CN108273062A

CN108273062A - Foxm1抑制剂在肝内胆管细胞癌治疗中的作用

Info

Publication number: CN108273062A
Application number: CN201810270919.0A
Authority: CN
Inventors: 陈迪宇; 吴健; 戴龙飞; 刘华
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2018-03-29
Publication date: 2018-07-13

Abstract

本发明属于医药技术领域，本发明经过广泛而深入的研究发现，FOXM1在胆管细胞癌中高表达并和预后相关，FOXM1抑制剂通过增加凋亡抑制胆管细胞癌增殖，FOXM1敲低可以增加胆管细胞癌对于顺铂的敏感性，且FOXM1抑制剂联合顺铂抑制胆管细胞癌增殖。由此可知，FOXM1在胆管细胞癌的发生和发展过程中扮演着重要的角色，为胆管细胞癌的诊断与治疗提供了新思路。

Description

FOXM1抑制剂在肝内胆管细胞癌治疗中的作用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及FOXM1抑制剂在肝内胆管细胞癌治疗中的作用。

背景技术

胆管细胞癌(CCAs)是一类胆道上皮来源的恶性肿瘤，具有胆管细胞的分化特性。可以根据解剖位置不同，分为肝内胆管细胞癌(ICC)，肝门部胆管癌以及肝外胆管细胞癌(ECC)。在过去的四十年里，肝内胆管细胞癌的整体发病率在全球范围内逐步增加。目前，对于肝内胆管细胞癌的主要手段是手术治疗。然而对于无法进行根治性切除或伴有周围组织器官转移的病人，临床上使用顺铂联合吉西他滨的化疗方案(亦称为GP化疗方案)作为对于这些病人的一线治疗。然而，该种治疗方案对于改善肝内胆管细胞癌病人预后的作用十分有限。并且肝内胆管细胞的基因变异异质性较大，无法寻找特异性的靶向治疗药物。迄今为止，最大规模的多中心临床研究发现肝内胆管细胞癌病人对于GP化疗的敏感性和预后均较差，治疗效果不佳。所以，我们迫切需要寻找针对肝内胆管细胞癌的可行治疗策略。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供FOXM1抑制剂在肝内胆管细胞癌治疗中的作用。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供了FOXM1抑制剂在制备胆管细胞癌治疗药物中的用途。

进一步地，所述胆管细胞癌包括但不限于肝内胆管细胞癌、肝门部胆管癌以及肝外胆管细胞癌。

进一步地，所述胆管细胞癌治疗药物至少具有以下功用之一：

减少胆管细胞癌细胞增殖速率、诱导胆管细胞癌细胞凋亡、增加胆管细胞癌细胞凋亡比例、增加胆管细胞癌细胞死亡率、抑制胆管细胞癌细胞增殖、抑制胆管细胞癌细胞增长、抑制胆管细胞癌肿瘤生长、减小胆管细胞癌肿瘤体积。

进一步地，所述FOXM1抑制剂是指对FOXM1具有抑制效果的分子。

对FOXM1具有抑制效果包括但不限于：抑制FOXM1活性，或者抑制FOXM1基因转录或表达、抑制FOXM1蛋白水平。

所述FOXM1抑制剂可以为siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。

如本发明实施例列举的，所述可以为siRNA、shRNA、Siomycin A。

所述胆管细胞癌治疗药物必然包括FOXM1抑制剂，并以FOXM1抑制剂作为前述功用的有效成分。

所述胆管细胞癌治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为FOXM1抑制剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。

亦即，FOXM1抑制剂为所述胆管细胞癌治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

所述胆管细胞癌治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

所述胆管细胞癌治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述胆管细胞癌治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

本发明的第二方面，提供一种治疗胆管细胞癌的方法，为向对象施用FOXM1抑制剂。

所述FOXM1抑制剂同本发明第一方面前所述。

所述的对象可以为哺乳动物或哺乳动物的胆管细胞癌细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。所述胆管细胞癌细胞可以为离体胆管细胞癌细胞。

所述对象可以是罹患胆管细胞癌的患者或者期待治疗的胆管细胞癌的个体。或者所述对象为胆管细胞癌患者或者期待治疗胆管细胞癌的个体的胆管细胞癌细胞。

FOXM1抑制剂可以在接受胆管细胞癌治疗前、中、后向对象施用。

本发明的第三方面，提供一种胆管细胞癌治疗药物，包括有效剂量的FOXM1抑制剂。

所述FOXM1抑制剂同本发明第一方面所述。

本发明的第四方面，提供FOXM1抑制剂用于制备胆管细胞癌化疗药物敏感性促进剂的用途。

所述FOXM1抑制剂同本发明第一方面所述。

进一步地，所述FOXM1抑制剂用于提高胆管细胞癌细胞或肿瘤对胆管细胞癌化疗药物的敏感性。

所述提高是指与未施用FOXM1抑制剂、而只施用胆管细胞癌化疗药物相比。

进一步地，所述胆管细胞癌化疗药物选自顺铂、吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、亚叶酸钙、表阿霉素、草酸铂、替吉奥、伊立替康、多西紫杉醇。

