CN110244056A - Znf521基因在制备肝癌治疗药物、诊断及预后评估试剂中的应用 - Google Patents

Znf521基因在制备肝癌治疗药物、诊断及预后评估试剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及ZNF521基因在制备肝癌治疗药物、诊断及预后评估试剂中的应用。发明人在实验中发现，人肝癌组织中ZNF521蛋白的表达量显著高于癌旁组织。另外，发明人还发现，相比于癌旁组织，人肝癌组织中普遍存在ZNF521蛋白的突变体S341C/T980K，且ZNF521蛋白的突变体S341C/T980K可显著降低肝癌患者的生存率。因此，ZNF521蛋白及其突变体S341C/T980K可作为肝癌的特异性分子标志物，通过检测所述蛋白在肝组织中的表达水平和/或肝组织中的上述突变体，可以有效地诊断肝癌、判断药物治疗肝癌有效性或判断肝癌患者的预后效果。

Description

ZNF521基因在制备肝癌治疗药物、诊断及预后评估试剂中的 应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及ZNF521基因在制备肝癌治疗药物、诊断及预后评估试剂中的应用。
背景技术
肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球第六大常见肿瘤类型，死亡率居第二位。乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是HCC的主要危险因素之一，我国有约80％的HCC患者伴有HBV感染。由于肝癌发病隐匿，病人首诊往往已属中晚期，5年生存率不足16％。尽管肝癌的临床研究在近十多年中已取得长足进展，但肝癌5年复发率仍高达60％以上。肝癌的高发病率、高死亡率及其逐年增高的趋势给我国的社会和医疗带来了沉重的负担。
近年来，肿瘤治疗已进入分子靶向治疗的新时代，也成为肝癌治疗的新方向。分子靶向抗肿瘤药物可选择性抑制与肿瘤生长和增殖相关的酶、信号通路及生长因子受体，从而发挥抗肿瘤效应，具有疗效显著、对正常组织毒副作用小且耐受性好等优点，为肝癌临床诊断、治疗和预后提供了崭新的方法和手段。
因此，采用先进的分子生物学技术筛选、鉴定出重要的靶分子，可为开发肝癌靶向治疗药物、肝癌早期诊断、个性化治疗和预后提供理论基础，从而可望提高肝癌病人的生存率。
锌指蛋白521(Zinc Finger Protein 521，以下简称为ZNF521)是一种辅助转录因子，存在于许多组织的细胞核中，参与骨形态生成蛋白信号通路(bone morphogeneticprotein signaling)和造血系统未成熟室的调控。研究发现ZNF521在干细胞的神经分化和脑发育中发挥作用，可能与晚发阿尔茨海默病有关(Late-onset Alzheimer’s Disease)。ZNF521通过招募核小体重塑与组蛋白去乙酰化酶(the nucleosome remodeling andhistone deacetylase，NuRD)复合体，在髓母细胞瘤细胞的克隆生长、转移和成瘤中发挥作用。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
发明人在实验中发现，人肝癌组织中ZNF521蛋白的表达量显著高于癌旁组织。另外，发明人还发现，相比于癌旁组织，人肝癌组织中普遍存在ZNF521蛋白的突变体S341C/T980K，且ZNF521蛋白的突变体S341C/T980K可显著降低肝癌患者的生存率。因此，ZNF521蛋白及其突变型S341C/T980K可作为肝癌的特异性分子标志物。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种蛋白质。根据本发明的实施例，与野生型ZNF521基因表达的蛋白质的氨基酸序列相比，所述蛋白质具有下列的至少一个位置突变：(1)S341C，即氨基酸序列341位的丝氨酸突变为半胱氨酸，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；(2)T980K，即氨基酸序列980位的苏氨酸突变为赖氨酸，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。需要说明的是，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10中的单下划线表示发生突变的位点。
MSRRKQAKPRSLKDPNCKLEDKTEDGEALDCKKRPEDGEELEDEAVHSCDSCLQVFESLSDITEHKINQCQLTDGVDVEDDPTCSWPASSPSSKDQTSPSHGEGCDFGEEEGGPGLPYPCQFCDKSFSRLSYLKHHEQSHSDKLPFKCTYCSRLFKHKRSRDRHIKLHTGDKKYHCSECDAAFSRSDHLKIHLKTHTSNKPYKCAICRRGFLSSSSLHGHMQVHERNKDGSQSGSRMEDWKMKDTQKCSQCEEGFDFPEDLQKHIAECHPECSPNEDRAALQCVYCHELFVEETSLMNHMEQVHSGEKKNSCSICSESFHTVEELYSHMDSHQQPESCNHCNSPSLVTVGYTSVSSTTPDSNLSVDSSTMVEAAPPIPKSRGRKRAAQQTPDMTGPSSKQAKVTYSCIYCNKQLFSSLAVLQIHLKTMHLDKPEQAHICQYCLEVLPSLYNLNEHLKQVHEAQDPGLIVSAMPAIVYQCNFCSEVVNDLNTLQEHIRCSHGFANPAAKDSNAFFCPHCYMGFLTDSSLEEHIRQVHCDLSGSRFGSPVLGTPKEPVVEVYSCSYCTNSPIFNSVLKLNKHIKENHKNIPLALNYIHNGKKSRALSPLSPVAIEQTSLKMMQAVGGAPARPTGEYICNQCGAKYTSLDSFQTHLKTHLDTVLPKLTCPQCNKEFPNQESLLKHVTIHFMITSTYYICESCDKQFTSVDDLQKHLLDMHTFVFFRCTLCQEVFDSKVSIQLHLAVKHSNEKKVYRCTSCNWDFRNETDLQLHVKHNHLENQGKVHKCIFCGESFGTEVELQCHITTHSKKYNCKFCSKAFHAIILLEKHLREKHCVFETKTPNCGTNGASEQVQKEEVELQTLLTNSQESHNSHDGSEEDVDTSEPMYGCDICGAAYTMETLLQNHQLRDHNIRPGESAIVKKKAELIKGNYKCNVCSRTFFSENGLREHMQTHLGPVKHYMCPICGERFPSLLTLTEHKVTHSKSLDTGNCRICKMPLQSEEEFLEHCQMHPDLRNSLTGFRCVVCMQTVTSTLELKIHGTFHMQKTGNGSAVQTTGRGQHVQKLYKCASCLKEFRSKQDLVKLDINGLPYGLCAGCVNLSKSASPGINVPPGTNRPGLGQNENLSAIEGKGKVGGLKTRCSSCNVKFESESELQNHIQTIHRELVPDSNSTQLKTPQVSPMPRISPSQSDEKKTYQCIKCQMVFYNEWDIQVHVANHMIDEGLNHECKLCSQTFDSPAKLQCHLIEHSFEGMGGTFKCPVCFTVFVQANKLQQHIFSAHGQEDKIYDCTQCPQKFFFQTELQNHTMTQHSS(SEQ ID NO：9)。
MSRRKQAKPRSLKDPNCKLEDKTEDGEALDCKKRPEDGEELEDEAVHSCDSCLQVFESLSDITEHKINQCQLTDGVDVEDDPTCSWPASSPSSKDQTSPSHGEGCDFGEEEGGPGLPYPCQFCDKSFSRLSYLKHHEQSHSDKLPFKCTYCSRLFKHKRSRDRHIKLHTGDKKYHCSECDAAFSRSDHLKIHLKTHTSNKPYKCAICRRGFLSSSSLHGHMQVHERNKDGSQSGSRMEDWKMKDTQKCSQCEEGFDFPEDLQKHIAECHPECSPNEDRAALQCVYCHELFVEETSLMNHMEQVHSGEKKNSCSICSESFHTVEELYSHMDSHQQPESCNHSNSPSLVTVGYTSVSSTTPDSNLSVDSSTMVEAAPPIPKSRGRKRAAQQTPDMTGPSSKQAKVTYSCIYCNKQLFSSLAVLQIHLKTMHLDKPEQAHICQYCLEVLPSLYNLNEHLKQVHEAQDPGLIVSAMPAIVYQCNFCSEVVNDLNTLQEHIRCSHGFANPAAKDSNAFFCPHCYMGFLTDSSLEEHIRQVHCDLSGSRFGSPVLGTPKEPVVEVYSCSYCTNSPIFNSVLKLNKHIKENHKNIPLALNYIHNGKKSRALSPLSPVAIEQTSLKMMQAVGGAPARPTGEYICNQCGAKYTSLDSFQTHLKTHLDTVLPKLTCPQCNKEFPNQESLLKHVTIHFMITSTYYICESCDKQFTSVDDLQKHLLDMHTFVFFRCTLCQEVFDSKVSIQLHLAVKHSNEKKVYRCTSCNWDFRNETDLQLHVKHNHLENQGKVHKCIFCGESFGTEVELQCHITTHSKKYNCKFCSKAFHAIILLEKHLREKHCVFETKTPNCGTNGASEQVQKEEVELQTLLTNSQESHNSHDGSEEDVDTSEPMYGCDICGAAYTMETLLQNHQLRDHNIRPGESAIVKKKAELIKGNYKCNVCSRTFFSENGLREHMQTHLGPVKHYMCPICGERFPSLLTLTEHKVKHSKSLDTGNCRICKMPLQSEEEFLEHCQMHPDLRNSLTGFRCVVCMQTVTSTLELKIHGTFHMQKTGNGSAVQTTGRGQHVQKLYKCASCLKEFRSKQDLVKLDINGLPYGLCAGCVNLSKSASPGINVPPGTNRPGLGQNENLSAIEGKGKVGGLKTRCSSCNVKFESESELQNHIQTIHRELVPDSNSTQLKTPQVSPMPRISPSQSDEKKTYQCIKCQMVFYNEWDIQVHVANHMIDEGLNHECKLCSQTFDSPAKLQCHLIEHSFEGMGGTFKCPVCFTVFVQANKLQQHIFSAHGQEDKIYDCTQCPQKFFFQTELQNHTMTQHSS(SEQ ID NO：10)。
