CN114441760A - 一种用于肝癌诊断的生物标志物和试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于肝癌诊断的生物标志物和试剂盒及检测方法，属于分子标志物技术领域，所要解决的技术问题是如何提高肝细胞癌诊断的灵敏度和/或特异性。本发明提供了生物标志物和/或检测所述生物标志物的物质在肝细胞癌诊断或制备用于肝细胞癌诊断的产品中的应用；所述生物标志物为血浆外泌体CD48蛋白或血浆外泌体CD48蛋白和血浆AFP的组合。本发明的生物标志物CD48蛋白及检测方法具有敏感性强、特异性高的特点，灵敏度可以达到0.928，因此漏诊率（假阴性率）低，将其应用于临床肝细胞癌患者的诊断中可提高早期肝癌的诊断率，将亚临床肝癌或隐匿性肝癌从人群中筛查出来，有助于提高肝癌的治愈率及降低死亡率。

Description

一种用于肝癌诊断的生物标志物和试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于借助于测试材料的化学或物理性质来测试或分子材料的分子标志物技术领域，具体涉及一种用于肝癌诊断的生物标志物和试剂盒及检测方法。
背景技术
原发性肝癌（Primary liver cancer，PLC）是全球发病率排名第六，死亡率排名第三的消化系统恶性肿瘤。肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC；以下简称肝癌）约占原发性肝癌的75%-85%。超过60%的肝细胞癌患者在晚期才被确诊，因而无法得到及时有效的治疗。目前临床上常用于肝癌诊断的血清标志物敏感性均偏低，所以鉴定高敏感性和特异性的肝癌诊断标志物是临床上亟待解决的问题之一。
外泌体（Exosome）是一种直径约为40～200纳米（Nanometer，nm）、由细胞内多囊泡胞内体（Multi-vesicular endosome，MEV）成熟过程中膜向内出芽形成的具有脂质双分子层的腔内小泡，其所包含的蛋白质、核酸和脂类物质等，可以作为癌症的诊断和/或预后标志物，具有潜在的临床应用价值。但截至目前，尚未有肝细胞癌血浆来源的外泌体蛋白标志物及分子分类器的报道。因此，发现肝细胞癌血浆来源的血浆外泌体蛋白标志物及相应的分子分类器，进一步建立非侵入性、易操作性、高灵敏性和高特异性的肝细胞癌诊断或检测方法，将有助于肝细胞癌早发现、早诊断和早治疗。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于肝细胞癌诊断的生物标志物，所要解决的技术问题是如何提高肝细胞癌诊断的灵敏度和/或特异性。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了生物标志物和/或检测所述生物标志物的物质的下述任一种应用：
A1）在肝细胞癌诊断或制备用于肝细胞癌诊断的产品中的应用；
A2）在肝细胞癌筛查或制备用于肝细胞癌筛查的产品中的应用；
A3）在评估肝细胞癌风险或制备用于评估肝细胞癌风险的产品中的应用；
A4）在肝细胞癌预后评估或制备用于肝细胞癌预后评估的产品中的应用；
A5）在鉴别区分肝细胞癌和肝硬化或制备鉴别区分肝细胞癌和肝硬化的产品中的应用；
所述生物标志物可为下述任一种：
B1）血浆外泌体中的CD48蛋白和血浆中的AFP；
B2）血浆外泌体中的CD48蛋白。
所述生物标志物可适用于ELISA常规的蛋白检测实验。
进一步地，所述血浆外泌体中的CD48蛋白在肝细胞癌样品（肝癌患者血浆样品）与对照样品（健康人和肝硬化患者血浆样品）中的表达水平有显著性差异。
进一步地，所述血浆外泌体中的CD48蛋白在肝癌样品中表达水平上调。
