KR20220147530A

KR20220147530A - 테트라스파닌-12(Tetraspanin-12, TSPAN12)를 포함하는 뇌종양 진단용 바이오마커 조성물

Info

Publication number: KR20220147530A
Application number: KR1020220051356A
Authority: KR
Inventors: 정규하; 이여송
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2021-04-27
Filing date: 2022-04-26
Publication date: 2022-11-03

Abstract

본 발명은 테트라스파닌-12(Tetraspanin-12, TSPAN12) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 뇌종양 진단용 바이오마커 조성물 등에 관한 것으로서, 상기 TSPAN12는 뇌종양에서 정상 대비 통계적으로 유의하게 높은 발현을 보이고, 뇌종양 특히 다형성교모세포종에서 TSPAN12의 발현을 증가시키는 경우, 세포 증식, 이동 및 침습을 억제하고, 환자의 생존기간을 연장할 수 있으므로, 본 발명은 TSPAN12 바이오마커를 표적하는 약물전달체계의 개발, 암 치료 기전연구, 표적 진단제 또는 치료제 개발 등으로 활용될 수 있다.

Description

테트라스파닌-12(Tetraspanin-12, TSPAN12)를 포함하는 뇌종양 진단용 바이오마커 조성물{Biomarker composition for diagnosis of brain tumor comprising Tetraspanin-12}

테트라스파닌-12(Tetraspanin-12, TSPAN12) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 뇌종양 진단용 바이오마커 조성물 등에 관한 것이다.

다형성교모세포종(Glioblastoma multiforme,GBM)은 공격적인 치료에도 15개월의 평균 생존기간을 나타내는 가장 공격적인 악성 종양으로 가장 큰 원발성 뇌종양 군에 속한다. 다형성교모세포종 환자에 대한 현재 표준 치료법은 외과적 절제와 동시에 DNA 합성을 억제하여 세포 사멸을 유도하는 테모졸로마이드(temozolomide, TMZ)를 사용한 화학방사선 요법을 수행하는 것이다. 그러나 현재 치료법에 대한 반응이 좋지 않고, 약물 내성 및 재발률이 높으며, 다형성교모세포종 환자의 특정 분자 변형으로 인해 TMZ에 대한 반응률은 45% 미만이다. O6-메틸구아닌 DNA 메틸트랜스퍼라제 프로모터(O6-methylguanine DNA methyltransferase promoter, MGMT)의 메틸화는 다형성교모세포종에서 강력한 약물 내성 관련 인자로 작용하고, 이소시트레이트 탈수소효소(isocitrate dehydrogenase, IDH) 야생형 환자는 TMZ 치료에 내성을 나타낸다. 최근 교모세포종 줄기세포에서 TMZ 내성에 대한 연구 등 추가적인 연구가 활발히 진행되고 있지만, 다형성교모세포종은 예후가 좋지 않아 대안적인 바이오마커 발굴이 시급하다.

테트라스파닌(tetraspanin, TSPAN)은 종양 진행의 다양한 메커니즘에 관여하는 막 단백질이며 테트라스파닌 웹(tetraspanin-web) 또는 테트라스파닌이 풍부한 도메인(tetraspanin-enriched domain) 형성을 통해 신호 플랫폼 역할을 한다. 흥미롭게도, 알려진 33개의 테트라스파닌 계열 구성원 중 거의 50%가 종양 억제제로 작용한다. 그 중 TSPAN29는 인간 암에서 종양 형성을 현저하게 억제하며, TSPAN29 발현 감소가 유방암에서 암세포 전이를 증가시킨다는 점이 최근 보고되었다. 그러나, 테트라스파닌 계열은 암의 종류에 따라 종양유전자 또는 종양 억제제로 역할을 달리한다. 상술한 TSPAN29의 경우, 페암, 유방암, 대장암 등에서는 종종 종양발생(oncogenic) 또는 전이촉진(pro-metastatic) 기능을 나타내는 것으로 보고된 바 있다. 환언하면, 테트라스파닌은 장기별로 암에 있어 상반된 결과들이 보고되고 있으므로, 이의 역할을 규명하는 것은 암을 치료하는데 있어 중요한 사항으로 생각된다.

따라서 본 발명자들은 테트라스파닌 계열의 TSPAN12 단백질과 다형성교모세포종 사이의 관계에 초점을 맞춰 다형성교모세포종 및 관련 신호 전달 경로에서 TSPAN12의 역할을 연구하고, 다형성교모세포종에 대한 대안적인 바이오마커로서 TSPAN12의 잠재적 유용성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 테트라스파닌-12(tetraspanin-12, TSPAN12) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 뇌종양 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 뇌종양 진단용 조성물 및 이를 포함하는 뇌종양 진단용 키트를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 뇌종양 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 테트라스파닌-12(tetraspanin-12, TSPAN12) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 뇌종양 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다. 상기 진단은 뇌종양의 발병 여부를 판정하거나, 뇌종양의 예후를 예측하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 뇌종양은 성상세포종(astrocytoma), 다형성교모세포종(glioblastoma multiforme), 핍지신경교종(oligodendroglioma), 핍지교성상세포종(oligoastrocytoma), 상의세포종(ependymoma), 수모세포종(medulloblastoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 뇌수막종(meningioma), 뇌하수체선종(pituitary adenoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 및 맥락총유두종(choroid plexus papilloma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 다형성교모세포종(GBM)일 수 있다.