需要说明的是，本领域技术人员能够理解，本文中所说的野生型ZNF521基因序列位置是以人类基因组中野生型ZNF521基因的序列为准，但当该野生型ZNF521基因存在于其他物种中时，该序列会有差异，本领域技术人员可以通过将该物种的野生型ZNF521基因与人野生型ZNF521基因进行比对，进而获得该物种的野生型ZNF521基因中所对应的位置。
上述野生型基因的cDNA和/或基因组DNA序列可以从如下网址获得：
ZNF521基因组DNA序列获取网址如下所示：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/CcdsBrowse.cgi？REQUEST＝CCDS&GO＝MainBrowse&DATA＝CCDS32806.1。
发明人发现，相比于癌旁组织，人肝癌组织中普遍存在ZNF521蛋白的突变体S341C/T980K，发明人构建了ZNF521蛋白的突变体(S341C/T980K)并转染到HepG2和HCC-LM3细胞系中，研究其对肝癌肿瘤细胞生长、克隆形成、原位成瘤及化疗药物敏感性的影响，实验结果表明ZNF521突变体(S341C/T980K)可显著提高肝癌肿瘤细胞的生长速度、克隆形成能力、原位肿瘤形成能力及其对化疗药物的耐受性。因此，通过检测上述突变体在肝脏生物样品中是否存在，可以有效地判断生物样品是否患有肝癌。
在本发明的第二方面，本发明提出了ZNF521基因作为肝癌标志物的用途。需要说明的是，所述“ZNF521基因”应做广义理解，既包括编码ZNF521基因的核酸，又包括ZNF521基因所对应的蛋白质，且ZNF521基因的野生型和突变体均包括在内。如前所述，发明人在实验中发现，人肝癌组织中ZNF521蛋白的表达量显著高于癌旁组织。另外，发明人还发现，相比于癌旁组织，人肝癌组织中普遍存在ZNF521蛋白的突变体S341C/T980K，且ZNF521蛋白的突变体S341C/T980K可显著降低肝癌患者的生存率。因此，ZNF521蛋白及其突变型S341C/T980K可作为肝癌的特异性分子标志物。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：试剂，所述试剂用于检测ZNF521蛋白，所述试剂盒用于诊断肝癌、判断药物治疗肝癌有效性或判断肝癌患者预后效果。如前所述，ZNF521蛋白及其突变型S341C/T980K可作为肝癌的特异性分子标志物。因此，包括特异性检测肝脏生物样品中ZNF521蛋白或其突变型S341C/T980K的试剂的根据本发明实施例的试剂盒，能够特异性诊断肝癌、判断药物治疗肝癌有效性或判断肝癌患者预后效果。
根据本发明的实施例，上述试剂盒还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
需要说明的是，所述试剂的种类不受特别限制，只要能够实现特异性检测ZNF521蛋白的表达量或特异性检测ZNF521蛋白的突变体S341C/T980K即可。本领域技术人员可以理解的是，“表达量”既可指绝对表达量也可指相对表达量，可以以对照样本中ZNF521蛋白的表达量作为基准，相对表示待测样本中ZNF521蛋白的表达量，也可以以管家基因的表达量为基准，相对表示ZNF521蛋白的表达量。
根据本发明的实施例，所述试剂包括选自特异性检测ZNF521蛋白的抗体、引物和探针的至少之一。例如，当采用特异性检测ZNF521蛋白的抗体对ZNF521蛋白进行检测时，可以通过蛋白质印迹法、流式细胞术等方法进行检测；当采用特异性检测ZNF521蛋白的引物对ZNF521蛋白进行检测时，可以通过实时定量PCR的方法检测ZNF521蛋白的mRNA的表达量；当采用特异性检测ZNF521蛋白的探针对ZNF521蛋白进行检测时，可采用Northern blot的方法检测ZNF521蛋白的mRNA的表达量。
根据本发明的实施例，针对野生型ZNF521蛋白，所述引物具有SEQ ID NO:1～2所示的核苷酸序列。在一些实施例中，针对ZNF521蛋白的突变型S341C，所述引物具有SEQ IDNO:3～4所示的核苷酸序列。在一些实施例中，针对ZNF521蛋白的突变型T980K，所述引物具有SEQ ID NO:5～6所示的核苷酸序列。
在本发明的第四方面，本发明提出了试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂用于特异性检测ZNF521蛋白，所述试剂盒用于诊断肝癌、判断药物治疗肝癌有效性或判断肝癌患者预后效果。如前所述，ZNF521蛋白及其突变型S341C/T980K可作为肝癌的特异性分子标志物。因此，能够特异性检测肝脏生物样品中ZNF521蛋白或其突变型S341C/T980K的试剂制备的试剂盒，能够特异性诊断肝癌、判断药物治疗肝癌有效性或判断肝癌患者预后效果。
根据本发明的实施例，上述用途还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述试剂包括选自特异性检测ZNF521蛋白的抗体、引物和探针的至少之一。
根据本发明的实施例，针对野生型ZNF521蛋白，所述引物具有SEQ ID NO:1～2所示的核苷酸序列。在一些实施例中，针对ZNF521蛋白的突变型S341C，所述引物具有SEQ IDNO:3～4所示的核苷酸序列。在一些实施例中，针对ZNF521蛋白的突变型T980K，所述引物具有SEQ ID NO:5～6所示的核苷酸序列。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种肝癌细胞模型。根据本发明的实施例，与野生型肝细胞相比，所述细胞模型中ZNF521蛋白的表达水平高，所述细胞模型为肝细胞；和/或与野生型ZNF521蛋白相比，所述细胞模型中ZNF521蛋白具有选自下列的至少一种类型的突变：S341C或T980K，所述细胞模型为肝细胞。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种肝癌动物模型。根据本发明的实施例，与非癌动物的肝组织相比，所述动物模型的肝组织中ZNF521蛋白的表达水平高，其中，所述非癌动物为不患任何癌症的动物；和/或与野生型ZNF521蛋白相比，所述动物模型的肝组织中ZNF521蛋白具有选自下列的至少一种类型的突变：S341C或T980K。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：用于降低ZNF521蛋白的表达水平的试剂和/或用于特异性改变ZNF521蛋白的S341C和/或T980K突变的试剂，所述药物组合物用于治疗或预防肝癌。需要说明的是，“特异性改变ZNF521蛋白的突变”是指能使得突变的核酸或者基因突变的位点或者突变的蛋白恢复到原来的野生状态或者其他不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其他序列不产生实质影响。发明人对ZNF521基因进行了体外细胞功能学的研究，构建ZNF521shRNA载体并转染到HepG2和L02细胞系中稳定敲低ZNF521基因的表达后，其生长速度、克隆形成能力均显著下降；裸鼠成瘤实验发现敲低ZNF521表达可显著降低裸鼠皮下移植瘤形成的数目和大小。此外，发明人还构建了ZNF521突变体(S341C/T980K)并转染到HepG2和HCC-LM3细胞系中，研究其对肿瘤细胞生长、克隆形成、原位成瘤及化疗药物敏感性的影响，实验结果表明ZNF521突变体可显著提高肿瘤细胞的生长速度、克隆形成能力、原位肿瘤形成能力及其对化疗药物的耐受性。因此，包括用于降低ZNF521蛋白的表达水平的试剂和/或用于特异性改变ZNF521蛋白的S341C和/或T980K突变的试剂的根据本发明实施例的药物组合物，能够特异性治疗或预防肝癌。
根据本发明的实施例，上述药物组合物还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述用于降低ZNF521蛋白的表达水平的试剂为敲低ZNF521蛋白的shRNA。在一些实施例中，所述shRNA具有SEQ ID NO：7～8所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例，所述特异性改变ZNF521蛋白的S341C和/或T980K突变的试剂为基于基因编辑或核酸合成方法的试剂。
在本发明的第八方面，本发明提出了ZNF521蛋白的抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防肝癌。发明人的体内外实验结果证实ZNF521蛋白在肝癌中起着促进肿瘤形成的作用。因此，ZNF521蛋白的抑制剂制备的药物，能够特异性治疗或预防肝癌。
根据本发明的实施例，上述用途还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述抑制剂包括选自特异性敲低ZNF521蛋白的试剂、ZNF521蛋白的竞争性抑制剂或ZNF521蛋白的抗体的至少之一。
根据本发明的实施例，所述特异性敲低ZNF521蛋白的试剂为shRNA，所述shRNA具有SEQ ID NO：7～8所示的核苷酸序列。
在本发明的第九方面，本发明提出了特异性改变ZNF521蛋白的S341C和/或T980K突变的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防肝癌。如前所述，实验结果表明ZNF521突变体可显著提高肿瘤细胞的生长速度、克隆形成能力、原位肿瘤形成能力及其对化疗药物的耐受性。因此，特异性改变ZNF521蛋白的S341C和/或T980K突变的试剂制备的药物，能够特异性治疗或预防肝癌。
根据本发明的实施例，上述用途还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述特异性改变ZNF521蛋白的S341C和/或T980K突变的试剂为基于基因编辑或核酸合成方法的试剂。
在本发明的第十方面，本发明提出了一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗或预防肝癌。根据本发明的实施例，所述方法包括：将肝癌模型与候选药物接触；比较接触前后，所述肝癌模型中ZNF521蛋白的表达水平；接触后相比于接触前，所述肝癌模型中所述ZNF521蛋白的表达水平降低，是所述候选药物为目标药物的指示。如前所述，发明人在实验中发现，人肝癌组织中ZNF521蛋白的表达量显著高于癌旁组织，ZNF521蛋白可作为肝癌的特异性分子标志物。因此，利用根据本发明实施例的方法可以有效筛选获得特异性治疗或预防肝癌的药物。
在本发明的第十一方面，本发明提出了一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗或预防肝癌。根据本发明的实施例，所述方法包括：将肝癌模型与候选药物接触；比较接触前后，所述肝癌模型中ZNF521蛋白的S341C和/或T980K突变是否发生回复突变；接触后相比于接触前，所述肝癌模型中ZNF521蛋白的S341C和/或T980K突变发生回复突变，是所述候选药物为目标药物的指示。需要说明的是，“回复突变”是指能使得突变的核酸或者基因突变的位点或者突变的蛋白恢复到原来的野生状态或者其他不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其他序列不产生实质影响。如前所述，发明人发现，ZNF521蛋白的突变型S341C/T980K可显著降低肝癌患者的生存率，ZNF521蛋白的突变型S341C/T980K可作为肝癌的特异性分子标志物。因此，利用根据本发明实施例的方法可以有效筛选获得特异性治疗或预防肝癌的药物。
在本发明的第十二方面，本发明提出了一种诊断肝癌、判断药物治疗肝癌有效性或判断肝癌患者预后效果的系统。根据本发明的实施例，参考图13，所述系统包括：获得装置100，所述获得装置100用于获得待检样本中ZNF521蛋白的表达水平和/或ZNF521蛋白的突变情况；判断装置200，所述判断装置200与所述获得装置100相连，所述判断装置200用于基于所述待检样本中ZNF521蛋白的表达水平和/或ZNF521蛋白的突变情况，诊断肝癌、判断药物治疗肝癌有效性或判断肝癌患者预后效果。需要说明的是，所述待检样本为待检肝细胞。
根据本发明的实施例，上述系统还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述待检样本中ZNF521蛋白的表达水平高于正常样本中ZNF521蛋白的表达水平，和/或所述待检样本中ZNF521蛋白具有S341C和/或T980K突变，是所述待检样本患有肝癌的指示。
根据本发明的实施例，所述待检样本中ZNF521蛋白的表达水平与正常样本中ZNF521蛋白的表达水平相当，和/或所述待检样本中ZNF521蛋白的S341C和/或T980K突变发生回复突变，是所述肝癌患者预后效果良好的指示。
根据本发明的实施例，药物治疗后相比于药物治疗前，所述待检样本中ZNF521蛋白的表达水平降低，和/或所述待检样本中ZNF521蛋白的S341C和/或T980K突变发生回复突变，是所述药物治疗肝癌有效性良好的指示。
在本发明的第十三方面，本发明提出了一种调控肝癌细胞增殖能力的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使培养过程中肝癌细胞的ZNF521蛋白的表达水平升高或降低，和/或使培养过程中肝癌细胞的ZNF521蛋白的341位点和/或980位点发生突变或回复突变，以便控制所述肝癌细胞的增殖能力。需要说明的是，所述方法可以用于非治疗目的，如用于科学研究，例如，通过调节肝癌细胞的ZNF521蛋白的表达水平和/或使培养过程中肝癌细胞的ZNF521蛋白的341位点和/或980位点发生突变或回复突变，从而可以调控肝癌细胞的增殖能力，进而获得相应的肝癌细胞模型，用于后续的肝癌实验研究。
根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述肝癌细胞为肝癌细胞系。在一些实施例中，所述肝癌细胞系为HepG2或HCCLM3。
根据本发明的实施例，所述肝癌细胞的ZNF521蛋白的S341C和/或T980K突变发生回复突变，所述肝癌细胞的增殖能力下降。
根据本发明的实施例，所述肝癌细胞中ZNF521蛋白的表达水平降低，所述肝癌细胞的增殖能力下降。
根据本发明的实施例，所述肝癌细胞中ZNF521蛋白的表达水平降低是通过shRNA实现的。在一些实施例中，所述shRNA具有SEQ ID NO：7～8所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例，所述肝癌细胞的ZNF521蛋白的341位点和/或980位点发生S341C和/或T980K突变，所述肝癌细胞的增殖能力增强。
根据本发明的实施例，所述肝癌细胞中ZNF521蛋白的表达水平升高，所述肝癌细胞的增殖能力增强。
根据本发明的实施例，所述肝癌细胞中ZNF521蛋白的表达水平升高是通过将携带有ZNF521基因的表达载体导入肝癌细胞中实现的。在一些实施例中，所述表达载体为pDsRed1-C1。
附图说明
图1表示根据本发明实施例的肝癌组织样本中ZNF521基因的蛋白表达显著升高；
图2表示根据本发明实施例的肝癌组织中ZNF521突变和肿瘤预后负相关，其中，mutant表示突变体；
图3表示根据本发明实施例的Western blot验证在细胞系中的ZNF521敲低效果；
图4表示根据本发明实施例的细胞系中ZNF521表达受shRNA抑制后，细胞增速变慢；
图5表示根据本发明实施例的细胞系中ZNF521表达受shRNA抑制后，细胞克隆形成能力降低；
图6表示根据本发明实施例的肝癌细胞系HepG2稳定敲低ZNF521表达后，细胞注射与裸鼠皮下，形成的移植瘤的数目和大小显著减少；
图7表示根据本发明实施例的ZNF521突变过表达肿瘤细胞株(HepG2和HCC-LM3)构建成功；
图8表示根据本发明实施例的肿瘤细胞过表达ZNF521及其突变体(S341C/T980K)后，细胞生长能力增强；
图9表示根据本发明实施例的肿瘤细胞过表达ZNF521及其突变体(S341C/T980K)后，细胞克隆形成能力增强；
图10表示根据本发明实施例的肿瘤细胞过表达ZNF521及其突变体(S341C/T980K)后，细胞在肝脏的成瘤能力增强；
图11A表示根据本发明实施例的在索拉非尼处理下的肝癌细胞系的IC50值，可见突变显著增强肿瘤对化疗药物的耐受性，其中：a和b表示CCK-8实验检测在索拉非尼处理下的HepG2和HCC-LM3细胞的IC50值；
图11B表示根据本发明实施例的在RAF265处理下的肝癌细胞系的IC50值，可见突变显著增强肿瘤对化疗药物的耐受性，其中：c和d表示CCK-8实验检测在RAF265处理下的HepG2和HCC-LM3细胞的IC50值；
图11C表示根据本发明实施例的在NVP-AEW541处理下的肝癌细胞系的IC50值，可见突变显著增强肿瘤对化疗药物的耐受性，其中：e和f表示CCK-8实验检测在NVP-AEW541处理下的HepG2和HCC-LM3细胞的IC50值；
图12A表示根据本发明实施例的在索拉非尼处理下对肝癌细胞系克隆形成的抑制作用，可见突变显著增强肿瘤对化疗药物的耐受性，其中：a和b表示平板克隆实验检测sorafenib(索拉非尼)对HepG2和HCC-LM3肝癌细胞系克隆形成的抑制作用；
图12B表示根据本发明实施例的在RAF265处理下对肝癌细胞系克隆形成的抑制作用，可见突变显著增强肿瘤对化疗药物的耐受性，其中：c和d表示平板克隆实验检测RAF265对HepG2和HCC-LM3肝癌细胞系克隆形成的抑制作用；
图12C表示根据本发明实施例的在NVP-AEW541处理下对肝癌细胞系克隆形成的抑制作用，可见突变显著增强肿瘤对化疗药物的耐受性，其中：e和f表示平板克隆实验检测NVP-AEW541对HepG2和HCC-LM3肝癌细胞系克隆形成的抑制作用；
图13表示根据本发明的实施例的系统的结构示意图。
附图标记：
100：获得装置
200：判断装置
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本申请的发明人发现，肝癌组织中锌指蛋白521(ZNF521)在肝癌组织中显著高表达，与病人预后负相关，且其突变型可进一步降低患者生存率。
发明人对ZNF521基因进行了体外细胞功能学的研究，构建ZNF521shRNA载体并转染到HepG2和L02细胞系中稳定敲低ZNF521基因的表达后，其生长速度、克隆形成能力均显著下降；裸鼠成瘤实验发现敲低ZNF521表达可显著降低裸鼠皮下移植瘤形成的数目和大小。过表达ZNF521基因后，肿瘤细胞的生长速度，克隆形成能力及原位肿瘤形成能力均显著提高。发明人的体内外实验结果证实ZNF521在肝癌中起着促进肿瘤形成的作用。此外，发明人还构建了ZNF521突变体(S341C/T980K)并转染到HepG2和HCC-LM3细胞系中，研究其对肿瘤细胞生长、克隆形成、原位成瘤及化疗药物敏感性的影响，实验结果表明ZNF521突变体可显著提高肿瘤细胞的生长速度、克隆形成能力、原位肿瘤形成能力及其对化疗药物的耐受性。
因此，可以合成或制作该基因的抑制物，作为肝癌潜在的靶向治疗药物。由于该基因在肝癌中蛋白表达升高，故可制作检测该基因表达变化的试剂盒，用于肝癌诊断；由于该基因表达水平及突变也与病人预后密切相关，故检测其表达水平和突变型的试剂盒可用于其预后的评估，以指导临床的治疗；此外，由于通过抑制或敲出该基因的可抑制肝癌细胞生长，有助于对肿瘤的药物治疗，故制作肿瘤化疗增敏药物。因此，该基因的细胞生物学功能研究为制备治疗肝癌的新药物和诊断及预后评估的试剂盒的开发提供了基础。
下面将结合具体实施例对本发明进行进一步解释说明。
实施例
1.肝癌组织中ZNF521蛋白表达及其对病人的预后评价
使用的石蜡包埋组织芯片(tissue microarrays,TMA)包含两个独立的肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织及相应的癌旁组织样本集。第一个样本集来自76个乙肝病毒感染(Hepatitis B virus,HBV)相关HCC患者(南京军区总医院)。第二个样本集来自143个HBV相关HCC患者(东方肝胆外科医院)。
实验操作如下：
(1)首先使用二甲苯将载玻片上的组织芯片脱蜡，再用二甲苯和乙醇将其水化；
(2)抗原修复：浸入3％过氧化氢溶液10分钟(min)，之后再在95℃柠檬酸盐溶液中加热25分钟，随后室温冷却60分钟；
(3)TMA载玻片与ZNF521抗体(LS-B4732；LS-bioscience)4℃孵育过夜，之后PBS冲洗3次，每次5min，用滤纸擦拭净载玻片表面的残留液；
(4)滴加辣根过氧化物酶标记的二抗使其完全覆盖组织切片，37℃条件下孵育15min，之后PBS冲洗3次，每次5min，用滤纸擦拭净载玻片表面的残留液；
(5)在避光的条件下滴加新鲜配制的DAB溶液，使其完全覆盖组织切片，置于湿盒中显色5min～10min，显色时间不宜过长，可在显微镜下观察染色程度，流水冲洗；苏木素复染2min，盐酸酒精分化；梯度酒精脱水各5min，二甲苯透明各15min，TMA载玻片有胶贴裱，通过Olympus BX51显微镜/数码相机系统进行检查和捕获，以进行研究比较。
(6)对免疫组化染色(immunohistochemistry,IHC)信号进行评分，包括反映组织中阳性染色细胞比例的比例评分值(0，无；1，<1/100；2,1/100至<1/10；3,1/10至<1/3；4,1/3-2/3；5，>2/3)和反映阳性细胞染色强度估计均值的强度打分(0，无；1，+；2，++；3，+++；4，++++)，将这两个评分值综合后可得到一个综合评分(0-9)。IHC评分超过8被认为是ZNF521高表达，否则为ZNF521低表达。
(7)采用SPSS 17.0统计学软件包及Graph-pad prism 5.0软件处理和分析实验数据和制图，ZNF521免疫组化评分采用卡方检验进行分析。用Kaplan-Meier生存曲线进行生存分析。以P<0.05为差异具有统计学意义(图1)。
从图1可以看出，肝癌组织中的ZNF521蛋白表达量显著高于癌旁组织。
2.实时荧光定量PCR(qPCR)检测肝癌组织中ZNF521基因mRNA水平及基因突变与肿瘤预后的关系
发明人通过对169个肝癌组织样本进行全外显子组测序(illumina Hiseq 4000)，发现ZNF521两个危害性极强的突变位点(S341C和T980K)。
提取肝癌及癌旁组织mRNA和DNA，qPCR方法分别检测ZNF521基因mRNA水平和两个突变型，采用引物见下表1。
表1：引物序列
从图2可以看出，肝癌组织中ZNF521高表达及其突变均和肿瘤预后负相关，且突变能进一步恶化患者的预后。
3.稳定敲降细胞株的建立
(1)人类HCC细胞系HepG2购自中国科学院细胞库。永生化的肝细胞系L02来自北京蛋白组学研究中心。
(2)基于GenBank中ZNF521转录本(NM_015461)信息，设计针对该基因的shRNA，即：
sh-ZNF521-#1(Sh-#1)：5'-CCTCACTCTATAACCTAAA-3'(SEQ ID NO:7)
sh-ZNF521-#2(Sh-#2)：5'-ATCAAGTGTCAGATGGTTT-3'(SEQ ID NO:8)
对照shRNA(Sh-Ctrl)：5’-ATCGACTAGCCACTTAGAC-3’购自英茂盛业(Inovogen)公司。
(3)然后将上述3种shRNA片段亚克隆到慢病毒载体GV-248-GFP中(购自上海吉凯基因化学技术公司)，构建3种针对ZNF521基因逆转录病毒介导的RNA干扰表达载体，分别是GV-248-GFP-Sh-#1、GV-248-GFP-Sh-#2和GV-248-GFP-Sh-Ctrl；在Polybrene(8mg/ml,Sigma)介导下感染HepG2、L02细胞系。然后利用Western blot验证ZNF521敲将效率(图3)。
从图3可以看出，肝癌细胞系Hep-G2和永生化肝细胞系L2在稳定转染sh-ZNF521后，ZNF521蛋白的表达均显著下调。
4.稳定敲降细胞增殖实验
将敲降ZNF521基因的肝癌细胞HepG2、永生化肝细胞L02及相应的阴性对照细胞，接种于48孔细胞培养板，接种密度为每孔4000个细胞。在接种的第0h、24h、48h、72h、or96h，每孔加入10ul CCK-8试剂溶液，在培养箱内孵育1h后，用酶标仪测量在450nm处的吸光值(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)。根据吸光度值计算细胞增殖率，画出生长曲线(图4)。
从图4可以看出，对于肝癌细胞HepG2(图4中的a)和永生化肝细胞L02(图4中的b)，当细胞中ZNF521受到shRNA抑制后，细胞增殖速度均变慢。***P<0.001。
5.敲降细胞平板克隆形成实验
将敲降细胞及相应的对照细胞接种于60mm培养板，接种密度为每孔1000个细胞，培养14天。结晶紫染色后拍照，通过BioSpot计数软件进行细胞计数(Version 5.0,Cellular Technology Limited,USA)(图5)。
从图5可以看出，对于肝癌细胞HepG2(图5中的a)和永生化肝细胞L02(图5中的b)，当细胞中ZNF521受到shRNA抑制后，细胞的克隆形成能力降低。**P<0.01，***P<0.001。
6.降敲肿瘤细胞裸鼠皮下成瘤实验
取6周龄的BALB/c裸鼠，在其背部的左侧和右侧区域分别接种5×106敲降ZNF521的HepG2及相应的对照细胞；每种细胞接种6只裸鼠，待肿瘤形成后每4天测量一次肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线(图6中的b)；5-7周后处死、解剖裸鼠，取出肿瘤组织，10％福尔马林固定包埋支撑石蜡组织切片观察病例形态(图6中的a)。肿瘤体积计算公式如下：体积(mm3)＝[宽2(mm2)×长(mm)]/2。
从图6可以看出，肝癌细胞HepG2稳定降敲ZNF521后，细胞注射于裸鼠皮下，成瘤的数目和大小显著减少。
7.ZNF521突变过表达肿瘤细胞株的构建
ZNF521全长cDNA购自Origene(货号RC217463)，采用QuikChange定点突变试剂盒，依照操作说明构建相关碱基突变的突变型S341C、T980K。采用DNA重组技术,亚克隆突变型ZNF521基因至pDsRed1-C1真核表达载体中,重组为pDsRed1-C1-ZNF521(S341C)、pDsRed1-C1-ZNF521(T980K),酶切鉴定及DNA测序鉴定后，脂质体转染HepG2细胞和HCC-LM3细胞，分4组分别为：空载体转染组(Vector)、野生型转染组(WT)、S341C突变型转染组(S341C)和T980K突变型转染组(T980K)。
从图7可以看出ZNF521突变过表达肿瘤细胞株成功构建。
8.ZNF521过表达及突变体对肿瘤细胞增长的影响
选用CCK-8法测定Vector、WT、S341C、T980K四组肿瘤细胞的生长情况(图8)，测定方法如前所述。
从图8可以看出：(1)过表达ZNF521可以显著增强肿瘤的增殖能力(WT组vs Vector组比较)；(2)两种ZNF521突变体均可以进一步增强肿瘤细胞的增殖能力(S341C/T980K vsWT)，***P<0.001。
9.ZNF521过表达及突变体对肿瘤细胞克隆形成的影响
平板克隆试验方法如前所述，本实验对Vector、WT、S341C、T980K四组肿瘤细胞的克隆形成能力进行了检测(图9)。
从图9中可以看出：(1)过表达ZNF521可以显著增强肿瘤细胞的克隆形成能力(WT组vs Vector组比较)；(2)两种ZNF521突变体均可以进一步增强肿瘤细胞的克隆形成能力(S341C/T980K vs WT)，**P<0.01,***P<0.001。
10.ZNF521过表达及突变体对肿瘤细胞原位成瘤的影响
首先针对上述4组肿瘤细胞，建立了4组裸鼠原位移植瘤模型：每组取6只6周龄的BALB/c裸鼠，在其背部的一侧分别接种5×106转染了空载体(Vector)、ZNF521野生型(WT)、ZNF521突变体S341C(S341C)、ZNF521突变体T980K(T980K)的肿瘤细胞。两周后，将形成的皮下瘤摘下，切成约1mm3小块。
然后在小鼠麻醉状态下，在左上腹直肠旁切口，将准备好的肿瘤组织植入肝脏左叶，然后缝合创口。通过IVIS@Lumina小动物活体成像系统检测肿瘤的生长状况，每周2次。8周后处死，解剖裸鼠，取出肿瘤组织，测量肿瘤大小(图10)。肿瘤体积计算公式如下：体积(mm3)＝[宽2(mm2)×长(mm)]/2。
从图10可以看出：(1)过表达ZNF521可以显著增强肿瘤细胞的增殖能力(WT组vsVector组比较)；(2)两种ZNF521突变体均可以进一步增强肿瘤细胞的增殖能力(S341C/T980K vs WT)，*P<0.05。
11.ZNF521突变体对肿瘤细胞化疗药物敏感性的影响
IC50(half maximal inhibitory concentration)是指被测量的化合物或药物发挥50％抑制能力时的浓度。以肿瘤细胞凋亡为例，某种化合物使50％的肿瘤细胞发生凋亡时的浓度称为该化合物针对该肿瘤细胞的IC50值。IC50值可以用来衡量化合物诱导凋亡的能力，或细胞对化合物的耐受能力，耐受能力越强，该数值越高。
取状态良好的HepG2细胞和HCC-LM3细胞，每种细胞均设转染空载体(Vector)、ZNF521野生型(WT)、ZNF521突变体S341C(S341C)、ZNF521突变体T980K(T980K)四组，均匀铺到96孔板中，第二天加入等浓度梯度的药物处理72h，然后通过CCK-8实验和平板克隆实验检测细胞的存活能力。
图11A～C和图12A～C均表明在HepG2和HCC-LM3细胞中，ZNF521突变(S341C/T980K)使细胞对索拉非尼、RAF265和NVP-AEW541的耐受性显著增加。
发明人的研究发现，肝癌组织中的ZNF521蛋白表达显著上升，与患者预后负相关，且其突变型可进一步降低患者生存率；ZNF521在肝癌中起着促进肿瘤形成的作用；ZNF521突变体(S341C/T980K)可显著提高肿瘤细胞成瘤能力，同时也能提高其对化疗药物的耐受性。
本发明公开了(1)一种原发性肝细胞癌诊断试剂盒及制备方法与应用，该试剂盒可以快速、准确地进行ZNF521检测，从而对原发性肝细胞癌做出快速辅助诊断，具有重要的临床应用价值；本发明包括采用免疫组化染色方法检测ZNF521蛋白表达水平，采用qPCR检测ZNF521基因突变，具有广阔的市场前景。(2)通过干扰或敲出ZNF521，可抑制肝癌细胞生长，有助于对肿瘤的药物治疗，故制作肿瘤化疗增敏药物，在肿瘤治疗领域具有潜在良好的应用前景。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> ZNF521基因在制备肝癌治疗药物、诊断及预后评估试剂中的应用
<130> PIDC3190720
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ZNF521-F
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<400> 4
aagggctgtt gcagtgattg catgactccg gtt 33
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> T980K-F
<400> 5
ctgaacacaa agtcaagcat agtaagagtc ttgatactgg 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> T980K-R
<400> 6
agactcttac tatgcttgac tttgtgttca gtaagagtta 40
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> sh-ZNF521-#1
<400> 7
cctcactcta taacctaaa 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> sh-ZNF521-#2
<400> 8
atcaagtgtc agatggttt 19
<210> 9
<211> 1311
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 蛋白质的氨基酸序列
<400> 9
Met Ser Arg Arg Lys Gln Ala Lys Pro Arg Ser Leu Lys Asp Pro Asn
1 5 10 15
Cys Lys Leu Glu Asp Lys Thr Glu Asp Gly Glu Ala Leu Asp Cys Lys
20 25 30
Lys Arg Pro Glu Asp Gly Glu Glu Leu Glu Asp Glu Ala Val His Ser
35 40 45
Cys Asp Ser Cys Leu Gln Val Phe Glu Ser Leu Ser Asp Ile Thr Glu
50 55 60
His Lys Ile Asn Gln Cys Gln Leu Thr Asp Gly Val Asp Val Glu Asp
65 70 75 80
Asp Pro Thr Cys Ser Trp Pro Ala Ser Ser Pro Ser Ser Lys Asp Gln
85 90 95
Thr Ser Pro Ser His Gly Glu Gly Cys Asp Phe Gly Glu Glu Glu Gly
100 105 110
Gly Pro Gly Leu Pro Tyr Pro Cys Gln Phe Cys Asp Lys Ser Phe Ser
115 120 125
Arg Leu Ser Tyr Leu Lys His His Glu Gln Ser His Ser Asp Lys Leu
130 135 140
Pro Phe Lys Cys Thr Tyr Cys Ser Arg Leu Phe Lys His Lys Arg Ser
145 150 155 160
Arg Asp Arg His Ile Lys Leu His Thr Gly Asp Lys Lys Tyr His Cys
165 170 175
Ser Glu Cys Asp Ala Ala Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Ile His
180 185 190
Leu Lys Thr His Thr Ser Asn Lys Pro Tyr Lys Cys Ala Ile Cys Arg
195 200 205
Arg Gly Phe Leu Ser Ser Ser Ser Leu His Gly His Met Gln Val His
210 215 220
Glu Arg Asn Lys Asp Gly Ser Gln Ser Gly Ser Arg Met Glu Asp Trp
225 230 235 240
Lys Met Lys Asp Thr Gln Lys Cys Ser Gln Cys Glu Glu Gly Phe Asp
245 250 255
Phe Pro Glu Asp Leu Gln Lys His Ile Ala Glu Cys His Pro Glu Cys
260 265 270
Ser Pro Asn Glu Asp Arg Ala Ala Leu Gln Cys Val Tyr Cys His Glu
275 280 285
Leu Phe Val Glu Glu Thr Ser Leu Met Asn His Met Glu Gln Val His
290 295 300
Ser Gly Glu Lys Lys Asn Ser Cys Ser Ile Cys Ser Glu Ser Phe His
305 310 315 320
Thr Val Glu Glu Leu Tyr Ser His Met Asp Ser His Gln Gln Pro Glu
325 330 335
Ser Cys Asn His Cys Asn Ser Pro Ser Leu Val Thr Val Gly Tyr Thr
340 345 350
Ser Val Ser Ser Thr Thr Pro Asp Ser Asn Leu Ser Val Asp Ser Ser
355 360 365
Thr Met Val Glu Ala Ala Pro Pro Ile Pro Lys Ser Arg Gly Arg Lys
370 375 380
Arg Ala Ala Gln Gln Thr Pro Asp Met Thr Gly Pro Ser Ser Lys Gln
385 390 395 400
Ala Lys Val Thr Tyr Ser Cys Ile Tyr Cys Asn Lys Gln Leu Phe Ser
405 410 415
Ser Leu Ala Val Leu Gln Ile His Leu Lys Thr Met His Leu Asp Lys
420 425 430
Pro Glu Gln Ala His Ile Cys Gln Tyr Cys Leu Glu Val Leu Pro Ser
435 440 445
Leu Tyr Asn Leu Asn Glu His Leu Lys Gln Val His Glu Ala Gln Asp
450 455 460
Pro Gly Leu Ile Val Ser Ala Met Pro Ala Ile Val Tyr Gln Cys Asn
465 470 475 480
Phe Cys Ser Glu Val Val Asn Asp Leu Asn Thr Leu Gln Glu His Ile
485 490 495
Arg Cys Ser His Gly Phe Ala Asn Pro Ala Ala Lys Asp Ser Asn Ala
500 505 510
Phe Phe Cys Pro His Cys Tyr Met Gly Phe Leu Thr Asp Ser Ser Leu
515 520 525
Glu Glu His Ile Arg Gln Val His Cys Asp Leu Ser Gly Ser Arg Phe
530 535 540
Gly Ser Pro Val Leu Gly Thr Pro Lys Glu Pro Val Val Glu Val Tyr
545 550 555 560
Ser Cys Ser Tyr Cys Thr Asn Ser Pro Ile Phe Asn Ser Val Leu Lys
565 570 575
Leu Asn Lys His Ile Lys Glu Asn His Lys Asn Ile Pro Leu Ala Leu
580 585 590
Asn Tyr Ile His Asn Gly Lys Lys Ser Arg Ala Leu Ser Pro Leu Ser
595 600 605
Pro Val Ala Ile Glu Gln Thr Ser Leu Lys Met Met Gln Ala Val Gly
610 615 620
Gly Ala Pro Ala Arg Pro Thr Gly Glu Tyr Ile Cys Asn Gln Cys Gly
625 630 635 640
Ala Lys Tyr Thr Ser Leu Asp Ser Phe Gln Thr His Leu Lys Thr His
645 650 655
Leu Asp Thr Val Leu Pro Lys Leu Thr Cys Pro Gln Cys Asn Lys Glu
660 665 670
Phe Pro Asn Gln Glu Ser Leu Leu Lys His Val Thr Ile His Phe Met
675 680 685
Ile Thr Ser Thr Tyr Tyr Ile Cys Glu Ser Cys Asp Lys Gln Phe Thr
690 695 700
Ser Val Asp Asp Leu Gln Lys His Leu Leu Asp Met His Thr Phe Val
705 710 715 720
Phe Phe Arg Cys Thr Leu Cys Gln Glu Val Phe Asp Ser Lys Val Ser
725 730 735
Ile Gln Leu His Leu Ala Val Lys His Ser Asn Glu Lys Lys Val Tyr
740 745 750
Arg Cys Thr Ser Cys Asn Trp Asp Phe Arg Asn Glu Thr Asp Leu Gln
755 760 765
Leu His Val Lys His Asn His Leu Glu Asn Gln Gly Lys Val His Lys
770 775 780
Cys Ile Phe Cys Gly Glu Ser Phe Gly Thr Glu Val Glu Leu Gln Cys
785 790 795 800
His Ile Thr Thr His Ser Lys Lys Tyr Asn Cys Lys Phe Cys Ser Lys
805 810 815
Ala Phe His Ala Ile Ile Leu Leu Glu Lys His Leu Arg Glu Lys His
820 825 830
Cys Val Phe Glu Thr Lys Thr Pro Asn Cys Gly Thr Asn Gly Ala Ser
835 840 845
Glu Gln Val Gln Lys Glu Glu Val Glu Leu Gln Thr Leu Leu Thr Asn
850 855 860
Ser Gln Glu Ser His Asn Ser His Asp Gly Ser Glu Glu Asp Val Asp
865 870 875 880
Thr Ser Glu Pro Met Tyr Gly Cys Asp Ile Cys Gly Ala Ala Tyr Thr
885 890 895
Met Glu Thr Leu Leu Gln Asn His Gln Leu Arg Asp His Asn Ile Arg
900 905 910
Pro Gly Glu Ser Ala Ile Val Lys Lys Lys Ala Glu Leu Ile Lys Gly
915 920 925
Asn Tyr Lys Cys Asn Val Cys Ser Arg Thr Phe Phe Ser Glu Asn Gly
930 935 940
Leu Arg Glu His Met Gln Thr His Leu Gly Pro Val Lys His Tyr Met
945 950 955 960
Cys Pro Ile Cys Gly Glu Arg Phe Pro Ser Leu Leu Thr Leu Thr Glu
965 970 975
His Lys Val Thr His Ser Lys Ser Leu Asp Thr Gly Asn Cys Arg Ile
980 985 990
Cys Lys Met Pro Leu Gln Ser Glu Glu Glu Phe Leu Glu His Cys Gln
995 1000 1005
Met His Pro Asp Leu Arg Asn Ser Leu Thr Gly Phe Arg Cys Val
1010 1015 1020
Val Cys Met Gln Thr Val Thr Ser Thr Leu Glu Leu Lys Ile His
1025 1030 1035
Gly Thr Phe His Met Gln Lys Thr Gly Asn Gly Ser Ala Val Gln
1040 1045 1050
Thr Thr Gly Arg Gly Gln His Val Gln Lys Leu Tyr Lys Cys Ala
1055 1060 1065
Ser Cys Leu Lys Glu Phe Arg Ser Lys Gln Asp Leu Val Lys Leu
1070 1075 1080
Asp Ile Asn Gly Leu Pro Tyr Gly Leu Cys Ala Gly Cys Val Asn
1085 1090 1095
Leu Ser Lys Ser Ala Ser Pro Gly Ile Asn Val Pro Pro Gly Thr
1100 1105 1110
Asn Arg Pro Gly Leu Gly Gln Asn Glu Asn Leu Ser Ala Ile Glu
1115 1120 1125
Gly Lys Gly Lys Val Gly Gly Leu Lys Thr Arg Cys Ser Ser Cys
1130 1135 1140
Asn Val Lys Phe Glu Ser Glu Ser Glu Leu Gln Asn His Ile Gln
1145 1150 1155
Thr Ile His Arg Glu Leu Val Pro Asp Ser Asn Ser Thr Gln Leu
1160 1165 1170
Lys Thr Pro Gln Val Ser Pro Met Pro Arg Ile Ser Pro Ser Gln
1175 1180 1185
Ser Asp Glu Lys Lys Thr Tyr Gln Cys Ile Lys Cys Gln Met Val
1190 1195 1200
Phe Tyr Asn Glu Trp Asp Ile Gln Val His Val Ala Asn His Met
1205 1210 1215
Ile Asp Glu Gly Leu Asn His Glu Cys Lys Leu Cys Ser Gln Thr
1220 1225 1230
Phe Asp Ser Pro Ala Lys Leu Gln Cys His Leu Ile Glu His Ser
1235 1240 1245
Phe Glu Gly Met Gly Gly Thr Phe Lys Cys Pro Val Cys Phe Thr
1250 1255 1260
Val Phe Val Gln Ala Asn Lys Leu Gln Gln His Ile Phe Ser Ala
1265 1270 1275
His Gly Gln Glu Asp Lys Ile Tyr Asp Cys Thr Gln Cys Pro Gln
1280 1285 1290
Lys Phe Phe Phe Gln Thr Glu Leu Gln Asn His Thr Met Thr Gln
1295 1300 1305
His Ser Ser
1310
<210> 10
<211> 1311
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 蛋白质的氨基酸序列
<400> 10
Met Ser Arg Arg Lys Gln Ala Lys Pro Arg Ser Leu Lys Asp Pro Asn
1 5 10 15
Cys Lys Leu Glu Asp Lys Thr Glu Asp Gly Glu Ala Leu Asp Cys Lys
20 25 30
Lys Arg Pro Glu Asp Gly Glu Glu Leu Glu Asp Glu Ala Val His Ser
35 40 45
Cys Asp Ser Cys Leu Gln Val Phe Glu Ser Leu Ser Asp Ile Thr Glu
50 55 60
His Lys Ile Asn Gln Cys Gln Leu Thr Asp Gly Val Asp Val Glu Asp
65 70 75 80
Asp Pro Thr Cys Ser Trp Pro Ala Ser Ser Pro Ser Ser Lys Asp Gln
85 90 95
Thr Ser Pro Ser His Gly Glu Gly Cys Asp Phe Gly Glu Glu Glu Gly
100 105 110
Gly Pro Gly Leu Pro Tyr Pro Cys Gln Phe Cys Asp Lys Ser Phe Ser
115 120 125
Arg Leu Ser Tyr Leu Lys His His Glu Gln Ser His Ser Asp Lys Leu
130 135 140
Pro Phe Lys Cys Thr Tyr Cys Ser Arg Leu Phe Lys His Lys Arg Ser
145 150 155 160
Arg Asp Arg His Ile Lys Leu His Thr Gly Asp Lys Lys Tyr His Cys
165 170 175
Ser Glu Cys Asp Ala Ala Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Ile His
180 185 190
Leu Lys Thr His Thr Ser Asn Lys Pro Tyr Lys Cys Ala Ile Cys Arg
195 200 205
Arg Gly Phe Leu Ser Ser Ser Ser Leu His Gly His Met Gln Val His
210 215 220
Glu Arg Asn Lys Asp Gly Ser Gln Ser Gly Ser Arg Met Glu Asp Trp
225 230 235 240
Lys Met Lys Asp Thr Gln Lys Cys Ser Gln Cys Glu Glu Gly Phe Asp
245 250 255
Phe Pro Glu Asp Leu Gln Lys His Ile Ala Glu Cys His Pro Glu Cys
260 265 270
Ser Pro Asn Glu Asp Arg Ala Ala Leu Gln Cys Val Tyr Cys His Glu
275 280 285
Leu Phe Val Glu Glu Thr Ser Leu Met Asn His Met Glu Gln Val His
290 295 300
Ser Gly Glu Lys Lys Asn Ser Cys Ser Ile Cys Ser Glu Ser Phe His
305 310 315 320
Thr Val Glu Glu Leu Tyr Ser His Met Asp Ser His Gln Gln Pro Glu
325 330 335
Ser Cys Asn His Ser Asn Ser Pro Ser Leu Val Thr Val Gly Tyr Thr
340 345 350
Ser Val Ser Ser Thr Thr Pro Asp Ser Asn Leu Ser Val Asp Ser Ser
355 360 365
Thr Met Val Glu Ala Ala Pro Pro Ile Pro Lys Ser Arg Gly Arg Lys
370 375 380
Arg Ala Ala Gln Gln Thr Pro Asp Met Thr Gly Pro Ser Ser Lys Gln
385 390 395 400
Ala Lys Val Thr Tyr Ser Cys Ile Tyr Cys Asn Lys Gln Leu Phe Ser
405 410 415
Ser Leu Ala Val Leu Gln Ile His Leu Lys Thr Met His Leu Asp Lys
420 425 430
Pro Glu Gln Ala His Ile Cys Gln Tyr Cys Leu Glu Val Leu Pro Ser
435 440 445
Leu Tyr Asn Leu Asn Glu His Leu Lys Gln Val His Glu Ala Gln Asp
450 455 460
Pro Gly Leu Ile Val Ser Ala Met Pro Ala Ile Val Tyr Gln Cys Asn
465 470 475 480
Phe Cys Ser Glu Val Val Asn Asp Leu Asn Thr Leu Gln Glu His Ile
485 490 495
Arg Cys Ser His Gly Phe Ala Asn Pro Ala Ala Lys Asp Ser Asn Ala
500 505 510
Phe Phe Cys Pro His Cys Tyr Met Gly Phe Leu Thr Asp Ser Ser Leu
515 520 525
Glu Glu His Ile Arg Gln Val His Cys Asp Leu Ser Gly Ser Arg Phe
530 535 540
Gly Ser Pro Val Leu Gly Thr Pro Lys Glu Pro Val Val Glu Val Tyr
545 550 555 560
Ser Cys Ser Tyr Cys Thr Asn Ser Pro Ile Phe Asn Ser Val Leu Lys
565 570 575
Leu Asn Lys His Ile Lys Glu Asn His Lys Asn Ile Pro Leu Ala Leu
580 585 590
Asn Tyr Ile His Asn Gly Lys Lys Ser Arg Ala Leu Ser Pro Leu Ser
595 600 605
Pro Val Ala Ile Glu Gln Thr Ser Leu Lys Met Met Gln Ala Val Gly
610 615 620
Gly Ala Pro Ala Arg Pro Thr Gly Glu Tyr Ile Cys Asn Gln Cys Gly
625 630 635 640
Ala Lys Tyr Thr Ser Leu Asp Ser Phe Gln Thr His Leu Lys Thr His
645 650 655
Leu Asp Thr Val Leu Pro Lys Leu Thr Cys Pro Gln Cys Asn Lys Glu
660 665 670
Phe Pro Asn Gln Glu Ser Leu Leu Lys His Val Thr Ile His Phe Met
675 680 685
Ile Thr Ser Thr Tyr Tyr Ile Cys Glu Ser Cys Asp Lys Gln Phe Thr
690 695 700
Ser Val Asp Asp Leu Gln Lys His Leu Leu Asp Met His Thr Phe Val
705 710 715 720
Phe Phe Arg Cys Thr Leu Cys Gln Glu Val Phe Asp Ser Lys Val Ser
725 730 735
Ile Gln Leu His Leu Ala Val Lys His Ser Asn Glu Lys Lys Val Tyr
740 745 750
Arg Cys Thr Ser Cys Asn Trp Asp Phe Arg Asn Glu Thr Asp Leu Gln
755 760 765
Leu His Val Lys His Asn His Leu Glu Asn Gln Gly Lys Val His Lys
770 775 780
Cys Ile Phe Cys Gly Glu Ser Phe Gly Thr Glu Val Glu Leu Gln Cys
785 790 795 800
His Ile Thr Thr His Ser Lys Lys Tyr Asn Cys Lys Phe Cys Ser Lys
805 810 815
Ala Phe His Ala Ile Ile Leu Leu Glu Lys His Leu Arg Glu Lys His
820 825 830
Cys Val Phe Glu Thr Lys Thr Pro Asn Cys Gly Thr Asn Gly Ala Ser
835 840 845
Glu Gln Val Gln Lys Glu Glu Val Glu Leu Gln Thr Leu Leu Thr Asn
850 855 860
Ser Gln Glu Ser His Asn Ser His Asp Gly Ser Glu Glu Asp Val Asp
865 870 875 880
Thr Ser Glu Pro Met Tyr Gly Cys Asp Ile Cys Gly Ala Ala Tyr Thr
885 890 895
Met Glu Thr Leu Leu Gln Asn His Gln Leu Arg Asp His Asn Ile Arg
900 905 910
Pro Gly Glu Ser Ala Ile Val Lys Lys Lys Ala Glu Leu Ile Lys Gly
915 920 925
Asn Tyr Lys Cys Asn Val Cys Ser Arg Thr Phe Phe Ser Glu Asn Gly
930 935 940
Leu Arg Glu His Met Gln Thr His Leu Gly Pro Val Lys His Tyr Met
945 950 955 960
Cys Pro Ile Cys Gly Glu Arg Phe Pro Ser Leu Leu Thr Leu Thr Glu
965 970 975
His Lys Val Lys His Ser Lys Ser Leu Asp Thr Gly Asn Cys Arg Ile
980 985 990
Cys Lys Met Pro Leu Gln Ser Glu Glu Glu Phe Leu Glu His Cys Gln
995 1000 1005
Met His Pro Asp Leu Arg Asn Ser Leu Thr Gly Phe Arg Cys Val
1010 1015 1020
Val Cys Met Gln Thr Val Thr Ser Thr Leu Glu Leu Lys Ile His
1025 1030 1035
Gly Thr Phe His Met Gln Lys Thr Gly Asn Gly Ser Ala Val Gln
1040 1045 1050
Thr Thr Gly Arg Gly Gln His Val Gln Lys Leu Tyr Lys Cys Ala
1055 1060 1065
Ser Cys Leu Lys Glu Phe Arg Ser Lys Gln Asp Leu Val Lys Leu
1070 1075 1080
Asp Ile Asn Gly Leu Pro Tyr Gly Leu Cys Ala Gly Cys Val Asn
1085 1090 1095
Leu Ser Lys Ser Ala Ser Pro Gly Ile Asn Val Pro Pro Gly Thr
1100 1105 1110
Asn Arg Pro Gly Leu Gly Gln Asn Glu Asn Leu Ser Ala Ile Glu
1115 1120 1125
Gly Lys Gly Lys Val Gly Gly Leu Lys Thr Arg Cys Ser Ser Cys
1130 1135 1140
Asn Val Lys Phe Glu Ser Glu Ser Glu Leu Gln Asn His Ile Gln
1145 1150 1155
Thr Ile His Arg Glu Leu Val Pro Asp Ser Asn Ser Thr Gln Leu
1160 1165 1170
Lys Thr Pro Gln Val Ser Pro Met Pro Arg Ile Ser Pro Ser Gln
1175 1180 1185
Ser Asp Glu Lys Lys Thr Tyr Gln Cys Ile Lys Cys Gln Met Val
1190 1195 1200
Phe Tyr Asn Glu Trp Asp Ile Gln Val His Val Ala Asn His Met
1205 1210 1215
Ile Asp Glu Gly Leu Asn His Glu Cys Lys Leu Cys Ser Gln Thr
1220 1225 1230
Phe Asp Ser Pro Ala Lys Leu Gln Cys His Leu Ile Glu His Ser
1235 1240 1245
Phe Glu Gly Met Gly Gly Thr Phe Lys Cys Pro Val Cys Phe Thr
1250 1255 1260
Val Phe Val Gln Ala Asn Lys Leu Gln Gln His Ile Phe Ser Ala
1265 1270 1275
His Gly Gln Glu Asp Lys Ile Tyr Asp Cys Thr Gln Cys Pro Gln
1280 1285 1290
Lys Phe Phe Phe Gln Thr Glu Leu Gln Asn His Thr Met Thr Gln
1295 1300 1305
His Ser Ser
1310

Claims (22)

1.一种蛋白质，其特征在于，与野生型ZNF521基因表达的蛋白质的氨基酸序列相比，所述蛋白质具有下列的至少一个位置突变：
(1)氨基酸序列341位的丝氨酸突变为半胱氨酸，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO：9所示；
(2)氨基酸序列980位的苏氨酸突变为赖氨酸，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
2.ZNF521基因作为肝癌标志物的用途。
3.一种试剂盒，其特征在于，包括：试剂，所述试剂用于检测ZNF521蛋白，所述试剂盒用于诊断肝癌、判断药物治疗肝癌有效性或判断肝癌患者预后效果。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括选自特异性检测ZNF521蛋白的抗体、引物和探针的至少之一；
任选地，针对野生型ZNF521蛋白，所述引物具有SEQ ID NO:1～2所示的核苷酸序列；
任选地，针对ZNF521蛋白的突变型S341C，所述引物具有SEQ ID NO:3～4所示的核苷酸序列；
任选地，针对ZNF521蛋白的突变型T980K，所述引物具有SEQ ID NO:5～6所示的核苷酸序列。
5.试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂用于特异性检测ZNF521蛋白，所述试剂盒用于诊断肝癌、判断药物治疗肝癌有效性或判断肝癌患者预后效果。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述试剂包括选自特异性检测ZNF521蛋白的抗体、引物和探针的至少之一；
任选地，针对野生型ZNF521蛋白，所述引物具有SEQ ID NO:1～2所示的核苷酸序列；
任选地，针对ZNF521蛋白的突变型S341C，所述引物具有SEQ ID NO:3～4所示的核苷酸序列；
任选地，针对ZNF521蛋白的突变型T980K，所述引物具有SEQ ID NO:5～6所示的核苷酸序列。
7.一种肝癌细胞模型，其特征在于，与野生型肝细胞相比，所述细胞模型中ZNF521蛋白的表达水平高，所述细胞模型为肝细胞；和/或
与野生型ZNF521蛋白相比，所述细胞模型中ZNF521蛋白具有选自下列的至少一种类型的突变：S341C或T980K，所述细胞模型为肝细胞。
8.一种肝癌动物模型，其特征在于，与非癌动物的肝组织相比，所述动物模型的肝组织中ZNF521蛋白的表达水平高，其中，所述非癌动物为不患任何癌症的动物；和/或
与野生型ZNF521蛋白相比，所述动物模型的肝组织中ZNF521蛋白具有选自下列的至少一种类型的突变：S341C或T980K。
9.一种药物组合物，其特征在于，包括：
用于降低ZNF521蛋白的表达水平的试剂，和/或
用于特异性改变ZNF521蛋白的S341C和/或T980K突变的试剂，
所述药物组合物用于治疗或预防肝癌。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述用于降低ZNF521蛋白的表达水平的试剂为敲低ZNF521蛋白的shRNA；
任选地，所述shRNA具有SEQ ID NO：7～8所示的核苷酸序列；
任选地，所述特异性改变ZNF521蛋白的S341C和/或T980K突变的试剂为基于基因编辑或核酸合成方法的试剂。
11.ZNF521蛋白的抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防肝癌。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述抑制剂包括选自特异性敲低ZNF521蛋白的试剂、ZNF521蛋白的竞争性抑制剂或ZNF521蛋白的抗体的至少之一。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述特异性敲低ZNF521蛋白的试剂为shRNA，所述shRNA具有SEQ ID NO：7～8所示的核苷酸序列。
14.特异性改变ZNF521蛋白的S341C和/或T980K突变的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防肝癌。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述特异性改变ZNF521蛋白的S341C和/或T980K突变的试剂为基于基因编辑或核酸合成方法的试剂。
16.一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗或预防肝癌，其特征在于，包括：
将肝癌模型与候选药物接触；
比较接触前后，所述肝癌模型中ZNF521蛋白的表达水平；
接触后相比于接触前，所述肝癌模型中所述ZNF521蛋白的表达水平降低，是所述候选药物为目标药物的指示。
17.一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗或预防肝癌，其特征在于，包括：
将肝癌模型与候选药物接触；
比较接触前后，所述肝癌模型中ZNF521蛋白的S341C和/或T980K突变是否发生回复突变；
接触后相比于接触前，所述肝癌模型中ZNF521蛋白的S341C和/或T980K突变发生回复突变，是所述候选药物为目标药物的指示。
18.一种诊断肝癌、判断药物治疗肝癌有效性或判断肝癌患者预后效果的系统，其特征在于，包括：
获得装置，所述获得装置用于获得待检样本中ZNF521蛋白的表达水平和/或ZNF521蛋白的突变情况；
判断装置，所述判断装置与所述获得装置相连，所述判断装置用于基于所述待检样本中ZNF521蛋白的表达水平和/或ZNF521蛋白的突变情况，诊断肝癌、判断药物治疗肝癌有效性或判断肝癌患者预后效果。
19.根据权利要求18所述的系统，其特征在于，所述待检样本中ZNF521蛋白的表达水平高于正常样本中ZNF521蛋白的表达水平，和/或
所述待检样本中ZNF521蛋白具有S341C和/或T980K突变，是所述待检样本患有肝癌的指示；
任选地，所述待检样本中ZNF521蛋白的表达水平与正常样本中ZNF521蛋白的表达水平相当，和/或
所述待检样本中ZNF521蛋白的S341C和/或T980K突变发生回复突变，是所述肝癌患者预后效果良好的指示；
任选地，药物治疗后相比于药物治疗前，所述待检样本中ZNF521蛋白的表达水平降低，和/或
所述待检样本中ZNF521蛋白的S341C和/或T980K突变发生回复突变，是所述药物治疗肝癌有效性良好的指示。
20.一种调控肝癌细胞增殖能力的方法，其特征在于，包括：
使培养过程中肝癌细胞的ZNF521蛋白的表达水平升高或降低，和/或
使培养过程中肝癌细胞的ZNF521蛋白的341位点和/或980位点发生突变或回复突变，以便控制所述肝癌细胞的增殖能力；
任选地，所述肝癌细胞为肝癌细胞系；
任选地，所述肝癌细胞系为HepG2或HCCLM3。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述肝癌细胞的ZNF521蛋白的S341C和/或T980K突变发生回复突变，所述肝癌细胞的增殖能力下降；
任选地，所述肝癌细胞中ZNF521蛋白的表达水平降低，所述肝癌细胞的增殖能力下降；
任选地，所述肝癌细胞中ZNF521蛋白的表达水平降低是通过shRNA实现的；
任选地，所述shRNA具有SEQ ID NO：7～8所示的核苷酸序列。
22.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述肝癌细胞的ZNF521蛋白的341位点和/或980位点发生S341C和/或T980K突变，所述肝癌细胞的增殖能力增强；
任选地，所述肝癌细胞中ZNF521蛋白的表达水平升高，所述肝癌细胞的增殖能力增强；
任选地，所述肝癌细胞中ZNF521蛋白的表达水平升高是通过将携带有ZNF521基因的表达载体导入肝癌细胞中实现的；
任选地，所述表达载体为pDsRed1-C1。
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