对于健康人（Healthy control，HC）、肝硬化（Live cirrhosis，LC）患者与肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）患者，血浆外泌体中的CD48蛋白可以作为用于区分HCC和HC、LC的生物标志物。
健康人和肝硬化患者血浆外泌体中的CD48表达水平低于肝癌患者。
上述应用中，所述物质可为用于检测CD48蛋白含量（即血浆外泌体中的CD48蛋白表达水平）的试剂（如检测血浆外泌体中的CD48蛋白含量的试剂）和用于检测AFP含量的试剂或试剂盒（如检测血浆外泌体中的AFP含量的试剂或试剂盒）；或所述物质为用于检测CD48蛋白含量的试剂（如检测血浆外泌体中的CD48蛋白含量的试剂）。
上述应用中，所述检测所述生物标志物的物质可包括通过酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、放射免疫测定法、免疫共沉淀法、免疫印迹法、高效液相色谱法、毛细管凝胶电泳法、近红外光谱法、质谱法、免疫化学发光法、胶体金免疫技术、荧光免疫层析技术、表面等离子共振技术、免疫-PCR技术或生物素-亲和素技术检测所述生物标志物的物质。
上述应用中，所述用于检测CD48蛋白含量的试剂可包括CD48蛋白（如Ag26536，Proteintech，USA）和结合CD48蛋白的抗体（如ab134049，Abcam，UK）；所述用于检测AFP含量的试剂可包括AFP和结合AFP的抗体。
所述用于检测AFP含量的试剂盒包括AFP和结合AFP的抗体。
所述用于检测CD48蛋白含量的试剂中的CD48蛋白作为标准品。
所述用于检测AFP含量的试剂中的AFP蛋白作为标准品。
进一步地，所述用于检测CD48蛋白表达水平的物质可为特异性结合CD48蛋白的抗体（如兔抗人CD48多克隆抗体）。
本发明还提供了组合物，所述组合物含有所述用于检测CD48蛋白含量的试剂和用于检测AFP含量的试剂，所述组合物具有下述至少一种用途：
U1）肝细胞癌诊断或制备用于肝细胞癌诊断的产品；
U2）肝细胞癌筛查或制备用于肝细胞癌筛查的产品；
U3）评估肝细胞癌风险或制备用于评估肝细胞癌风险的产品；
U4）肝细胞癌预后评估或制备用于肝细胞癌预后评估的产品；
U5）鉴别区分肝细胞癌和肝硬化或制备鉴别区分肝细胞癌和肝硬化的产品。
所述组合物中所述用于检测CD48蛋白含量的试剂和所述用于检测AFP含量的试剂均独立包装。
所述产品的检测样本可为血浆。
本发明还提供了试剂盒，所述试剂盒包括所述组合物或所述用于检测CD48蛋白含量的试剂，所述试剂盒具有下述至少一种用途：
U1）肝细胞癌诊断或制备用于肝细胞癌诊断的产品；
U2）肝细胞癌筛查或制备用于肝细胞癌筛查的产品；
U3）评估肝细胞癌风险或制备用于评估肝细胞癌风险的产品；
U4）肝细胞癌预后评估或制备用于肝细胞癌预后评估的产品；
U5）鉴别区分肝细胞癌和肝硬化或制备鉴别区分肝细胞癌和肝硬化的产品。
上述试剂盒中，所述试剂盒的检测样本可为血浆。
进一步地，所述试剂盒包括定量检测血浆外泌体中的CD48蛋白的试剂。
进一步地，所述试剂盒还包括标准品，所述标准品可为CD48蛋白标准品。
进一步地，所述试剂盒还可包括外泌体富集纯化试剂。
进一步地，所述试剂盒可为肝细胞癌诊断试剂盒，所述肝细胞癌诊断试剂盒还包括对照样品，所述对照样品可为健康人血浆外泌体和/或肝硬化患者血浆外泌体。
本发明还提供了所述试剂盒的下述任一种应用：
C1）在肝细胞癌诊断或制备用于肝细胞癌诊断的产品中的应用；
C2）在肝细胞癌筛查或制备用于肝细胞癌筛查的产品中的应用；
C3）在评估肝细胞癌风险或制备用于评估肝细胞癌风险的产品中的应用；
C4）在肝细胞癌预后评估或制备用于肝细胞癌预后评估的产品中的应用；
