CN111053774B - 盐酸他克林在制备治疗胆管癌的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了盐酸他克林在制备治疗胆管癌的药物中的应用。在本发明中，通过外显子测序，确定了CCA患者中CLK3的关键Q607体细胞突变，该CLK3突变体作为癌基因在促进CCA中从头嘌呤合成的重要作用。同时，筛选出盐酸他克林作为抑制CLK3异常CCA的潜在药物，为包含CLK3失调的CCA提供了新的治疗策略。

Description

盐酸他克林在制备治疗胆管癌的药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，更具体地，本发明涉及盐酸他克林在制备治疗胆管癌的药物中应用。
背景技术
胆管细胞源性胆管癌，简称胆管癌(英文名称缩写：CCA)，是原发性肝恶性肿瘤，根据解剖位置分为肝外和肝内(Maroni等，2013)。全球范围内，CCA的发病率正在增加，其预后仍然令人沮丧。到目前为止，尚无可唯一识别的CCA标记物，其治疗选择很少。尽管已显示出诸如ERBB2，FOXM1和Yap之类的几种危险因素可促进CCA的发生 (Sugihara等，2019)，但在大多数CCA患者中通常并未发现它们。最近，遗传学研究增强了对正常胆管细胞获得人CCA恶性转化特性的分子机制的理解(Marks和Yee，2016)。因此，朝这个方向的更多努力可能构成开发新的诊断方法和更有效的CCA治疗方法的基础。
CDC样激酶3(英文名称缩写：CLK3)是一种核双特异性激酶，在含有丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸的底物上起作用(Nayler等，1997)。CLK3通过磷酸化富含丝氨酸/精氨酸(SR) 的蛋白(例如SRSF1和SRSF3)来调节RNA剪接(Cesana等人，2018)。CLK3失调已被证明是在不同类型的人类肿瘤中的高渗透因子，但其在肿瘤中的功能尚不清楚(Bowler 等人，2018)。
分析Oncomine数据库发现，CLK3的基因组DNA在食道癌(ESCA)和胃癌(GC) 中也经常被扩增。但是，KEGG功能途径分析未表明其参与嘌呤合成。CLK3可能代表一种独特的激酶，对于CCA细胞从头嘌呤合成至关重要。该证实强烈支持CLK3作为CCA 中治疗靶标的潜力，这将为治疗这种破坏性疾病提供新的方法。本发明还证实，盐酸他克林盐酸盐是FDA批准的用于治疗阿尔茨海默氏病的药物，可以重新用于CCA治疗。
了解遗传驱动基因突变的功能后可极大地促进靶向癌症治疗的发展。利用FDA批准的美国药物收藏，盐酸他克林被确认为有效下调CCA中CLK3水平的一种候选药物。盐酸他克林是一种胆碱酯酶抑制剂，已被FDA批准用于治疗阿尔茨海默氏病(de losRíos和Marco-Contelles，2019年)。有报道盐酸他克林或其衍生物显示出强大的抗癌能力(Qin 等人，2018)。在临床中已证明盐酸他克林具有良好的安全性和高效力。因此，该药可能成为治疗人CCA的候选药物，它也可以作为与CLK3相关的研究的有用工具。
发明内容
在本发明中，证明了CLK3在胆管癌(CCA)中显着上调，并在CLK3激酶结构域中鉴定了代表功能获得性突变的复发性Q607R体细胞替代。通过比较CCA细胞的代谢谱进一步证实了CCA患者中较高的CLK3表达主要与核苷酸代谢重编程有关。CLK3在Y708 处直接磷酸化USP13，促进其与c-Myc的结合，从而阻止Fbx1414介导的c-Myc泛素化并激活嘌呤代谢基因的转录。CCA相关的CLK3-Q607R突变体可诱导USP13-Y708磷酸化并增强c-Myc的活性；反之，c-Myc转录上调CLK3。以上发现表明，CLK3在CCA嘌呤代谢中起关键作用，具备潜在的治疗用途，针对CDC样激酶3的含量水平与胆管癌的相关性，确定了盐酸他克林是抑制CLK3异常CCA的潜在药物。
本发明的目的是在于提供盐酸他克林在制备治疗胆管癌的药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种治疗胆管癌的药物组合物。
本发明的技术方案如下：
盐酸他克林在制备治疗胆管癌的药物中的应用。
本发明的另一技术方案如下：
一种治疗胆管癌的药物组合物，该药物组合物的有效成分包括盐酸他克林。
进一步，该药物组合物的有效成分为盐酸他克林。
本发明的有益效果是：在本发明中，通过外显子测序，确定了CCA患者中CLK3的关键Q607体细胞突变，该CLK3突变体作为癌基因在促进CCA中从头嘌呤合成的重要作用。同时，筛选出盐酸他克林作为抑制CLK3异常CCA的潜在药物，为包含CLK3失调的CCA提供了新的治疗策略。
附图说明
图1为实施例1中CCA与其他消化系统癌症的CLK3表达量及CCA不同阶段的CLK3 表达量、存活率和IHC分析图。其中，A为消化系统肿瘤中CLK3mRNA平均表达量的 TCGA分析图；B为CLK3表达量与CCA患者生存期关系图；C为GSE26566数据中正常人群与CCA患者群的CLK3表达量对比图；D为100个CCA患者的CLK3表达量及 mRNA表达量的QPCR队列分析图；E为100个CCA患者的CLK3表达量与肿瘤大小、转移情况、疾病阶段的柱形关系图；F为正常人与不同阶段CCA患者的CLK3表达量的 IHC分析图；G为100个CCA患者的CLK3表达量的Kaplan-Meier分析图。
