinomycin D가 없는 조건에서 일정 시간 동안 처리하여, 표식유전자의 mRNA 레벨을 qRT-PCR에 의해 분석한 것이다. 도 3c는 RNA 면역침강 분석을 UV 방사선의 유무에 관계없이 대조군 벡터 또는 TTP 발현 벡터로 도입한 A549 세포의 용해물에서 TTP에 대한 항체를 사용하여 수행한 것으로, Claspin mRNA의 3'UTR에 TTP 결합 위치의 존재는 RT-PCR로 분석하였다. 또한, GAPDH mRNA는 음성 대조군으로 사용된 것이다. 도 3d는 A549 세포를 psiCHECK2 luciferase reporter constructs(ARE1WT 또는 ARE1Mut를 포함하는 인코딩 mRNA)와 TTP 발현 벡터 또는 siTTP로 공동 도입한 후, 발광효소 리포터로 분석한 것이다. 발광효소 리포터의 활성은 Renilla 발광효소 신호에 대한 반딧불 발광효소 신호의 비율로 측정되었다. 도 3e는 A549 세포를 siCTRL 또는 siTTP 와 대조군 벡터 또는 siRNA 저항성 TTP를 발현하는 벡터로 공동 도입하여, 20 J/m2 UV-C로 처리한 것과, 처리하지 않은 것의 용해물을 표식항체에 대한 면역블로팅으로 분석한 것이다.
도 4는 실시예 3에 대응되는 것으로, 도 4a는 siRNA 또는 siRNA 저항성 Claspin이 발현된 벡터가 도입된 A549 세포를 mock 또는 20 J/m2 UV-C 조건에서 처리하여, 표식항체로 면역 블롯 분석한 것이다. 도 4b는 siTTP 또는 siClaspin이 도입된 세포들을 라벨링 과정 사이에 UV-C (20J/m2) 노출에 관계없이 순차로 IdU(red)로 20분간, CIdU(green)으로 40분간 펄스 라벨링 한 후, DNA 섬유 분석을 수행한 것으로, CIdU 대 IdU의 길이 비율은 활성 복제 분기점으로부터 계산하였다(red-green, n>100). 도 4c는 A549 세포를 표식 siRNA 또는 siRNA 저항성 Claspin을 발현하는 벡터로 도입하고 순차로 IdU, CIdU으로 펄스 라벨링 한 후, 4mM HU에서 6시간 동안 처리하여 DNA fiber 분석을 수행한 것이다. CldU 대 IdU의 길이 비율은 활성 복제 분기점(red-green)으로부터 계산하였다. 하나의 실험 조건 당 200개 이상 섬유의 중간 값은 빨간색 막대로 표시되었고, 통계학적 분석은 Mann-Whitney test를 이용하여 분석하였다.
도 5는 실시예 4에 대응되는 것으로, siRNA가 도입된 A549 세포에 대조군 벡터 또는 siRNA 저항성 TTP 발현 벡터를 공동 도입시킨 후, 순차적으로 IdU, CldU로 각각 20분씩 펄스 라벨링하였다. 도 5a는 복제하는 부분의 대표적인 이미지를 나타낸 것이고, 도 5b는 각 실험 조건 당 150개 이상의 섬유(fiber)들의 중간값을 빨간색 막대기로 나타낸 것이다. 통계학적 분석은 Mann-Whitney test를 이용하여 수행되었다.
도 6은 실시예 5에 대응되는 것으로, 도 6a는 siCTRL 또는 siTTP로 도입된 A549 세포를 4mM HU 또는 10μM 시스플라틴으로 처리하고, 표시된 항체로 면역 염색한 것이다. 각 실험에서 53BP1과 γH2AX foci의 위치를 정량화하기 위해 100개 이상의 세포들을 무작위로 선정하였다. 도 6b는 siCTRL 또는 siTTP 도입 A549 세포를 4mM HU 또는 10μM 시스플라틴으로 처리하고, 약물 제거 후 알칼리성 electrophoresis 하는 동안 DNA 파손 정도를 comet 분석으로 평가한 것이다. 도 6c는 복제 스트레스가 적용된 후, HCT116 세포에서 염색체 이상을 분석한 것이다. siCTRL 또는 siTTP로 도입된 세포는 4mM HU 또는 20uM 시스플라틴으로 처리한 후 0.1μg/ml colcemid로 배양하였다. 대표적인 이미지는 Giemsa로 염색된 중기 단계에서의 확산을 나타낸 것이며, 화살표는 비정상적인 염색체를 나타낸다. 각 실험 당 총 100번의 분열 중기 단계가 관찰되었다. 도 6d는 사멸세포를 세포 사멸인자인 cleaved caspase 3로 면역 형광 염색(immunofluorescence)하여 검출한 것이다. A549 세포는 coverlip에서 배양되어 siCTRL 또는 siTTP로 도입되었고, 48시간 후 4mM HU 또는 20μM 시스플라틴으로 처리하여 고정 전 24시간 동안 회복시켰다. 이어서 cleaved caspase3으로 면역 염색(immunostaining)하였다. 각 실험에서 100개 이상의 세포를 무작위로 선정하여 cleaved-caspase-3 양성 세포의 비율을 확인하였다. 도 6e는 TUNEL 분석을 통해 복제 스트레스가 가해진 후, A549 세포 중에서 사멸세포(TUNEL, green) 대 모든 핵(Hoechst 33342, blue)의 형광 라벨을 나타낸 것으로, siCTRL 또는 siTTP로 도입된 세포는 4mM HU 또는 20μM 시스플라틴으로 처리하여 TUNEL 분석을 진행하였다. 각 실험에서, 200개 이상의 세포를 무작위로 선정하여 TUNEL 양성 세포의 비율을 확인하였다.