C5）在鉴别区分肝细胞癌和肝硬化或制备鉴别区分肝细胞癌和肝硬化的产品中的应用。
本文中，所述产品可为试剂、试剂盒或芯片。
本发明还提供了所述生物标志物（血浆外泌体中的CD48蛋白）作为靶点在制备治疗或预防肝细胞癌的药物中的应用。
本发明还提供了筛查或辅助诊断肝细胞癌的方法，所述方法可为下述任一种：
D1）所述方法包括利用所述组合物检测待测患者血浆中的CD48蛋白含量和AFP含量，根据CD48蛋白含量和AFP含量确定待测患者是否为肝细胞癌患者；
D2）所述方法包括利用所述用于检测CD48蛋白含量的试剂检测待测患者血浆中的CD48蛋白含量，根据CD48蛋白含量确定待测患者是否为肝细胞癌患者。
本发明所述肝细胞癌诊断包括以下步骤：
E1）采集肝癌样品；
E2）用所述肝细胞癌诊断试剂（检测所述生物标志物的物质）检测肝癌样品和对照样品中的血浆外泌体CD48的蛋白表达水平；
E3）若肝癌样品中的CD48蛋白表达水平高于对照样品，则有患肝细胞癌的风险。
所述肝癌样品为血浆样品。
进一步地，所述检测可为通过酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测血浆外泌体中CD48蛋白的表达水平。
本发明还提供了血浆外泌体中CD48蛋白的ELISA检测方法。
在本发明的一个实施方案中，所述ELISA方法包括如下步骤：
（1）在96孔酶标板（95029180，Thermo Fisher Scientific，USA）中包被100 μL鼠抗人CD63单克隆抗体（1:1 000；67605-1-Ig，Proteintech，USA），4 ℃孵育过夜后洗涤、拍干水珠；（2）每孔中加入200 μL含0.05 %吐温-20的5 %脱脂奶粉溶液，室温孵育2 h后洗涤、拍干水珠；（3）每孔中加入100 μL血浆样本和蛋白标准品，37 ℃下孵育2 h后洗涤、拍干水珠；（4）每孔中加入100 μL兔抗人CD48多克隆抗体（1:500；ab134049，Abcam，UK），37 ℃孵育2 h后洗涤、拍干水珠；（5）每孔中加入100 μL结合HRP的羊抗兔IgG多克隆抗体（1:1 000；ab205718，Abcam，UK），37 ℃孵育1 h后洗涤、拍干水珠；（6）每孔加入90 μL TMB，室温下孵育15 min后，每孔加入50 μL终止液（2 M H2SO4）；（7）采用SunriseTM读板机在450 nm处读取反应信号，根据标准曲线定量血浆样本中的CD48蛋白含量。
上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现CD48蛋白在肝细胞癌（HCC）患者的血浆外泌体中高表达，并以此开发了用于肝细胞癌诊断检测的生物标志物，CD48蛋白作为生物标志物可应用于肝细胞癌的非创诊断、筛查、预后评估。此外，CD48蛋白还可作为药物作用靶点，应用于肝细胞癌药物的筛选和开发中。
本发明提出用于肝细胞癌诊断的血浆外泌体蛋白标志物及其应用。本发明筛选并进一步鉴定出肝细胞癌相关的特异性蛋白（血浆外泌体中的CD48）及其与血浆AFP所组成的分子分类器，通过其蛋白表达量，实现肝细胞癌的诊断，其可适用于ELISA肝细胞癌相关检测试剂盒的开发，从而应用于临床肝细胞癌患者的诊断。
本发明用于肝细胞癌诊断检测的生物标志物血浆外泌体中的CD48蛋白及用于检测该CD48蛋白表达水平的物质、试剂盒及检测方法具有敏感性强、特异性高的特点；现有的生物标志物血浆AFP单独鉴别HCC的AUC为0.796，最佳截断点为4.64 ng/mL，灵敏度和特异度分别为0.554和0.970。而本发明的血浆外泌体中的CD48蛋白单独鉴别HCC的AUC为0.886，最佳截断点为9.29 ng/mL，灵敏度和特异度分别为0.928和0.706；可见本发明的血浆外泌体中的CD48蛋白具有更高的灵敏度，而灵敏度越高则漏诊率（假阴性率）越低。在肝癌的诊断和筛查中，由于肝癌通常发现晚，一发现则几乎难以治愈，所以灵敏度的提高尤为重要，灵敏度的提高能够提高早期肝癌的诊断率，将亚临床肝癌或隐匿性肝癌从人群中筛查出来，有助于提高肝癌的治愈率及降低死亡率。