图2为实施例2的小鼠实验中沉默CLK3与CCA细胞的侵略性各种关系图。其中，A为Dox诱导的CLK3敲低后HuCCT1细胞的增殖图；B为Dox诱导的CLK3敲低后 HuCCT1细胞的增殖曲线图；C为Dox诱导的CLK3敲低后HuCCT1细胞的BrdU掺入测定图；D为Dox诱导的CLK3敲低后HuCCT1细胞的锚定非依赖性生长比较图；E为Dox 诱导的CLK3敲低后HuCCT1细胞的伤口愈合实验分析图；F为Dox诱导的CLK3敲低后 HuCCT1细胞的穿孔实验分析图；G为Dox诱导的CLK3缺乏后HuCCT1细胞对小鼠异种移植物的影响分析图；H为HuCCT1细胞中CLK3的Dox诱导性敲低与CCA小鼠腹部转移性结节的数量关系图。
图3中从各方面证明实施例3中通过重新编程嘌呤代谢来上调CLK3而促进CCA的发展。其中，A为CCA患者中具有CLK3高丰度的前500个上调基因的热图；B为CCA 患者中CLK3高表达的前20个生物学过程的P值分析对比图；C为HuCCT1细胞中Dox 诱导的CLK3敲低的代谢谱图；D为HuCCT1细胞中Dox诱导的CLK3敲低的主要代谢途径的示意图；E为HuCCT1细胞中DoCC诱导的CLK3敲低对15N嘌呤中间体的抑制作用分析图；F为HuCCT1细胞中DoCC诱导的CLK3敲低对14C-甘氨酸的抑制作用分析图；G为CLK3沉默对决定HuCCT1细胞中嘌呤代谢的基因的影响分析图；H为CLK3 表达量与HuCCT1细胞的增殖的关系示意图；I为ATIC抑制剂与HCCC9810细胞的增殖的关系示意图。
图4为实施例4中c-Myc的稳定性和核易位对嘌呤从头合成和CCA进程的影响示意图。其中：A为HuCCT1细胞中引入c-Myc对shCLK3介导的嘌呤代谢产物的影响分析图 (1)；B为HuCCT1细胞中引入c-Myc对shCLK3介导的嘌呤代谢产物的影响分析图(2)； C为CLK3表达量对HuCCT1细胞(左)或HCCC9810细胞(右)中c-Myc mRNA丰度的影响分析图；D为使用环己酰亚胺处理的HuCCT1的细胞的c-Myc半衰期分析图；E为使用环己酰亚胺处理的HCCC9810的细胞的c-Myc半衰期分析图；F为MG132对HuCCT1 细胞中c-Myc降解的影响分析图；Gi为CLK3表达量对HuCCT1细胞中c-Myc细胞易位的影响示意图；Gii为CLK3表达量对HCCC9810细胞中c-Myc细胞易位的影响示意图。
图5为实施例5中CLK3在Y708处与USP13相互作用结果示意图。其中，A为 HCCC9810细胞中的邻近依赖性生物素实验分析图；B为HuCCT1细胞中CLK3和USP13 的核共定位的免疫荧光染色示意图；C为GST下拉测定实验分析图；D为放射自显影技术测定体外激酶结果示意图；E为CLKP3诱导的USP13的磷酸化位点的MS分析结果示意图；F为USP13-Y708F对CLK3介导的磷酸化的影响示意图；G为特异性抗磷酸化 USP13-Y708抗体用于检测USP13磷酸化结果示意图(1)；H为特异的抗磷酸化USP13-Y708抗体用于检测USP13磷酸化结果示意图(2)；I为EGF或TGFβ1处理后的 HCCC9810细胞的蛋白质印迹示意图。
图6为实施例6中通过Y708的CLK3检验USP13磷酸化的生理意义示意图。其中， A为HuCCT1细胞中CLK3的敲低后的结果示意图；B为HCCC9810细胞中CLK3的过表达的结果示意图；C为邻近结扎试验(PLA)结果示意图；D为ZDOCK和Pymol软件预测的USP13-Y708磷酸化与c-Myc相互作用的结构计算模型示意图；E为WT-USP13的过表达对HEK293细胞中c-Myc蛋白的半衰期的影响示意图；F为由蛋白质印迹确定的 c-Myc的泛素化结果示意图；G为不同处理后的HCCC9810细胞的ChIP测定结果示意图； H为不同处理后的c-Myc在嘌呤相关酶的启动子上的表达示意图；I为小鼠模型中 WT-USP13及其磷酸化突变体对CCA肿瘤体积的影响曲线图；J为小鼠模型中WT-USP13 及其磷酸化突变体对CCA肿瘤转移的影响曲线图。
图7为实施例7中人类CCA中CLK3的突变、激活情况分析。其中，Ai为100位CCA 患者中CLK3体细胞突变的示意图；Aii为Sanger测序以鉴定100个人类CCA中的CLK3 突变示意图；Bi为IP激酶测定结果柱形图；Bii为IP激酶测定结果免疫印迹示意图；Ci 为人CCA相关的CLK3突变体对HCCC9810细胞增殖的影响示意图；Cii为人CCA相关的CLK3突变体对HCCC9810集落形成的影响示意图；Di为人类CCA相关的CLK3突变体对HCCC9810细胞伤口愈合的影响示意图；Dii为人类CCA相关的CLK3突变体对 HCCC9810细胞侵袭的影响示意图；E为HCCC9810细胞中嘌呤代谢的CCA患者中的 WT-CLK3及其突变体热图；F以15N2标记CCA患者的WT-CLK3及其突变体对HCCC9810 细胞中嘌呤中间体的影响分析图；G以13C1标记CCA患者的WT-CLK3及其突变体对 HCCC9810细胞中嘌呤中间体的影响分析图；H以14C标记CCA患者的WT-CLK3及其突变体对HCCC9810细胞中DNA与RNA的影响。
图8为实施例9中盐酸他克林对CCA患者CLK3异常表达的抑制作用分析。其中， A为使用美国药物收集筛选CLK3抑制剂的示意图；B为20种候选药物对CLK3表达量影响的热图分析；C为稳定表达CLK3-Q607R或空载体的HCCC9810和HuH-28细胞经盐酸他克林处理24小时后的免疫印迹图；D为不同处理后HCCC9810和HuH-28细胞中嘌呤的含量示意图；E为盐酸他克林对稳定表达CLK3-Q607R突变体的HCCC9810细胞侵袭性的影响的曲线图；F为盐酸他克林对稳定表达CLK3-Q607R突变体的HCCC9810细胞侵袭性的影响的柱形图；G为盐酸他克林对不同处理后小鼠CCA生长的影响示意图。