도 7은 HCT116 또는 ARPE-19 세포를 siCTRL 또는 siTTP 중 하나, 대조군 벡터 또는 siRNA 저항성 TTP 발현 벡터 중 하나와 공동 도입시키고, 표식 유전자에서 mRNA 수준을 RT-PCR을 통해 측정한 것이다.
도 8은 Claspin mRNA에서 ARE로 추정되는 위치를 표시하여 나타낸 것이다.
도 9는 siCTRL 또는 siTTP로 도입된 세포를 2시간 동안 EdU 라벨링하고 채취한 후, 세포들을 Alexa 488 azide 화합물로 염색하여 EdU 합성 여부를 확인하였다. 그 후 프로피듐 요오드화합물(PI)로 염색하여 DNA를 검출하여, Y축에 EdU 합성, X축에 총 DNA로 대표적인 그래프를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 트리스테트라프롤린(tristetraprolin, TTP) 억제제를 포함하는 DNA 복제 저해성 항암제 내성암의 항암 보조제에 관한 것이다.
트리스테트라프롤린 억제제는 트리스테트라프롤린의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 물질이다.
트리스테트라프롤린은 DNA 손상에 반응하여 선택적으로 ATR-CHK1 활성을 조절하는 것으로, ATR-CHK1 기능이 복제 스트레스에 반응하여 분기점의 속도를 늦추고, 정지된 분기점의 안정성을 유지하고 재시작을 하기 위해 TTP가 필요하다. 또한, Claspin mRNA의 전사 후 조절을 통해 ATR-CHK1의 활성을 조절할 수 있는데, TTP는 Claspin ARE1에 대해 직접 결합하여 Claspin mRNA의 안정화를 유지시킨다. TTP는 Claspin에 의존하여 복제 분기점 속도를 조절할 수도 있다.
ATR-CHK1 경로는 복제 스트레스 반응에서 중요한 작용을 한다. ATR-CHK1 경로가 활성화되면, 세포가 스트레스에서 살아남고 DNA 복제를 충실히 완료할 수 있도록 돕고, 복구 시스템에 의해 손상이 허용되거나 제거된 후 정지된 복제 분기점이 재시작 할 수 있도록 관여한다.
상기 DNA 복제 저해성 항암제는 암세포가 DNA를 복제하는 것을 방지하여 항암효과를 나타내는 것으로, 암세포의 DNA 복제 스트레스를 가중시켜 항암 효과를 나타낸다. 본 발명에서 항암제는 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil, 5-FU), 젬시타빈(Gemcitabine), 시스플라틴(cisplatin) 등일 수 있다.
본 발명의 DNA 복제 저해성 항암제 내성암은 DNA 복제 저해성 항암제를 쓰는 환자군에서 DNA 복제 저해성 항암제를 지속적으로 사용 시, 기존의 용량대로 치료를 유지하여도 치료 효과가 감소하거나 부작용이 나타나는 항암제 내성이 생기는 경우를 의미할 수 있다. 구체적으로, 암세포에 대한 DNA 복제 스트레스가 해소되지 않아야 암세포 사멸 효과가 발생하는 것인데, 상기와 같이 항암제에 내성이 생기면 복제 스트레스가 이전에 비해 극대화 되지 않고 일부 해소되어 항암제에 의한 치료 효과가 감소하게 될 수 있다.
본 발명의 항암 보조제는 트리스테트라프롤린 억제제를 포함함으로써 트리스테트라프롤린의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 것으로, 그 자체로는 항암 활성을 나타내지 않으나, 항암제와 함께 사용될 경우 항암제에 의한 복제 저해 효과를 보조 또는 개선할 수 있다. 전술한 바와 같이, 항암제를 지속적으로 사용하게 되면 항암제에 대해 내성이 생겨 기대되는 암세포의 DNA 복제 저해 효과를 충분히 발휘하지 못하게 될 수 있고, 이 경우 트리스테트라프롤린의 발현 또는 활성을 억제하여 복제 스트레스를 극대화하여 항암제의 DNA 복제가 저해되는 효과 및 항암 보조제에 의한 복제 스트레스를 가중시켜 암세포 DNA의 복제를 저해하는 항암 효과를 나타낼 수 있는 것이다.
트리스테트라프롤린 억제제는 트리스테트라프롤린의 활성 또는 발현을 저해하는 것이라면 그 종류는 제한되지 않으며, 예를 들면 siRNA일 수 있다. 이는 예를 들면 서열번호 1 또는 2의 서열을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 DNA 복제 저해성 항암제 내성암의 항암 보조제에서 상기 내성을 나타낼 수 있는 암은 고형암일 수 있고, 바람직하게는 폐암, 난소암, 대장암, 결장암, 췌장암, 간암, 자궁 경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 자궁암, 방광암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이며, 보다 바람직하게는 대장암 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 항암 보조제는 DNA 복제 저해성 항암제와 병용 투여될 수 있다. 항암제와 병용 투여 시 투여 순서는 특별히 한정되지 않으며, 항암제와 동시 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명은 트리스테트라프롤린 억제제; 및 DNA 복제 저해성 항암제에 대한 내성 암 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 트리스테트라프롤린을 억제하는 억제제 및 DNA 복제 저해성 항암제로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 트리스테트라프롤린 억제제는 트리스테트라프롤린의 발현 또는 활성을 억제할 수 있다.
트리스테트라프롤린 억제제는 전술한 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항암제는 전술한 종류를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 내성을 나타낼 수 있는 암의 종류는 전술한 바와 같으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항암 보조제는 약제학적 제제로 제조될 수 있고, 상기 약제학적 제제는 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 및 부형제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수 있다. 상기 제제는 분산제 또는 안정화제를 더 포함할 수 있다.