附图说明
图1为提取血浆外泌体的质量评估；A：纳米粒子跟踪分析显示富集到的外泌体大小在40～150 nm之间，其粒径峰值约为72.25 nm图；B：透射电镜观察到的外泌体的大小及结构图；C：在富集到的外泌体中标志物分子FLOT1和CD63蛋白的表达水平图。
图2为本发明中血浆外泌体蛋白与外泌体数据库ExoCarta和Vesiclepedia的比对结果；A：对各组样本的质谱数据进行归一化图；B：鉴定到的血浆外泌体标记物的丰度在所有蛋白质中排名居前；C：HCC与HC组血浆外泌体蛋白质的比对韦恩图；D：各组血浆外泌体蛋白质与外泌体数据库ExoCarta和Vesiclepedia的比对韦恩图。
图3基于发掘人群鉴定与肝细胞癌相关的外泌体蛋白；A：基于血浆外泌体蛋白质组的主成分分析；B：质控后HCC组和HC组中保留用于分析的高质量蛋白质的韦恩图；C：HCC组和HC组间差异表达蛋白质的火山图；D：差异表达蛋白质在两组之间的表达水平箱式图。
图4为检测血浆外泌体中CD48蛋白水平ELISA方法的建立与评估图；A、通过免疫荧光染色检测出完整外泌体中的CD48；B、自建检测血浆外泌体中的CD48蛋白ELISA方法的示意图；C、ELISA方法1在提纯的外泌体中的标准曲线图；D、ELISA方法1在血浆中的标准曲线图；E、ELISA方法1在提纯的外泌体和血浆中检测结果的相关性图；F、ELSIA方法2在CD48蛋白标准品中的标准曲线；G、ELISA方法1检测血浆外泌体中的CD48蛋白在验证队列各组中的表达水平；H、ELSIA方法2检测血浆CD48在验证队列各组中的表达水平。
图5为血浆外泌体中CD48蛋白用于肝细胞癌诊断价值的评估图；A：血浆外泌体中的CD48蛋白在验证队列各组中的表达水平；B：血浆AFP在验证队列各组中的表达水平；C：血浆外泌体中的CD48蛋白单独及联合AFP鉴别HCC的ROC。
图6为实施例4中研究对象的临床特征。TNM表示Tumor-Node-Metastasis（肿瘤-淋巴结-转移）；HBsAg表示Hepatitis B virus surface antigen（乙型肝炎病毒表面抗原）；AFP表示Alpha-fetoprotein（甲胎蛋白）；HCC表示Hepatocellular carcinoma（肝细胞癌）；LC表示Live cirrhosis（肝硬化）；HC表示Healthy control（健康对照）。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
蛋白的提取
采用本领域常规的外泌体蛋白的提取方法，提取健康人与确诊为肝细胞癌患者血浆外泌体作为本发明的试验材料，健康人与确诊为肝细胞癌的患者人数满足统计学样本最低采集要求，因此，具有统计学意义上的代表性。
样本纳入标准：
健康人（HC）：①未患肿瘤；②无高脂血症、高血压；③无全身性炎症反应；④无囊肿、可疑性结节等。
肝细胞癌（HCC）患者：根据美国肝病协会（American association for the studyof liver diseases，AASLD）临床分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期的HCC患者。
肝硬化（LC）患者：根据病理活检或两种影像学检查确诊（超声检查合并CT或MRI）。
采用试剂盒检测血浆AFP（甲胎蛋白）的水平（简称ELISA检测血浆AFP方法）。
