CN114377020A - 乙酰丹参酮iia在制备治疗肺癌的药物中的应用及治疗肺癌的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了乙酰丹参酮IIA在制备治疗肺癌的药物中的应用及治疗肺癌的药物,属于药物技术领域。该方案提出了乙酰丹参酮IIA在治疗肺癌,尤其是治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的应用,其可通过使用小分子化合物乙酰丹参酮IIA来对抗NSCLC细胞对表皮生长因子受体,即酪氨酸激酶抑制剂(EGFR TKIs)的原发性和获得性耐药。本申请还进一步确定了ATA的分子靶点,并阐明了其抑制耐药性NSCLC细胞和肿瘤生长的机制。成分含有乙酰丹参酮IIA的药物有望发展成为治疗TKI耐药NSCLC的多靶点抗癌剂。
Description
技术领域
本发明涉及药物技术领域,具体而言,涉及乙酰丹参酮IIA在制备治疗肺癌的药物中的应用及治疗肺癌的药物。
背景技术
在所有类型的癌症中,肺癌的发病率和死亡率都是世界上最高的,2018年全球有210万新病例,约180万死亡病例。非小细胞肺癌(NSCLC)占所有新诊断的肺癌的85%,是该疾病的主要组织学亚型。表皮生长因子受体(EGFR)激活突变是最常见的驱动突变,可作为治疗NSCLC的目标。表皮生长因子受体靶向疗法的发展已经彻底改变了NSCLC的临床治疗。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR TKIs)的靶向治疗已经改善了NSCLC患者的预后。然而,由于对EGFR TKIs的原发性或获得性耐药,对这些药物的反应通常是不完全的和暂时的,这已成为NSCLC治疗过程中一个复杂的临床问题。
研究表明,各种机制可导致对EGFR TKIs的耐药性。具体来说,对EGFR TKIs产生原发性耐药的原因包括但不限于野生型EGFR的上调、KRAS或BRAF突变的激活、Bim缺失、一些罕见的EGFR突变、肿瘤微环境中的癌相关成纤维细胞(CAF)或NF-κB信号的激活。在大约30%的NSCLC患者中,在密码子12或13中观察到活化的KRAS突变,这与EGFR TKIs的耐药性有关。对EGFR TKIs的获得性耐药涉及多种机制,包括在具有L858R的初级突变的EGFR中获得T790M的第二个突变,旁路信号通路(如MET通路或HER2通路)的持续激活,肿瘤抑制因子的失活(如PTEN丢失或neurofibromin缺失),组织学上从上皮细胞过渡到SCLCs,上皮-间质转化(EMT),或肿瘤内异质性。对Erlotinib的获得性耐药主要是由T790M EGFR二级突变介导的,这发生在50-65%对EGFR TKIs耐药的NSCLC患者中。此外,在5-10%对EGFR TKIs产生获得性耐药的NSCLC患者中发现MET基因的扩增。因此,迫切需要新的策略和药物来克服NSCLC对EGFR TKIs的原发性和获得性耐药。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种乙酰丹参酮IIA在制备治疗肺癌的药物中的应用及治疗肺癌的药物以解决上述技术问题。
本申请可这样实现:
第一方面,本申请提供乙酰丹参酮IIA在制备治疗肺癌的药物中的应用。
在可选的实施方式中,乙酰丹参酮IIA用于制备治疗非小细胞肺癌的药物。
第二方面,本申请提供乙酰丹参酮IIA在制备肺癌细胞生长抑制剂中的应用。
在可选的实施方式中,乙酰丹参酮IIA用于制备非小细胞肺癌细胞生长抑制剂。
在可选的实施方式中,乙酰丹参酮IIA用于制备A549细胞生长抑制剂、H358细胞生长抑制剂、H1975细胞生长抑制剂和/或H1650细胞生长抑制剂。
第三方面,本申请提供乙酰丹参酮IIA在制备蛋白合成抑制剂中的应用。
在可选的实施方式中,蛋白合成抑制剂包括细胞周期相关蛋白合成抑制剂。
在可选的实施方式中,蛋白合成抑制剂对应的蛋白包括p70S6K、cyclin D3、AURKA、PLK1、cyclin B1、survivin、EGFR和MET中的至少一种。
第四方面,本申请提供乙酰丹参酮IIA在制备蛋白下游信号分子磷酸化水平抑制剂中的应用。
在可选的实施方式中,乙酰丹参酮IIA用于制备p70S6K和/或S6RP磷酸化抑制剂。
第五方面,本申请提供乙酰丹参酮IIA在制备p21转录激活剂或p53促进剂中的应用。
第六方面,本申请提供一种治疗肺癌的药物,药物的成分含有乙酰丹参酮IIA。
在可选的实施方式中,药物为治疗非小细胞肺癌的药物。
本申请的有益效果包括:
本申请提出了乙酰丹参酮IIA在治疗肺癌,尤其是治疗非小细胞肺癌的应用,其可通过使用小分子化合物乙酰丹参酮IIA来对抗NSCLC细胞对表皮生长因子受体,即酪氨酸激酶抑制剂(EGFR TKIs)的原发性和获得性耐药。成分含有乙酰丹参酮IIA的药物有望发展成为治疗TKI耐药NSCLC的多靶点抗癌剂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1和图9为实施例1中ATA有效抑制对EGFR TKIs原发或获得性耐药的NSCLC细胞的生长、迁移和侵袭结果图;
图2为实施例2中ATA大大降低了耐药NSCLC细胞中EGFR和MET的蛋白水平结果图;
图3和图10为实施例3中ATA通过减少p70S6K抑制耐药NSCLC细胞的生长结果图;
图4和图11为实施例4中ATA通过与p70S6K结合并增加其泛素化而降解p70S6K蛋白结果图;
图5和图12为实施例5中ATA通过影响p21和cyclin D3阻止细胞周期在G1/S期的进展结果图;
图6为实施例6中ATA通过降低AURKA的蛋白水平抑制耐药NSCLC细胞的生长结果图;
图7为实施例7中ATA通过降低p70S6K的蛋白水平影响细胞周期相关蛋白结果图,图13为实施例7中正常和耐药NSCLC细胞之间蛋白质水平的比较结果;
图8为实施例8中ATA抑制耐药性NSCLC衍生的异种移植肿瘤在小鼠的生长结果图,图14为实施例8中接受药物治疗后的体重结果,图15为实施例8中不同类型癌症的癌症样本和正常样本中p70S6K和AURKA的表达水平结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本申请提供的乙酰丹参酮IIA在制备治疗肺癌的药物中的应用及治疗肺癌的药物进行具体说明。
本申请提出乙酰丹参酮IIA在制备治疗肺癌的药物中的应用,尤其是用于制备治疗非小细胞肺癌的药物。
进一步地,本申请还提供了乙酰丹参酮IIA在制备肺癌细胞生长抑制剂中的应用,尤其是用于制备非小细胞肺癌细胞的生长抑制剂。
可参考地,乙酰丹参酮IIA示例性但非限定性地可用于制备A549细胞生长抑制剂、H358细胞生长抑制剂、H1975细胞生长抑制剂和/或H1650细胞生长抑制剂。
此外,本申请还提供了乙酰丹参酮IIA在制备蛋白合成抑制剂中的应用。
其中,蛋白合成抑制剂可包括细胞周期相关蛋白合成抑制剂。
可参考地,上述蛋白合成抑制剂对应的蛋白示例性但非限定性地可包括p70S6K、cyclin D3、AURKA、PLK1、cyclin B1、survivin、EGFR和MET中的至少一种。
在此基础上,本申请还提供了乙酰丹参酮IIA在制备蛋白下游信号分子磷酸化水平抑制剂中的应用(如用于制备p70S6K和/或S6RP磷酸化抑制剂)以及在制备p21转录激活剂或p53促进剂中的应用。
相应地,本申请还提供了一种治疗肺癌的药物,该药物的成分中含有乙酰丹参酮IIA。优选地,该药物为治疗非小细胞肺癌的药物。
需说明的是,本申请的保护范围还包括成分中含有乙酰丹参酮IIA的肺癌细胞生长抑制剂、蛋白合成抑制剂、蛋白下游信号分子磷酸化水平抑制剂、p21转录激活剂和p53促进剂。
更为具体的,肺癌细胞生长抑制剂为非小细胞肺癌细胞的生长抑制剂,如A549细胞生长抑制剂、H358细胞生长抑制剂、H1975细胞生长抑制剂和/或H1650细胞生长抑制剂等。蛋白合成抑制剂为细胞周期相关蛋白合成抑制剂,具体可以为p70S6K抑制剂、cyclinD3抑制剂、AURKA抑制剂、PLK1抑制剂、cyclin B1抑制剂、survivin抑制剂、EGFR抑制剂和/或MET抑制剂等。蛋白下游信号分子磷酸化水平抑制剂可以为p70S6K和/或S6RP磷酸化抑制剂。
发明人经研究得出:乙酰丹参酮IIA(ATA)在抑制耐药NSCLC细胞及其衍生的异种移植肿瘤的生长方面显示出比Erlotinib更强的效力。