필요에 따라, 상기 약제학적 제제는 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 항암 보조제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있고, 목적하는 바에 따라 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 항암 보조제는 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 항암 보조제의 투여량은 투여되는 질환 종류 및 중증도, 환자의 연령 및 성별, 약물에 대해 내성을 나타내는 정도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정되며 상기 요소를 모두 고려하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들면, 약 0.0001 내지 100mg/kg, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg일 수 있으며, 필요에 따라 상기 투여량을 수회에 나누어 일정시간 간격으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 조성물 중 총 중량에 대하여 상기 트리스테트라프롤린 억제제 및 DNA 복제 저해성 항암제를 0. 001 중량% 내지 99.9 중량%, 구체적으로 0.1 중량% 내지 99 중량%, 더욱 구체적으로 1중량% 내지 50 중량% 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 앞서 예시된 방법으로 트리스테트라프롤린 억제제 및 DNA 복제 저해성 항암제를 포함할 수 있고, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 약학적 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 덱스트린, 말토덱스트린, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제되나, 이에 제한되지 않는다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며 이에 제한되지는 않으나, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물의 형태, 투여경로 및 투여기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다. 구체적으로 1일 1μg/kg 내지 400mg/kg으로, 더욱 구체적으로는 1mg/kg 내지 200mg/kg으로 투여할 수 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 트리스테트라프롤린 유전자 또는 그 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 DNA 복제 저해성 항암제 내성 진단용 조성물을 제공한다.
상기 물질은 TTP mRNA 또는 그 단백질을 검출할 수 있다면 제한되지 않는다.
상기 물질은 서열번호 4 및 5로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다. 다만, 서열은 이에 한정되는 것은 아니며 TTP 유전자의 발현을 측정할 수 있는 물질이라면 그 종류는 제한되지 않는다.
본 발명에서 '프라이머'란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
상기 물질은 항체, 압타머, DNA, 단백질, 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 하나일 수 있다.
본 발명에서, "항체"란 항원성 부위에 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 마커 단백질인 NMI에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 및 재조합 항체를 모두 포함할 수 있다.
상기 모노클로날 항체는 당해 분야에 널리 공지된 하이브리도마 방법, 또는 파지 항체 라이브러리기술을 이용하여 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
상기 폴리클로날 항체는 상기한 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 것을 포함하는, 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 폴리클로날 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
또한, 본 발명의 항체에는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간항체 등의 특수항체도 포함될 수 있다.
상기 "펩티드"는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.
상기 "앱타머(aptamer)"란, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.
상기 항암제는 전술한 바와 같다.
본 발명은 상기 조성물을 포함하는 DNA 복제 저해성 항암제 내성 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 트리스테트라프롤린 유전자 또는 그 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함할 뿐만 아니라, 그 키트가 이용하는 트리스테트라프롤린 유전자 또는 그 단백질 발현량을 측정하는 분석 방법에 적합한 하나 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다.
상기 키트는 트리스테트라프롤린 유전자 또는 단백질의 발현량을 측정하기 위한 키트일 경우, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 이외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(dEPC water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인　프라이머　쌍을 포함할 수 있다.
상기 키트는 트리스테트라프롤린을 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오티드의 단편 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 물질의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차　항체, 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질은 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)(ABTS) 또는 o-페닐렌디아민(OPD), 테트라메틸 벤지딘(TMB) 등이 사용될 수 있다.
상기 키트는 트리스테트라프롤린 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 항암제 내성 진단용 마이크로어레이(microarray)일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 상기 지표인자를 이용하여 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 키트는 환자 시료 내 트리스테트라프롤린 유전자 또는 그 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제뿐만 아니라, 발현 수준 분석에 적합한 한 종류 이상의 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 검출 라벨로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
구체적인 일례로, 상기 키트는 ELISA 키트, 샌드위치 ELISA등 다양한 ELISA 방법을 구현하기 위하여, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. 이러한 ELISA 키트는 상기 단백질들에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 트리스테트라프롤린에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 재조합 항체일 수 있다.
또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
이 외에도, 상기 키트는 웨스턴 블롯, 면역침전분석법, 보체 고정 분석법, 유세포분석, 또는 단백질 칩 등을 구현하기 위한 키트일 수 있으며, 각 분석 방법에 적합한 부가적인 구성을 추가로 포함할 수 있다. 이 분석 방법들을 통하여, 항원-항체 복합체 형성량을 비교함으로써 항암제 내성을 진단할 수 있다.
본 발명은 진단 대상으로부터 분리된 시료 내의 트리스테트라프롤린 유전자 또는 그 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 DNA 복제 저해성 항암제 내성 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공할 수 있다.
상기 진단 대상은 현재 DNA 복제 저해성 항암제를 이용하여 치료하고 있거나, DNA 복제 저해성 항암제를 이용하여 치료한 경험이 있는 환자, 그 외 DNA 복제 저해성 항암제 내성 진단을 위한 정보를 제공받고자 하는 환자 등으로서, 바람직하게는 대장암 또는 폐암을 진단 받은 환자일 수 있다.
상기 암은 고형암일 수 있고, 바람직하게는 폐암, 난소암, 대장암, 결장암, 췌장암, 간암, 자궁 경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 자궁암, 방광암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이며, 보다 바람직하게는 대장암 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다.
상기 시료는 진단 대상으로부터 분리된 것으로서, 그 예로는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 또는 뇨일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 DNA 복제 저해성 항암제로 치료하는 환자군에서 상기 항암제 투약이 지속적으로 동일한 항암효과를 낼 수 있는지를 예측하는데 사용하기 위한 물질로서, 진단 대상으로부터 분리된 시료에 처리하여 시료 내의 트리스테트라프롤린 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하여 항암제에 대한 반응성을 예측하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 측정된 발현 수준이 대조군 대비 높으면 상기 진단 대상이 DNA 복제 저해성 항암제 내성이 대조군 대비 높다고 판단할 수 있다. 예를 들어, DNA 복제 저해성 항암제를 투여하는 환자군의 특정 환자에서 분리된 시료 내의 트리스테트라프롤린 유전자 또는 그 단백질의 발현량이 다른 환자 대비 높은 경우, 그 환자는 다른 환자에 비해 상기 항암제에 대한 내성이 있다고 판단할 수 있다.