采用酶联免疫吸附试剂盒（KA0202，Abnova，China），按照厂家的说明书进行血浆中AFP水平的检测。过程简要如下：（1）将血浆样本稀释液和蛋白质标准品（AFP（KA0202，Abnova，China）依次加入反应孔中，孵育后清洗；（2）每孔中加入生物素化检测抗体，孵育后清洗；（3）每孔中加入亲和素辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP），孵育后清洗；（4）每孔中加入3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB），其在HRP的催化下产生蓝色产物，加入酸性停止液后变成黄色；（5）采用SunriseTM读板机（Tecan，Switzerland）在450 nm处读取反应信号，根据标准曲线定量血浆样本中的AFP含量。
检测血浆外泌体中CD48蛋白水平ELISA方法（简称ELISA方法1）建立：
采用ELISA方法1检测外泌体中CD48蛋白的表达水平，过程简要如下：（1）在96孔酶标板（95029180，Thermo Fisher Scientific，USA）中包被100 μL鼠抗人CD63单克隆抗体（1:1000；67605-1-Ig，Proteintech，USA），4 ℃孵育过夜后洗涤、拍干水珠；（2）每孔中加入200 μL含0.05 %吐温-20的5 %脱脂奶粉溶液，室温孵育2 h后洗涤、拍干水珠；（3）每孔中加入100 μL血浆样本和外泌体标准品，37 ℃下孵育2 h后洗涤、拍干水珠；（4）每孔中加入100μL兔抗人CD48多克隆抗体（1:500；ab134049，Abcam，UK），37 ℃孵育2 h后洗涤、拍干水珠；（5）每孔中加入100 μL结合HRP的羊抗兔IgG多克隆抗体（1:1000；ab205718，Abcam，UK），37℃孵育1 h后洗涤、拍干水珠；（6）每孔加入90 μL TMB，室温下孵育15 min后，每孔加入50 μL终止液（2 M H2SO4）；（7）采用SunriseTM读板机在450 nm处读取反应信号，根据标准曲线定量血浆样本中的CD48蛋白含量。
检测血浆中CD48蛋白水平ELISA方法（简称ELISA方法2）建立：
采用ELISA方法2检测血浆中CD48蛋白的表达水平，过程简要如下：（1）在96孔酶标板（95029180，Thermo Fisher Scientific，USA）中包被100 μL鼠抗人CD48单克隆抗体（1:1000；ab9185，Abcam，UK），4 ℃孵育过夜后洗涤、拍干水珠；（2）每孔中加入200 μL含0.05 %吐温-20的5 %脱脂奶粉溶液，室温孵育2 h后洗涤、拍干水珠；（3）每孔中加入100 μL血浆样本和CD48蛋白标准品（Ag26536，Proteintech，USA），37 ℃下孵育2 h后洗涤、拍干水珠；（4）每孔中加入100 μL兔抗人CD48多克隆抗体（1:1000；ab134049，Abcam，UK），37 ℃孵育2 h后洗涤、拍干水珠；（5）每孔中加入100 μL结合HRP的羊抗兔IgG多克隆抗体（1:1 000；ab205718，Abcam，UK），37 ℃孵育1 h后洗涤、拍干水珠；（6）每孔加入90 μL TMB，室温下孵育15 min后，每孔加入50 μL终止液（2 M H2SO4）；（7）采用SunriseTM读板机在450 nm处读取反应信号，根据标准曲线定量血浆样本中的CD48蛋白含量。
免疫荧光法（Immunofluorescence，IF）：