또한, 본 발명은 테트라스파닌-12 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 뇌종양 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 테트라스파닌-12 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자와 결합하는 화합물, 항체, 압타머, 올리고펩티드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid), 올리고뉴클레오티드, 프라이머, 및 프로브로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 뇌종양은 성상세포종(astrocytoma), 다형성교모세포종(glioblastoma multiforme), 핍지신경교종(oligodendroglioma), 핍지교성상세포종(oligoastrocytoma), 상의세포종(ependymoma), 수모세포종(medulloblastoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 뇌수막종(meningioma), 뇌하수체선종(pituitary adenoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 및 맥락총유두종(choroid plexus papilloma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 다형성교모세포종(GBM)일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 뇌종양 진단용 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 키트는 테트라스파닌-12 단백질을 펩티드화하기 위한 시약 및 단백질 가수분해효소를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 키트는 테트라스파닌-12 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트, 및 핵산 증폭용 시약을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 환자의 생물학적 시료로부터 테트라스파닌-12 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 뇌종양 진단을 위한 정보제공방법 또는 뇌종양 진단방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 단계 이후에 측정된 발현 수준이 악성뇌종양의 예후가 좋은 개체에서 측정된 테트라스파닌-12 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준보다 낮은 경우, 뇌종양 예후가 나쁜 것으로 판별하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 생물학적 시료는 환자 유래의 조직, 객담, 세포, 혈액, 혈장, 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 발현 수준은 웨스턴 블롯, 단백질 칩, 효소면역분석법(ELISA), 방사선면역분석, 면역침강법, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 보체 고정 분석법, 유세포 분석(FACS), 조직 마이크로어레이, 노던 블롯, 및 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 측정하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 테트라스파닌-12 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키는 제제를 포함하는, 뇌종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 테트라스파닌-12 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키는 제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 뇌종양 예방 또는 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 뇌종양 진단, 예방, 또는 치료용 제제의 제조를 위한 테트라스파닌-12 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 용도를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 제제는 화합물, 항체, 압타머, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 siRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 뇌종양 예방 또는 치료용 약제의 스크리닝 방법을 제공한다:

(1) 뇌종양 세포에 후보물질을 처리하는 단계;

(2) 상기 세포의 테트라스파닌-12 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

(3) 상기 측정된 발현 수준이 후보물질 처리 전보다 증가한 경우 상기 후보물질을 뇌종양의 예방 또는 치료용 약제로 선정하는 단계.

본 발명의 효과는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 효과들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 다형성 교모세포종(GBM) 환자에서 테트라스파닌-12(TSPAN12) 단백질의 발현 수준이 예후와 양의 상관관계를 가진다는 점을 나타낸 것이다. (n=21, p < 0.05; 위험 비율 = 0.23; 95% 신뢰 구간 = 0.05-1.00).
도 2는 주요 암 20종에서 TSPAN12의 정상 대비 암 비교발현도를 나타낸 것이다.
도 3은 TSPAN12 siRNA의 억제 효능을 나타낸 것으로서, 도 3a는 상대적인 mRNA 발현 수준을, 도 3b는 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이다.
도 4은 TSPAN12 발현의 침묵이 다형성교모세포종 세포의 증식과 이동을 유발한다는 점을 나타낸 것이다. 도 4a는 리포펙타민으로 처리하거나 대조군 siRNA 또는 TSPAN12 특이적 siRNA로 형질감염된 U87 세포를 나타낸 것이다. 도 4b는 형질감염된 U87 세포에서 WST-1 분석에 의해 결정된 세포생존율을 나타낸 것이다. 도 4c는 동일한 병렬 세포에서 실시간 PCR을 통해 평가한 CDKN1A 및 SURVIVIN의 발현을 나타낸 것이다. 도 4d는 명시야 및 공초점 현미경의 대표적인 이미지를 나타낸 것으로서, TSPAN12 침묵이 U87 세포에서 형태학적 변화를 유도한다는 점을 시사한다. 도 4e는 대조군/TSPAN12 siRNA 형질감염된 U87 세포에 17시간동안 상처를 형성하여 수행한 상처 치유 분석을 나타낸 것이다. 도 4f는 실시간 PCR을 통해 측정된 대조군/TSPAN12 침묵 세포에서 상피 중간엽 전이(epithelial mesenchymal transition, EMT) 마커, CDH1 및 TWIST의 발현 수준을 나타낸 것이다. 도 4g는 웨스턴 블롯을 통해 측정된 동일한 세포군의 기타 EMT-마커를 나타낸 것이다. 액틴을 로딩 컨트롤로 사용하였고, 실험은 3회 반복하여 수행하였다. 결과는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001.
도 5는 TSPAN12 발현의 고갈이 다형성교모세포종 세포 침습성 및 줄기세포성을 유도한다는 점을 나타낸 것이다. 도 5a는 대조군 또는 TSPAN12 특이적 siRNA로 형질감염 이후 U87 세포의 트랜스웰 마트리겔 침습 분석(Transwell Matrigel invasion assay)을 나타낸 것이다. 도 5b는 표시된 각 시점에서 관찰된 마트리겔에 임베딩된 스페로이드의 대표적인 위상차 이미지를 나타낸 것이다. 도 5c는 대조군 또는 TSPAN12 침묵 U87 세포의 세포외 기질 접착 분석 결과를 나타낸 것이다. 라미닌 1, 피브리노겐, 피브로넥틴, 콜라겐 I 및 콜라겐 IV에 부착된 세포를 추출 후 염색하고 560 nm에서 정량화하였다. 도 5d는 실시간 PCR에 의해 측정된 대조군/TSPAN12 침묵 세포에서 줄기세포성 마커, BMI 1 및 NESTIN의 발현 수준을 나타낸 것이다. 도 5e는 웨스턴 블롯을 통해 확인된 동일한 줄기세포성 마커의 발현을 나타낸 것이다. 액틴을 로딩 컨트롤로 사용하였고, 결과는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001.
도 6는 다형성교모세포종 세포 진행을 지지하는 TSPAN12-매개 신호 단백질을 식별하는 포스포프로테옴 프로파일링(Phosphoproteome profiling)을 나타낸 것이다. 도 6a는 대조군 또는 TSPAN12 siRNA 형질감염된 U87 세포에서 인단백질(phosphoprotein) 활성화의 스크리닝을 나타낸 것이다. 프로테옴 프로파일러 인광체-키나아제(phosphor-kinase) 분석 및 현저하게 증가된 발현을 나타내는 두 개의 대표적인 인단백질을 사용하였다. 도 6b는 현저하게 증가된 발현을 갖는 인단백질의 정량화된 그래프를 나타낸 것이다. 도 6c는 웨스턴 블롯을 통해 측정된 대조군/TSPAN12 침묵 세포에서 pFAK(Y397) 및 pERK(Y202/T204)의 발현 수준을 나타낸 것이다. 액틴을 로딩 컨트롤로 사용하였고, 실험은 3회 반복하여 수행하였다. 결과는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. * p < 0.05; ** p < 0.01.