상기 측정은 트리스테트라프롤린 유전자 또는 그 단백질을 검출하는 물질을 상기 시료에 처리하여 수행되는 것일 수 있다.
상기 트리스테트라프롤린 유전자 또는 그 단백질을 검출하는 물질은 앞서 예시한 범위 내의 것일 수 있다.
상기 진단 대상 및 항암제는 전술한 바와 같다.
상기 트리스테트라프롤린 유전자 또는 그 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법으로서 트리스테트라프롤린을 코딩하는 유전자의 전사물질인 mRNA의 시료 내 농도 또는 상기 트리스테트라프롤린 단백질의 시료 내 농도를 측정하는 방법을 택할 수 있으나, 이에 제한되지 아니하고, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법을 택하여 수행할 수 있다.
상기 mRNA의 시료 내 농도를 측정하는 방법으로서 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅 (Northern blotting) 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단백질의 시료 내 농도를 측정하는 방법으로서 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 면역탁본검사, 샌드위치 측정법(sandwich assay), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색(immunohistochemistry), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS(fluorescence-activated cell sorting), 웨스턴 블롯팅, 유체 세포 측정법(flow cytometry), 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있고, 바람직하게는 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)를 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예 1. 트리스테트라프롤린(TTP) 녹다운에 의해 유전 독성 스트레스에 반응한 CHK1의 인산화 성능 감소 확인
ATR과 ATM은 DNA 손상을 인식하는 kinase로, 각각 단일 가닥의 절단 및 DSB(Double strand break)를 감지하여 유전 독성 스트레스로부터 게놈 완전성을 보호하는데 중요한 역할을 한다. DNA 손상에 대한 반응으로 TTP의 기능을 확인하기 위해, ATR의 판독치로서 CHK1(p-CHK1)과 CHK2(p-CHK2)의 인산화 수준을 분석하였다.
서열번호 1 또는 2로 이루어진 siRNA로 TTP를 고갈시킨 후, UV 조사 시 p-CHK2가 아닌 p-CHK1에서 상당한 하향조정이 관찰되었으며, 이는 일반적으로 처리 2시간 후에 P-CHK1과 p-CHK2 양쪽의 상향조절에서 볼 수 있듯이 ATR 경로와 ATM 경로의 활성화를 유발하였다(도 1a). 이러한 결과는 TTP가 ATR-CHK1 경로에 관련될 수 있음을 나타낸다.
또한, p-p53, γH2AX 등 CHK1 이외의 주요 ATR 기질을 분석한 결과, 이들 기질로부터의 변화는 거의 없었다(도 1a). 중요한 것은, TTP 결핍 세포의 siRNA 내성 TTP의 이소성 발현으로, 대조군 세포에 비해 UV에 대한 반응에서 p-CHK1의 정도를 완전히 회복시켰다(도 1b). 면역 결핍 세포에서 외인적 DNA 손상이 관찰되지 않은 상태에서 ATR 기질의 인산화는 유의하게 나타나지 않은 반면(도 1c), 면역 세포 화학 분석(immunocytochemistry analysis) 결과 UV 조사 시, CHK1 인산화에 TTP가 선택적으로 필요한 것으로 확인되었다(도 1c, 1d). 또한, ATM(KU55933) 또는 DNA-PK 억제제(NU7026)가 아닌, ATR 억제제(VE-822)만 존재하는 경우 TTP 결핍 세포에서 잔류 p-CHK1 신호가 사라졌다(도 1e). 이를 토대로 TTP가 ATR-CHK1 의존성 DNA 손상 반응을 조절한다는 것을 확인할 수 있다. CHK1은 서열번호 8 및 9의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 통해 증폭되었다.
그 후, 본 연구에서 디옥시뉴클레오사이드 삼인산염 풀(deoxynucleoside triphosphate pool)을 고갈시키는 또 다른 CHK1 인산화 유발 시약인 HU(Hyroxyurea; Sigma-Aldrich)로 세포를 처리하여, RSR(복제 스트레스 반응)을 유도하였다. HU 처리 후, 2시간 동안 대조군 세포는 p-CHK1를 확실히 형성하는 것으로 보였으나, TTP 결핍 세포는 총 CHK1 또는 ATR 단백질 수치를 변경하지 않고, 손상된 p-CHK1를 형성하는 것을 확인하였다(도 1f).
실시예 2. 복제 스트레스 반응(RSR, replication stress response)에서 TTP 역할의 확인
(1) 복제 스트레스 반응에 있어 ATR-CHK1 경로는 중요한 작용을 하고, 일단 활성화되면 세포가 스트레스 상황에서 살아남고 DNA 복제를 충실히 완료할 수 있도록 돕는다. 상기 실시예 1과 같이, TTP가 ATR-CHK1 활성화에 관여하는 것은 확인되었으므로, 뉴클레오티드 유사체의 합성에 의존하는 복제 스트레스 중 가장 정확한 판독치인 DNA 섬유 분석(DNA fiber analysis)을 사용하여 복제 분기점에서 TTP의 효과에 대해 검토하기로 하였다. 복제된 DNA는 20분 동안 IdU로 라벨을 부착한 후, 20J/m2 UV에 노출되거나 모의처리 되었고, 추가적으로 40분 동안 CldU 라벨을 부착하였다.