ATA主要通过以下机制实现上述效果:首先,ATA可以在p70S6K的ATP结合位点和其结合以防止其磷酸化,其次通过增加p70S6K的泛素化导致其降解。由于p70S6K可以通过对S6核糖体蛋白(S6RP)的磷酸化来诱导核糖体处的蛋白质合成,因此ATA造成的p70S6K的显著减少导致几种细胞周期相关的新蛋白质合成大大减少,包括cyclin D3、aurora kinaseA、polo-like kinase、cyclin B1和survivin;并降低EGFR和MET的水平。此外,ATA增加了p53和p21蛋白的水平,从而阻止了G1/S期的细胞周期进程。由于p70S6K在肺肿瘤样本中含量较高,ATA降解p70S6K可以有效抑制TKI耐药肺癌细胞的生长,因此p70S6K可能成为治疗耐药NSCLC细胞的一个新靶点。
基于ATA可有效阻断对蛋白质合成和细胞增殖所必需的多种信号通路,因此,ATA有可能发展成为治疗TKI耐药NSCLC的多靶点抗癌剂。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
以下实施例所涉及的材料和方法如下:
细胞系和细胞培养
耐药性NSCLC细胞系A549和H358来自美国类型培养物库(ATCC),H1975和H1650细胞系来自中国澳门大学健康科学学院的Joong Sup SHIM教授。A549细胞在Dulbecco'smodified Eagle's培养基(DMEM)中培养,H358、H1975、H1650细胞在RPMI 1640培养基中培养。所有的培养基都补充了10%的胎牛血清(FBS)和100U/ml的青霉素-链霉素(均来自Gibco)。所有的细胞都在37℃的加湿培养箱中培养,并加入5%的CO2。
试剂
从Selleck Chemicals获得:Erlotinib(#S7786)、Afatinib(#S1011)、Osimertinib(#S7297)、LY294002(#S1105)、PF-4708671(#S2163)、rapamycin(#S1039)和MLN8237(#S1133)。从Sigma-Aldrich获得:Cycloheximide(#01810)和MTT(#M2128)粉末。
MTT实验
细胞以每孔3×103个的密度种在96孔板中,让其附着过夜,并用各种浓度的药剂处理。处理72小时后,每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL),平板培养4小时。用100μL的10%(w/v)SDS与0.01mol/L HCl溶液溶解结晶的甲臜24小时,然后用酶标仪在595nm处分光光度读取数值。IC50值是指在72小时抑制50%的细胞生长的药剂浓度,用GraphPad Prism 7软件计算。
克隆形成实验
细胞以每孔1×103的密度种在6孔板中,培养24小时。细胞用药物或DMSO处理10天,之后用1×PBS清洗细胞一次,然后用4%多聚甲醛固定20分钟,用0.1%结晶紫染色15分钟。拍摄每个孔中染色细胞的图像,用ImageJ软件对每孔的菌落数量进行量化。
球状体的形成实验
在超低附着力圆底96孔板(Corning,#7007)中,H1975的细胞密度为每孔500个细胞,H1650的密度为每孔1000个细胞。细胞在48小时内形成紧密的球状体后,暴露在各种药物处理下8天,每2天更换一次培养基并加入新鲜药物。每2天用(Carl Zeiss AxioObserver 7)拍摄球状体的图像。使用ImageJ软件计算球状体的面积。
细胞迁移和侵袭
细胞迁移和侵袭试验是在孔径为8微米的转孔室(Corning,#3422)中进行的。用不同浓度的ATA和Erlotinib处理细胞48小时,然后收集细胞并重新悬浮在无血清培养基中。将细胞(1×104)加入到转孔室的上侧,并在下侧加入含有10%FBS的新鲜培养基。让细胞在37℃下从室的上侧迁移到下侧,持续24小时。用4%的多聚甲醛固定细胞室的膜20分钟。用棉签轻轻去除留在膜上侧的细胞,用1%的结晶紫染色20分钟,将迁移到转孔室另一侧的细胞染色。然后将膜切下并固定在玻璃片上。用Leica M165-FC显微镜对每个玻片上的迁移细胞进行成像。对于transwell侵袭试验,Matrigel溶液(Corning,#356230)用无血清培养基稀释到三十分之一,并用于预涂室的上侧2小时,Matrigel凝固后,将细胞加入transwell室的上侧。下面的步骤与迁移试验相同。使用ImageJ软件对迁移和入侵的细胞进行量化。
蛋白印迹分析
细胞用PBS清洗一次,在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Sigma-Aldrich)的RIPA裂解缓冲液中冰冻30分钟。超声处理和离心后,用Bio-Rad公司的浓缩染料试剂(Bio-Rad)进行蛋白质测定,确定总蛋白浓度。每个样品的等量蛋白质(25-50微克)通过SDS-PAGE分离并电转到硝酸纤维素膜(GE Healthcare)。在膜上用1:1000稀释的特异性一抗进行检测,然后用1:2000稀释的HRP结合的二抗进行孵化。最后,用化学发光底物(Clarity Western ECL底物;Bio-Rad公司)检测免疫反应性。EGFR(#4267S)、MET(#8198S)、p-Akt(#9271L)、Akt(#9272S)、p-mTOR(#5536S)、mTOR(#2983S)、p-p70S6K(#9234S)、p70S6K(#2708S)、p-S6RP(#4857S)、S6RP(#2217S)、p-4E-BP1(#9455S)抗体。4E-BP1(#9644S),p53(#2527S),p21 waf1/Cip1(#2947S),Survivin(#2808S),Cyclin B1(#12231S),Cyclin D3(#2936S)和GAPDH(#2118S)均购自Cell Signaling Technology。Aurora A(#ab13824)和PLK1(#ab189139)抗体来自Abcam。
免疫荧光染色
用1×PBS洗一次生长在盖玻片上的细胞,用4%多聚甲醛固定20分钟,然后用0.3%Triton X-100透化20分钟。用3%BSA阻断1小时后,用EGFR(#4267S)、MET(#8198S)和p-S6RP(#4857S)抗体以1:100的稀释度在4℃孵育过夜,然后用Alexa Fluor 488结合的抗兔抗体(Thermo Fisher Scientific)以1:100稀释度孵育1小时。用Hoechst33342(ThermoFisher Scientific)标记细胞核15分钟后,用4-88(Calbiochem,Merck)将盖玻片安装到干净的玻璃显微镜载玻片上。免疫荧光染色的照片是在配备了采集ZEISS ZEN 2核心成像软件(均来自Carl Zeiss Microscopy GmbH)的共聚焦激光扫描显微镜(Carl ZeissConfocal LSM710)上获得的。
协同免疫沉淀(Co-IP)
在补充有蛋白酶抑制剂和去泛素化酶抑制剂N-乙基马来酰亚胺(Sigma-Aldrich)的IP裂解缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.6,150mM NaCl,1mM EDTA,1%Triton X-100,5%甘油)中,冰上打乱细胞30分钟。细胞裂解液被离心(16,000g,4℃,30分钟),300微升上清液与5微升抗p70S6K抗体(#sc-8418)在4℃孵育过夜。然后捕获免疫复合物,用15微升PierceProtein A/G Plus Agarose浆液(Thermo Fisher Scientific)在4℃下旋转沉淀4小时。将带有免疫沉淀物的树脂洗三次,用2×SDS样品缓冲液煮5分钟,最后加载到SDS-PAGE凝胶上进行Western印迹分析。
实时PCR
使用试剂(Thermo Fisher Scientific)分离总RNA,随后根据制造商的说明,使用iScriptTMcDNA合成试剂盒(Bio-Rad)逆转录成第一链cDNA。使用iTaqTMUniversal SYBR Green Supermix(Bio-Rad)在CFX96 TouchTM Real-Time PCR检测系统(Bio-Rad)上进行实时PCR,一式三份。使用ΔΔCT方法进行相对定量。对照样本被用作校准器,以计算处理过的样本中相关基因表达的折叠变化。每个实时定量PCR实验重复3次。用于实时PCR的引物列于表1。
表1实时PCR的引物
RNA测序分析
使用试剂(Thermo Fisher Scientific)从用ATA或对照处理48小时的A549细胞中提取总RNA。然后将RNA样品提交给Novogene公司(北京,中国)进行IlluminaHiseqPE150测序。
分子对接分析