본 발명자들은 TSPAN12가 다형성교모세포종에서 종양 억제를 매개하며, 그에 따라, 고갈된 TSPAN12는 세포 증식, 이동/침습, 및 세포외 기질 부착 능력을 유도하고, 다형성교모세포종에서 신호 전달과 관련된 FAK/ERK를 활성화함으로써 줄기세포성을 나타낸다는 점을 확인하였다. 더욱이, 21명의 환자 검체에서 TSPAN12 발현도를 1명의 병리과 전문의의 암맹평가를 통하여 저발현과 고발현 군으로 구분하고 이들 검체에 해당하는 환자의 예후를 평가하였을 때, TSPAN12 단백질의 저발현이 다형성교모세포종의 나쁜 예후와 양의 상관관계가 있음을 확인하였다(도 1; n=21, p < 0.05; 위험 비율 = 0.23; 95% 신뢰 구간 = 0.05-1.00).

보다 구체적으로, 본 발명자들은 인간 교모세포종 특징을 나타낼 것으로 추정되는 가장 대표적인 신경교종 세포주인 U87 세포주를 사용하여 다형성교모세포종에서 TSPAN12의 기능을 밝혔다. TSPAN12-siRNA로 일시적으로 형질감염된 U87 세포의 데이터를 통해 고갈된 TSPAN12가 특히 증식 및 이동/침습에서 향상된 다형성교모세포종 세포 진행과 관련이 있음을 확인하였다. 또한, 다형성교모세포종 환자의 생존기간은 TSPAN12 발현과 반비례하므로, 본 발명은 TSPAN12의 발현을 조절하여 14-18개월의 평균 생존기간인 다형성교모세포종의 예후를 개선할 수 있으며, 종양의 성장을 억제할 수 있다.

이에, 본 발명은 TSPAN12 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 뇌종양 진단용 바이오마커 조성물, 및 상기 TSPAN12의 발현을 증가시키는 제제를 포함하는, 뇌종양 예방 또는 치료용 조성물 등을 제공한다.

본 발명에서, 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 개체의 예후(prognosis)를 예측하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 개체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다.

본 발명에서, 용어 “예후(prognosis)”는 질병을 진단하여 판단된 장래의 증세 또는 경과에 대한 전망을 말하며, 환자의 생존율, 병세의 진행, 투약 및 치료에 따른 효과, 회복에 관한 예측 등을 나타내는 것이다. 본 발명에서 예후가 나쁘다는 것은 암세포의 증식, 이동, 또는 침습이 증가되거나, 암세포가 전이되어 생존기간이 짧아진 경우를 의미하며, 뇌종양 중 다형성교모세포종 환자의 평균 생존기간은 14-18개월이다.