그 결과, 대조군(서열번호 3으로 이루어진 siRNA를 도입시킨 군, 1.92)과 TTP 결핍(1.94) 세포 모두 CldU 라벨 부착 섬유에서 ldU 부착 섬유보다 거의 두 배 더 긴 것을 확인할 수 있었고, 모의 처리한 세포에서 CldU: ldU 비율의 평균 값의 큰 차이는 없었다(도 2a). UV를 조사하게 되면, ATR이 관여하는 S상 체크포인트의 내부를 자극해 손상이 복구될 때까지 DNA 합성의 연장 속도를 늦출 수 있다. 예상대로 UV 처리는 대조군 세포에서의 CldU: ldU 비율의 평균이 상당히 감소하여 0.75에 가까운 값을 나타냈지만, TTP 결핍 세포(1.81)는 모의 처리된 CldU: IdU 비율에 비하여 감소를 보이지 않았다(도 2a). 이러한 결과는 ATR-CHK1 기능이 복제 스트레스에 반응하여 분기점의 속도를 늦추는데 TTP가 필요하다는 것을 나타낸다.
(2) 또한, ATR-CHK1 경로는 복구 시스템에 의해 손상이 허용되거나 제거된 후 정지된 복제 분기점이 재시작할 수 있도록 관여한다. TTP가 분기점의 재시작에 관여하는지 확인하기 위해, 본 연구에서는 IDU와 CldU를 라벨링하는 과정 사이에 2시간 동안 세포에 4mM HU를 처리했다. 분기점의 재시작 비율을 정량화하기 위해, 온전한 ssDNA(파란색)에서 정지된 분기점의 수(ldU 전용 fiber)가 복제 분기점의 총 수로 표준화되었다.
그 결과, TTP 결핍 세포는 대조군 세포보다 약 2배의 정지된 분기점을 생성하였으며, siRNA 저항성 TTP의 재발현이 이 결함을 상쇄했다(도 2b). 정지된 분기점이 다시 시작되지 않으면, S상으로의 진행이 어려워질 수 있다. 실제로, DNA 합성이 재개된 세포의 수를 평가하기 위한 EdU 통합 분석에서, 대조군과 TTP가 녹다운된 세포에서 EdU 양성세포가 각각 50%와 10%의 비율로 명백한 차이가 나타났다(도 2c).
(3) 정지된 분기점의 보호 및 복구에 TTP가 관여하는지를 확인하기 위해, DNA 복제 과정에서 순차적으로 20분 동안 IdU와 CldU 라벨을 각각 부착하고, 이어서 6시간 동안 HU 처리를 하여 복제 분기점을 정지시켰다. 그리고 나서 분기점의 기능이 저하된 것을 나타내는 CldU fiber가 상대적으로 축소된 것을 분석하였다.
그 결과, 도 2d에 제시된 바와 같이 대조군 세포의 복제 분기점은 1.0에 가까운 0.8의 CldU: IdU 중간 값 비율을 나타냈고, 반면에 TTP 결핍 세포는 0.67로 비율이 현저히 감소한 것을 보였다. 이는 RSR 중에 정지된 분기점의 안정성과 재시작을 위해 TTP가 필요하다는 것을 나타낸다.
실시예 3. Claspin mRNA의 안정화에 대한 TTP의 역할 확인
(1) 최근의 연구 결과에 의하면 ATR-CHK1 경로에 대한 잠재적인 조절자로 TTP가 포함되었고, 이전 연구 결과에 의하면 복제 스트레스를 받는 ATR 의존성 CHK1 인산화의 핵심 매개자로 Claspin을 입증하였는데, 이러한 두 연구 결과의 결합에 의하면 TTP가 Claspin mRNA의 전사 후 조절을 통해 ATR-CHK1의 활성을 조절할 수 있다는 의미를 나타낸다.
이를 확인하기 위해, 외인성 DNA 손상이 없을 때(mock 조건)와 UV 노출 2시간 후에 CHK1 인산화가 최고조에 달했을 때 Claspin mRNA의 양을 확인하는 정량적인 RT-PCR을 사용하였다(도 1). Claspin mRNA의 증폭에는 서열번호 6 및 7의 프라이머 세트를 이용하였다. DNA 손상이 있는 경우와 없는 경우 모두 TTP 결핍 세포에서 Claspin mRNA 의 총량이 약간 감소하는 것이 확인되었고, 감소된 양은 TTP가 재발현을 되면서 거의 완전히 회복되었다(도 3a). 따라서 Claspin mRNA 양의 동적 변화는 TTP mRNA의 세포농도(도 3a)와 높은 상관관계가 있다는 것을 확인할 수 있다.
(2) TTP가 고갈되면 Claspin mRNA의 반감기는 적당히 감소하는 반면, TTP 고갈 세포에서 siRNA(서열번호 1 또는 2로 이루어진 siRNA) 저항성 TTP가 과발현되면 반감기가 상당히 증가한다(도 3b). 이는 Claspin mRNA의 TTP 의존적 조절은 UV 손상이 있을 때 관찰되는 것이고, Claspin mRNA의 안정화를 위해 TTP가 필요하다는 것을 나타낸다.
또한 두 개의 서로 다른 인간 세포주인 HCT116(대장암)와 ARPE-19(정상 상피 세포)로 유전 독성 스트레스에 반응한 Claspin mRNA 안정성의 규제에 대한 TTP 영향을 조사하였고(도 7), 이러한 세포에서도 Claspin mRNA 안정성에 대한 TTP 매개 조절이 적용되고 있다는 것을 밝혀냈다. 다만, 이 표현형은 세포 주에 의존하지 않는다.