进行分子对接分析以研究ATA和HTA与p70S6K(PDB ID:4RLO)的结合,这些都是从蛋白质数据库获得的。所有的对接都使用了AutoDockVina软件。
液相色谱-质谱法(LC-MS)分析
用2μM的ATA处理细胞0-6小时,密集洗涤后,收集细胞并按照使用p70S6K抗体的co-IP实验方案裂解。用两体积含有1mM DTT的冷乙腈处理co-IP拉出的免疫沉淀物。在以下条件下用LC-MS(Waters Xevo TQD)进行分析。A线流动相是浓度不断增加的乙腈(0分钟60%,1分钟至4分钟60%,5分钟90%),B线流动相是0.1%的甲酸,流速为0.4毫升/分钟。用乙腈作为阴性对照,用0.1μM的ATA标准品作为阳性对照。
细胞周期分析
细胞周期分析是使用标准的流式细胞仪协议进行的。简单地说,在ATA处理后,收获细胞,用1×PBS洗涤,然后用70%的预冷乙醇在4℃下固定30分钟。固定的细胞用1×PBS洗两次,重新悬浮在0.5mL 1×PBS中,含有50μg/mL碘化丙啶(PI)和100μg/mL RNase A,在37℃黑暗中30分钟。然后,在BD Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences,CA)下对细胞周期进行分析。流式细胞仪的数据用FlowJo软件(Tree Star)进行分析。
基于SiRNA的基因敲除
Lipofectamine 2000转染试剂(#11668019)购自Invitrogen(Waltham,USA),AllStars阴性对照(#1027280)siRNA购自Qiagen(Hilden,Germany)。Sip70S6K-1(5'to 3'sequence:CAUGGAACAUUGAGAAATT)和Sip70S6K-2(5'to 3'sequence:GGUUUUCAAGUACGAAAATT)siRNA是由我们自己设计。siRNA转染实验按照制造商的说明进行。简单地说,将3μL储存浓度为10μM的siRNA悬浮在250μL无血清培养基中,并与250μL含有6μLLipofectamine 2000的无血清培养基混合。转染混合物在室温下孵化20分钟。用胰蛋白酶消化细胞,将3×105个细胞悬浮在2.5mL的培养基中,并加入到60mm的培养皿中。将转染混合物滴加到培养皿中的悬浮细胞中。用抗p70S6K抗体进行Western印迹分析,评估基因沉默的效率。
基因过度表达
RPS6KB1质粒(pLV[Exp]-Puro-CMV>hRPS6KB1)和AURKA质粒(pLV[Exp]-Puro-CMV>hAURKA)均购自VectorBuilder。使用基于慢病毒的感染方法将质粒转染到宿主细胞。简而言之,239T细胞以8×105的密度在6孔板中播种。12-16小时后,用pMD2G(编码VSV G包膜蛋白)、pCMVR8.2(编码HIV-1Gag、Pol、Tat和Rev蛋白)以及目标质粒(pCDH、pRPS6KB1和pAURKA)转染细胞。4-6小时转染后,用新鲜的完全培养基替换转染液。36小时后收集含有病毒的上清液。肺癌H1650和A549细胞以2×105的密度在6孔板中播种24小时,将由239T细胞感染后产生的病毒与肺癌细胞孵化24小时,然后用新鲜培养基替换。用2μg/ml嘌呤霉素筛选细胞数天。
免疫组化
在裸鼠中形成的肿瘤异种移植组织在室温下用10%的中性缓冲福尔马林固定过夜,处理成石蜡块,随后以5微米的厚度切片。将组织切片和病人的肿瘤组织去掉石蜡,然后用柠檬酸盐缓冲液煮沸5分钟以暴露抗原。在阻断内源性过氧化物酶活性和非特异性抗体结合后,将切片与一抗在4℃下孵育过夜。根据制造商的说明,使用兔特异性HRP/DAB(ABC)检测IHC试剂盒(Abcam)来检测免疫反应性。用苏木精对切片进行轻度反染色。用蔡司Axiocam506彩色相机(Carl Zeiss Microscopy GmbH)在光学显微镜上获得免疫组化染色的彩色图像。
小鼠异种移植研究
细胞系异种移植实验在6周龄的雌性裸鼠中进行,将4×106A549细胞按1:1与Matrigel-基底膜基质(Corning)混合后注射到裸鼠皮下。让肿瘤生长至80毫米左右,随机选择小鼠接受ATA(25毫克/千克)或Erlotinib(25毫克/千克)治疗,每3天腹腔注射一次,持续31天。ATA使用25%的乙醇、60%的PEG300(Sigma-Aldrich)和15%的吐温80(Sigma-Aldrich)配制。Erlotinib是用5%DMSO、30%PEG300、5%Tween 80和60%H2O配制的。每3天通过体重计和卡尺测量小鼠体重和肿瘤体积。肿瘤体积(毫米3)用公式计算。π/6×长度(毫米)×[宽度(毫米)]2。在研究期间,对照组和治疗组中至少有6只小鼠被评估。所有小鼠在31天的药物治疗后被牺牲,收集肿瘤,并记录肿瘤重量。所有的动物研究都是按照澳门大学动物研究伦理委员会的要求进行的,并遵守了所有相关的伦理规定。
统计分析
所有的实验都进行了三次。数据以平均值±标准差(SD)表示。对照组和试验组的统计学意义由GraphPad Prism7的相关测试来确定。显著性表示如下。基于单因素或双因素方差分析,然后进行Tukey's多重比较检验或学生t检验,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001和****P<0.0001。
实施例1
ATA有效抑制对EGFR TKIs产生原发性或获得性耐药的NSCLC细胞的生长
选择四个耐药细胞株,其中A549和H358细胞对EGFR TKIs(如Erlotinib、Afatinib和Osimertinib)有原发性耐药,原因是野生型EGFR(wt-EGFR)和KRAS的激活突变。H1975细胞在EGFR中有两个突变(L858R和T790M),第二个突变使这些细胞对Erlotinib产生了抗性。H1650细胞有一个EGFR激活的突变(A746-A750缺失)和一个PTEN缺失的突变。由于PTEN的缺失,这些细胞对Erlotinib、Afatinib和Osimertinib三种抗EGFR药物产生了抗性(如表2所示)。
表2 Erlotinib和ATA在耐药NSCLC细胞中的IC50值
WT:野生型。
在三种EGFR TKIs中,比较ATA与第一代EGFR TKI:Erlotinib的生长抑制作用,MTT结果显示:在所有四个细胞系中,ATA处理比Erlotinib显著降低细胞活力(如图1中A所示)。Erlotinib在这些细胞中的IC50值为10-22μM,而ATA的IC50值介于1.3-1.8μM,比Erlotinib的IC50值低6-17倍(表2)。随后,测量用ATA、第二代EGFR TKI:Afatinib或第三代EGFR TKI:Osimertinib处理后所有四个细胞系的活力(如图9中A所示),并计算了相应的IC50值。对于A549、H358和H1650细胞,ATA的IC50值明显低于Afatinib和Osimertinib,而对于H1975细胞,ATA的IC50值明显高于这两种抑制剂(如图9中B所示)。
随后,比较ATA与三种抑制剂对菌落形成的抑制作用。结果显示:在1μM时,ATA对所有四个耐药细胞系的菌落形成的抑制作用比Erlotinib和Osimertinib要有效得多。在H358和H1650细胞中,ATA也显示出明显高于Afatinib的菌落形成抑制能力。重要的是,即使在0.125μM的低浓度下,ATA也几乎完全抑制了H358和H1975细胞形成菌落,并使H1650和A549细胞的菌落形成能力分别显著降低73%和42%(如图1中B所示)。
此外,球状体形成实验用于评价ATA在三维和非粘附条件下抑制两种具有获得性耐药性的NSCLC细胞系的生长能力。结果显示:ATA在1和2μM两种浓度下都能强烈抑制H1975和H1650细胞的球状体形成;在2μM时完全抑制这两种细胞系的球状体生长。相比之下,2μM的Erlotinib没有减少但明显增加了H1975细胞的球体大小,在H1650细胞中产生的抑制作用比ATA弱(如图1中C所示)。
最后,为了评估ATA在耐药NSCLC细胞中的抗转移潜力,进行了细胞迁移和侵袭试验。结果显示:1μM的ATA可以显著降低A549细胞的迁移和侵袭能力,分别为80%和88%。即使在0.5μM时,ATA也会对细胞迁移和侵袭产生明显的抑制作用,而Erlotinib则不产生这种作用(如图1中D和E所示)。
承上,四种体外实验的结果表明:ATA能有效地抑制对EGFR TKIs具有原发性或获得性耐药的NSCLC细胞的生长、迁移和侵袭。
图1中,(A)对应用不同浓度的ATA或Erlotinib处理A549、H358、H1975和H1650细胞72小时,然后,用MTT法测定细胞活力。****P<0.0001是基于双向方差分析,然后进行Sidak的多重比较检验。(B)对应A549、H358、H1975和H1650细胞用不同浓度的ATA、Erlotinib(1μM)、Afatinib(1μM)或Osimertinib(1μM)处理10天。用结晶紫对平板进行染色。显示了三个独立实验的代表图像。对形成的菌落进行量化(与对照组相比的相对菌落数)。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001和****P<0.0001是基于单因素方差分析和Tukey的多重比较试验。(C)对应H1975和H1650细胞球体分别用ATA(1或2μM)或Erlotinib(2μM)处理0至8天。显示了三个独立实验的代表图像。相对球体面积的量化值是从8个球体得到的平均值(N=8)。****P<0.0001是基于双向方差分析和Tukey的多重比较测试。比例尺,200μm。(D)对应用ATA(0.5或1μM)或Erlotinib(1μM)处理A549细胞24小时,迁移的细胞用结晶紫染色。迁移细胞的定量显示。****P<0.0001是基于单因素方差分析和Tukey的多重比较试验。比例尺,200μm。(E)对应用ATA(0.5或1μM)或Erlotinib(1μM)处理A549细胞24小时,入侵的细胞用结晶紫染色。侵袭细胞的定量显示。****P<0.0001是基于单因素方差分析,然后是Tukey的多重比较试验。比例尺,200μm。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。
图9中,(A)为用不同浓度的ATA、Afatinib或Osimertinib处理A549、H358、H1975和H1650细胞72小时,然后使用MTT测定法测定细胞活力。(B)为ATA、Afatinib和Osimertinib在A549、H358、H1975和H1650细胞中的IC50值。**P<0.01、***P<0.001和****P<0.0001基于双尾分析和t检验。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。
实施例2
ATA在降低耐药NSCLC细胞中EGFR和MET的蛋白水平方面比Erlotinib更有效
为了确定为什么ATA在抑制耐药NSCLC细胞的生长方面比Erlotinib更有效,本实施例比较了它们对本研究中使用的所有细胞系中EGFR和MET蛋白水平的影响。结果显示:Erlotinib处理明显增加了A549和H1650中EGFR的蛋白水平。然而,除了A549的EGFR蛋白水平外,ATA强烈降低了耐药NSCLC细胞的EGFR和MET蛋白水平(如图2中A所示)。
进一步地,为证实ATA是否可以通过降低EGFR和MET的水平来抑制耐药NSCLC的生长,用1或2μM的ATA处理A549、H358、H1975和H1650细胞48小时,Western blot结果显示:1或2μM的ATA使H358、H1975和H1650细胞中的EGFR蛋白水平大大降低了60-70%,2μM的ATA使所有四个细胞系的MET蛋白水平降低了70-90%(如图2中B所示)。免疫荧光染色图像进一步证实:ATA有效地降低了H1650细胞中EGFR蛋白的水平,并降低了A549和H1650细胞中MET蛋白的水平(如图2中C所示)。
为解释48小时ATA处理没有减少而增加A549细胞中的EGFR蛋白水平,在ATA处理后对其mRNA水平进行了测定。实时PCR结果显示:ATA处理48小时后,A549细胞中EGFR的mRNA水平明显增加,但不影响其他三个细胞系H358、H1975和H1650中EGFR或MET的mRNA水平(如图2中D所示)。这种短暂的EGFR mRNA水平的增加可能会导致A549细胞中ATA处理后其蛋白水平的增加。为了验证这一假设,将ATA的处理时间从48小时延长到72小时和96小时,发现在这些较长的时间内,ATA并没有明显提高A549细胞中EGFR或MET的mRNA水平(如图2中E所示)。并且,用2μM ATA处理A549细胞72或96小时可以降低细胞中EGFR和MET的蛋白水平达90%之多(如图2中F和G所示)。
承上,结果表明:ATA可以有效降低对EGFR TKIs原发或获得性耐药的NSCLC细胞中EGFR和MET的蛋白水平。
图2中(A)对应A549和H1650细胞用或不用Erlotinib(2μM)或ATA(2μM)处理48小时,通过Western blot分析测定EGFR和MET的蛋白水平。(B)对应用ATA(1或2μM)处理A549、H358、H1975和H1650细胞48小时,通过Western blot分析测定EGFR和MET的蛋白水平。(C)对应用ATA(1或2μM)处理A549和H1650细胞48小时,显示EGFR和MET免疫荧光染色的代表性共聚焦图像。比例尺,20μm。(D)对应用ATA(1或2μM)处理A549、H358、H1975和H1650细胞48小时,通过实时PCR测量EGFR和MET mRNA水平。EGFR和MET mRNA水平的量化显示。****P<0.0001是基于双向方差分析,然后进行Tukey的多重比较测试。(E)对应用ATA(1或2μM)处理A549细胞72和96小时,通过实时PCR测量EGFR和MET mRNA水平。显示了EGFR和MET mRNA水平的量化情况。(F)对应用ATA(1或2μM)处理A549细胞72和96小时,通过Western blot分析测定EGFR和MET蛋白水平。(G)对应用ATA(1或2μM)处理A549细胞72小时,显示EGFR和MET免疫荧光染色的代表性共聚焦图像。比例尺,20μm。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。
实施例3
ATA通过减少p70S6K来抑制耐药NSCLC细胞的生长
研究ATA对EGFR和MET的下游信号通路的影响,Western blot结果显示:ATA处理并没有明显降低大多数细胞系中p-Akt、Akt、p-mTOR和mTOR的水平,但大大降低了p70S6K蛋白及其磷酸化形式的水平。此外,ATA也明显减少了可被p70S6K磷酸化的S6核糖体蛋白(S6RP)的磷酸化;但ATA并没有大大降低S6RP蛋白的水平(如图3中A所示)。共聚焦免疫荧光染色也证实,ATA处理降低了A549和H358细胞中p-S6RP的水平(如图10中A所示)。
由于p70S6K对S6RP的磷酸化可以诱导核糖体的蛋白质合成,进行确定ATA对p70S6K的减少作用是否会影响新蛋白质的合成的实验,其结果显示:ATA明显抑制了A549和H1650细胞中新蛋白质的合成。特别是2μM的ATA几乎完全取消了新蛋白质的合成,取得了比环己胺(CHX,一种蛋白质合成抑制剂)更好的抑制效果(如图3中B所示)。除p70S6K外,还研究了ATA对真核启动因子4E结合蛋白1(4E-BP1)的影响。与它对p70S6K的影响相反,ATA对降低总的和磷酸化的4E-BP1的水平没有什么影响(如图10中B所示)。这些结果表明:ATA可能通过降低p70S6K的蛋白水平和抑制p70S6K和S6RP的磷酸化来抑制蛋白质的合成。
为确定ATA是否通过降低p70S6K的蛋白水平或抑制其磷酸化来抑制耐药NSCLC细胞的生长,比较ATA在A549和H1650细胞中降低p70S6K及其磷酸化形式水平的效果与PI3K(LY294002)、p70S6K(PF-4708671)和mTOR(rapamycin)抑制剂的效果。Western blot结果显示:ATA大大降低了p70S6K、p-p70S6K和p-S6RP的水平;相反,其他三种抑制剂并没有降低p70S6K的水平,而只是降低了p-p70S6K和p-S6RP的水平(如图3中C所示)。进一步地,比较ATA和三种抑制剂之间抑制蛋白质合成的功效。结果显示:在2μM时,LY294002和PF-4708671并不影响蛋白质的合成。尽管rapamycin使A549和H1650细胞的蛋白质合成减少了25-28%(如图3中D所示),但ATA在相同浓度下取得了更高的抑制率,达到85-99%(如图3中B所示)。这些结果表明,ATA比PI3K、p70S6K和mTOR的抑制剂更有效地阻止蛋白质的合成。进一步地,比较ATA和这三种抑制剂在A549和H1650细胞中的生长抑制作用。MTT结果显示:ATA对A549和H1650细胞的生长的抑制作用明显高于所有三种抑制剂(如图10中C所示)。
此外,耐药性NSCLC细胞在Erlotinib处理后表现出更高的p70S6K水平(如图3中E所示),这可能导致这些细胞对Erlotinib产生抗性。为了证实ATA通过减少p70S6K来抑制耐药NSCLC细胞的生长,在A549和H1650细胞中过表达p70S6K蛋白,并观察到其过表达提高了p70S6K、p-p70S6K、p-S6RP的水平,但不影响S6RP蛋白的水平(如图3中F所示)。随后用ATA处理这些细胞,发现这些细胞中p70S6K的过表达部分地逆转了ATA在二维培养中的生长抑制作用(如图3中G所示)。此外,p70S6K在A549和H1650细胞中的过表达明显逆转了ATA对集落形成的抑制作用(如图3中H所示)。
承上,研究结果表明:ATA对p70S6K有两种作用:抑制其磷酸化和降低其蛋白水平,而ATA可以通过减少p70S6K和抑制蛋白合成来抑制耐药NSCLC细胞的生长。
图3中(A)对应A549、H358、H1975和H1650细胞用ATA(1或2μM)处理48小时,通过Western blot分析测定p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、p-p70S6K、p70S6K、p-S6RP和S6RP蛋白质水平。(B)对应A549和H1650细胞分别用ATA(1或2μM)或蛋白合成抑制剂环己胺(CHX,35μM)处理48小时。使用click-iTTM HPG Alexa FluorTM 594蛋白合成检测试剂盒测定蛋白合成率。染色图像中德州红荧光的强度代表蛋白质合成的速率。蛋白质合成率的量化显示。****P<0.0001是基于单因素方差分析,然后进行Tukey的多重比较测试。比例尺,50μm。(C)对应A549和H1650细胞分别用PI3K抑制剂(LY294002,2μM)、p70S6K抑制剂(PF-4708671,2μM)、mTOR抑制剂(rapamycin,2μM)或ATA(2μM)处理48小时。通过Western blot分析测定p-p70S6K、p70S6K、p-S6RP和S6RP的蛋白水平。(D)对应A549和H1650细胞分别用PI3K抑制剂(LY294002,2μM)、p70S6K抑制剂(PF-4708671,2μM)或mTOR抑制剂(rapamycin,2μM)处理48小时。使用click-iTTM HPG Alexa FluorTM 594蛋白合成检测试剂盒测定蛋白合成率。染色图像中德州红荧光的强度代表蛋白质合成率。蛋白质合成率的量化显示。*P<0.05和**P<0.01是基于单因素方差分析,然后进行Tukey的多重比较测试。比例尺,50μm。(E)对应用或不用Erlotinib(2μM)或ATA(2μM)处理A549、H358、H1975和H1650细胞48小时,通过Western印迹分析测定p-p70S6K、p70S6K、p-S6RP和S6RP的蛋白水平。(F)对应A549和H1650细胞用空载体(EV)或p70S6K过表达(p70S6K-OE)质粒进行转染。空载体(EV)质粒被用作对照。通过Western blot分析测定p70S6K、p-p70S6K、S6RP和p-S6RP的蛋白水平。(G)对应用ATA(2μM)处理过表达p70S6K的A549和H1650细胞72小时,然后,用MTT法测定细胞存活率。****P<0.0001是基于单因素方差分析和Tukey的多重比较试验。(H)对应用ATA(1μM)处理过表达p70S6K的A549和H1650细胞10天。用结晶紫对平板进行染色。显示了三个独立实验的代表图像。菌落形成的量化(与对照组相比的相对菌落数)显示。****P<0.0001是基于单因素方差分析,然后是Tukey的多重比较测试。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。
图10中,(A)为A549和H358细胞用ATA(1μM)处理48小时。显示了p-S6RP免疫荧光染色的代表性共聚焦图像。比例尺,20μm。(B)为A549和H358细胞用ATA(1或2μM)处理48小时。p-4E-BP1和4E-BP1的蛋白质水平通过蛋白质印迹分析确定。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。(C)为A549和H1650细胞分别用PI3K抑制剂(LY294002,2μM)、p70S6K抑制剂(PF-4708671,2μM)、mTOR抑制剂(rapamycin,2μM)或ATA(2μM)处理72小时。然后,通过MTT法测定细胞活力。**P<0.01和****P<0.0001基于单因素方差分析,然后是Tukey的多重比较检验。
实施例4
ATA通过与p70S6K结合并增加其泛素化而降解p70S6K蛋白
为研究ATA如何降低p70S6K的蛋白水平,首先测量p70S6K的mRNA水平,qPCR结果显示:ATA并没有改变所有四个细胞系中p70S6K的mRNA水平(如图4中A所述)。随后用Co-IP从细胞裂解物中分离p70S6K,发现ATA处理大大增加了A549和H1650细胞中p70S6K的泛素化(如图4中B所示)。为研究ATA是否可能通过与p70S6K结合而引致其蛋白质降解,进行分子对接分析,具体的,使用ATA和HTA的化学结构进行对接分析。在对接分析中,PF-4708671的化学结构被用作阳性对照,以确定p70S6K中ATP结合口袋的位置。结果显示:PF-4708671可以结合到p70S6K的ATP结合口袋,并通过Leu-175氨基酸残基与p70S6K形成氢键(如图11中A所示)。
随后用ATA和HTA与p70S6K进行分子对接分析。结果发现:ATA和HTA可以在PF-4708671与p70S6K结合的相同位置与p70S6K结合,也就是ATP结合口袋(如图4中C所示)。模型中的相互作用表明:ATA和HTA都能与ATP结合口袋中的氨基酸残基相互作用,并通过Leu-175氨基酸残基与p70S6K形成氢键(如图4中D和E所示),这与PF-4708671在p70S6K中的结合位点一致(如图11中A所示)。此外,分别计算ATA、HTA和PF-4708671与p70S6K之间的结合能,结果显示:HTA的结合能值最低,为-10.0千卡/摩尔,略低于ATA(-9.6千卡/摩尔),但远低于已知抑制剂(PF-4708671)的结合能(G分)(-8.8千卡/摩尔)(如图4中C所示)。这些结果表明:ATA和HTA可能比PF-4708671更有效地与p70S6K结合。
为了进一步研究ATA和HTA是否能与p70S6K结合,用co-IP从细胞裂解物中分离出p70S6K,然后用LC-MS检测ATA和HTA。LC-MS的洗脱图显示,在乙腈组(阴性对照)中没有检测到明显的峰,但在ATA标准品(阳性对照)中检测到一个峰(如图4中F所示)。随后,用同样的条件来测试对照组(用ATA处理0小时的细胞)和ATA组(用ATA处理1小时的细胞)。结果显示:在对照组中没有检测到明显的峰,而在ATA组中检测到两个峰(如图4中F所示)。随后,用质谱分析了这两个峰。第一个小峰的m/z=297.14,这可能是由HTA(MW=296.14)加上一个H+(MW=1.00)得出的。第二个大峰的m/z=381.16,可能来自于ATA(MW=380.16)和一个H+(MW=1.00)(如图4中G所示)。这些结果表明:ATA和HTA都能与p70S6K结合。
此外,用LC-MS检测ATA组不同时间段(1、2、3和6小时)的ATA和HTA,量化结果显示:p70S6K结合的HTA含量在1-3小时内有所增加,在6小时内略有下降,而p70S6K结合的ATA含量在1-3小时内递减下降,6小时后保持相对稳定(如图11中B和C所示)。这些可能是因为在第一个小时内,主要是ATA与p70S6K结合。当更多的ATA分子转化为HTA时,HTA也可以与p70S6K结合,使其与p70S6K的结合在3小时内增加50%。
承上,上述结果显示:ATA可以迅速与p70S6K结合,这可能阻止其磷酸化并刺激泛素化介导的蛋白质降解。
图4中,(A)对应用ATA(1或2μM)处理A549、H358、H1975和H1650细胞48小时,通过实时PCR测量p70S6KmRNA水平。p70S6K mRNA水平的定量显示。(B)对应用ATA(2μM)处理A549和H1650细胞6、12和24小时后、用抗p70S6K抗体从细胞裂解物中分离p70S6K及其泛素化产物,通过Western blot分析确定泛素和p70S6K蛋白水平。(C)示意图显示ATA、HTA和p70S6K抑制剂PF-4708671与p70S6K蛋白的ATP结合口袋结合。(D)和(E)示意图显示ATA和HTA与p70S6K蛋白的ATP结合口袋结合。模型相互作用图显示ATA和HTA与p70S6K蛋白中的氨基酸残基结合。紫色破折线表示静电相互作用,绿色破折线表示氢键。(F)对应acetonitrile、ATA标准品、对照组和ATA组的LC-MS色谱图。(G)对应质谱分析用于确定ATA和HTA的分子量。A图数据显示的是三个独立实验的平均值±SD。
图11中,(A)示意图显示了p70S6K蛋白的ATP结合口袋。放大的图像显示p70S6K抑制剂(PF-4708671)与p70S6K蛋白的ATP结合口袋结合。模型相互作用图显示PF-4708671与p70S6K蛋白中的氨基酸残基结合。键显示为虚线,颜色编码如下:紫色为静电相互作用,绿色为氢键。(B)为ATA处理组在1、2、3和6小时的LC-MS色谱图。(C)为ATA处理组1、2、3、6小时HTA和ATA曲线面积的定量结果。
实施例5
ATA通过影响p21和cyclin D3阻止细胞周期在G1/S期的进展
为探索ATA是如何通过降低p70S6K的蛋白水平来抑制耐药NSCLC细胞的生长,对ATA处理过的细胞和对照A549细胞进行了RNA测序(RNA-seq)分析。分析两组基因表达的差异(如图5中A所示)后发现分别有1752个被明显上调、2105个基因被明显下调,其倍数变化大于2,P值<0.05(如图12中A所示)。随后,为确定哪些生物途径主要受到ATA处理的影响,对差异表达的基因进行了基因本体学(GO)分析。结果显示:ATA处理后最明显上调的生物过程是“对压力的反应、最明显下调的生物过程是“细胞周期”(如图5中B所示)。基因集富集分析(GSEA)也显示,与ATA处理的细胞相比,细胞周期途径在对照组细胞中被富集(如图5中C所示)。这些发现表明:ATA抑制了细胞周期的进展。然后,检查ATA处理后A549和H1650细胞的细胞周期分布,结果显示:ATA增加了G1期的细胞比例,减少了S期的细胞比例,这意味着ATA在细胞周期进展过程中阻止了细胞从G1期向S期移动(如图5中D和图12中B所示)。
为了理清ATA是如何阻断G1/S期的细胞周期的,分析所有ATA影响的基因,发现ATA处理影响了621个细胞周期相关基因的表达。其中,132个基因被上调,489个基因被下调(如图5中E所示)。随后,分别确定了23个被显著上调和26个被显著下调的基因,其折合变化大于2,P值小于0.05(如图12中C所示)。然后,选择一个上调的基因CDKN1A(p21)和五个下调的基因CCND3(cyclin D3)、AURKA(AURKA)、BIRC5(survivin)、PLK1(PLK1)、CCNB1(cyclinB1),它们的转录在ATA处理后受到明显影响(如图5中E所示)。
经研究发现:ATA处理明显提高了所有四个耐药NSCLC细胞系中p21的mRNA和蛋白水平(如图5中F和G所示)。为了确定ATA处理如何提高p21的mRNA水平,我们检查了p53的蛋白水平,因为p53是细胞周期进展中p21的转录激活因子。结果显示:ATA增加了A549和H1975细胞中p53的蛋白水平(如图5中G所示)。上述结果产生的原因可能在于:ATA可能对细胞产生一种压力,从而在ATA处理的细胞中形成“压力”,而p53可以对这种“压力”作出反应,导致p53在受压细胞中的积累。然后,p53诱导p21的转录,导致p21蛋白水平的增加,使细胞停滞在细胞周期的G1/S期。经研究还发现:ATA降低了所有四个耐药NSCLC细胞系中cyclin D3mRNA表达和蛋白质水平(如图5中F和G所示)。Cyclin D3可与CDK4或CDK6形成复合物,其活性是细胞周期从G1到S期转换所必需的。这些结果表明:ATA可能通过提高p21的mRNA和蛋白水平和降低cyclin D3的mRNA和蛋白水平将耐药性NSCLC细胞阻断在细胞周期的G1/S期。
图5中(A)对应用ATA(2μM)处理A549细胞48小时,一式两份进行RNA测序以分析转录组的情况。使用对数10(FPKM+1)值进行聚类分析的FPKM(每百万碱基的转录物序列的片段)的总体结果。红色表示高表达水平的基因,蓝色表示低表达水平的基因。颜色范围从红色到蓝色代表对数10(FPKM+1)值从高到低。(B)对应进行基因本体论(GO)分析,以确定A549细胞中ATA诱导的生物过程中最明显上调或下调的基因。(C)对应细胞周期相关途径中差异表达基因的基因集富集分析(GSEA)。(D)对应A549和H1650细胞用ATA(1或2μM)处理48小时,在碘化丙啶(PI)染色和流式细胞仪测量后进行细胞周期分析。(E)对应ATA处理组和A549细胞对照组的RNA-seq火山图显示了受ATA影响的细胞周期相关基因。(F)对应用ATA(1或2μM)处理A549、H358、H1975和H1650细胞48小时,通过实时PCR测定p21和cyclin D3的mRNA水平。mRNA水平的量化显示。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,和****P<0.0001是基于双向方差分析和Tukey的多重比较试验。(G)对应A549、H358、H1975和H1650细胞用ATA(1或2μM)处理48小时,通过Western blot分析测定p21、p53和cyclin D3的蛋白水平。(F)数据以三个独立实验的平均值±SD表示。
图12中,(A)为A549细胞中ATA处理组和对照组的RNA-seq图显示1752和2105个基因分别显著上调和下调,倍数变化高于2且P值<0.05。(B)为A549和H1650细胞用ATA(1或2μM)处理48小时。在碘化丙啶(PI)染色和流式细胞术测量后进行细胞周期分析。显示了ATA处理后A549和H1650细胞的细胞周期分布的量化。***P<0.001和****P<0.0001基于双向ANOVA,然后是Tukey的多重比较检验。(C)为ATA处理A549细胞后细胞周期相关基因的热图显示23和26个基因分别显著上调和下调,倍数变化大于2且P值<0.05。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。
实施例6
ATA通过降低AURKA的蛋白水平来抑制耐药性NSCLC细胞的生长
除了p21和cyclin D3,ATA还降低了耐药NSCLC细胞中极光激酶A(AURKA)、polo样激酶(PLK1)、cyclin B1和survivin的mRNA和蛋白水平(如图6中A和B所示)。AURKA可能是治疗耐药性NSCLC的一个有效靶点。经研究发现:耐药的NSCLC细胞在Erlotinib治疗后表现出更高的AURKA蛋白水平(如图6中C所示),这可能导致这些细胞对Erlotinib产生抗性。相反,ATA明显降低了所有四个耐药NSCLC细胞中AURKA、PLK1、cyclin B1和survivin的蛋白水平(如图6中C所示)。这些发现可能解释了为什么ATA对这些耐药NSCLC细胞的生长抑制作用比Erlotinib更有效。
本实施例研究进一步表明:在A549和H1650细胞中,ATA的单一治疗比Erlotinib和MLN8237(一种AURKA抑制剂)的联合治疗产生了更强的生长抑制作用(如图6中D所示)。随后,为进一步研究ATA是否可以通过减少AURKA来抑制耐药NSCLC细胞的生长,我们评估了AURKA过表达对ATA介导的耐药NSCLC细胞生长抑制的影响。MTT结果显示:AURKA的过表达增加了AURKA和survivin的蛋白水平(如图6中E所示),并部分逆转了ATA的生长抑制作用(如图6中F所示)。同样,在A549和H1650细胞中过表达AURKA也部分降低了ATA对菌落形成的抑制作用(如图6中G所示)。
承上,上述结果表明:ATA可以通过降低AURKA的蛋白水平来抑制耐药NSCLC的细胞生长。
图6中(A)对应用ATA(1或2μM)处理A549、H358、H1975和H1650细胞48小时,通过实时PCR测定AURKA、PLK1、cyclin B1和survivin的mRNA水平。mRNA水平的量化显示。**P<0.01,***P<0.001,和****P<0.0001是基于双向方差分析和Tukey的多重比较试验。(B)对应A549、H358、H1975和H1650细胞用ATA(1或2μM)处理48小时,通过Western blot分析测定AURKA、PLK1、cyclin B1和survivin的蛋白水平。(C)对应A549、H358、H1975和H1650细胞经Erlotinib(2μM)或ATA(2μM)处理48小时后,通过Western blot分析测定AURKA、PLK1、cyclin B1和survivin的蛋白水平。(D)对应用AURKA抑制剂(MLN8237,40nM)、Erlotinib(1μM)或ATA(2μM)处理A549和H1650细胞72小时,然后,用MTT试验测量细胞存活率。*P<0.05,**P<0.01和***P<0.001是基于单因素方差分析和Tukey的多重比较试验。(E)对应A549和H1650细胞用空载体(EV)或AURKA过表达(AURKA-OE)质粒进行转染。空载体(EV)作为对照。通过Western blot分析确定AURKA和survivin蛋白水平。(F)对应用ATA(2μM)处理过表达AURKA的A549和H1650细胞72小时,用MTT法测量细胞存活率。****P<0.0001是基于单因素方差分析,然后进行Tukey的多重比较测试。(G)对应用ATA(1μM)处理过表达AURKA的A549和H1650细胞10天。用结晶紫对平板进行染色。显示了三个独立实验的代表图像。菌落形成的量化(与对照组相比的相对菌落数)显示。****P<0.0001是基于单因素方差分析,然后是Tukey的多重比较测试。统计数据以三个独立实验的平均值±SD表示。
实施例7
ATA通过降低p70S6K的蛋白水平影响细胞周期相关蛋白
ATA可能通过降低p70S6K的蛋白水平来降低cyclin D3的mRNA和蛋白水平。为确定哪种蛋白首先受到ATA的影响,用2μM的ATA对A549和H1650细胞进行不同时间的处理。Western blot结果显示:ATA按以下时间顺序依次降低各种蛋白的水平:6小时,p70S6K降低;12小时,AURKA降低;24小时,MET降低;36小时,S6RP降低;48-72小时,EGFR降低(如图7中A至C所示)。这些发现表明:ATA首先减少p70S6K蛋白,然后减少细胞周期相关蛋白(如AURKA)和受体蛋白(如EGFR和MET)的蛋白水平。
随后,为了确定ATA是否通过降低p70S6K的蛋白水平来影响细胞周期相关蛋白,用p70S6K siRNA来沉默p70S6K的表达。结果发现:p70S6K siRNA明显降低了p70S6K的蛋白水平,更重要的是,降低p70S6K的表达降低了A549和H1650细胞中p70S6K和S6RP的磷酸化(如图7中D所示)。此外,p70S6K siRNA增加了p21的蛋白水平,降低cyclin D3、AURKA、PLK1、cyclin B1和survivin的蛋白水平。然而,p70S6K siRNA对EGFR和MET的影响较小(如图7中D所示)。最后,评估p70S6K siRNA对A549和H1650细胞的生长抑制的影响,MTT结果显示:p70S6K siRNA在这两个细胞系中明显减少了40%的细胞生长(如图7中E所示)。
进一步地,比较PI3K抑制剂(LY294002)、p70S6K抑制剂(PF-4708671)、mTOR抑制剂(rapamycin)与ATA对这些细胞周期相关蛋白、EGFR、MET的影响。Western blot结果显示:LY294002、PF-4708671和rapamycin在提高p21的蛋白水平和降低cyclin D3、AURKA、PLK1、cyclin B1、survivin、EGFR和MET的蛋白水平方面的效果远不如ATA(如图7中F所示)。
此外,还比较了正常成纤维细胞(HDF)和肺癌细胞(A549和H1650)之间这些蛋白质的表达水平。结果显示:与正常细胞相比,肺癌细胞表达的EGFR、MET、p-p70S6K、p70S6K、p-S6RP、cyclin D3、AURKA、PLK1、cyclin B1的水平要高出2.3-14.5倍,S6RP的水平相似,而p21的水平较低(如图7中G和图13所示)。这些发现可能解释了为什么ATA在癌细胞中比正常细胞有更好的生长抑制作用。
承上,上述结果表明:ATA通过降低p70S6K的蛋白水平,然后影响其他细胞周期相关蛋白来抑制耐药NSCLC细胞的生长。
图7中,用ATA(2μM)处理A549和H1650细胞6、12、24、36和48小时,通过Westernblot分析测定每个时间点的p70S6K、AURKA、MET、S6RP和EGFR的蛋白水平显示如(A),量化的蛋白水平显示在(B)。(C)显示了在ATA处理过程中蛋白质减少的时间线。(D)对应用10nMp70S6K siRNA和阴性对照的siRNA处理A549和H1650细胞48小时,通过Western blot分析测定p70S6K,p-p70S6K,S6RP,p-S6RP,p21,cyclin D3,AURKA,PLK1,cyclin B1,survivin,EGFR和MET蛋白水平。(E)对应A549和H1650细胞用10nM p70S6K siRNA和阴性对照siRNA处理48小时,用MTT试验测量细胞存活率。****P<0.0001是基于单因素方差分析,然后进行Tukey多重比较试验。(F)对应A549和H1650细胞用LY294002(2μM)、PF-4708671(2μM)、rapamycin(2μM)和ATA(2μM)处理48小时,通过Western blot分析测定p21、cyclin D3、AURKA、PLK1、cyclin B1、survivin、EGFR和MET蛋白水平。(G)对应通过Western blot分析确定成纤维细胞HDF、A549和H1650细胞中EGFR、MET、p-p70S6K、p70S6K、p-S6RP、S6RP、p21、cyclin D3、AURKA、PLK1、cyclin B1和survivin的表达水平。统计数据以三个独立实验的平均值±SD表示。
图13中为通过Western blot分析并量化后在HDF、A549和H1650细胞中EGFR、MET、p-p70S6K、p70S6K、p-S6RP、S6RP、p21、cyclin D3、AURKA、PLK1、cyclin B1和survivin的表达水平。
实施例8
ATA抑制小鼠耐药性NSCLC衍生异种移植肿瘤的生长
基于上述实施例已经证明ATA在体外可以抑制耐药NSCLC细胞的生长。为了确定ATA在体内是否也可以产生同样的效果,本实施例将A549细胞皮下注射到裸鼠体内,形成肿瘤异种移植。小鼠被随机分配到三组。当每个肿瘤的大小增长到大约100立方毫米的体积时,通过腹腔注射每3天给小鼠注射一次溶剂对照、ATA(25毫克/千克)或Erlotinib(25毫克/千克),持续31天。每3天测量一次每个小鼠的肿瘤大小和体重,直到第31天动物实验结束。结果显示,在第31天,与对照组相比,Erlotinib使肿瘤大小减少了32.5%,但它并没有明显减少肿瘤重量。相比之下,ATA显示出比Erlotinib更高的肿瘤生长抑制效力,使肿瘤大小减少了72.1%,肿瘤重量减少了77.4%(如图8中A至C所示)。此外,三组之间的裸鼠体重没有差异(如图14所示),而且在治疗期间没有小鼠死亡。这些数据表明:ATA强烈地抑制了A549细胞衍生的异种移植肿瘤的生长,并且在裸鼠体内不产生明显的毒性。
随后,对A549衍生的异种移植肿瘤组织中的相关蛋白水平进行试验,其结果显示:ATA处理后,EGFR、MET、p-p70S6K、p70S6K、p-S6RP、AURKA、PLK1和survivin的蛋白水平大大降低,p21蛋白的水平增加2倍以上(如图8中D所示)。此外,通过免疫组化(IHC)分析检查A549衍生的异种移植瘤中EGFR、MET、p70S6K和AURKA蛋白的水平。染色结果显示:ATA处理后这些蛋白在肿瘤中的水平也明显降低(如图8中E所示)。所有这些数据说明:ATA能够抑制A549衍生的异种移植肿瘤的生长,并降低肿瘤组织中EGFR、MET、p70S6K和AURKA蛋白水平。
为进一步确定p70S6K和AURKA在肺腺癌患者中表达的临床意义,在进行本实施例过程中还购买了两套组织芯片,包含30个肺癌样本和30个邻近组织。这些癌症样本包括肺腺癌患者的I、II和III期的肿瘤组织。对这些组织样本进行了IHC染色,并使用IHC评分来表示染色强度。对于每个样本,IHC评分的范围是0-8分,由比例评分(0=0%比例;1=1%比例;2=10%比例;3=33%比例;4=66%比例;5=100%比例)和强度评分(0=阴性;1=弱;2=中等;3=强)组成。结果显示:与邻近组织相比,p70S6K和AURKA蛋白在肿瘤样本中的表达水平高得多。具体来说,p70S6K的IHC评分在肿瘤样本中高出4.7倍,AURKA的IHC评分在肿瘤样本中高出2.8倍(如图8中F所示)。此外,在许多不同类型的癌症中,与正常样本相比,p70S6K和AURKA在癌症样本中也是高表达的(如图15所示)。
经本实施例研究还发现:p70S6K和AURKA在II期和III期肿瘤样本的染色强度明显高于I期肿瘤样本(如图8中G所示)。最后,UALCAN分析显示:p70S6K和AURKA的高表达与肺腺癌患者的总生存期较短相关(如图8中H所示),表明p70S6K和AURKA蛋白的高表达与肺腺癌的进展有临床相关性。
图8中(A)对应将400万个A549细胞通过皮下注射引入裸鼠体内,形成肿瘤异种移植。用25毫克/千克ATA,25毫克/千克Erlotinib或溶剂对照通过腹腔注射到动物体内,每3天一次,持续31天,每3天测量肿瘤体积(立方毫米)。动物实验结束时获得的对照组、ATA处理组和Erlotinib处理组的肿瘤异种移植的代表图像。比例尺,1厘米。(B)肿瘤体积数据来自于6只小鼠/组。数据以平均值±SD表示。*P<0.05和**P<0.01是基于双尾非配对t检验。(C)肿瘤重量数据来自6只小鼠/组。数据以平均值±SD表示。**P<0.01和****P<0.0001是基于单因素方差分析和Tukey的多重比较试验。(D)对应收集对照组和ATA处理组的单个异种移植肿瘤的裂解液。通过Western blot分析检测EGFR、MET、p-p70S6K、p70S6K、p-S6RP、S6RP、p21、AURKA、PLK1和survivin蛋白水平。Western blot样本来自每组的两个独立肿瘤。(E)为代表性的IHC图像:EGFR、MET、p70S6K和AURKA,来自于用溶剂对照或ATA治疗的小鼠A549异种移植肿瘤。放大率为20倍。比例尺,50μm。(F)为患者来源的肺部肿瘤(n=30)和邻近组织(n=30)的p70S6K和AURKA的IHC染色的代表图像。根据IHC染色的量化结果,患者来源的肿瘤和邻近组织的p70S6K和AURKA的平均水平。放大5倍和20倍。比例尺,100μm。****P<0.0001是基于双尾分析和非配对t检验。(G)为p70S6K和AURKA的代表性IHC染色图像,来自I期(n=3)、II期(n=11)和III期(n=16)的患者来源的肺部肿瘤。根据IHC染色的定量,I期、II期和III期患者来源肿瘤的p70S6K和AURKA的平均水平。图片以5倍和20倍放大镜拍摄。比例尺,100μm。*P<0.05和**P<0.01是基于单因素方差分析,然后进行Tukey的多重比较测试。(H)为用UALCAN分析绘制p70S6K(GSE11969)和AURKA(GSE13213)表达水平不同的肺腺癌患者的总生存率。带有总生存率分析工具的网站是http://genomics.jefferson.edu/proggene/index.php。(I)为ATA靶向p70S6K抑制细胞周期相关蛋白的合成,继而抑制耐药NSCLC细胞增殖的建议机制。
图14为通过腹膜内给药,向携带A549衍生异种移植肿瘤的裸鼠注射25mg/kgErlotinib、ATA或溶剂对照。每3天记录每只小鼠的体重,持续31天。从每组中的六只小鼠获得平均体重,并表示为平均值±SD。
图15中p70S6K(RPS6KB1)和AURKA的临床数据来自网站(http://timer.cistrome.org/)。
综上所述,本申请发现ATA在体外和体内治疗对EGFR TKIs产生原发性或获得性耐药的NSCLC具有良好的疗效。本申请研究结果表明,ATA能有效地抑制耐药NSCLC细胞的生长、菌落形成、球体形成、迁移和侵袭。更重要的是,ATA强烈抑制了A549细胞在裸鼠体内的异种移植肿瘤的生长。机理研究表明,ATA可能通过靶向p70S6K及其下游信号分子来克服NSCLC对EGFR TKIs的原发和获得性耐药。ATA的第一组目标包括p70S6K和它的底物S6RP。ATA及其代谢物HTA能与p70S6K的ATP结合位点结合,从而阻止其磷酸化。ATA还能增加泛素化介导的p70S6K的降解,导致其蛋白水平的降低。ATA对p70S6K的抑制作用进一步阻止了对蛋白质合成至关重要的S6RP的激活。第二组包括p53、p21和survivin。ATA增加了p53的水平,而p53增加了p21的转录,可以阻止细胞从G1进入到S期。作为一个转录因子,p53也可以抑制survivin的转录,这可能部分地导致其蛋白水平的降低。survivin有两种功能:首先是作为一种抗凋亡蛋白,其次是在有丝分裂中发挥积极作用。第三组包含几个对细胞周期进展至关重要的蛋白,如cyclin D3、AURKA、PLK1和cyclin B1。ATA可以通过减少p70S6K来降低这些细胞周期相关蛋白的蛋白水平。这可能是因为许多参与细胞周期控制的蛋白质在细胞周期的每个阶段都是从新制造的,而当p70S6K被ATA抑制时,所有这些新的蛋白质都不能被合成。而最后一组包括受体酪氨酸激酶的两个成员EGFR和MET。
虽然ATA可以降低多种蛋白的水平,但从蛋白降低的时间线和沉默p70S6K基因表达的结果来看,ATA的主要目标可能是p70S6K,而p70S6K在蛋白合成的调控中发挥着重要作用。癌细胞比正常细胞生长得快,因此需要高水平的蛋白质合成。本申请结果显示:与正常成纤维细胞相比,许多ATA下调的蛋白包括EGFR、MET、p70S6K、p-S6RP、cyclin D3、AURKA、PLK1、cyclin B1和survivin在肺癌细胞中高表达。从临床样本中,同样观察到NSCLC患者的肿瘤样本中p70S6K和AURKA的蛋白水平远高于其邻近组织。许多研究也表明,p70S6K和AURKA在许多类型的癌症中被过度表达或激活,这表明这两个激酶可能促进肿瘤的发生。
此外,p70S6K与肿瘤的转移和耐药性有关,而AURKA的过度表达或激活也参与了对EGFR TKIs的耐药性。临床样本结果也显示,与I期肿瘤样本相比,NSCLC的II期和III期肿瘤样本中p70S6K和AURKA的表达更高。并且,UALCAN分析显示,p70S6K和AURKA的高表达与肺腺癌患者的预后不佳相关。因此,针对p70S6K和AURKA可能有利于治疗对EGFR TKIs原发或获得性耐药的NSCLC患者。
本申请研究结果还表明:与PI3K抑制剂LY294002、p70S6K抑制剂PF-4708671和mTOR抑制剂rapamycin相比,ATA通过降低p70S6K的蛋白水平对细胞生长和蛋白合成有更好的抑制作用。此外,本申请还发现耐药的NSCLC细胞在用Erlotinib治疗后会增加p70S6K和AURKA的蛋白水平。p70S6K和AURKA的增加可能导致NSCLC对Erlotinib的耐药。相关研究结果表明:ATA降低了p70S6K和AURKA的蛋白水平,导致持续和不可逆的抑制激酶活性。这种作用解释了为什么ATA在抑制耐药NSCLC细胞的生长方面比Erlotinib更好。
本申请研究中,还发现:除了p70S6K和AURKA之外,ATA还可以降低耐药的NSCLC细胞中多种蛋白质的水平,包括PLK1、cyclin B1、survivin、EGFR和MET。ATA的这些多靶点作用应使ATA能够抑制多种信号通路,克服NSCLC对EGFR TKIs的耐药性。
总之,上述研究整体表明:ATA可能作为一种有效的抗癌剂,通过降解p70S6K、AURKA和其他细胞周期相关蛋白来治疗耐药的NSCLC。
以上仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.乙酰丹参酮IIA在制备治疗肺癌的药物中的应用;
优选地,所述乙酰丹参酮IIA用于制备治疗非小细胞肺癌的药物。
2.乙酰丹参酮IIA在制备肺癌细胞生长抑制剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述乙酰丹参酮IIA用于制备非小细胞肺癌细胞生长抑制剂。
4.根据权利要求2或3所述的应用,其特征在于,所述乙酰丹参酮IIA用于制备A549细胞生长抑制剂、H358细胞生长抑制剂、H1975细胞生长抑制剂和/或H1650细胞生长抑制剂。
5.乙酰丹参酮IIA在制备蛋白合成抑制剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述蛋白合成抑制剂包括细胞周期相关蛋白合成抑制剂。
7.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述蛋白合成抑制剂对应的蛋白包括p70S6K、cyclin D3、AURKA、PLK1、cyclin B1、survivin、EGFR和MET中的至少一种。
8.乙酰丹参酮IIA在制备蛋白下游信号分子磷酸化水平抑制剂中的应用;
优选地,所述乙酰丹参酮IIA用于制备p70S6K和/或S6RP磷酸化抑制剂。
9.乙酰丹参酮IIA在制备p21转录激活剂或p53促进剂中的应用。
10.一种治疗肺癌的药物,其特征在于,所述药物的成分含有乙酰丹参酮IIA;
优选地,所述药物为治疗非小细胞肺癌的药物。
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