首先，取20 μL分离纯化的外泌体与500 μL 2%的多聚甲醛（80096618，sinopharm，China）混合，并滴加在盖玻片上固定20 min，用PBS洗涤两次，使用5%马血清（16050122，Gibco，USA）封闭外泌体30 min，用PBS洗涤两次；其次，在盖玻片上加入400 μL的鼠抗人CD48单克隆抗体（1:40，MAB36441，R & D Systems，USA）孵育20 min，用PBS洗涤两次；然后，在盖玻片上加入400 μL的山羊抗小鼠IgG（1:200，A28175，Thermo Fisher Scientific，USA）孵育20 min，用PBS洗涤两次；随后，在盖玻片上加入400 μL的抗荧光淬灭封片液（P10144，Thermo Fisher Scientific，USA）；最后，在激光扫描共聚焦显微镜（GEHealthcare，USA）观察拍照。仅用山羊抗小鼠IgG处理的外泌体作为对照。
实施例1、血浆外泌体的提取与鉴定
选取肝细胞癌（HCC）患者、健康人（HC）血浆标本各4例，按年龄、性别匹配，分离血浆外泌体后，并分别采用纳米粒径分析、透射电镜分析和免疫印迹分析评估所提取的外泌体的质量。纳米粒子跟踪分析结果显示，富集到的外泌体直径大小约为30～150 nm，其粒径峰值约为72.25 nm，浓度约为2.19 × 109 particles/mL（图1中A），与文献报道的外泌体大小相近。通过透射电镜分析可以清晰地观察到血浆外泌体的大小在40～150 nm之间（图1中B），形状如“茶托型”或“椭圆形”，与外泌体的形貌特征相符。免疫印迹分析显示，所富集的外泌体高表达特异性标记物FLOT1和CD63（图1中C）。综上，这些结果表明分离富集到了高质量的血浆外泌体颗粒。
实施例2、血浆外泌体的蛋白质组学分析
绘制肝癌血浆外泌体的蛋白质组学图谱，采用鸟枪法策略和非数据依赖性采集（Data-independent acquisition，DIA）数据采集方式进行全蛋白质组的高通量质谱检测。
本发明经质控过滤、数据归一化及蛋白质定性和定量分析（图2中A），一共鉴定到1434个蛋白质。其中，20个蛋白质为已知的外泌体表面的特征性标记物，其表达丰度在所有鉴定的蛋白质中排名居前（图2中B）。在HCC组和HC组中分别鉴定到1226和1346个蛋白质（图2中C），两组之间有1138个共有的蛋白质。
对鉴定到的1434个蛋白质与外泌体数据库ExoCarta和Vesiclepedia（图2中D）进行了比对，结果显示有83.1%的蛋白质是外泌体蛋白质，进一步提示富集到了高质量的血浆外泌体。
实施例3、血浆外泌体中与肝癌相关的候选蛋白质标志物的鉴定
发明人进行了主成分分析（Principle component analysis，PCA）。结果显示，血浆外泌体蛋白质组可以将HCC组和HC组显著分开（图3中A），提示肝癌发生时血浆外泌体发生了显著的变化。
为了确保分析结果的可靠性，发明人只保留了至少在2个样本中被检测到的蛋白质，并采用KNN（K最近邻，k-Nearest Neighbor）法对缺失值进行填充。最终，HCC组和HC组中分别保留了1056和1186个蛋白质用于后续分析（图3中B）。进一步，发明人通过蛋白质差异表达分析，发现CD48是HCC组与HC组之间差异最为显著的蛋白质（P < 0.001、Benjamin-Hochberg校正后P = 0.042、倍数变化= 3.101）（图3中C、图3中D），提示其可能具有作为肝癌诊断标志物的潜在价值。
实施例4、检测血浆外泌体中CD48蛋白水平的ELISA方法的建立和评估
为了进一步评估血浆外泌体中的CD48蛋白作为候选肝癌标志物的诊断价值，首先招募了独立的肝癌验证人群（图6），包括56例HCC患者、20例LC患者和48例HC个体。