(3) Claspin mRNA는 TTP가 결합하는 위치로 추정되는 3'UTR에서 4개의 보존된 ARE를 포함한다(도 8). TTP가 Claspin mRNA의 3'UTR에 직접적으로 결합할 수 있는지를 확인하기 위해, TTP 결합 RNA는 항TTP 항체로 면역침강반응(immunoprecipitation)을 하였고, 4개의 다른 ARE는 역전사 PCR에 의해 증폭되었다. GAPDH mRNA는 음성 대조군으로 사용된 것으로, 서열번호 10 및 11의 프라이머 세트로 PCR에 의해 증폭되었다.
상기 역전사 PCR에서 ARE1은 서열번호 12 및 13의 프라이머 세트, ARE2는 서열번호 14 및 15의 프라이머 세트, ARE3은 서열번호 16 및 17의 프라이머 세트, ARE4는 서열번호 18 및 19의 프라이머 세트를 이용하여 증폭시켰다.
그 결과, 4개의 ARE 중 Claspin mRNA의 정지 코돈에 가장 가까운 ARE1 만이 성공적으로 증폭되었다(도 3c). Claspin mRNA의 안정화가 실제로 TTP의 Claspin ARE1에 대한 직접 결합에 의한 것인지 확인하기 위해, TTP 결핍 및 TTP 과발현 세포를 야생형(ARE1WT) 또는 돌연변이 Claspin ARE1(AREMut)을 포함하는 발광효소 리포터 유전자로 도입시켰다.
Claspin ARE1WT로 발광효소 mRNA를 발현하는 세포에서, 발광효소의 활성은 TTP 고갈 후 약 5배 감소한 것을 확인하였다(도 3d). 또한, 대조군 또는 TTP 녹다운 세포에서의 TTP 과발현은 발광효소 신호를 크게 증가시켰다(도 3d). 반면에, ARE1Mut 세포에서 TTP의 과발현은 발광효소 활성을 유발하지 못했다(도 3d).
이는 TTP가 3'UTR의 ARE1에 직접 결합하여 Claspin mRNA의 발현을 촉진한다는 것을 나타낸다. 또한, Claspin의 단백질 수준이 유전 독성 스트레스의 유무에서 TTP의 세포 농도에 대해 엄격히 통제되고 있다는 것을 확인했다(도 3e). 따라서 TTP는 3'UTR의 안정화를 통해 Claspin mRNA의 정도(level)를 유지한다는 것을 알 수 있다.
(4) 다음으로 TTP가 복제 스트레스 반응을 조절하는 것이 실제로 Claspin에 의해 매개되는지 확인하기 위해, CHK1 인산화, 복제 분기점 감속 및 Claspin 결핍세포에 대한 Claspin 과발현의 효과를 확인하였다. TTP가 고갈된 세포에서 감소된 CHK1 인산화는 Claspin 과발현에 의해 완전히 복원되었다(도 4a). Claspin 결핍 세포는 세포에 siClaspin(서열번호 20)을 도입하여 만든 것이고, 이후 siRNA 저항성 Claspin을 발현하는 벡터로 도입하여 Claspin을 과발현 시킨 것이다. 또한, DNA 손상에 따른 TTP나 Claspin 결핍 세포의 손상된 분기점 감속 및 분기점 보호도 Claspin 과발현에 의해 성공적으로 복구되었다(도 4b, 4c).
실시예 4. 비활성 세포에서 복제 분기점의 연장에 대한 TTP의 역할 확인
도 9와 같이, Claspin 녹다운 세포의 세포주기와 유사하게, TTP 녹다운 자체가 비활성세포에서 세포 주기 진행을 방해하지 않는 다는 것을 확인하였다. 그러나 일반적으로, Claspin은 S상에서 척추동물 세포의 복제 분기점이 안정적으로 연장되기 위해 필요하다. 본 연구에서는 TTP가 DNA 손상 이후뿐 아니라 방해 받지 않는 조건에서의 Claspin 발현을 조절한다는 것을 확인하였고(도 9), 이것은 TTP가 매개한 Claspin 조절이 비활성 세포에서 복제 분기점의 진행에도 관여할 수 있다는 가능성을 의미한다. 이를 확인하기 위해 TTP 및 Claspin 결핍 세포에서의 복제 분기점 속도를 DNA fiber 분석법으로 확인하였다 (도 5a).
그 결과 대조군 세포의 평균 분기점 속도는 0.36μm/min인 반면, Claspin 결핍 세포의 분기점 속도는 0.22μm/min로 앞서 보고한 바와 같이 상당한 감소를 나타낸다. TTP의 고갈은 분기점 속도(0.21μm/min)의 감소를 초래했는데, 이는 Claspin 결핍 세포에서 볼 수 있는 감속과 같다(도 5b). 그리고 Claspin과 TTP가 동시에 고갈되었을 때, 더 이상의 감소는 없었다. 따라서 TTP와 Claspin은 다른 방해가 없는 조건에서 복제 분기점 속도를 조절하는 경로가 동일한 것으로 보인다. TTP의 재발현은 TTP 결핍 세포의 분기점 속도를 복원하여 대조군 세포의 분기점 속도 (0.34μm/min)와 거의 유사한 수준으로 형성하였다.
마지막으로 Claspin 녹다운 세포의 TTP 과발현은 분기점 속도를 향상시키지 못했지만, TTP 녹다운 세포의 과발현은 분기점 속도를 완전히 회복시키는 결과를 가져왔으며, 이는 DNA 복제의 정상적인 진행 중 TTP가 Claspin에 의존하여 복제 분기점 속도를 조절한다는 것을 의미한다.
실시예 5. DNA DSB와 염색체 이상에 대한 TTP의 역할 확인
비정상적인 DNA 복제와 정지된 복제 분기점의 재시작을 실패하게 되면 DNA가 파괴되고 게놈의 불안정성이 촉진된다. 또한 ATR-CHK1 경로에서 기능 손실이 일어나는 경우, DNA 복제의 이상조절이 일어나거나 파괴되는 염색체 수가 많아지는 결과를 나타낸다. ATR-CHK1 경로에서 TTP의 역할과 정상적인 DNA 복제를 고려해 보았을 때, TTP 고갈이 분기점 파괴와 그에 따른 염색체 이상을 유발할 수 있다.