본 발명에서, 용어 “예측”은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 뇌종양으로 진단받은 환자의 병의 경과, 즉 예후를 미리 짐작하는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 뇌종양의 발생, 확산 또는 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서, 상기 “발현 수준을 측정할 수 있는 제제”는 단백질 또는 유전자의 발현 수준을 확인함으로써 본 발명의 바이오마커 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미한다. 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머, 올리고펩티드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 등일 수 있으며, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드, 프라이머, 프로브, 안티센스 뉴클레오티드 등일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 의미하며, 단클론(monoclonal) 항체 및 다클론(polyclonal) 항체는 물론 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다. “압타머”는 특정 물질에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA(ssDNA) 또는 RNA를 의미하며, 비교적 단순한 방법으로 합성이 가능하고 세포, 단백질, 그리고 작은 유기 물질까지도 표적물질이 될 수 있으며, 특이성 및 안정성이 매우 우수하다. “리간드”는 유기물질, 단백질, 펩티드 등을 포함하는 표적물질에 결합하는 물질로 하는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3 hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 표적서열(template)과 염기쌍(base pair)를 형성할 수 있고 표적서열 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. “프로브”는 유전자와 특이적 결합할 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데 올리고뉴클레오티드 브로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다. “안티센스 뉴클레오티드”는 상기 유전자에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 염기서열로서 이에 제한되지는 않으나 antisenseRNA, antagonist miRNA를 포함한다.

상기 키트는 예를 들어, 상기 단백질을 펩티드화하기 위한 키트일 수 있다. 펩티드화는 단백질의 질량분석 전처리를 위하여 알려진 방법이면 제한되지 않는다. 상기 키트는 단백질의 펩티드화에 요구되는 알려진 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 키트는 디티오트레이톨(Dithiothreitol: DTT), 요오드아세트아마이드(Iodoacetamide: IAA), 트리스 (2-클로로에틸) 인산(Tris(2-carboxyethyl)phosphine: TCEP), 메틸메타노티오설포네이트(Methyl methanethiosulfonate: MMTS), 단백질 가수분해 효소(protease), 그의 활성에 필요한 버퍼, 보조인자, 및/또는 기질을 더 포함할 수 있다. 상기 단백질 가수분해 효소는 트립신(trypsin), 엔도 프로테이나제 Lys-C(Endoproteinase Lys-C), 엔도 프로테이나제 Glu-C(Endoproteinase Glu-C) 및 이들의 조합일 수 있다.

또한 상기 키트는 상기 유전자를 증폭하기 위한 키트일 수 있다. 증폭방법은 핵산증폭을 위하여 알려진 방법이면 제한되지 않으며, 열순환(termal cycling)을 필요로 하는 것 또는 등온 (isothermal)에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 증폭방법은 폴리머라제 연쇄반응(polymerase chainreaction: PCR), 핵산서열-기초증폭(nucleic acid sequence-based amplification: NASBA), 리가제연쇄반응(ligase chain reaction: LCR), 가닥치환증폭(strand displacement amplificaton: SDA), 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification: RCA) 등을 포함할 수 있다. 증폭 방법은 또한, 역전사(reverse transcription: RT) 또는 역전사-PCR을 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 표적핵산의 증폭에 요구되는 알려진 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 키트는 핵산폴리머라제, 그의 활성에 필요한 버퍼, 보조인자, 및/또는 기질을 더 포함할 수 있다. 상기 핵산폴리머라제는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역전사효소(reverse transcriptase) 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명에서, 용어 "진단용 조성물"은 질병을 진단, 바람직하게는 질병의 예후를 예측하기 위한 목적으로 제조된 것을 의미하고, "예방 또는 치료용 약학적 조성물"은 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은, 각각의 제형에 따라 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상의 혼합물일 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수도 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수도 있다. 더 나아가, 당분야의 적정한 방법으로, 또는 Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수도 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 약학적으로 유효한 양으로 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 본 발명의 용어 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

따라서, 본 발명의 조성물을 개체에 투여하여 뇌종양을 예방, 치료, 및/또는 진단할 수 있으며, 상기 뇌종양은 악성이거나 양성이든지 관계없이 모든 신생 세포 성장 및 증식을 나타내는 모든 전암(pre-cancerous) 세포 및 암 세포를 칭하며, 바람직하게는 악성 뇌교종(malignant glioma)를 의미한다. 비제한적인 예로서 성상세포종(astrocytoma), 다형성교모세포종(glioblastoma multiforme), 핍지신경교종(oligodendroglioma), 핍지교성상세포종(oligoastrocytoma), 상의세포종(ependymoma), 수모세포종(medulloblastoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 뇌수막종(meningioma), 뇌하수체선종(pituitary adenoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 및 맥락총유두종(choroid plexus papilloma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 다형성교모세포종(GBM)일 수 있다.

본 발명에서 용어, “개체”는 상기 질환의 예방, 치료, 및/또는 진단이 필요한 가축, 인간 등의 포유류라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 인간일 수 있다.

본 발명의 조성물은 개체에 투여를 위한 다양한 형태로 제형화 될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화 될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제 (예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신)와 활탁제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네 슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염 과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 방부제, 수화제, 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제와 같은 보조제와 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화 될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안 된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

[실험예]

실험예 1. 환자 검체 면역염색 및 예후 평가

TSPAN12 (ab93179, Abcam, Cambridge, UK) 1차 항체를 이용하여 총 21명의 악성 뇌종양 환자 검체에 대한 면역염색과 암맹평가를 1명의 병리과 전문의의 판독을 통해 TSPAN12 저발현군과 고발혈군으로 구분하여, 이들 검체에 해당하는 환자 예후인 전체생존기간(OS; overall survival)에 대한 분석을 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad Software, CA, USA)를 이용하여 시행하였다.