图9为实施例10中CCA患者样本中CLK3，p-USP13-Y708，c-Myc和ATIC之间的临床相关性分析。其中，A为两位CCA患者标本中CLK3，p-USP13-Y708，c-Myc和ATIC 蛋白表达的IHC分析图(比例尺＝100μM)；B为CCA(n＝103)患者的CLK3， p-USP13-Y708，c-Myc和ATIC蛋白表达的Pearson相关系数分析图；C为CCA患者的 OS数据的Kaplan-Meier数据分析图；D为CCA中的CLK3功能示意图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
材料和方法
细胞培养，试剂和抗体：HEK293T，正常人肝内上皮胆管细胞(以HiBEC为对照) 和CCA细胞系(HuCCT1，RBE，HuH-28和HCCC9810)由中国科学院上海细胞银行， ScienCell和American Type提供。
胎牛血清(FBS)，13C-甘氨酸，X膜和3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)分别来自Millipore和Sigma。蛋白酶抑制剂混合物获自Santa Cruz。14C-甘氨酸来自Perkin Elmer。Lipofectamine 2000，PBS，抗生素和DMEM培养基购自Invitrogen。吐温20和X胶片由Sigma提供。定点诱变试剂盒(安捷伦)是QuikChange II。Alexa Fluor 488Phalloidin来自ThermoFisher。列出了以下抗体：抗谷胱甘肽S-转移酶(GST)抗体 (Abcam#ab19256)，抗FlagM2缀合的琼脂糖来自Sigma，抗His(Abcam，#ab18184)， CLK3(Santa CruzBiotechnology，#sc-365225)，ADSL(GeneTex#GTX84956)，Fbx114 (Sigma，#SAB2103691)，ATF4(Santa Cruz Biotechnology#sc-390063)，CLK2(Abcam， #ab86147)，GAPDH(Abcam，#ab9485)，c-Myc(Abcam，#ab39688)，ATIC(圣克鲁斯生物技术，#sc-53612)，MITF(Abcam#ab20663)，CLK1(Abcam，#ab74044)， GMPS(Abeam，#ab135538)，CLK4(Abcam，#ab67936)，PFAS(Abcam，#ab251740)，磷酸丝氨酸(Abcam，#ab9332)，微管蛋白(Abcam，#ab18251)，USP13抗体(Bethyl Laboratories，#A302-762A)，磷酸苏氨酸(Abcam，#ab9337)，磷酸酪氨酸(Abcam，# ab10321)，磷酸丝氨酸/苏氨酸(Abcam，#ab17464)使用与之前所述类似的方法(Hong 等，2018)通过该实验室制备了二抗(Bio-Rad，#1706515和#1706516)，p-USP13-Y708特异性抗体。
针对CLK3筛选化合物：CLK3-Q607R突变体被稳定转染到HCCC9810和HuH-28细胞中。然后将这些细胞用96孔板培养至50％融合。将来自美国药物收集中心的1280种药物分别添加1μM到每个孔中。12小时后，将CCA细胞用PBS洗涤。然后测量荧光强度以确定转染的CCA细胞中CLK3的水平。
转染，构建体，shRNA和siRNA：对于Tet诱导的CLK3过表达，按照制造商的说明使用了Tet-On 3G诱导表达系统(Clontech)。即，将CLK3 eDNA或flag-CLK3克隆到Tet 诱导型载体中，将pTRE3G(Clontech)与HCCC9810或HuH-28细胞用pCMV-Tet-3G质粒(500μg/mL G418，稳定转染2周)使用Xfect转染试剂(Clontech)生成Tet-On 3G细胞系。然后，在嘌呤霉素选择下(1μg/mL，持续2周)用pTRE3G-CLK3转染Tet-On 3G 细胞系，以产生双稳态Tet-On 3G诱导型细胞系。对于Tet诱导的CLK3敲低，将针对CLK3 的两个不同的shRNA(shCLK3-#1和#2)分别克隆到pLVCT-tTR-KRAB(Addgene质粒#11643)中，在其中用嘌呤霉素替换了GFP。对于转染，如先前报道的那样(Zhu等人，2018)，HuCCT1和RBE细胞通过pLVCT-tTR-KRAB-shCLK3和 pLVCT-tTR-KRAB-shcontrol慢病毒颗粒自旋接种转染，感染复数(MOI)为：大约两周的抗生素选择(1μg/mL)后，建立了具有shcontrol或shCLK3的稳定多克隆CCA细胞系。根据实验要求，将以上细胞维持在不存在或存在强力霉素(Dox)条件的情况下。对于siRNA 转染，按照协议，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)对siATF4，siMyc，siMITF或加扰阴性对照(Invitrogen)进行siRNA转染。免疫印迹用于确定转染后两天的敲除效率。来自圣克鲁斯生物技术的所有siRNA和shRNA是：shCLK3-#1： 5′-AGTCAGACATCAAGACACAC-3′(SEQ IDNO.001)；shCLK3-#2： 5′-GAUGCUUGAUCUUGCACAATT-3′(SEQ ID NO.002)；或shcontrol：5′-AATGCTCGCACAGCACAAG-3′(SEQ ID NO.003)；siMITF： 5′-GAAACUUGAUCGACCUCUACA-3′(SEQ ID NO.004)；siATIC： 5′-CAGUCUAACUCUGUGUGCUACGCCA-3′(SEQ ID NO.005)；siATF4： 5′-CCACGUAUGACACUUGTT-3′(SEQ ID NO.006)；SiC-Myc#1： 5′-TCCGTACAGCCCTATTTCA-3′(SEQ ID NO.007)；SiC-Myc#2： 5′-GTTCTAATTACCTCATTGTCT-3′(Invitrogen)(SEQ ID NO.008)；CLK3，c-Myc和USP13 构建体购自GeneChem。如先前所述(Hong等人，2014)，构建了来自不同基因(例如CLK3 和USP13)的突变体或截短片段。并且测序被用来验证所得的突变体。
CCA患者的样本收集：在这项研究中，从2012年至2017年在安徽医科大学和哈尔滨医科大学附属医院收集了所有CCA患者的组织样本和相应的非肿瘤样本。该研究伦理由哈尔滨医科大学研究所研究伦理委员会通过。每个CCA参与者都签署了知情同意书。病理学家在组织病理学上确认了所有用于RNA分离和免疫组织化学(IHC)的肿瘤组织。根据美国联合委员会(第7版)，肿瘤分期转移(TNM)是一种癌症分期系统，用于定义组织学类型和癌症分期。
免疫印迹：如前所述，使用裂解缓冲液RIPA收集CCA组织或细胞系(Song等，2018)。BCA蛋白试剂(Pierce)用于测量蛋白浓度。变性10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离所有样品，然后将其转移到PVDF膜上。使用含5％牛奶的TBST封闭1小时后，将指示的一抗在4℃下添加到PVDF膜上过夜。如前所述(Qu等人，2016)，加入二抗并通过可视化印迹观察增强的化学发光(Pierce)。
免疫共沉淀：如前所述(Qu等人，2016)，将指示的抗体添加到500μg预先清除的样品中，并在4℃旋转约8小时。然后将A&G珠(Sigma)与样品混合3小时。最后，对免疫沉淀复合物进行印迹分析。
聚合酶链反应：购买了TRIzol(Thermo Fisher Scientific)可以从CCA细胞或CCA组织中纯化指定的RNA。然后，购买随机引物和逆转录试剂盒(Invitrogen)，将总RNA逆转录成互补DNA(cDNA)。随后，RT-PCR由Applied Biosystems完成。各个基因的引物由Invitrogen合成。通过2-ΔΔΔCT方法分析了指示蛋白的相对水平。内源性对照是 GAPDH。所有引物序列为：CLK1，5′-ACAAGACATTATAGAGCACCGGA-3′(SEQ ID NO.009)和5′-GTGGTCCAAGAATCCTTTCCATC-3′(SEQ ID NO.010)；USP13， 5′-GCGAAATCAGGCTATTCAGG-3′(SEQ ID NO.011)和 5′-TTGTAAATCACCCATCTTCCTTCCC-3′(SEQ ID NO.012)；CLK2， 5′-CGAACACTATCAGAGCCGAAAG-3′(SEQ ID NO.013)和 5′-GAACGTGGTAGCTGTCCTCC-3′(SEQ IDNO.014)；CLK3， 5′-CGTACCTGAGCTACCGATGGA-3′(SEQ ID NO.015)和 5′-TCCCTTCGGGACGGGTATC-3′(SEQ ID NO.016)；CLK4， 5′-ATGCGGCATTCCAAACGAAC-3′(SEQ IDNO.017)和 5′-GTACTGCTGTGAGACCTTCTCT-3′(SEQ ID NO.018)；ATF4， 5′-TTCTCCAGCGACAAGGCTAAGG-3′(SEQ ID NO.019)， 5′-CTCCAACATCCAATCTGTCCCG-3′(SEQ IDNO.020)；GMPS，5′- ATGGCTCTGTGCAACGGAG-3′(SEQ ID NO.021)和 5′-CCTCACTCTTCGGTCTATGACT-3′(SEQ ID NO.022)；PFAS， 5′-CCCAGTCCTTCACTTCTATGTTC-3′(SEQ ID NO.023)和 5′-GTAGCACAGTTCAGTCTCGAC-3′(SEQ ID NO.024)；ADSL，5′-TAGCGACAGGTATAAATTCC-3′(SEQ ID NO.025)和 5′-TCTCCTGCCCTTGCTTTCCT-3′(SEQ IDNO.026)；GART， 5′-GGAATCCCAACCGCACAATG-3′(SEQ ID NO.027)，和 5′-AGCAGGGAAGTCTGCACTCA-3′(SEQ ID NO.028)；ATIC， 5′-CACGCTCGAGTGACAGTG-3′(SEQ IDNO.029)和5′-TCGGAGCTCTGCATCTCCG-3′ (SEQ ID NO.030)；c-Myc5′-AATGAAAAGGCCCCCAAGGTAGTTATCC-3′(SEQ ID NO.031)和5′-CGTACTGGAGAGTTCCGGTTTG-3′(SEQ ID NO.032)；GAPDH， 5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′(SEQ ID NO.033)和5′-CACCACATCGCTCAGACAC-3′ (SEQ ID NO.034)。
体内去泛素化：将指示的构建体转染到指示的细胞中48小时。在收集这些细胞之前，添加5μg/mL MG132(Bio-Rad)并孵育约4h。然后将细胞在含有0.1M NaH2PO4和 Na2HPO4、6M胍盐酸盐，10mM咪唑和400mM Tris-HCl的变性缓冲液中裂解。在冷室中将这些裂解物与镍珠混合三小时。最后，用指定的抗体进行免疫印迹。
代谢物测定：如前所述(Ben-Sahra等人，2016)，LC/MS/MS用于分析指定细胞的细胞内代谢产物。即，使用不含甘氨酸的DMEM洗涤指示的细胞，然后向细胞中加入含有 400μM[13C1]-甘氨酸的相同培养基30分钟。使用4mL 80％甲醇在干冰上提取代谢物。在 4℃下以4000xg纺丝后，通过在4℃下以20,000xg纺丝，用0.5mL 80％甲醇分离不溶性沉淀物。来自Organomation Associates的N-EVAP用于在氮气下干燥代谢产物。将 10μLHPLC级水添加到重悬的沉淀中，然后进行MS分析。最后，使用Multi/Quant v2.0 软件AB/SCIEX分析代谢物的SRM过渡，并使用SRM分析LC-MS/MS中15N或13C 的结合情况。
通过质谱鉴定CLK3结合蛋白和USP13磷酸化位点：如前所述，基于BioID2的筛选用于鉴定CLK3结合蛋白(Kim等，2016)。即，将myc-BioID2-CLK3或myc-BioID2稳定转染到HCCC9810细胞中。将50mM生物素添加到这些细胞的培养基中两天。然后通过旋转并保留上清液来提取蛋白质。通过使用AssayMap链霉抗生物素蛋白小柱纯化生物素化的蛋白质。最后，进行了LC-MS/MS分析。并且USP13的磷酸化位点如先前所述 (Caporarello等人，2017)被确定。
软琼脂测定：将CCA细胞在顶部琼脂(0.4％)中，在6孔板中选取1孔进行进行培养(每孔5000个细胞)。大约三周后，使用0.05％的结晶紫将菌落染色1小时。使用数码相机计数菌落。重复所有实验至少三次。
细胞侵袭试验：对于侵袭测定，使用具有8μm孔的孔和Matrigel(Corning Co.)来测量CCA细胞系的侵袭能力。即，在转染48小时后，将指示的每孔2×104个细胞在上室中用100μL不含FBS的培养基培养。然后将500μL培养基添加到下部腔室中，其中包括 10％的FBS，用作化学吸引剂。24小时后，用棉签擦拭留在上层膜上的细胞，同时保留被侵袭的细胞。在4％甲醛中固定后，使用1％结晶紫将入侵的细胞染色。倒置显微镜(尼康)用于计数十个随机视野。
MTT测定：在12孔板中培养了约1×104个细胞。将4μg/mL Dox加入培养基中三天。然后在37℃下加入1mL MTT试剂处理细胞30分钟。并加入1mL酸性异丙醇。在595nm 处，通过在650nm处进行背景扣除分析吸光度。
伤口愈合(刮擦)实验：如前所述进行实验(Mereness等人，2018)。即，将指示的细胞以每孔3×105在包被的12孔板上培养，并生长至汇合24小时。使用移液器吸头在每个孔中垂直刮擦单层。分别在0小时和24小时拍摄刮擦图像。
GST下拉测定：如前所述(Song等，2014)，大肠杆菌用于表达GST融合蛋白。然后IPTG诱导其表达。使用购自Sigma的谷胱甘肽-琼脂糖4B珠纯化蛋白。带有GST标签的CLK3或USP13，以及GST(约10μg)在反应缓冲液(pH 8.0)中通过盐酸二氢嘧啶亚氨酸二甲酯与谷胱甘肽-琼脂糖交联。用样品缓冲液洗脱后，用考马斯染色和蛋白质印迹法分析样品。
萤光素酶报告基因检测：培养HEK293T细胞以进行双荧光素酶报告基因检测，即，在铺板后使用Lipofectamine 2000过夜，将0.2μg萤火虫启动子荧光素酶报告基因构建体(WT-CLK3或CLK3突变启动子)与指定质粒共转染。对照组是PGL-TK海肾荧光素酶质粒。双荧光素酶系统购自Promega。荧光素酶活性取三个重复实验的平均值。
染色质免疫沉淀(ChIP)：如(Song等人，2019)所述，用于c-Myc基序的引物分别为(5′-GACGGAGTTTTGCTCTCTTG-3′)(SEQ ID NO.035)和 (5′-CTGCCTCCCGGGTTTAAGTG-3′)(SEQ ID NO.036)： (5′-CTCCCACCTCAGCCTCC-3′)(SEQ ID NO.037)和(5′-AGGCGCGTGCCACCACGTCT-3′)(SEQ ID NO.038)； (5′-CATGTTGGCCAGACTGGTCT-3′)(SEQ IDNO.039)和 (5′-GCCTCCCAAAGTACTGGGAT-3′)(SEQ ID NO.040)； (5′-CTCAAAAGATCCCCACCTCA-3′)(SEQ ID NO.041)和 (5′-GCCTCGTAATCCTGTCCGAC-3′)(SEQ IDNO.042)。
小鼠异种移植实验及转移模型：根据NIH指南，进行了小鼠实验。安徽医科大学和哈尔滨医科大学的机构动物委员会批准了动物规程。对于异种移植或转移模型，将1×106Dox诱导的敲低或CLK3细胞及其相应的对照细胞过表达分别皮下或腹膜内或静脉内注射到4～6周龄的BALB/c-nu/nu小鼠中(n＝6～10/组)。给予小鼠含有2mg/mL Dox和10％蔗糖的饮用水，以诱导CLK3的敲低或过表达。在注射后的指定时间点监测异种移植物肿瘤或转移性腹膜肿瘤或转移性肺肿瘤。在指定的时间，如先前所述计算肿瘤的大小和体积 (Qu等人，2016)。
组织阵列和免疫组化(IHC)染色：CCA组织微阵列(TMA)购自Alenabio Company，如前所述(Hong等人2018)对CLK3进行了IHC染色，对IHC染色进行了评估并按以下等级进行评分：0、1+，2+和3+，分别代表无染色，弱，中，强染色。最终的H分数是根据先前报道的公式计算的(Ma等)。指示的蛋白水平由H评分定义，然后将低表达和高表达患者分组。
免疫沉淀激酶分析：如前所述(Bankston等，2017)，进行了IP激酶测定。即，将裂解物(1mg)与抗HA抗体(Santa Cruz Biotechnology，#sc-57592)混合。24小时后，加入蛋白G-琼脂糖珠(Santa Cruz Biotechnology，#sc2002)。将免疫复合物重悬于含有1mm Na3VO4的缓冲液中。通过使用磷酸纤维素纸试验，如下检测了免疫沉淀的CLK3活性。在混合物中加入一种衍生自SRSF1蛋白磷酸化位点的合成肽(1mM)(CLK3的已知底物) 作为底物(0.4mMATP，1mm Na3VO4、20mM Tris，[γ32P]ATP和pH 7.4)，10mM MgCl2)。 30分钟后，在30℃，10％三氯乙酸终止反应。然后将混合物作为点装载在p81磷酸纤维素纸上。闪烁计数用于确定32P掺入肽中。
TCGA和基因表达综合分析：有关CCATCGA数据集的全基因组RNA测序(RNA-seq) 日期可通过以下网址下载：https://xenabrowser.net。没有生存数据的患者被排除在外。从TCGA数据集和Gepia(http://gepia.cancer-pku.cn/)获得了相关的临床特征，包括年龄，性别，病理TNM，疾病分期，生存时间和检查者。CCA中有关CLK3分析的mRNA阵列数据可在Gene Expression Omnibus(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/；登录号GSE26566) 中公开获得。使用Graphpad Prism 5软件绘制表达模式。
体外激酶测定：将1μg重组CLK3蛋白和纯化的WT-USP13或其突变蛋白与含有10μMATP和0.2mM Na3VO4和10μCi[γ-32P]ATP的1X反应缓冲液混合。反应在30℃下进行 15分钟。然后分离混合物，并通过成像板-放射自显影系统检测掺入的[γ-32P]放射性同位素。
BrdU分析：简要地，将指示的细胞(约4000个细胞/孔)接种到96孔板中。24小时后，使用化学发光的5-溴脱氧尿苷(BrdU)试剂盒(Sigma)检查CCA细胞的增殖。
统计：使用t检验比较两组的结果；使用单向方差分析比较来自两组以上的数据；使用了双向方差分析增长曲线；使用皮尔逊相关分析阐明两种蛋白质的相关性；使用GraphPad Prism 5，R软件包(版本3.0.0)和Social Sciences软件20.0(SPSS)的程序确定Kaplan-Meier数据需要进行对数秩检验；通过平均值±SD报告数据，至少重复三次；* P＜0.05在统计学上被认为是显着的。**P＜0.01或***P＜0.001非常显着，而#则没有显着性。
实施例1：
通过分析TCGA中具有各种组织学亚型的1508个消化系统肿瘤的基因表达谱，证明了CCA和其他消化系统癌症中的CLK3水平显着上调并与总体生存期降低相关：
(1)CLK3与非肿瘤对照组相比显着上调，与其他肿瘤相比，CCA中CLK3表达水平的变化最为明显(图1A)。
(2)CLK3高表达患者的存活率显着降低，表明CLK3在人体消化系统中可能具有促癌作用(图1B)。
(3)对GSE26566开放数据和CCA细胞系的分析证实，与对照相比，CLK3表达有所增强(图1C)。
(4)通过100名CCA患者的队列分析进一步证实了CLK3表达上调并且与肿瘤的大小，分期和转移呈正相关(图1D-F)。比例尺＝100μm。如材料和方法中所述，对使用 Allred评分的IHC信号进行评分。
(5)通过两个Kaplan-Meier数据证实了CLK3水平较高的CCA患者的总生存期(OS)较短(图1G)。
实施例2：
通过以下系列小鼠实验数据证明CLK3沉默将抑制CCA细胞的侵袭性。
(1)MTT分析用于测量有或没有4μg/mL Dox诱导的CLK3敲低的HuCCT1细胞的增殖，Dox引起的CLK3缺乏严重损害HuCCT1细胞的增殖和BrdU的掺入(图2A-C)。
(2)在RBE细胞中，CLK3敲低抑制HuCCT1细胞的锚定非依赖性生长，(图2D)。上述效应暗示CLK3是直接致癌基因。
(3)伤口愈合和穿孔实验证明CLK3在CCA细胞中的侵袭功能(图2E，2F)。
(4)HCCC9810细胞中的过表达增强了小鼠异种移植肿瘤的发展(图2G)。
(5)CLK3的敲低显着减少CCA腹部转移性结节的数量(图2H)。
以上发现证实了CCA中CLK3的促肿瘤活性。
实施例3：
以下数据有力证实CLK3主要激活CCA中的从头嘌呤合成：
(1)如图3A，通过评估人CCATCGA的转录组，检查CLK3表达变化的前500个差异表达基因(结果表明，CCA患者中高CLK3表达主要是重新编程肿瘤代谢，特别是嘌呤代谢(图3B)。
(2)通过质谱(MS)收集Dox诱导的CLK3敲低的HuCCT1细胞的代谢谱，证明 CLK3沉默主要下调了嘌呤中间体的细胞内池(图3C-D)，表明CCA细胞中的CLK3沉默主要抑制了嘌呤的合成。
(3)DoCC诱导的HuCCT1细胞中的CLK3敲低显着抑制了15N嘌呤中间体(IMP， AMP和GMP)的数量(图3E，上图)。
(4)13C-甘氨酸进入嘌呤中间体的通量时，观察到相似的结果(图3E，下图)。
(5)Dox诱导的CLK3敲低显着降低了HuCCT1细胞中14C-甘氨酸标记的DNA和 RNA的水平(图3F)。
(6)DoCC诱导的HuCCT1细胞CLK3敲低显着抑制了从头嘌呤合成途径必需的关键酶(图3G)。
(7)CLK3沉默强烈抑制HuCCTl细胞的增殖和侵袭能力后，补充嘌呤或ATIC(嘌呤合成途径中的一种关键酶)的过表达可恢复HuCCT1细胞的增殖和侵袭能力(图3H)。
(8)ATIC抑制剂可显着恢复由CLK3过表达诱导的HCCC9810细胞的增殖，迁移和侵袭(图3I)。
以上实验数据表明CLK3上调至少通过重新编程从头嘌呤代谢来促进CCA的发展。
实施例4：
以下实验数据将证明CLK3通过增强c-Myc的稳定性和核转位，促进嘌呤从头合成和 CCA进程。
(1)引入c-Myc逆转了shCLK3介导的对嘌呤代谢的作用(图3C和图4A-B)。
(2)CLK3过表达上调了c-Myc的蛋白水平，但没有影响其mRNA水平(图4C)。
(3)HCCC9810细胞中WT-CLK3具有相反的效果(图4D-E)。
(4)MG132可恢复由CLK3沉默介导的c-Myc下调(图4F)。
(5)WT-CLK3的过表达增强了c-Myc核易位，而CLK3的缺乏则具有相反的作用(图4Gi-4Gii)，数据表明CLK3的过表达通过增强c-Myc的转录活性来促进嘌呤合成。
以上数据表明CLK3的过表达增强了CCA细胞中c-Myc蛋白的稳定性，以及c-Myc 是CCA中CLK3下游的必需效应子。
实施例5：
以下实验数据将证明CLK3在Y708直接与USP13相互作用并使之磷酸化。
(1)在HCCC9810细胞中进行邻近依赖性生物素(BioID2)实验以阐明CLK3稳定 c-Myc的调控机制。通过筛选确定，验证了两个真正的CLK3相互作用子SRSF1和SRSF3 (Cesana等人，2018)的方法(图5A)。
(2)USP13与HuCCT1细胞中的内源性CLK3或HEK293细胞中的外源性CLK3共免疫沉淀和共定位(图5B)。
(3)下拉实验表明USP13与CLK3的直接结合(图5C)。
(4)使用Ni-NTA琼脂糖珠固定细菌纯化的His-CLK3蛋白。然后将这些珠子与纯化的GST-USP13和[γ-32P]ATP激酶缓冲液孵育。进行放射自显影。体外激酶测定结果表明，WT-CLK3能够直接磷酸化USP13(图5D)。
(5)MS将USP13中高度保守的酪氨酸708鉴定为CLK3介导的磷酸化位点(图5E)。
(6)USP13-Y708突变为苯丙氨酸(Y708F)消除了CLK3介导的磷酸化作用(图5F)。
(7)用或不用EGF或TGFβ1处理HuCCT1和RBE细胞。使用USP13进行IP。由该小组生产的特异性抗磷酸-USP13-Y708抗体用于检测USP13磷酸化。通过EGF (50ng/mL)或TGFβ1(10ng/mL)处理具有或不具有CLK3-K186M转染的HuCCT1细胞。使用USP13进行IP。特异的抗磷酸化USP13-Y708抗体用于检测USP13磷酸化。在不改变HuCCT1和RBE细胞中USP13的水平的情况下，CCA相关的EGF和TGFβ1处理将内源性磷酸USP13-Y708的水平显着提高大约三倍(图5G)。但CLK3-K186M转染削弱了这种增加(图5H)。
(8)将稳定表达Flag-CLK3和His-USP13的HCCC9810细胞用EGF(50ng/mL)或 TGFβ1(10ng/mL)处理60分钟。如所示进行蛋白质印迹。分别分析了pTyr磷酸酪氨酸， pSer磷酸丝氨酸，pThr磷酸苏氨酸。经EGF或TGFβ1处理后，在HCCC9810转染的 Flag-CLK3中，His-USP13在酪氨酸处被磷酸化，而在丝氨酸或苏氨酸处未被磷酸化(图5I)。
以上数据表明了USP13是CCA中CLK3的新基板。
实施例6：
以下通过Y708的CLK3以检查USP13磷酸化的生理意义，证实Y708上USP13的 CLK3依赖性磷酸化通过激活c-Myc介导的嘌呤合成促进CCA进展。
(1)HuCCT1细胞中的CLK3敲低将极大地损害USP13与c-Myc的相互作用(图6A)。
(2)用His-WT-USP13或USP13-Y708F或与Flag-CLK3一起转染HCCC9810细胞，并用MG132处理。使用His抗体进行Co-IP。HCCC9810细胞中CLK3的过表达将促进 c-Myc与WT-USP13的结合(图6B)。
(3)邻近结扎试验(PLA)进一步证实了以上结果，表明HCP9810细胞中USP13 与c-Myc结合的接近连接测定法(图6C)。
(4)根据ZDOCK和pymol软件的预测，USP13的Y708位于c-Myc和USP13之间的界面，Y708的磷酸化通过增加亲水性极大地增强了USP13与c-Myc的结合亲和力。计算分子对接，以分析USP13-Y708磷酸化与c-Myc相互作用的分子机理。通过ZDOCK和 Pymol软件预测的结构计算模型表明，Y708磷酸化对于USP13与c-Myc的直接结合是必需的(图6D)。
(5)用WT-USP13或磷酸突变体转染HEK293T细胞，然后用CHX处理。如所示进行蛋白质印迹。CHX追踪分析表明，WT-USP13(特别是拟磷酸化的USP13-Y708E)的过表达，将明显上调HEK293细胞中c-Myc蛋白的半衰期(图6E)。
(6)将HEK293T细胞用WT-USP13或具有HA标签的遍在蛋白和MG132的磷酸缺乏或模拟磷酸突变体处理。进行蛋白质印迹以确定c-Myc的泛素化。HEK293细胞中的 USP13-Y708E转染被显着抑制，而USP13-Y708F则显着增加c-Myc泛素化(图6F)。以上数据表明Y708处的USP13磷酸化将还原Fbx114介导的c-Myc泛素化。
(7)USP13-Y708E显着促进了c-Myc在嘌呤相关酶的启动子上的募集(图6G)，从而增强了它们的表达(图6H)。
(8)在体内，WT-USP13，特别是USP13-Y708E构建体在HCCC9810细胞中的表达显着增强了CCA细胞的转移和生长，而USP13-Y708F构建体在植入裸鼠后对癌变具有抗性(图6I和J)。
实施例7：
IP激酶测定。即，用表达WT-CLK3或其突变体的HEK293细胞的抗HA抗体免疫沉淀CLK3。免疫沉淀蛋白与SRSF1蛋白(CLK3的已知底物)合成肽和[γ-32P]ATP混合。磷酸纤维素纸试验用于测量激酶活性。对于WT-CLK3，将结果标准化为1.0。
通过对CLK3的所有外显子进行测序以揭示CLK3在CCA中的临床意义，鉴定了100名CCA患者的复发性体细胞突变，可见CLK3在人类CCA中经常被突变和激活。
(1)在8％的患者中发现了两个错义突变(Gln607Arg或Q607R和Arg634Cys或R634C)(图7A)。
(2)Q607R突变体极大地增加了CLK3的活性，而R634C没有明显的作用(图7Bi)。
(3)Q607R突变体上调了Y708处的USP13磷酸化(图7Bii)。
(4)与HCCC9810细胞中的CLK3-K186M过表达相比，WT-CLK3或CLK3-Q607R/ R634C突变体的过表达显着促进了侵略性，而Q607R的增强作用显着大于WT(图 7Ci-7Dii)。
(5)Q607R对嘌呤合成途径的增强作用显着大于WT中的增强作用(图7E-7H)。
以上实验结果表明，在CCA患者中，CLK3的致癌作用通常被其Q607R突变激活。
实施例8：
以下通过筛选具有异常CLK3表达或Q607R突变体的CCA治疗药物，实验证明盐酸他克林能够抑制CLKA表达异常的CCA。
(1)将来自美国药物收藏的1280种化合物分别添加到稳定表达EGFP-CLK3-Q607R的HCCC9810细胞中(图8A)。结果表明，有20种化合物降低了CLK3-Q607R的荧光，其中盐酸他克林盐酸盐的命中率最高(图8B)。
(2)盐酸他克林可显着降低CCA细胞中CLK3-Q607R增强的嘌呤生成和 USP13-Y708磷酸化(图8C-D)。
(3)盐酸他克林抑制稳定表达CLK3-Q607R突变体的HCCC9810细胞的增殖和侵袭(图8E-F)。
(4)在体内，盐酸他克林可显着抑制CLK3-Q607R过表达的小鼠中CCA的生长(图8G)。
以上实验数据证实了盐酸他克林可能是CLK3表达异常或突变的人CCA的候选化合物。
实施例9：
以下实验数据将说明CCA患者组织中CLK3，p-USP13-Y708，c-Myc和ATIC之间的临床相关性。
(1)通过检查103例CCA患者样品中的CLK3，p-USP13-Y708，c-Myc和ATIC，进行IHC分析，结果表明这些标记之间存在显着正相关(图9A)。
(2)使用Pearson分析进一步验证了CCA患者样品中的CLK3，p-USP13-Y708，c-Myc和ATIC之间的正相关性(图9B)。
(3)Kaplan-Meier数据表明，CCA中CLK3，p-USP13-Y708和c-Myc的高水平与不良OS显着相关(图9C)。
(4)以上实验数据表明EGF或TGFβ1或人类CCA相关的CLK3突变体激活CLK3，从而增强USP13的p-Y708水平。此事件显着增加了USP13与c-Myc的结合并破坏了 Fbxl14介导的c-Myc泛素化，从而激活了从头嘌呤的生物合成途径并促进了CCA的发展。激活的c-Myc转录上调了CLK3表达。靶向CLK3/USP13/c-Myc反馈环在治疗人类CCA 中具有重要作用(图9D)。
以上细胞和遗传研究不仅将CLK3识别为CCA中的另一个显着突变基因，而且还证明了CLK3-Q607R突变体是CCA患者中的功能获得性突变，可加速致癌性CLK3驱动的 CCA进程。以上数据阐明了CCA中以前无法识别的机制，从而为包含CLK3突变的CCA 提供了一种新的可行的治疗策略。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 盐酸他克林在制备治疗胆管癌的药物中的应用
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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1.盐酸他克林在制备治疗胆管癌的药物中的应用。
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