이를 평가하기 위해 HU 또는 시스플라틴(cisplatin)으로 인한 복제 스트레스에서 DNA DSB의 수를 측정했다. 동일한 세포에서 핵 53BP1과 γH2AX 초점(foci)은 HU 또는 시스플라틴 처리 후 DSB 수의 대용품으로 정량화되었다. 모의 고갈에 비교하여 TTP 고갈은 시스플라틴 또는 HU 처리 후 DSB가 상당히 더 많이 산출되었다(도 6a). 추가적으로 유전 독성 스트레스에 대한 TTP 결핍 세포에서 DNA 조각화를 나타내는 DNA 꼬리가 약 2배 더 긴 것을 관찰했다(도 6b).
또한, 염색체 안정성에 대한 TTP의 관여를 평가하기 위해 TTP를 녹다운 시킨 다음, 유사분열의 중기에 Giemsa 염색으로 처리하여 염색체 이상 발생 빈도를 측정하였다. 그 결과 시스플라틴 또는 HU로 처리된 대조군 보다 TTP 결핍 세포당 염색체 이상 수가 분열 중기 당 약 2배 증가하였고(도 6c), 유전 독성 스트레스가 없는 TTP 고갈 자체도 염색체 이상 정도를 크게 증가시켰다(도 6c).
TTP 고갈은 암세포를 세포 사멸에 더욱 취약하게 만들었고, HU 또는 시스플라틴(cisplatin) 처리 후 분리된 caspase3 분석(도 6d)와 TUNEL 분석(도 6e)에 의해 확인되었다. 이러한 결과는 복제 스트레스에 대한 게놈 안정성의 유지에 TTP가 필요하다는 것을 나타낸다.
<110> Dong-A University Research Foundation for Industry-Academy Cooperation <120> Anti-cancer adjuvant and pharmaceutical Composition for treating anticancer drugs resistance cancer and kit comprising the same <130> 20P03016 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siTTP-892 <400> 1 auccgacccu gaugaauaug ccagc 25 <210> 2 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siTTP-1209 <400> 2 ccccaagugu gcaagcucag uauuc 25 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siCTRL <400> 3 gcaagcatcg gctagtacgt a 21 <210> 4 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTP primer <400> 4 tccacaaccc tagcgaagac 20 <210> 5 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTP primer <400> 5 gacagtggga gacggaagag 20 <210> 6 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Claspin primer <400> 6 gtttgggttc agctcaggtg 20 <210> 7 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Claspin primer <400> 7 tcgtaggagg aaggagttgg 20 <210> 8 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHK1 primer <400> 8 gcctgaaaga gacttgtgag aag 23 <210> 9 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHK1 primer <400> 9 aaggccgaaa gattcccact acct 24 <210> 10 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer <400> 10 gtctcctctg acttcaa 17 <210> 11 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer <400> 11 accaccctgt tgctgta 17 <210> 12 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARE1 <400> 12 ggccactgat ttcaattctg 20 <210> 13 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARE1 <400> 13 ggaggcagag attgtggtga 20 <210> 14 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARE2 <400> 14 gacccttcct gggactgaat 20 <210> 15 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARE2 <400> 15 ccatggtggc cttctctcaa 20 <210> 16 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARE3 <400> 16 ttgagagaag gccaccatgg 20 <210> 17 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARE3 <400> 17 gcacactctc ttccaactgc 20 <210> 18 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARE4 <400> 18 cagagccagc ctatgtctca 20 <210> 19 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARE4 <400> 19 acagagccag cctatgtctc a 21 <210> 20 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siClaspin-494 <400> 20 aaccuugcuu agagcugagu cuuca 25

Claims (18)

  1. 트리스테트라프롤린 억제제를 포함하는 DNA 복제 저해성 항암제 내성암의 항암 보조제로,
    상기 트리스테트라프롤린 억제제는 siRNA(short interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(micro RNA), gRNA(guide RNA) 또는 ASO(antisense oligonucleotide)이고,
    상기 DNA 복제 저해성 항암제는 시스플라틴 또는 히드록시우레아이고,
    상기 내성암은 폐암 또는 대장암인, 항암 보조제.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 트리스테트라프롤린 억제제는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 siRNA인, 항암 보조제.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 항암 보조제는 DNA 복제 저해성 항암제와 병용 투여용인, 항암 보조제.
  6. 트리스테트라프롤린 억제제; 및 DNA 복제 저해성 항암제를 포함하는 DNA 복제 저해성 항암제 내성암 치료용 약학 조성물로,
    상기 트리스테트라프롤린 억제제는 siRNA(short interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(micro RNA), gRNA(guide RNA) 또는 ASO(antisense oligonucleotide)이고,
    상기 DNA 복제 저해성 항암제는 시스플라틴 또는 히드록시우레아이고,
    상기 내성암은 폐암 또는 대장암인, 약학 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 트리스테트라프롤린 억제제는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 siRNA인, 약학 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 트리스테트라프롤린 유전자 또는 그 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 DNA 복제 저해성 항암제 내성 진단용 조성물로,
    상기 물질은 항체, 압타머, DNA, 단백질, 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 하나이고,
    상기 DNA 복제 저해성 항암제는 시스플라틴 또는 히드록시우레아이고,
    상기 진단의 대상은 폐암 또는 대장암 환자인, 진단용 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 물질은 서열번호 4 및 5로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 조성물.