실험예 2. 세포 배양

U87 다형성교모세포종 세포주를 American Type Culture Collection(ATCC, VA, USA)에서 구입하고, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 10% FBS(Gibco) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)이 처리된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)(Gibco, NY, USA)에 배양하였다.

실험예 3. 소형 간섭 RNA(siRNA) 형질감염

TSPAN12에 대한 특이적 siRNA 및 스크램블된(scrambled) 비특이적 대조군 siRNA는 Bioneer (대한민국 대전)에서 구입하였다. RNA 간섭에 사용된 TSPAN12 siRNA의 두 표적 서열은 다음과 같다: 5'-GUGACUACCUAAAUGUGAU-3' 및 5'-AUCACAAUUAGGUAGUCAC-3'. 리포펙타민 2000(lipofectamine 2000)(Invitrogen, CA, USA)을 사용한 형질감염 실험을 위해 세포를 6웰 플레이트에 웰당 4 × 10⁵ cell로 시딩(seed)하여 밤새 배양 후 60-70% 컨플루언스(confluence)를 달성하였다. 그 후, 제조사의 지시에 따라 리포펙타민-siRNA 복합체를 제조하였다. 형질감염 효율 및 암 진행 관련 검증은 48시간 후에 분석하였다.

실험예 4. 세포 증식 분석

세포 생존율은 수용성 테트라졸륨염 (tetrazolium salt) WST-1 (DoGenBio, 서울, 대한민국)의 대사 변화를 평가하여 증식 활성을 결정하는 비색 분석을 사용하여 군당 5회 이상 반복하여 측정하였다. 다형성교모세포종 세포에서 다양한 시간에 따른 생존률을 평가하고 배양 웰에 WST-1를 직접 첨가하고 37℃에서 60-120분 동안 배양함으로써 분석을 수행하였다. 그 후, 450 nm의 파장에서 흡광도를 평가하였다. 각 실험 조건에 대해 세 가지 개별 실험을 수행하였다.

실험예 5. 정량적 실시간 역전사 PCR(qRT-PCR)

총 RNA는 AccuPrep Universal RNA 추출 키트(Bioneer)를 사용하여 추출하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 AccuPower RT PreMix를 사용하여 총 RNA(0.5-1μg)를 역전사하였다. 정량적 실시간 역전사 PCR(Quantitative Real-Time Reverse Transcription PCR, qRT-PCR)에 사용된 프라이머 서열을 하기 표 1에 나열하였다. mRNA 발현은 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)의 발현으로 정규화하였다.

Gene	Forward	Reverse
*TSPAN12*	GTTCATCCGGTCATGATTGCT	CCACAAGCCAGTTCTACACAG
*SURVIVIN*	GGCCCAGTGTTTCTTCTGCTT	GCAACCGGACGAATGCTTT
*CDKN1A*	GCACTCAGAGGAGGCGCCATGTCA	GGGGCCCCGTGGGAAGGTAGAG
*CDH1*	GGTCGACAAAGGACAGCCTA	GGCGTAGACCAAGAAATGGA
*TWIST*	TCCAGAGAAGGAGAAAATGGA	CCCACGCCCTGTTTCTTTGA
*CD44*	GCTATTGAAAGCCTTGCAGAG	CGCAGATCGATTTGAATATAACC
*BMI-1*	ATGTGTGTGCTTTGTGGAG	AGTGGTCTGGTCTTGTGAAC
*NESTIN*	AACAGCGACGGAGGTCTCTA	TTCTCTTGTCCCGCAGACTT
*OCT4*	GACAACAATGAAAATCTTCAGGAGA	TTCTGGCGCCGGTTACAGAACCA
*GAPDH*	AATCCCATCACCATCTTCCA	TGGACTCCACGACGTACTCA

실험예 6. 세포 이동(migration) 및 3차원 스페로이드(spheroid) 침습(invasion) 분석

세포 이동 분석은 제조사의 프로토콜에 따라 l-Dish 35-mm-high culture inserts (Ibidi, Martinsried, Germany)을 사용하여 수행하였다. 간단히 말해서, 실험 전날에 다형성교모세포종 세포를 각 배양 삽입물에 시딩하고 배양하였다. 다음날, 핀셋을 사용하여 배양 삽입물을 제거하여 부착된 세포 사이에 비세포 간극을 만들었다. 이 간극으로의 세포 운동성은 17시간 후에 관찰되었다. 3차원 스페로이드 침습 분석을 위해, 96웰 둥근 바닥 플레이트(Thermo Fisher, New York, USA)에 10,000개의 세포를 2일 동안 시딩하여 스페로이드를 형성한 후, 이 스페로이드를 마트리겔(Corning, New York, USA)에 심고, 1 ml의 완전한 DMEM 배지를 첨가하였다. 18-96시간 후에 광학 현미경을 사용하여 침습을 측정하였다. 군당 5개의 스페로이드를 사용하여 침습을 분석하였다.