本发明第五方面，提供FOXM1抑制剂与胆管细胞癌化疗药物联合用于制备胆管癌治疗药物的用途。

所述FOXM1抑制剂同本发明第一方面所述。

本发明的第六方面，提供一种胆管癌治疗药物组合，包括有效量的FOXM1抑制剂和至少一种其他胆管细胞癌治疗药物。

所述FOXM1抑制剂同本发明第一方面所述。

所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

一)将FOXM1抑制剂和其他胆管细胞癌治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。

当其他胆管细胞癌治疗药物为抗体时，一般采用胃肠外给药型。当其他胆管细胞癌治疗药物为化学药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化学药物的已知给药途径给药。当其他胆管细胞癌治疗药物为化学药物时，所述化疗药物选自顺铂、吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、亚叶酸钙、表阿霉素、草酸铂、替吉奥、伊立替康、多西紫杉醇。

二)将FOXM1抑制剂和其他胆管细胞癌治疗药物配置成复方制剂，在将FOXM1抑制剂和其他胆管细胞癌治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。

本发明的第七方面，提供一种治疗胆管细胞癌的方法，为向对象施用有效量的

FOXM1抑制剂以及向对象施用有效量的其他胆管细胞癌治疗药物和/或向对象实施其他胆管细胞癌治疗手段。

所述FOXM1抑制剂同本发明第一方面所述。

可以同步地或顺序地给予有效量的FOXM1抑制剂和至少一种有效量的其他胆管细胞癌治疗药物。

基于FOXM1为本发明首次发现的胆管细胞癌治疗靶点，在与FOXM1抑制剂以外的其他胆管细胞癌治疗药物联合用药中，至少可以起到疗效相加的效果，进一步增强对于胆管细胞癌的治疗作用。

其他的胆管细胞癌治疗药物包括但不限制于：抗体药物、化学药物或靶向型药物等。

所述胆管细胞癌抑制剂可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。所述其他胆管细胞癌治疗药物可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。对于抗体药物，一般采用胃肠外给药。

当其他胆管细胞癌治疗药物为化学药物时，所述化疗药物选自顺铂、吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、亚叶酸钙、表阿霉素、草酸铂、替吉奥、伊立替康、多西紫杉醇。

进一步地，所述其他胆管细胞癌治疗手段为化疗。

本发明的第八方面，提供FOXM1抑制剂在制备具有以下任一项或多项作用的药物中的用途：

本发明的第九方面，提供FOXM1用于制备胆管细胞癌检测试剂的用途。

进一步地，所述胆管细胞癌检测试剂用于胆管细胞癌的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。

可基于FOXM1基因序列，制备特异性扩增FOXM1基因或转录本的引物或特异识别FOXM1基因或转录本的探针，从而作为胆管细胞癌检测试剂。

也可以基于FOXM1蛋白，制备特异性识别FOXM1蛋白的试剂，从而作为胆管细胞癌检测试剂。

本发明的第十方面，提供特异性识别FOXM1的试剂用于制备胆管细胞癌检测试剂盒的用途。

进一步地，所述胆管细胞癌检测试剂盒用于胆管细胞癌的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。

特异性识别FOXM1的试剂，可以是特异性扩增FOXM1基因或转录本的引物或特异识别FOXM1基因或转录本的探针。所述特异性扩增FOXM1基因或转录本的引物可以是引物对。所述引物对具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列。

特异性识别FOXM1的试剂，也可以是特异性识别FOXM1蛋白的试剂。所述特异性识别FOXM1蛋白的试剂可以是FOXM1蛋白的抗体。所述抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明经过广泛而深入的研究发现，FOXM1在胆管细胞癌中高表达并和预后相关，FOXM1抑制剂通过增加凋亡抑制胆管细胞癌增殖，FOXM1敲低可以增加胆管细胞癌对于顺铂的敏感性，且FOXM1抑制剂联合顺铂抑制胆管细胞癌增殖。由此可知，FOXM1在胆管细胞癌的发生和发展过程中扮演着重要的角色，为胆管细胞癌的诊断与治疗提供了新思路。

附图说明

图1A：在20对肝内胆管细胞癌组织和癌旁组织标本中使用荧光定量PCR(RT-PCR)测定FOXM1的mRNA表达量。

图1B：在20对肝内胆管细胞癌组织和癌旁组织标本中使用Western blotting测定FOXM1的蛋白水平表达量，代表性的8对结果呈现在本图中。

图1C：在20对肝内胆管细胞癌组织和癌旁组织标本中免疫组化染色结果。

图1D：不同FOXM1免疫组化染色结果比较。

图1E：对90例肝内胆管细胞癌术后病人进行预后分析。

图1F：对胆管癌细胞系(CCLP-1,HuCCT-1,HCCC-9810,RBE)及正常上皮细胞(HIBEC)进行FOXM1的表达量蛋白测定。

图2A：在60例肝内胆管细胞癌术后接受GP化疗方案的病人进行预后分析：病人总体预后随着FOXM1的表达量升高而降低。

图2B：FOXM1高表达的胆管癌细胞系在顺铂处理下细胞活性比FOXM1低表达细胞系要高。

图2C：将胆管癌细胞系中的FOXM1表达敲低后，检测其和阴性对照相比在顺铂作用下的细胞活性改变。

图2D：用FOXM1敲低和正常肝内胆管癌细胞构建皮下成瘤模型，每4天测量1次肿瘤体积。

图2E：将小鼠皮下成瘤组织取材后使用Ki67进行免疫组化染色。

图3A：使用FOXM1抑制剂(Siomycin A)处理后，使用CCK-8检测CCLP-1、HuCCT-1细胞的细胞活性。

图3B：使用FOXM1抑制剂(Siomycin A)处理后，CCLP-1、HuCCT-1的克隆形成结果。

图3C：使用FOXM1抑制剂(Siomycin A)处理后，使用流式细胞分析CCLP-1、HuCCT-1的凋亡比例。

图3D：Western blotting检测FOXM1抑制剂(Siomycin A)处理后CCLP-1、HuCCT-1的凋亡相关蛋白的表达差异性改变。

图3E：皮下成瘤模型中使用FOXM1抑制剂(Siomycin A)后，测量不同处理情况下肿瘤体积增长情况。

图3F：将FOXM1抑制剂(Siomycin A)处理组、空白对照组小鼠皮下成瘤组织取材后使用Ki67进行免疫组化染色结果。

图4A：Siomycin A+顺铂处理组、顺铂处理组、空白对照组使用CCK-8检测细胞活性结果。

图4B：Siomycin A+顺铂处理组、顺铂处理组、空白对照组使用CCK-8检测细胞活性结果。

图4C：Siomycin A+顺铂处理组、顺铂处理组、空白对照组中CCLP-1、HuCCT-1的克隆形成结果。

图4D：Siomycin A+顺铂处理组、顺铂处理组、空白对照组小鼠皮下成瘤组织取材后使用Ki67进行免疫组化染色结果。

图4E：Western blotting检测Siomycin A+顺铂处理组、顺铂处理组、空白对照组的凋亡相关蛋白的表达差异性改变。

图4F：将双药联合组和顺铂单药组细胞提取蛋白，用Western blotting检测凋亡相关蛋白的蛋白水平的表达，发现双药联合组的细胞中凋亡相关蛋白表达量明显比顺铂单药处理组升高。

具体实施方式

本发明通过临床调查发现，在肝内胆管细胞癌中接受GP化疗方案(亦即顺铂联合吉西他滨的化疗方案)治疗的病人整体预后随着FOXM1的表达升高而逐渐下降。那么FOXM1是否和肝内胆管细胞癌的化疗敏感性相关呢？

由于顺铂是一类临床上广泛使用的常规化疗药物，所以本发明选择将顺铂作为后续试验的研究药物靶点。通过研究发现这种现象背后的机制，结果显示可能是由FOXM1在肝内胆管细胞癌中通过减少在顺铂治疗情况下诱导的细胞凋亡产生的。而且本发明还发现，FOXM1可以对E2F1产生负性转录调控作用，这个过程对胆管细胞癌中的p53依赖型凋亡至关重要。这些研究结果表明，FOXM1是对于改善肝内胆管细胞癌的顺铂敏感性，增强化疗效果的新型治疗策略的重要分子。

FOXM1

FOXM1是一个在机体内发挥重要作用的转录因子，FOXM1的全称为Forkhead BoxM1，属于FOX蛋白质超家族中的一员，具有特征性的高度保守翼螺旋DNA结合域。

FOXM1抑制剂

指对于FOXM1具有抑制效果的分子。对于FOXM1具有抑制效果包括但不限于：抑制FOXM1活性，或者抑制FOXM1基因转录或表达、抑制FOXM1蛋白水平。所述FOXM1抑制剂包括但不限于siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。

抑制FOXM1活性是指使FOXM1活力下降。优选地，相比抑制前，FOXM1活力下降至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，更佳的降低至少80％，最佳的降低至少90％。

抑制FOXM1基因转录或表达是指：使FOXM1的基因不转录，或降低FOXM1的基因的转录活性，或者使FOXM1的基因不表达，或降低FOXM1的基因的表达活性。

本领域技术人员可以使用常规方法对FOXM1的基因转录或表达进行调节，如基因敲除、同源重组，干扰RNA等。

FOXM1的基因转录或表达的抑制可以通过PCR及Western Blot检测表达量验证。

优选地，与野生型相比，FOXM1基因转录或表达降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地FOXM1基因完全没有表达。

小分子化合物

本发明中指由几个或几十个原子组成，分子质量在1000以下的化合物。本发明实施例中列举了所述FOXM1抑制剂可以是Siomycin A。Siomycin A的中文名称是盐霉素A、分子式是C₇₁H₈₁N₁₉O₁₈S₅、分子量是1648.9、CAS号是12656-09-6。

FOXM1抑制剂制备胆管细胞癌治疗药物

以FOXM1抑制剂为主要活性成分或主要活性成分之一制备胆管细胞癌治疗药物。通常，药物中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。

“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。

“药学上可接受的载体或辅料”应当与FOXM1抑制剂相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。

本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。

联合治疗药物组合和施用方法

所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

一)将FOXM1抑制剂和其他胆管细胞癌治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。使用时，可几种药同时使用，也可几种药先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对机体有效的期间内向机体施加其他药物。

抗体常用的用药方法为静脉注射、静脉滴注或动脉灌注。其用法用量可参考现有技术。

小分子化合物常用的用药方法可以是胃肠道给药或者是胃肠外给药。siRNA、shRNA、抗体则一般采用胃肠外给药。可以是局部给药亦可以为全身给药。

使用时，可将有效量的FOXM1抑制剂和有效量的其他胆管细胞癌治疗药物同时使用，也可将有效量的FOXM1抑制剂和有效量的其他胆管细胞癌治疗药物先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对生物体有效的期间内向生物体施加其他药物。

特异性FOXM1的试剂用于制备胆管细胞癌检测试剂盒的用途

本发明还对20例胆管细胞癌肿瘤组织和癌旁正常组织的FOXM1的mRNA表达量用RT-PCR进行检测，发现和癌旁组织相比肿瘤标本中的FOXM1表达量明显升高(P<0.01)。接下来在胆管癌细胞系(CCLP-1,、HuCCT-1、HCCC-9810和RBE)和正常胆管上皮细胞(HIBEC)中检测FOXM1的蛋白水平表达高低，发现胆管癌细胞系中FOXM1表达明显高于正常胆管上皮细胞。为了进一步分析FOXM1和肝内胆管细胞癌病人的预后关系，本发明还选取了60例胆管细胞癌手术病人进行Kaplan-Meier分析。结果，总体中位生存期为23.1个月，FOXM1低表达的病人中位生存期为34个月，而FOXM1高表达病人中位生存期仅为19.7个月。总体来说FOXM1和肝内胆管细胞癌的预后密切相关。这些结果提示FOXM1在胆管细胞癌的发生和发展过程中扮演着重要的角色，而它可以作为胆管细胞癌的一个预后标志物以及新的治疗靶标。

基于本发明人的上述新发现，可将FOXM1作为诊断胆管细胞癌的的标志物：(i)作为胆管细胞癌的分型、鉴别诊断，和/或易感分析的标志；(ii)评估相关人群的胆管细胞癌治疗药物、药物疗效、患者预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)评估相关人群胆管细胞癌患病风险、检测并进行早期防治。比如，可分离出由FOXM1基因或蛋白表达异常而易患胆管细胞癌的人群，从而可进行更有针对地防治。

因此，本发明提供了特异性识别FOXM1的试剂，用于制备胆管细胞癌检测试剂盒。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1

一、实验路线

(1)FOXM1在肝内胆管细胞癌的表达情况：

提取20例ICC患者肿瘤组织及配对癌旁组织的冰冻标本的mRNA，并收集他们的肿瘤及癌旁组织石蜡标本，利用实时荧光定量PCR、免疫组化等技术验证FOXM1在ICC肿瘤组织以及癌旁组织的表达情况。此外，应用免疫组织化学方法对91例肝内胆管细胞癌患者肿瘤组织和21例正常人肝组织的组织芯片进行了分析。

(2)预后分析：根据免疫组化结果，探究FOXM1与肝内胆管细胞癌病人临床病理特征及预后之间的关系。

(3)FOXM1表达与顺铂药物敏感性密切相关：提取60例ICC术后接受GP方案化疗的患者肿瘤组织，收集他们的肿瘤组织石蜡标本，利用免疫组化等技术验证FOXM1在ICC肿瘤组织表达情况。根据免疫组化结果，分析在不同FOXM1表达状态下的病人总体预后情况。

(4)抑制FOXM1可以增加顺铂敏感性：在肝内胆管细胞癌细胞系中，通过慢病毒载体转染FOXM1小干扰RNA的方式干扰FOXM1的表达，通过细胞层面，如CCK-8试验、克隆形成试验等；通过动物层面，构建异种皮下成瘤模型，观察FOXM1表达量降低后对于顺铂抑癌作用的影响。从而探索FOXM1对于顺铂在肝内胆管细胞癌中药效的影响作用。

(5)抑制FOXM1可以增加细胞凋亡，减少肿瘤增殖：FOXM1抑制剂在肝内胆管细胞癌细胞系中，通过加入FOXM1抑制剂(Siomycin A)，通过细胞层面的实验，如划痕实验、Transwell实验等，探索FOXM1在肝内胆管细胞癌细胞增殖、凋亡的过程中所发挥的作用。

(6)FOXM1和顺铂的联合化疗作用：在肝内胆管细胞癌细胞系中，将FOXM1抑制剂和顺铂两种药物联合，评价该种新型治疗方案的药效及生物安全性。

二、实验方法

1.临床标本

我们选取了2008至2011年在浙江大学附属第一医院接受了外科手术治疗或者肝脏移植的肝内胆管细胞癌患者的91例肿瘤标本和31例肿瘤旁正常肝脏组织标本。这些患者的标本均在术中冰冻标本切片和术后的病理报告诊断为肝内胆管细胞癌。我们收集样本的过程中的每一个步骤都符合国家的相关法律规定。

2.细胞株

四株肝内胆管细胞癌细胞系(CCLP-1，HuCCT-1，HCCC-9810和RBE)均从上海细胞研究所购买。

3.细胞复苏，培养传代和冻存

(1)细胞复苏：复苏细胞前将水浴锅的温度设定为37℃。迅速解冻后，立即将细胞倒入含2ml培养基的15ml离心管中进行离心，离心后弃上清，再用培养基将管底的细胞团块进行吹打。(2)细胞培养与传代：CCLP-1，HuCCT-1，HCCC-9810和RBE细胞用含10％FBS的RPMI1640培养基进行培养。根据细胞的生长状态，决定细胞是换液还是传代。若细胞状态很好并且细胞融合度有77％时，就需要给细胞进行传代。传代的具体步骤如下：弃掉25cm2细胞培养瓶中的液体，然后加入1ml的胰酶。(3)细胞冻存：在保证细胞生长状态非常好的前提下进行细胞冻存以备后用。冻存液现配现用。

4.Cell Counting Kit-8(CCK-8)实验

(1)各实验组经过相应处理后消化并计数细胞，使之完全分散为单个细胞，以每孔4000个细胞的浓度将其接种到96孔板中。每组细胞接种5块96孔板中，分别标上0小时、24小时、48小时、72小时和96小时。每孔体积为190μL，在37℃，5％CO2培养条件下培养。(2)6个小时后，细胞完全贴壁，取出标有0小时的96孔板，弃掉原有培养基，加入100μL无血清的混合培养基(其中里面含有10μL CCK8试剂)，将换好液体的96孔板放回培养箱中孵育2小时；孵育结束后取出96孔板，轻轻前后摇晃，通过在酶标仪中选取光波范围450nm检测吸光度值(OD值)，检测0小时的CCK-8值。(3)其余的96孔板，每天在相同的时间节点，检测各时间点的CCK-8值，方法同上。(4)重复三次以上独立实验。

5.克隆形成实验

(1)各实验组经过相应处理后消化并计数细胞，使之完全分散为单个细胞。(2)将混匀的细胞接种在6孔板中，密度为1000个/孔。(3)放入培养箱进行培养观察，10-14d左右取出。(4)吸出上层培养液，用4％多聚甲醛固定20分钟，用0.01％结晶紫染色10分钟，PBS漂洗3次，显微镜下进行统计。

6.凋亡实验

(1)各实验组经过相应处理后，选取生长状态良好的细胞，消化并计数，以30万个细胞每孔的浓度将其均匀接种到6孔板中。(2)24小时后将原有的培养液更换成无血清细胞培养液的，继续培养1天。将细胞消化，800转离心5分钟，弃上清。(3)用PBS将细胞小心重悬，以1000转的速度离心3分钟，弃上清，重复2次。(4)得到的细胞团块采用500μL的BindingBuffer重悬细胞，然后加入APC/PI凋亡试剂，轻柔地吹匀细胞。(5)室温避光条件下放置20分钟，流式细胞仪上机进行分析。

7.RNA反转录及荧光定量PCR

(1)用提取的RNA进行反转录得到cDNA，反应体系如下：

混匀后进行快速离心，然后放入PCR仪之中，37℃反应15min，85℃反应5s，然后放在冰上保存，得到的即为cDNA产物，然后往其中加入30μl的ddH2O进行稀释，稀释后放-20℃保存或者直接进行荧光定量PCR。

(2)配制qPCR所用反应液，如下：

在冰上配制反应液，每个样品的每个检测基因均设置三个复孔，将配制好的样品加入到96孔或384孔的PCR板中，放入qRCR仪器之中。

(3)qPCR的热循环条件为

阶段一：95℃预变性30s

阶段二：95℃5s---60℃30s---70℃15s，循环41次；

阶段三：溶解曲线。

(4)数据分析

我们的实验所用的基因qPCR引物如下：

8.免疫组化

(1)在我们的实验中，免疫组化组织标本采用10％甲醛的溶液固定，然后采用自动脱水机对其脱水后，利用石蜡包埋的方法将其长期保存。(2)然后我们将上面的免疫组化石蜡包块进行切片和捞片，制作好实验需要的免疫组化的石蜡切片。(3)把上面的切片放在60℃里面烘干，70分钟以后再将其移到室温进行保存。(4)实验前将上述的切片放在60℃恒温箱中烘烤45min左右，然后进行脱蜡处理。(5)我们采用柠檬酸溶液进行抗原修复。(6)采用3％H2O2封闭内源性过氧化物酶，封闭时间7min，切片的漂洗用PBS按洗4次，每次5分钟。使用血清封闭液封闭，室温下静置30分钟，去除残余液体。(7)加入一抗工作液40μL至上述的组织切片，将其放置于保湿盒中，4℃过夜。(8)将组织切片进行室温放置23分钟，用PBS进行漂洗3次。(9)取鼠兔均通用的二抗试剂40μL加入切片上，室温条件下，孵育70min，PBS漂洗5次。(10)现配DAB的染液，显微镜下看显色反应情况，等染色正好才停止显色反应，水洗至少30min以除去DAB。(11)将组织切片放入苏木素中进行复染2min，然后放入1％盐酸乙醇中8秒钟。(12)封片在脱水后进行。(13)在显微镜下随机选取多个视野，采用半定量结果判断评分。

9.蛋白质的样品制备和定量

(1)培养细胞或药物处理。(2)弃掉培养基，用冰的PBS漂洗细胞2次，尽可能去除残留培养基。(3)RIPA和蛋白酶抑制剂Cocktail按照100:1配置，每个培养皿加70μl(根据细胞数确定，宁少勿多)，用细胞刮涂匀(整个过程均在冰上进行)。(4)将收集的裂解液置于EP管中，冰浴1h，每12分钟用Vortex震荡一次，每次15秒，最后超声7秒以剪切DNA以减低样品粘性。最后离心12000g 18min，4℃取上清。(5)测蛋白浓度：取样品5μl，用RIPA稀释10倍配成50μl，然后取20μl，标准蛋白按浓度添加入小孔内，每孔20μl，加入显色液，37℃静置30min，单波长570nm检测，计算样品蛋白浓度。(6)蛋白变性：添加4×loading buffer，一般配100μl体系，则加25μl的loading buffer，根据蛋白浓度加入蛋白体积，其余用RIPA补足。(8)根据上述计算得到数据，将所得蛋白样品加上样缓冲液变性后，97℃10min变性即可上样检测，变性样品-80℃保存，一个月内使用。

10.蛋白免疫印迹(Western Blot)

(1)配置电泳液，加Marker每孔3-6μL，蛋白量每孔10到20μL。(2)跑胶：先是80mv，然后30分钟后改成120mv，等指示带到底结束。(3)转膜：配置转膜液，然后预冷，准备厚滤纸、转膜板，放置厚滤纸(放之前都要浸转膜液)。(4)封闭：将膜用TBST液洗涤2次。配置5％的脱脂奶粉封闭液；将膜置于封闭液中缓慢摇荡70分钟。(5)倒去封闭液，用TBST洗涤，加一抗，放置冰中摇晃，尽可能的使膜蛋白面与抗体充分接触，过夜。(6)取出膜，放置于塑料盒中，倒入TBST洗涤，每次洗8min，洗4次，加入二抗，室温缓慢摇晃90分钟。(7)用TBST洗涤4次，每次8分钟。(8)配好发光液。(9)到暗室里面压片，压片时间1-20min不等，然后显影定影，最后用清水冲洗晾干，做好标记采用扫描仪以及相关软件扫描分析。(10)为了保证实验的一致性，我们的每个样品都去设置复孔，并且同一个批次所提取的蛋白都在一周之内用掉，以防止蛋白的降解造成假阳性的结果。为了进一步保证实验的准确性，我们会提取不同批次的蛋白去进行显影，这样就大大的提高了我们实验结果的准确性以及我们的数据的可靠性。关键的阳性的实验结果，会由不同的实验室技师进行重复的验证。

11.统计学分析

本实验中所有图片和数据均采用SPSS17.0和GraphPad Prism 5.0软件进行绘图和分析。细胞学中的定量值间比较用配对t检验进行统计。P<0.05被认为有统计学意义。所有实验均重复至少3次。

三、实验结果

1.FOXM1在肝内胆管细胞癌中高表达并和预后相关

我们对20例肝内胆管细胞癌肿瘤组织和癌旁正常组织的FOXM1的mRNA表达量用RT-PCR进行检测。在图1A中可以看到，和癌旁组织相比肿瘤标本中的FOXM1表达量明显升高(P<0.01)。蛋白印记和免疫组化的结果同样显示FOXM1在肝内胆管细胞癌标本中有将近70％(14/20)为高表达状态(图1B、图1C)。接下来通过组织芯片研究，验证了FOXM1在肝内胆管细胞癌和正常肝组织中的差异性表达。在肿瘤组织芯片中，约16.5％(15/91)的样本呈阴性或弱阳性，83.5％(76/91)的样本呈中等或强阳性。在正常肝脏组织芯片中，仅约19.2％(5/31)的样本提示为强阳性(表1)。其次，分析了FOXM1表达与肿瘤临床病理特征的关系。患者特征的统计结果见表2。然而，通过分析没有发现有临床病理特点和FOXM1相关。我们接下来在胆管癌细胞系(CCLP-1,、HuCCT-1、HCCC-9810和RBE)和正常胆管上皮细胞(HIBEC)中检测FOXM1的蛋白水平表达高低，发现胆管癌细胞系中FOXM1表达明显高于正常胆管上皮细胞(图1F)。为了进一步分析FOXM1和肝内胆管细胞癌病人的预后关系，我们选取了60例肝内胆管细胞癌手术病人进行Kaplan-Meier分析。如表3和图1E所示，总体中位生存期为23.1个月，FOXM1低表达的病人中位生存期为34个月，而FOXM1高表达病人中位生存期仅为19.7个月。总体来说FOXM1和肝内胆管细胞癌的预后密切相关。

表1在组织芯片中FOXM1表达情况(P<0.01)

表2FOXM1表达和临床病理学特征分析

表3FOXM1和肝内胆管细胞癌病人预后分析

说明：统计分析采用Kaplan-Meier生存分析法。

2.在肝内胆管细胞癌中FOXM1和顺铂敏感性相关

我们选取了60例肝内胆管细胞癌术后接受GP(顺铂联合吉西他滨)方案化疗的病人进行Kaplan-Meier分析，发现FOXM1高表达组的病人总体生存时间明显低于低表达组(图2A)。由于顺铂可以在多种肿瘤中发挥作用，为一种经典的化疗药物，所以我们选取了顺铂作为研究靶点。接下来，我们在四种胆管癌细胞系中检测了顺铂的敏感性，发现在FOXM1表达量高的细胞系中(CCLP-1、HuCCT-1)中顺铂敏感性较低，在FOXM1低表达细胞系中(HCCC-9810、RBE)顺铂敏感性相对较高(图2B)。所以我们认为在肝内胆管细胞癌中FOXM1和顺铂敏感性相关。

3.FOXM1敲低可以增加肝内胆管细胞癌对于顺铂的敏感性

因为前述研究发现，在肝内胆管细胞癌病人中FOXM1表达和GP方案化疗预后明显相关，所以我们猜测FOXM1是否可以对于经典化疗药物顺铂敏感性具有作用。所以我们使用小干扰RNA来敲低FOXM1在胆管癌细胞癌中的表达。在敲低后我们发现，将敲低组和阴性对照组相比，同样使用顺铂处理后，敲低组的细胞活性明显降低，即在肝内胆管细胞癌中随着FOXM1的表达量降低，顺铂药物敏感性增高(图3C)。接下来我们在免疫缺陷小鼠中构建皮下成瘤模型，在小鼠皮下肿瘤用Lenvi-NC(阴性对照组)和Lenvi-FOXM1(FOXM1敲低组)细胞成瘤。10天后，将小鼠分为两组，每组各12只，使用12μmol/L浓度的顺铂进行瘤体内皮下注射。每过4天，测量裸鼠皮下成瘤体积，在4周以后，将小鼠处死，取出肿瘤标本。我们发现，FOXM1敲低组的肿瘤体积明显小于阴性对照组(图2D)。将小鼠皮下肿瘤标本取下后，进行Ki67(为肿瘤的一种特异性的增殖性生物标志，可以通过免疫组化来判断肿瘤增殖情况的快慢)免疫组化染色后发现，FOXM1敲低组肿瘤标本中Ki67的表达量比对照组明显降低(图2E)。

此处说明的是，敲低FOXM1所用的小干扰RNA的靶点序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：5’-CCCAACAGGAGUCUAAUCATT-3’。所述小干扰RNA所对应的shRNA的序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：5’-GCCCAACAGGAGTCTAATCAA-3’。所述小干扰RNA的序列如SEQ ID NO.7所示，具体为5’-CCCAACAGGAGUCUAAUCA-3’。

4.FOXM1抑制剂通过增加凋亡抑制肝内胆管细胞癌增殖

为了进一步探究FOXM1在肝内胆管细胞癌的具体作用机制，我们选择了FOXM1的特异性抑制剂(Siomycin A)，它可以在mRNA以及蛋白水平抑制FOXM1的表达。在使用SiomycinA后，我们发现顺着浓度梯度(20μmol/L，40μmol/L)的增加，肝内胆管癌细胞系的增殖速率逐级减少(图3A、图3B)。使用流式细胞仪分析可以发现在使用Siomycin A后，肿瘤细胞系的凋亡比率增加，细胞死亡明显增多(图3C)。我们又将空白对照组、Siomycin A梯度浓度处理组的细胞提取蛋白后进行蛋白印记法(Western blotting)检测凋亡相关蛋白的表达量(Apoptosis associated proteins)。我们发现随着FOXM1在抑制剂作用下表达量降低，其下游的凋亡相关蛋白表达升高，从而诱导凋亡细胞增多，从而抑制细胞增殖(图3D)。综上，FOXM1抑制剂(Siomycin A)可以通过增加细胞凋亡而抑制肝内胆管癌细胞增殖，从而抑制细胞增长，可能对于指导肝内胆管细胞癌的临床治疗具有重要作用。接下来我们在免疫缺陷小鼠中构建皮下成瘤模型，在小鼠皮下肿瘤用CCLP-1细胞成瘤。10天后，将小鼠分为两组，每组各12只，分别使用生理盐水、40μmol/L浓度的Siomycin A进行瘤体内皮下注射。每过4天，测量裸鼠皮下成瘤体积，在4周以后，将小鼠处死，取出肿瘤标本。我们发现，FOXM1抑制剂组的肿瘤体积明显小于阴性对照组(图3E)。将小鼠皮下肿瘤标本取下后，行Ki67免疫组化染色后发现，FOXM1抑制剂组肿瘤标本中Ki67的表达量比对照组明显降低(图3F)。

5.FOXM1抑制剂联合顺铂抑制肝内胆管细胞癌增殖

由于前述试验研究发现，敲低FOXM1可以导致肝内胆管细胞癌的顺铂敏感性增高，并且Siomycin A可以显著抑制肝内胆管细胞癌增殖。所以，我们尝试将Siomycin A和顺铂联合用于肝内胆管细胞癌的治疗。将FOXM1和顺铂双药、顺铂单药处理胆管癌细胞系(CCLP-1、HuCCT-1)，用CCK-8和克隆形成实验来检测细胞增殖情况(图4A、图4B、图4C)，发现双药联合组对于细胞增殖的抑制作用明显大于顺铂单药组。接下来，将双药联合组和顺铂单药组细胞提取蛋白，用Western blotting检测凋亡相关蛋白的蛋白水平的表达，发现双药联合组的细胞中凋亡相关蛋白表达量明显比顺铂单药处理组升高(图4F)。在免疫缺陷小鼠中构建皮下成瘤模型，在小鼠皮下肿瘤用CCLP-1细胞成瘤。10天后，将小鼠分为3组，每组各20只，分别使用生理盐水、12μmol/L顺铂、12μmol/L顺铂+40μmol/L Siomycin A进行瘤体内皮下注射。每过4天，测量裸鼠皮下成瘤体积，在4周以后，将小鼠处死，取出肿瘤标本。我们发现，双药处理组的肿瘤体积明显小于顺铂单药组(图4D)。将小鼠皮下肿瘤标本取下后，行Ki67免疫组化染色后发现，双药联合组肿瘤标本中Ki67的表达量明显降低(图4E)。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 浙江大学

<120> FOXM1抑制剂在肝内胆管细胞癌治疗中的作用

<130> 181875

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggggaagg tgaaggtcg 19

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggggtcattg atggcaacaa ta 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgtcggccac tgattctcaa a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcaggggat ctcttaggtt c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cccaacagga gucuaaucat t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcccaacagg agtctaatca a 21

<210> 7

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cccaacagga gucuaauca 19

Claims

1.FOXM1抑制剂在制备胆管细胞癌治疗药物中的用途。

2.一种胆管细胞癌治疗药物，包括有效剂量的FOXM1抑制剂。

3.FOXM1抑制剂用于制备胆管细胞癌化疗药物敏感性促进剂的用途。

4.FOXM1抑制剂与胆管细胞癌化疗药物联合用于制备胆管癌治疗药物的用途。

5.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述胆管细胞癌化疗药物选自顺铂、吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、亚叶酸钙、表阿霉素、草酸铂、替吉奥、伊立替康、多西紫杉醇。

6.一种胆管癌治疗药物组合，包括有效量的FOXM1抑制剂和至少一种其他胆管癌治疗药物；优选地，所述其他胆管癌治疗药物为胆管细胞癌化疗药物。

7.根据权利要求6所述的药物组合，其特征在于，所述胆管细胞癌化疗药物选自顺铂、吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、亚叶酸钙、表阿霉素、草酸铂、替吉奥、伊立替康、多西紫杉醇。

8.FOXM1抑制剂在制备具有以下任一项或多项作用的药物中的用途：减少胆管细胞癌细胞增殖速率、诱导胆管细胞癌细胞凋亡、增加胆管细胞癌细胞凋亡比例、增加胆管细胞癌细胞死亡率、抑制胆管细胞癌细胞增殖、抑制胆管细胞癌细胞增长、抑制胆管细胞癌肿瘤生长、减小胆管细胞癌肿瘤体积。

9.FOXM1用于制备胆管细胞癌检测试剂的用途。

10.特异性识别FOXM1的试剂用于制备胆管细胞癌检测试剂盒的用途。