  12. 삭제
  13. 청구항 10 내지 11 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 DNA 복제 저해성 항암제 내성 진단용 키트.
  14. 진단 대상으로부터 분리된 시료 내의 트리스테트라프롤린 유전자 또는 그 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 DNA 복제 저해성 항암제 내성 진단을 위한 정보 제공 방법으로,
    상기 진단 대상은 폐암 또는 대장암 환자이고,
    상기 DNA 복제 저해성 항암제는 시스플라틴 또는 히드록시우레아인, 정보 제공 방법.
  15. 삭제
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 또는 뇨로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  17. 삭제
  18. 청구항 14에 있어서, 상기 측정된 발현 수준이 대조군 대비 높으면 상기 진단 대상이 DNA 복제 저해성 항암제 내성이 대조군 대비 높다고 판단하는, 방법.
KR1020200044834A 2020-04-13 2020-04-13 항암제 내성 암 치료용 항암 보조제, 약학 조성물 및 이를 포함하는 키트 KR102443953B1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200044834A KR102443953B1 (ko) 2020-04-13 2020-04-13 항암제 내성 암 치료용 항암 보조제, 약학 조성물 및 이를 포함하는 키트
PCT/KR2021/000458 WO2021210762A1 (ko) 2020-04-13 2021-01-13 항암제 내성 암 치료용 항암 보조제, 약학 조성물 및 이를 포함하는 키트
US17/965,460 US20230080252A1 (en) 2020-04-13 2022-10-13 Anticancer adjuvant and pharmaceutical composition for treating anticancer-agent-resistant cancer, and kit comprising same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200044834A KR102443953B1 (ko) 2020-04-13 2020-04-13 항암제 내성 암 치료용 항암 보조제, 약학 조성물 및 이를 포함하는 키트

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210127012A KR20210127012A (ko) 2021-10-21
KR102443953B1 true KR102443953B1 (ko) 2022-09-15

Family

ID=78085164

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200044834A KR102443953B1 (ko) 2020-04-13 2020-04-13 항암제 내성 암 치료용 항암 보조제, 약학 조성물 및 이를 포함하는 키트

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20230080252A1 (ko)
KR (1) KR102443953B1 (ko)
WO (1) WO2021210762A1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010129746A2 (en) 2009-05-06 2010-11-11 Curna, Inc. Treatment of tristetraproline (ttp) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ttp

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101036207B1 (ko) * 2009-09-09 2011-05-20 한국생명공학연구원 트리스테트라프롤린을 이용한 항암제 또는 혈관신생 억제제 스크리닝 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010129746A2 (en) 2009-05-06 2010-11-11 Curna, Inc. Treatment of tristetraproline (ttp) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ttp

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Genome Biology. 2020. Vol.21, Article 33.*
Oncogene. 2020. Vol.39, pp.3245-3257.*

Also Published As

Publication number Publication date
US20230080252A1 (en) 2023-03-16
KR20210127012A (ko) 2021-10-21
WO2021210762A1 (ko) 2021-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. LncRNA HCP5 promotes triple negative breast cancer progression as a ceRNA to regulate BIRC3 by sponging miR‐219a‐5p
Jung et al. Multiplex image-based autophagy RNAi screening identifies SMCR8 as ULK1 kinase activity and gene expression regulator
Zhang et al. Targeting KDM4A epigenetically activates tumor-cell-intrinsic immunity by inducing DNA replication stress
US20130059903A1 (en) Compositions and Methods for Characterizing Breast Cancer
US9260755B2 (en) Compositions and methods for characterizing and treating muscular dystrophy
US20150301067A1 (en) Methods and assays for facioscapulohumeral muscular dystrophy
US20140303120A1 (en) Methods for the treatment of cancer
KR102499891B1 (ko) 염증성 장질환 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도
Guo et al. Promoting role of long non-coding RNA small nucleolar RNA host gene 15 (SNHG15) in neuronal injury following ischemic stroke via the MicroRNA-18a/CXC chemokine ligand 13 (CXCL13)/ERK/MEK Axis
Federico et al. NCOA4 links iron bioavailability to DNA metabolism
ES2731232T3 (es) Método y composición farmacéutica para su uso en el tratamiento y la predicción del infarto de miocardio
ES2604108T3 (es) Bloqueo de la señalización de la CCL18 a través del CCR6 como opción terapéutica en las enfermedades fibróticas y el cáncer
ES2773631T3 (es) Tratamiento de tumores que expresan p53 mutante
WO2019158512A1 (en) Methods for the prognosis and the treatment of glioblastoma
KR102443953B1 (ko) 항암제 내성 암 치료용 항암 보조제, 약학 조성물 및 이를 포함하는 키트
Coskun et al. Regulation of laminin γ2 expression by CDX2 in colonic epithelial cells is impaired during active inflammation
JP2023537053A (ja) Ｘｐｒ１：ｋｉｄｉｎｓ２２０タンパク質複合体を介したがんにおけるリン酸塩調節不全の治療的標的化
US11674184B2 (en) Enhancing radiation sensitivity comprising administering PMVK inhibiting siRNA and shRNA
US20190105340A1 (en) Methods and compositions for targeting vascular mimicry
Nunes et al. RRM2 is a target for synthetic lethal interactions with replication stress checkpoint addiction in high-risk neuroblastoma
KR20150018276A (ko) ＴｒｋＡ를 이용한 백혈병 진단용 조성물
US20210164982A1 (en) Pharmaceutical use of actinin-4 involved in induction of cervical cancer
KR102543618B1 (ko) 전립선암의 엔잘루타미드 저항성 예측용 신규 바이오마커 및 이의 용도
US20230366033A1 (en) Methods for treating cancers with inhibitors targeting the role of grb2 in dna repair
WO2017119988A2 (en) Radioprotection by wnt activation

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant