CN107739758A - 一种RDH10基因用于制备TWEAK‑NF‑κB信号通路阻断剂的应用 - Google Patents

一种RDH10基因用于制备TWEAK‑NF‑κB信号通路阻断剂的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种RDH10基因用于制备TWEAK‑NF‑κB信号通路阻断剂的应用。RDH10基因表达和胶质瘤等级之间呈正相关，所述RDH10基因敲除在体外调控神经胶质瘤细胞增殖，将导致细胞S和G2/M期停滞，抑制RDH10基因使胶质瘤细胞生长迟滞并将导致胶质瘤细胞的细胞侵袭能力下降。RDH10基因敲除改变了TNFRSF12A(TWEAKR)，TRAF1，TRAF3，BMPR2，TNFAIP3，NFKBIA，NFKBIE和IKBKB的相关表达，该结果显示RDH10可能通过调控TWEAK‑NF‑κB信号通路影响胶质瘤细胞增殖、凋亡和细胞周期。本发明通过研究发现RDH10在胶质瘤发生和进展中发挥着重要作用。RHD10基因的功能研究为人类神经胶质瘤的靶向治疗提高强有力的手段。

Description

一种RDH10基因用于制备TWEAK-NF-κB信号通路阻断剂的应用
技术领域
本发明涉及脑胶质瘤发病机制的研究领域，具体涉及一种RDH10基因用于制备TWEAK-NF-κB信号通路阻断剂的应用。
背景技术
胶质瘤是人类脑部恶性肿瘤中最致命的一种类型，目前仍没有有效的治疗手段。流行 病学数据显示，胶质瘤占原发性脑肿瘤的32％-45％，占恶性脑肿瘤的近70％-80％。此外， 近95％的脑胶质瘤患者的生存时间低于5年，胶质母细胞瘤的5年生存期更是低于5％。 虽然脑胶质瘤在外科手术治疗，放射治疗和化疗方面取得了一些成绩，但至今脑胶质瘤治 疗仍然是临床肿瘤学的一个挑战。为了获得理想的治疗效果，研究人员从人类胶质瘤的潜 在分子机制和遗传角度展开深入研究。虽然已经揭示了人类胶质瘤的基因组图，但脑胶质 瘤进展和特定分子异常之间的神秘关系至今仍没有解释清楚。
视黄醇脱氢酶10(RDH10)是短链脱氢酶/还原酶家族的成员，最初来自于克隆人、小 鼠和牛视网膜色素的上皮细胞。来自不同物种的RDH10基因亚型之间的氨基酸序列的同源 性非常高，在氨基酸水平上人和鼠RDH10之间具有99％的同一性。RDH10基因高度的序列保守性对其功能也具有重要意义。胚胎时期小鼠RDH10突变往往可导致其死亡，但是对于怀孕母体的维甲酸(RA)治疗可以挽救胚胎，这表明RDH10基因是胚胎发育期间维甲酸合 成的重要环节。虽然RDH10基因在RA生成中的确切作用仍不清楚，但RDH10在从视黄醇到 视黄醛的合成中的确发挥着重要的作用。
肿瘤坏死因子样的弱凋亡诱导物(TWEAK)及其受体、成纤维细胞生长因子诱导蛋白14 (Fn14)已被证实参与许多生物进程。例如，TWEAK调节非典型和典型的NF-κB通路。Fn14 过表达或与TWEAK结合将促进核NF-κB通路活化。NF-κB在生物进程中发挥关键作用的许 多保守的转录因子，影响细胞存活，免疫和炎症，并且与其他许多细胞功能相关。依据特定的细胞外信号，经典NF-κB信号传导通路通过诱导磷酸化和IκBα的降解来激活并释放RelA-p50复合物。然后将活化的NF-kB转运到细胞核中，与特定的DNA结合以诱导靶基因 的转录。RelB-p52异二聚体被NF-κB诱导激酶(NIK)激活,从而调节非典型NF-κB信号 传导。通常，NIK蛋白水平保持在低水平。NIK蛋白的稳定化是激活非规范NF-κB信号传 导的关键步骤，其有助于p100磷酸化和IKKα激活。磷蛋白-p100的蛋白水解加工形成p52， 其促使具有转录活性的RelB-p52异二聚体的核易位。以前的研究发现TWEAK和FN14在胶 质瘤中过表达，这也进一步证实NF-κB通路活化的重要意义。因此调控TWEAK-NF-κB信 号通路，抑制其活化或对其下游基因的靶向干预可能会对胶质瘤治疗产生关键作用。
目前只有少数肿瘤类型与RDH10基因过表达相关，包括非小细胞肺癌，甲状腺腺瘤和 癌以及肝细胞癌。RDH10基因在神经胶质瘤中的生物学功能和临床意义仍然未知，到目前 为止国内外文献尚无RDH10基因在脑胶质瘤疾病中的应用报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是提供一种RDH10基因用于制备TWEAK-NF-κB信号通 路阻断剂的应用。RDH10可能通过调控TWEAK-NF-κB信号通路影响胶质瘤细胞增殖、凋亡 和细胞周期。本发明通过研究发现RDH10在胶质瘤发展生和进展的中发挥着重要作用。RHD10 基因的功能研究为人类神经胶质瘤的靶向治疗提高强有力的手段。
本发明涉及一种RDH10基因用于制备TWEAK-NF-κB信号通路阻断剂的应用。
所述RDH10基因是维甲酸(RA)合成的重要环节。应用维甲酸治疗脑胶质瘤的目前研 究的一个热点。
RDH10基因表达与胶质瘤病理级别之间存在显著差异(**P<0.001)。分析整合癌症基 因组图谱(TCGA；http：//cancergenome.nih.gov)和基因型-组织表达(GTEx)数据 集的RDH10基因表达，结果显示与正常脑组织相比RDH基因在神经胶质瘤中明显上调，尤 其是在胶质母细胞瘤(GBM)中上调极为显著。TCGA数据库分析RDH10表达揭示了LGG和 胶质母细胞瘤(GBM)之间的显著差异(**P<0.01)。研究结果显示在RDH10高表达的胶 质瘤患者中，累积存活率显着低于RDH10低表达的胶质瘤患者(**P<0.01)。
RDH10基因表达和胶质瘤等级之间呈正相关，所述RDH10基因敲除在体外调控神经胶质 瘤细胞增殖，将导致细胞S和G2/M期停滞，抑制RDH10基因使胶质瘤细胞生长迟滞并将导致胶质瘤细胞的细胞侵袭能力下降。
由RDH10基因调节的多种癌症相关基因和途径，尤其是TWEAK-NF-κB轴，RDH10基因敲除改变参与RDH10敲减显著抑制TWEAK-NF-KB信号通路和与信号通路相关的基因表达，从而抑制胶质瘤细胞在体内和体外的生癌症的基因的表达，RDH10敲除显著抑制TWEAK，TNFR1和P53在内的几种关键癌症通路。
研究证实TWEAK调节NF-κB通路，从而保证持续的NF-κB活化，促进肿瘤发展，并 且与肿瘤侵袭，生长，迁移和转移和较差预后相关联。所述的TWEAK-NF-kB信号通路，包 括与该轴相关的基因的表达，在RDH10敲除后被显著抑制，多个基因的qPCR和Western blot 实验验证微阵列数据TNFSF12(TWEAK),TRKB1，IKBKB(IKK-β)，TGFBR1和BMPR2均表达降 低，而TRAF1，MAP3K14(NIK)，NFKBIA(IKBα)，NFKBIE(IKBε)，TNFAIP3，GADD45A和 CDKN1A显著上调，IκBα在调节中发挥中心作用；上游分析还发现IKBα被激活，此外， 使用NF-κB激动剂Fusicoccin探讨RDH10和TWEAK-NF-κB轴之间的相关性，发现NF-κB 活化阻断shRDH10诱导的细胞凋亡并部分拯救shRDH10处理细胞的受损细胞增殖。
有益效果
RDH10基因表达和胶质瘤等级之间呈正相关。RDH10基因敲除对细胞增殖，凋亡和细胞 周期具有显着影响。微阵列数据显示由RDH10基因调节的多种癌症相关基因和途径，尤其 是TWEAK-NF-κB轴。基于微阵列数据的进一步研究将提供关于胶质瘤发生和进展分子机 制的更多信息，为今后脑胶质瘤的靶向治疗提供强有力的手段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技 术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明 的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根 据这些附图获得其他的附图。
图1：RDH10在人神经胶质瘤中过度表达，并预测高水平和不良预后。A.世卫组织I，II，III和IV级神经胶质瘤中RDH10免疫染色的特征显微照片(放大率，左×100，右， ×200)。B.来自GE-mini(TCGA和GTEx数据集)的RDH10表达分析显示正常脑组织和胶 质瘤之间存在显着差异。C.LGG和GBM中RDH10表达的分析。对胶质瘤的TCGA RNA测序 数据进行广义线性模型(GLM)分析。**P<0.01。D.生存分析显示RDH10高表达的神经 胶质瘤预后比RDH10低表达的胶质瘤预后差。**P<0.01。
图2：慢病毒介导的RDH10敲减抑制人神经胶质瘤增殖。A.qPCR检测胶质瘤细胞系中 相对RDH10mRNA水平。B.qPCR揭示在U87和U251细胞中RDH10表达有效降低。**P<0.01.C和D.RDH10敲低抑制体外U87(C)和U251(D)增殖。应用CellomicsArrayScan VTI每天 进行增殖检测，连续5天。数据显示为平均值±标准差。**P<0.01。
图3：RDH10影响胶质瘤细胞增殖和存活。A和B.MTT测定表明RDH10沉默的U87(A)和U251(B)细胞的生长速率降低。C和D.RDH10敲减诱导U87(C)和U251(D)细胞凋亡。 E和F.RDH10敲减诱导U87(E)和U251(F)细胞中的S和G2/M细胞周期停滞。数据显 示为平均值±标准差。**P<0.01。G和H.Transwell Matrigel侵袭测定显示，与U87 (G)和U251(H)细胞对照组相比，RDH10-siRNA组侵袭细胞数明显减少。所有实验重复 至少三次。数据显示为平均值±SD，**P<0.01。
图4：体内异种移植模型证实RDH10基因成瘤效果。A.与对照组慢病毒感染细胞相比， RDH10-shRNA U87细胞的肿瘤生长曲线。B.实验结束时比较肿瘤重量。C.实验结束时比较了 肿瘤的荧光密度。**P<0.01，*P＝0.011。
图5：通过微阵列分析RDH10敲U-87细胞中基因表达的变化。A.热图分析显示通过微 阵列分析所检测到的1773个基因。校正P<0.05和绝对FC>1.5。B和C。通过IPA分析 RDH10敲减U87细胞中全基因组表达微阵列的疾病和功能富集。D.通过IPA分析RDH10敲减 U87细胞中全基因组表达微阵列的规范途径富集。
图6：在RDH10敲减的U87细胞中TWEAK-NF-κB信号通路被显著抑制。
A.IPA显示TWEAK信号传导是最显著抑制的途径。B.qPCR用于验证相关基因mRNA水平表达。C.蛋白质印迹用于验证相关基因蛋白质水平表达。D.灰度分析用以显示相关基因的蛋白表达水平。E和F.TWEAK-NF-κB信号通路中RDH10和相关基因的基因相互作用网络。结果表明NFKBIA位于中枢调控中心位置。
图7：NF-κB激动剂拯救了U-87细胞中由RDH10敲低引起的异常细胞凋亡和增殖。A.NF-κB激动剂Fusicoccin阻断U87细胞中由RDH10敲低引起的上调细胞凋亡。B.NF-κB 激动剂Fusicoccin拯救由U-87细胞中RDH10敲低介导的受损细胞增殖状态。通过MTT法 分析细胞增殖状态。****P<0.00011。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
材料和方法
胶质瘤标本收集和RDH10免疫组化分析
150例脑胶质瘤样本用于研究，本项研究得到首都医科大学附属北京天坛医院伦理委员 会的批准；在150例样本中，不同胶质瘤级别样本数量相近。我们使用IHC方法染色，福 尔马林固定，石蜡包埋的组织。通过阳性染色的面积和程度对每个载玻片进行评分。对于 统计学分析，如果>5％的细胞染色，则将RDH10染色定义为阳性。我们使用SPSS17.0分析RDH10表达与WHO神经胶质瘤级别之间的关系。使用广义线性模型回归计算统计学显著性(P<0.05)。
TCGA基因数据分析
使用来自TCGA数据库的10例正常脑组织和667例胶质瘤样本的相关临床参数和随访 信息进行RNA-Seq数据集分析人RDH10的表达差异。应用线性回归研究RDH10表达与胶质瘤WHO级别之间的关联。依据RDH10表达水平差异分为低表达组和高表达组，应用 Kaplan-Meier生存曲线分析两组患者的总生存时间。并应用对数秩检验来检测两组之间的 生存曲线差异的显著性。
细胞培养
从ATCC(Manassas，VA，USA)获得人神经胶质瘤U87和U251细胞系。将细胞至于37℃，5％CO2的潮湿环境中，使用10％胎牛血清补充的Dulbecco改良的Eagle培养基中培养。
RDH10 shRNA设计和慢病毒构建
设计了RDH10-shRNA序列，并构建了表达RDH10-shRNA的慢病毒从而抑制RDH10的表 达。针对RDH10-shRNA最有效的靶序列：5'-TACGATGCTGGAGATT AAT-3'，Scr-shRNA的序列 为5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。用于表达shRNA的pGCL-GFP-慢病毒购自上海Genechem公司(中国上海)。
RNA分离和qPCR
用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)提取总RNA。将约2μg的总RNA 逆转录成cDNA。使用Bio-Rad CFX96qPCR检测系统(Bio-Rad Laboratories，Hercules， CA，USA)，用SYBR Master Mix(Takara，Shiga，Japan)行PCR扩增。引物序列列于补充 补充表3中。
补充表3 qPCR底物列表
蛋白质印迹分析
使用标准技术进行蛋白质印迹分析，使用GAPDH作为全细胞裂解物的对照。抗体购自 不同公司：RDH10(ab174340，Abcam，Cambridge，UK)，CDKN1A(ab7960，Abcam)，BIRC3(ab32059，Abcam)，BMPR2(ab130206，Abcam)，NFKBIA(ab7217，Abcam)，TGFBR1(ab31013，Abcam)，GADD45A(ab180768，Abcam)和GAPDH(sc-32233，Santa CruzBiotechnology，Dallas，TX，USA)。
细胞增殖分析
将RDH10-shRNA或Scr-shRNA慢病毒处理细胞置于96孔板(2000个细胞/孔)中孵育。 接下来使用ArrayScan TM HCS(ThermoFisher，Waltham，MA，USA)连续5天，以24小时为间隔收集每个细胞的荧光图像，并且计数每个孔中的细胞数以产生生长曲线。
MTT测定
我们在初始密度2000个细胞/孔的96孔板中温育接种细胞。在每个时间点，将20μLMTT (5mg/mL溴化四氮唑，GE Healthcare，Little Chalfont，UK)加入每个孔中。在4小时孵育后，我们在570nm的吸光度条件下加入150μL DMSO溶解晶体20分钟，通过ELISA板 读数器(680型，Bio-Rad Laboratories)记录实验数据。对于NF-κB活化，在细胞用终 浓度为20uM的RDH10-shRNA或Scr-shRNA慢病毒处理24小时后加入激动剂Fusicoccin。
细胞周期分析
使用流式细胞仪检测细胞周期。首先，收集RDH10-shRNA或Scr-shRNA感染的细胞，并用冷70％乙醇固定30分钟。然后，使用PBS洗涤细胞两次并使用碘丙锭染色，然后用 PBS中的RNase孵育。用尼龙网过滤悬浮液，通过流式细仪(Becton-Dickinson，FranklinLakes，NJ，USA)分析至少1×105个染色的细胞。
细胞凋亡分析
通过膜联蛋白V-APC染色测定细胞凋亡，并通过流式细胞仪(Becton-Dickinson)检 测。对于凋亡分析，在含有5μL膜联蛋白V-APC和10μL碘化丙啶(20ng/mL)的100 μL结合缓冲液中对细胞染色，然后在黑暗环境室温下培养10-15分钟。通过流式细胞仪在 1小时内测量细胞凋亡率。对于NF-κB活化，在细胞用终浓度为20uM的RDH10-shRNA或 Scr-shRNA慢病毒处理24小时后加入激动剂Fusicoccin。
细胞侵袭能力测定
收集用shRDH10或shCtrl转染的细胞，将总共1×10 5个细胞接种在BioCoat TM小室(Corning，USA)上。显微镜下的GIEMSA染色和计数细胞，通过Matrigel观察侵袭细 胞16小时(U87)和40小时(U251)。在每个滤波器的9井中确定每个视野的侵入细胞的 平均数。在光学显微镜下计数细胞。
微阵列检测和数据分析
所有微阵列实验由Genechem(中国上海)使用从RDH10-shRNA和scr-shRNA
处理的U-87细胞中分离出的RNA完成。我们使用人GeneChip PrimeView(Affymetrix， Santa Clara，CA，USA)，根据制造商的方案进行微阵列检测。用GeneChipScanner 3000 (Affymetrix)扫描阵列以产生原始数据。我们使用P<0.05和绝对FC>1.5的标准选择 RDH10-shRNA和Scr-shRNA细胞之间的差异表达基因。通过IPA进行途径分析，疾病和功能 分析，网络分析和上游基因分析。
动物实验
用5周龄BALB/c-A裸鼠进行动物实验。所有程序均按照中国动物保健委员会的相关规 定进行，该方案获得首都医科大学附属北京天坛医院批准。将U87细胞(3×106)皮下植入 裸鼠身体的右侧腋窝以产生异种移植肿瘤。当肿瘤大小接近100mm3(大约32天)时，我们 用游标卡尺每48小时测量肿瘤直径。通过以下公式计算肿瘤体积：体积(mm3)＝(长度×宽度2)÷2。在第45天后获取肿瘤用于综合分析。
统计分析
用SPSS17.0软件包分析统计学数据。所有数值的表示方式采用平均值±标准偏差(SD) 的方式。使用生存分析，广义线性模型和Fisher精确检验进行组织样品中RDH10的表达分 析。所有实验重复至少三次，统计学显著性被认为是P<0.05。
结果
RDH10表达与人类胶质瘤中的病理分级呈正相关
世界卫生组织(WHO)将人类胶质瘤分为I-IV级[1]，分级与胶质瘤的进展，治疗和预 后高度相关。胶质瘤的病理分级通常分为低级别和高级别。低级别胶质瘤(LGG)包括I和II级，通常具有更好的预后，而高级胶质瘤(HGG)包括III级和IV级，通常预后较差。 在本项研究中，我们收集了150例I-IV及的人脑胶质瘤样品通过免疫组织化学(IHC)评 价RDH10表达(图1A)。IHC数显示RDH10在不同级别的胶质瘤样品中差异表达。I级中 5/36，II级17/39，III级24/34和IV级37/41中发现阳性RDH10表达(表1)，数据显 示RDH10表达与胶质瘤病理级别之间存在显著差异(P<0.001)。
表1 RDH10表达与胶质瘤WHO分级的相关性
分析GE-mini(http://gemini.cancer-pku.cn)包括癌症基因组图(TCGA)和基因型 组织表达(GTEx)数据集的RDH10表达，与正常脑组织对照相比，RDH10在胶质瘤呈现上调， 并且在胶质母细胞瘤(GBM)中显著上调(图1B)。
The Cancer Genome Atlas(TCGA；http：//cancergenome.nih.gov)数据库分析RDH10 表达揭示了LGG和胶质母细胞瘤(GBM)之间的显着差异(**P<0.01)(图1c，表S1)。
补充表1 TCGA数据库中LGG和GBM样本中RDH10表达情况
依据TCGA数据库对胶质瘤RNA测序数据进行广义线性模型分析，并且使用Kaplan-Meier存活曲线来评估患者存活时间。这些结果显示在具有较高RDH10表达的胶质瘤患者中，累积存活率显着低于具有较低RDH10表达的胶质瘤患者的累积存活率(**P <0.01)(图1D,表2)。
表2 TCGA数据库分析RDH10表达与胶质瘤患者生存期的关联
由于神经胶质瘤级别和RDH10表达水平对患者生存率都有显着影响，我们猜测RDH10 表达水平是否是胶质瘤患者生存的独立因素。Cox回归模型分析显示RDH10表达水平对胶 质瘤患者生存率有独立影响(表3，B＝1.068，***P<0.001)。
表3 Cox Regression分析结果
由于Cox回归模型的系数为阳性(B值＝1.068)，这意味着RDH10表达水平越高神经胶 质瘤患者预后较差，RDH10水平升高与死亡风险增加倍数为2.908倍(Exp(B)＝2.908)。结果表明RDH10可作为胶质瘤的预后的潜在标志物。
慢病毒介导的shRNA有效抑制RDH10的表达
为了研究RDH10表达与人神经胶质瘤的发生或进展之间是否存在因果关系，我们接下 来检测了胶质瘤细胞系U87，U251，U373和A172中的RDH10表达,PCR结果显示，在U87和A172细胞中RDH10的表达丰度是中度，在U373和U251细胞中的表达丰度是高度(图2A)。首先用RDH10-shRNA或Scr-shRNA病毒处理细胞，并获取总蛋白和RNA。应用Real-time PCR(qPCR)和western印迹来评估mRNA和蛋白质水平的RDH10表达。在RDH10-shRNA的细胞 中RDH10蛋白的水平显着降低；在U87中RDH10mRNA表达降低了84.4％，在U251细胞中 降低了74％(图2B)。这些数据显示慢病毒shRNA策略有效地抑制RDH10在蛋白质和mRNA 水平的表达。
RDH10敲减在体外影响了神经胶质瘤细胞增殖
持续的增殖信号是癌症的重要标志；为了研究RDH10敲减对胶质瘤细胞增殖的影响， 我们用两种不同的检测方法来评估细胞增殖以降低主观因素。首先，我们使用CellomicsArrayScan VTI连续五天监测细胞增殖(图2C和D)。这些结果显示，与Scr-shRNA处理的细胞相比，用RDH10-shRNA处理细胞48小时后细胞增殖开始明显减少。此外， RDH10-shRNA对增殖的限制性影响随时间进程显著增加(图2C和D)。其次，我们通过MTT 法检测细胞增殖情况，发现在细胞定值后第3,4,5天，RDH10敲减细胞的生长速率明显低于Scr-shRNA细胞，(**P<0.01)(图3A和B)。
RDH10敲减促进细胞凋亡
对抗细胞凋亡是癌细胞的另一个重要特征。RDH10敲减诱导细胞数量的减少(图2C和 D)，这可能是由于细胞增殖受损和/或凋亡增加。因此，我们使用流式细胞仪和AnnexinV-APC 来评估RDH10-shRNA处理的U87和U251细胞的凋亡。与Scr-shRNA组相比，RDH10-shRNA 组凋亡U87细胞的百分比显着增加(分别为11.06±1.41％和4.03±0.09％，P＝0.013) (图3C)。与Scr-shRNA相比，RDH10-shRNA处理后U251细胞的凋亡百分比也显着增加(分 别为12.04±1.12％与1.67±0.12％；P＝0.0036)(图3D)。这些结果表明在胶质瘤细胞中RDH10具有抗细胞凋亡作用。
RDH10敲低诱导细胞周期停滞
细胞周期的调节可导致细胞增殖的变化。为了进一步研究这些改变的机制，我们应用 流式细胞仪分析碘化丙锭染色的细胞以检查细胞周期曲线。对于U87细胞，Scr-shRNA组分 布显示G0/G1：51.97％，S：37.46％，G2/M：10.58％，RDH10-shRNA组G0/G1：43.74 ％，S：42.12％和G2/M：14.14％(图3E)。对于U251细胞，Scr-shRNA组显示G0/G1： 49.1％，S：46.21％和G2/M：4.69％，而RDH10-shRNA组显示G0/G1：41.6％，S：52.58 ％和G2/M：5.82％(图3F)。与Scr-shRNA组相比，两种细胞系的RDH10-shRNA组显示 G0/G1期的减少和S和G2/M期的伴随增加，说明RDH10影响细胞周期进程，如果敲减 RDH10将导致细胞S和G2/M期停滞(**P<0.01，图3E和F)。
RDH10敲除抑制胶质瘤细胞的侵袭能力
我们使用matrigel-coated transwell技术评估RDH10基因对胶质瘤细胞侵袭能力的 影响。RDH10-shRNA显着抑制U87和U251细胞的细胞侵袭能力。在U87细胞中，Scr-shRNA 和RDH10-shRNA组的侵袭细胞分别为97±6.73和13±0.59(图3G)。在U251细胞中Scr-shRNA和RDH10-shRNA组的侵袭细胞分别为88±5.04和18±1.81(图3H)(**P<0.01)。这些结果表明RDH10敲除显著抑制胶质瘤细胞的侵袭能力。
RDH10 shRNA在体内抑制胶质瘤细胞生长
将RDH10-shRNA或Scr-shRNA转染的U87细胞接种到裸鼠中以建立异种移植肿瘤模型。 结果显示，在整个监测期间，感染RDH10-shRNA的细胞的胶质瘤异种移植物的体积显着小 于用Scr-shRNA感染的胶质瘤异种移植物的体积(图4A)。此外，第45天检测肿瘤重量和荧光密度，RDH10-shRNA组肿瘤重量和荧光密度均显着低于Scr-shRNA组(图4B-C，n＝10， P＝0.0017和0.011)。
RDH10敲除改变参与癌症的基因的表达
为了进一步研究RDH10在胶质瘤发展中的基本分子机制，我们在表达Scr-shRNA或RDH10-shRNA的U-87细胞上进行全基因组表达微阵列检测。我们检测到1773个基因差异表达(校正P<0.05和绝对FC≥1.5)，包括850上调基因和923下调基因(图5A)。根据IPA 数据库分析，RDH10敲减改变了一系列与癌症，凋亡，生长和增殖，运动和细胞周期相关的 基因(图5B和C)。此外，RDH10敲减显著抑制几种关键癌症通路，例如TWEAK，TNFR1和 P53(图5D)。这些数据表明RDH10具有调节人类胶质瘤恶性进展的关键功能。
RDH10敲减通过下调TWEAK-NF-κB轴抑制胶质瘤细胞在体内和体外的生长
以前的研究证实TWEAK调节NF-κB通路，从而保证持续的NF-κB活化[16]。TWEAK 和Fn14也被证明参与MMP9上调[17]，促进肿瘤发展[18，19]，并且与肿瘤侵袭，生长，迁 移和转移和较差预后相关联[16]。在微阵列数据分析中，我们发现TWEAK-NF-κB信号通路， 包括与该轴相关的基因的表达，在RDH10敲低后被显着抑制(图5D和6A)。然后我们进行 多个基因的qPCR和western印迹实验以验证微阵列数据；TNFSF12(TWEAK)，TRKB1，IKBKB (IKK-β)，TGFBR1和BMPR2均表达降低，而TRAF1，MAP3K14(NIK)，NFKBIA(IKB α)， NFKBIE(IKBε)，TNFAIP3，GADD45A和CDKN1A显着上调(图6B、C和D)。根据IPA数 据库，该基因相互作用网络显示IκBα在调节中发挥中心作用(图6E)；此外，上游分析 还发现IKBα被激活(图6F)。在补充表2中列举了与癌症中的恶性进展相关的许多下游基 因如BIRC3，BCL2L1，BCL2L2，CDKN1A，DDIT3，GADD45A，GADD45B，MMP1，MMP2，MMP3， MMP7，RAC1和YAP1。我们进一步使用NF-κB激动剂Fusicoccin来研究RDH10和NF-κ B 之间的关联。我们发现RDH10敲低引起的增加的细胞凋亡可被Fusicoccin阻断(图7A-B)。 此外，由RDH10敲低介导的受损的细胞增殖可以被Fusicoccin部分地拯救。这些结果提 供了宝贵的证据支持RDH10和NF-κ B之间的直接联系。
补充表2 通过微阵列分析IKKα(NFKBIA)下游基因的表达改变

Claims (4)

1.一种RDH10基因用于制备TWEAK-NF-κB信号通路阻断剂的应用。
2.根据权利要求1所述的RDH10基因用于制备TWEAK-NF-κB信号通路阻断剂的应用，其特征在于，RDH10基因表达和胶质瘤等级之间呈正相关，所述RDH10基因敲除在体外调控神经胶质瘤细胞增殖，将导致细胞S和G2/M期停滞，抑制RDH10基因使胶质瘤细胞生长迟滞并将导致胶质瘤细胞的细胞侵袭能力下降。
3.根据权利要求1所述的RDH10基因用于制备TWEAK-NF-κB信号通路阻断剂的应用，其特征在于，由RDH10基因调节的多种癌症相关基因和途径，尤其是TWEAK-NF-κB轴，RDH10基因敲除改变参与RDH10敲减显著抑制TWEAK-NF-KB信号通路和与信号通路相关的基因表达，从而抑制胶质瘤细胞在体内和体外的生癌症的基因的表达，RDH10敲除显著抑制TWEAK，TNFR1和P53在内的几种关键癌症通路。
4.根据权利要求1、2或3中任一项所述的RDH10基因用于制备TWEAK-NF-κB信号通路阻断剂的应用，其特征在于，所述的TWEAK-NF-kB信号通路，包括与该轴相关的基因的表达，在RDH10敲除后被显著抑制，多个基因的qPCR和Western blot实验验证微阵列数据TNFSF12(TWEAK),TRKB1，IKBKB(IKK-β)，TGFBR1和BMPR2均表达降低，而TRAF1，MAP3K14(NIK)，NFKBIA(IKBα)，NFKBIE(IKBε)，TNFAIP3，GADD45A和CDKN1A显著上调，IκBα在调节中发挥中心作用；上游分析还发现IKBα被激活，此外，使用NF-κB激动剂Fusicoccin探讨RDH10和TWEAK-NF-κB轴之间的相关性，发现NF-κB活化阻断shRDH10诱导的细胞凋亡并部分拯救shRDH10处理细胞的受损细胞增殖。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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