실험예 7. 웨스턴 블롯 분석

전체 세포 용해물을 생성하기 위해, RIPA 완충액(Thermo Fisher Scientific)을 프로테아제 억제제와 함께 사용하여 세포를 용해하였다. 대략 10-60 μg의 단백질 추출물을 SDS-PAGE를 통해 분리하고, PVDF 막으로 옮겼다. 차단 후, 막을 pFAK (#8556, Cell Signaling, MA, USA), total FAK (ab40794, Abcam), pERK (#9101, Cell Signaling), total ERK (#9102, Cell Signaling), MMP2 (ab37150, Abcam), VIMENTIN (sc-80975, Santa-Cruz, CA, USA), CD133 (orb114000, Biorbyt, Cambridge, UK), β-actin (#3700, Cell Signaling), 및 TSPAN12 (ab93179, Abcam, Cambridge, UK)에 대한 1차 항체와 함께 배양하고, horseradish peroxidase (Santa-Cruz)에 접합된 이차 항체와 함께 배양하였다. β-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다.

실험예 8. 면역형광 현미경

U87 세포를 빙냉 PBS로 2회 세척하고, 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 저온 PBS로 세척하고, 0.1% Triton X-100/PBS로 10분 동안 투과화하고, 1% BSA/0.1% Triton X-100/PBS에서 4℃ 밤새도록 TSPAN12에 대한 1차 항체와 함꼐 배양하였다. PBS로 세척한 후, 25℃에서 60분동안 형광이 접합된 2차 항체로 처리하여 면역표지된 단백질을 시각화하였다. 이후, PBS로 세포를 세척하고 DAPI로 염색한 후 마운트(mount)하였다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경(LSM 700, Carl Zeiss, NY, USA)을 사용하여 형광 이미지를 수득하였다.

실험예 9. 접착 분석

형질감염된 U87 세포를 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 분리하고, 1백만/ml의 농도로 무혈청 DMEM 배지에 재현탁하였다. 그 후, 다양한 세포외 기질 단백질(CBA-052, Cell Biolabs, San Diego, CA)이 미리 코팅된 웰 내부에 150 μl의 세포 현탁액을 첨가하였다. 1시간 후, 웰을 PBS로 5회 세척하고 염색용액 200 μl를 첨가하여 10분간 배양하였다. 또한, PBS로 웰을 다시 세척한 후 추출 완충액을 가하였다. 10분 후, 각각의 추출된 시료에서 150 μl를 96 웰 플레이트로 옮기고 560 nm에서 O.D.를 측정했습니다. 각 조건에 대해 4회 이상 반복하였다.

실험예 10. 환자 및 데이터 수집

표본 연구의 모든 다형성교모세포종 환자는 고려대학교 구로병원 기관심사위원회(IRB No. 2017GR0330)에서 승인한 지침 및 프로토콜을 준수하였다. 수집된 의료 기록에서 임상 데이터를 소급하여 조사하였다.

실험예 11. 통계 분석

데이터는 GraphPad Prism 9.0 소프트웨어(CA, USA)를 사용하여 분석하였으며, 평균 ± 표준 편차로 표시하였다. 군 간 비교는 정규 분포 데이터에 대한 Welch 보정(Welch t-검정)과 비정상 분포 데이터에 대한 만-화이트니 비모수 검정(Mann-Whitney t-test)을 사용하여 쌍으로 구성되지 않은 양 꼬리 t-검정(unpaired two-tailed t-test)을 사용하여 수행하였다. p <0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하여 p <0.05(*), p <0.01(**), p <0.001(***), p <0.0001(****)로 제시하였다. 생존곡선의 비교를 위해 log-rank(Mantel-Cox) 및 위험비(Mantel-Haenszel) 검정을 수행하였다.

[실험결과]

실험결과 1. TSPAN12는 정상 세포 대비 뇌 종양에서 높은 발현을 나타낸다.

본 발명자들은 단순 암에서 과발현된 바이오마커가 아닌 정상 대비 암에서 비교발현도가 높은 바이오마커를 발굴하기 위해 연구한 결과, 테트라스파닌-12(Tetraspanin-12, TSPAN12)를 암의 진단 및 치료 표적용 바이오마커로 발굴하였다. 보다 구체적으로, 본 발명은 주요 암 20 종, 25,768례의 유전자 빅데이터 분석을 통하여, TSPAN12가 뇌종양(brain tumor), 뇌종양 중 교모세포종(glioblastoma), 대장암(colon cancer), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer) 등에 있어 통계적으로 유의하게 높은 정상 대비 암 비교발현도를 보임을 확인하였다.

각각의 정상 대비 암 비교발현도를 Mann-Whitney test와 기타 통계학적 분석을 통하여 통계적 유의성 등을 확인한 결과, 뇌종양 2.473(p<0.0001), 뇌종양 중 교모세포종 2.730(p<0.0001), 대장암 1.044(p<0.0001), 난소암 1.759(p<0.0001), 전립선암 1.535(p<0.0001) 등의 결과를 나타내었다(도 2).

이를 통해 뇌종양, 교모세포종 등에 있어 TSPAN12가 유효한 진단 및 치료 표적인 바이오마커로의 활용 가능성이 있음을 확인하고, 추가적인 세포주 실험을 수행하였다.

실험결과 2. TSPAN12의 SiRNA 매개 하향 조절은 다형성교모세포종 세포 증식을 촉진한다.

다형성교모세포종 세포에서 TSPAN12의 역할을 평가하기 위한 실험을 수행하기 전에, TSPAN12 특이적 siRNA를 사용하여 TSPAN12 mRNA를 침묵화하였으며, 이는 실제 단백질 수준에서도 TSPAN12 발현을 낮추었다(도 3). TSPAN12 발현이 siRNA 형질감염을 통해 효과적으로 하향 조절되는지 여부를 확인하였다(도 4a). TSPAN12 발현 수준과 다형성교모세포종 진행 사이의 관계를 확인하기 위해, 일시적으로 TSPAN12-침묵 U87 세포에서 WST-1을 사용하여 세포 생존률 분석을 수행하였다. TSPAN12-녹다운 U87 세포는 대조군 스크램블된 siRNA 형질감염된 세포와 비교할 때, 증가된 세포 생존률을 나타내었다. 또한, TSPAN12 siRNA-녹다운 세포의 증식 속도는 이에 상응하는 대조군의 증식 속도보다 상당히 높았다(도 4b). 또한, TSPAN12 발현 수준은 p21을 암호화하는 세포 주기 조절자인 CDKN1A 및 잘 알려진 종양 증식 마커인 SURVIVIN의 mRNA 수준과 유의한 상관관계가 있었다(도 4c). 이러한 결과는 TSPAN12가 아마도 다형성교모세포종 세포 증식을 매개함을 시사한다.

실험결과 3. TSPAN12의 억제는 상피-중간엽 전환을 강화하여 다형성교모세포종 세포 이동을 유도한다.

대부분의 경우, U87 세포에서 TSPAN12를 일시적으로 하향 조절했을 때, 중간엽 유사 세포(mesenchymal-like cells)의 세포 표현형에서 길쭉하고 방추형 세포 모양과 같은 형태학적 변화가 관찰되었다(도 4d). TSPAN12 발현의 녹다운은 높은 생존율을 유도할 뿐만 아니라 다형성교모세포종 세포에서 세포침윤상승 형태인 극적(spindle shape) 형상을 형태학적 변화를 완화시켰다. 따라서 다음으로 세포 이동 분석을 수행하였다. TSPAN12 침묵이 대조군 세포와 비교하여 U87 세포의 상처 치유 특성을 방해한다는 것을 모니터링하였다(도 4e). 이후 상피-중간엽 전환(epithelial-mesenchymal transition, EMT) 과정에서 현저하게 조절되는 CDH1 및 TWIST에 대해 실시간 qPCR을 수행하였다(도 4f). 특히, CDH1의 발현은 TSPAN12가 없을 때 하향조절된 반면, TWIST의 발현은 mRNA 수준에서 상향조절되어 TSPAN12 녹다운이 EMT 절차를 유도함을 간접적으로 암시하였다. 또한, 웨스턴 블롯을 사용하여, 다형성교모세포종 세포에서 TSPAN12가 없을 때 대표적인 분자 마커 EMT, MMP2, TWIST, VIMENTIN 발현이 증가한다는 것을 입증하였다(도 4g). 이러한 데이터는 TSPAN12가 EMT 과정을 조절함으로써 다형성교모세포종 세포 운동성을 조절한다는 증거를 제공한다.

실험결과 4. TSPAN12의 고갈은 세포외 기질에 대한 접착력을 증가시켜 다형성교모세포종 세포 침습을 가속화한다.

TSPAN12 매개 다형성교모세포종 세포 이동성을 확인하기 위해, TSPAN12 특이적 siRNA 또는 대조군으로 일시적으로 형질감염된 U87 세포를 사용하여 침습 분석을 수행하였다. 대조군 siRNA로 형질감염된 세포와 비교할 때, TSPAN12 siRNA 형질감염된 세포에서 침습 능력이 향상되었음을 관찰하였다(도 5a). 앞서 언급한 결과를 추가로 확인하기 위해 실제 원발성 종양을 더 잘 설명할 수 있는 3D 스페로이드를 사용하고 3D 스페로이드 침습 분석을 수행하였다. 스페로이드를 생성하기 위해, 동일한 양의 일시적으로 형질감염된 세포를 96웰 둥근 바닥 플레이트에 시딩하고 침입 분석을 수행하기 위해 마트리겔에 임베딩하였다. 17-22시간 후, 종양 스페로이드는 "스타버스트(starbust)"라고 하는 전형적인 침습 패턴으로 가장자리에서 마트리겔로 다세포 가닥을 확장하였다. 세포는 96시간에 걸쳐 방사상으로 확산되었다. TSPAN12-침묵 스페로이드는 대조군 스페로이드와 비교할 때, 광범위하게 연장된 돌출부(protrusion)를 나타내었다(도 5b). 현재 3D 스페로이드 침습 분석에 사용되는 마트리겔은 EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스 육종에서 추출한 라미닌 및 콜라겐과 같은 세포외 기질(ECM) 단백질을 포함하기 때문에, 보다 신뢰할 수 있는 검증을 이끌어 내기 위해, 추가로 ECM 접착 분석을 수행하였다. 그 결과, TSPAN12가 고갈된 U87 세포가 대조군 siRNA 형질감염된 세포보다 콜라겐 I 및 콜라겐 IV에 대해 상당한 접착력을 나타냈다는 것을 확인하였다. 또한, TSPAN12 침묵 U87 세포는 대조군과 비교할 때 라미닌, 피브리노겐 및 피브로넥틴과 같은 다른 ECM 구성요소에 대한 부착이 증가된 것으로 나타났다(도 5c). 이전 연구에서 암세포에서 침습성 획득은 줄기세포 특성(stemness)을 동반한다고 보고된 바와 같이, 본 발명자들은 줄기세포의 보편적인 마커인 NESTIN과 BMI1의 발현을 분석하였다. 두 마커 모두 대조군 세포에 비해 TSPAN12가 고갈된 U87 세포에서 유의하게 상향 조절되어 TSPAN12가 U87 세포에서 획득된 줄기세포성을 침묵시켰다(도 5d). 웨스턴 블롯 분석 결과 또한 TSPAN12가 억제된 다형성교모세포종 세포에서 줄기세포성을 획득했음을 나타내었다(도 5e). 이러한 결과는 TSPAN12의 부재가 다형성교모세포종 세포 이동과 침습성을 촉진한다는 점을 시사한다.

실험결과 5. TSPAN12는 CREB 및 HSP27 활성화를 통해 FAK-ERK 신호 전달 경로를 조절한다.

국소 유착 키나아제(focal adhesion kinase, FAK) - 세포외 신호 조절 키나아제(extracellular signaling regulated kinase, ERK) 신호 전달 캐스케이드는 다형성교모세포종 세포 악성 양상에서 잘 설명된 경로이기 때문에, 다음으로 대조군 또는 TSPAN12 siRNA 형질감염된 U87 세포에서 총 FAK 및 ERK 발현과 비교하여 인산화된 FAK 및 ERK의 발현 수준을 조사하였다. 두 인산화된 단백질 발현은 대조군과 비교하여 TSPAN12가 고갈된 U87 세포에서 증가하였다(도 6a). TSPAN12와 관련된 다른 기본 메커니즘을 발견하기 위해, 인단백질(phosphoprotein) 농축 분석을 위한 프로테옴 프로파일러 인광체-키나아제(phosphor-kinase) 분석을 수행하였다. 그 결과, TSPAN12 siRNA 형질감염된 세포에서 여러 인단백질이 유의하게 증가되었으며(도 6c), 그 중 CREB(S133) 및 HSP27(S78/S82)의 인산화 수준이 극적으로 변화하였다(도 6b).

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims

테트라스파닌-12(tetraspanin-12, TSPAN12) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 뇌종양 진단용 바이오마커 조성물.
제1항에 있어서,
상기 뇌종양은 성상세포종(astrocytoma), 다형성교모세포종(glioblastoma multiforme), 핍지신경교종(oligodendroglioma), 핍지교성상세포종(oligoastrocytoma), 상의세포종(ependymoma), 수모세포종(medulloblastoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 뇌수막종(meningioma), 뇌하수체선종(pituitary adenoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 및 맥락총유두종(choroid plexus papilloma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 바이오마커 조성물.
테트라스파닌-12 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 뇌종양 진단용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 테트라스파닌-12 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자와 결합하는 화합물, 항체, 압타머, 올리고펩티드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid), 올리고뉴클레오티드, 프라이머, 및 프로브로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 조성물.
제3항에 있어서,
상기 뇌종양은 성상세포종(astrocytoma), 다형성교모세포종(glioblastoma multiforme), 핍지신경교종(oligodendroglioma), 핍지교성상세포종(oligoastrocytoma), 상의세포종(ependymoma), 수모세포종(medulloblastoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 뇌수막종(meningioma), 뇌하수체선종(pituitary adenoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 및 맥락총유두종(choroid plexus papilloma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제3항의 조성물을 포함하는, 뇌종양 진단용 키트.
제6항에 있어서,
상기 키트는 테트라스파닌-12 단백질을 펩티드화하기 위한 시약 및 단백질 가수분해효소를 추가로 포함하는, 키트.
제6항에 있어서,
상기 키트는 테트라스파닌-12 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트, 및 핵산 증폭용 시약을 추가로 포함하는, 키트.
환자의 생물학적 시료로부터 테트라스파닌-12 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 뇌종양 진단을 위한 정보제공방법.
제9항에 있어서,
상기 단계 이후에 측정된 발현 수준이 악성뇌종양의 예후가 좋은 개체에서 측정된 테트라스파닌-12 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준보다 낮은 경우, 뇌종양 예후가 나쁜 것으로 판별하는 단계를 포함하는, 정보제공방법.
제9항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 환자 유래의 조직, 객담, 세포, 혈액, 혈장, 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 정보제공방법.
제9항에 있어서,
상기 발현 수준은 웨스턴 블롯, 단백질 칩, 효소면역분석법(ELISA), 방사선면역분석, 면역침강법, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 보체 고정 분석법, 유세포 분석(FACS), 조직 마이크로어레이, 노던 블롯, 및 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 측정하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
제9항에 있어서,
상기 뇌종양은 성상세포종(astrocytoma), 다형성교모세포종(glioblastoma multiforme), 핍지신경교종(oligodendroglioma), 핍지교성상세포종(oligoastrocytoma), 상의세포종(ependymoma), 수모세포종(medulloblastoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 뇌수막종(meningioma), 뇌하수체선종(pituitary adenoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 및 맥락총유두종(choroid plexus papilloma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.