已有研究报道CD48是一个细胞膜定位的蛋白质。因此，为了评估ELISA作为检测血浆外泌体中CD48蛋白表达水平方法的可行性，通过免疫荧光（Immunofluorescence，IF）实验鉴定其在外泌体上的定位。结果显示，在没有破外泌体膜的情况下，采用CD48抗体标记的CD48蛋白在外泌体膜上有较高的丰度（图4中A），提示可通过ELISA方法检测其表达水平。随后，建立了基于ELISA的CD48蛋白检测方法，并对其检测能力和适用范围进行了系统的评估（图4中B）。首先，分别采用外泌体特异性蛋白质标志物CD63的抗体作为捕获抗体，CD48的抗体作为检测抗体建立了ELISA方法1（图4中B）。分别评估了其在同体积血浆提纯的外泌体及同体积血浆中的检测能力。结果显示，ELISA方法1在血浆提纯的外泌体中的标准曲线的R2值达到了0.994（图4中C）；在血浆中直接检测的标准曲线的R2值也达到了0.992（图4中D）。更重要的是，通过上述两种检测策略得到的结果呈显著的正相关性（R = 0.999，P <0.001；图4中E），并且通过血浆提纯的外泌体的浓度梯度对应的OD值（450 nm）与血浆样本的浓度梯度对应的的OD值（450 nm）相差不超过0.02，表明ELISA方法1可直接从血浆样本中检测外泌体蛋白，而不必从预先提纯的外泌体中检测。
为了排除血浆中游离的非外泌体中的CD48蛋白的干扰，将捕获抗体换成CD48的抗体而建立了ELISA方法2（图4中B）。结果显示，此方法在CD48蛋白标准品的浓度梯度实验中呈现较高的特异性（R2 = 0.989；图4中F）。在验证人群中随机选取8例HCC患者和8例HC个体，同时采用ELISA方法1和方法2检测血浆中CD48蛋白的表达水平。采用ELISA方法1检测的结果显示，血浆外泌体中CD48的表达水平在HCC组中显著高于HC组（图4中G）；而采用ELISA方法2检测的结果显示血浆CD48的表达水平在HCC和HC样本间无统计学差异（图4中H）。上述结果不仅初步证实ELISA方法可以用于血浆外泌体蛋白质的定量检测，提示血浆外泌体中的CD48蛋白可能作为潜在的肝癌诊断标志物。
实施例5、血浆外泌体中CD48蛋白用于肝癌诊断价值的评估
受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）反映了灵敏度与特异度间的平衡，ROC曲线下面积是重要的试验准确度指标，ROC曲线下面积越大，试验的诊断价值越大。
灵敏度（真阳性率）：实际为HCC患者而按实验标准被正确判断为HCC患者的百分率，灵敏度越大越好，理想灵敏度为100%。
特异度（真阴性率）：实际为非HCC患者而按实验标准被正确判断为非HCC患者的百分率，特异度越大越好，理想特异度为100%。
为了进一步评估血浆外泌体中CD48蛋白的肝癌诊断价值，采用建立的ELISA方法1在验证人群样本（表1中的肝癌验证人群，包括56例HCC患者、20例LC患者和48例HC个体）中检测血浆外泌体中CD48蛋白的表达水平。同时，采用上述ELISA检测血浆AFP方法平行检测了血浆AFP的水平。结果显示，HCC组血浆外泌体中CD48蛋白的表达水平显著高于LC和HC组（P < 0.001；图5中A）；同时，血浆AFP在HCC组中的表达水平也显著高于LC和HC组（P <0.001；图5中B）。
通过构建ROC曲线，进一步评估了血浆外泌体中的CD48蛋白和血浆AFP鉴别HCC患者和对照个体（包括LC患者和HC个体）的能力。结果显示，血浆外泌体中的CD48蛋白单独鉴别HCC的AUC为0.886，最佳截断点为9.29 ng/mL，灵敏度和特异度分别为0.928和0.706；血浆AFP单独鉴别HCC的AUC为0.796，最佳截断点为4.64 ng/mL，灵敏度和特异度分别为0.554和0.970。上述结果初步提示血浆外泌体中的CD48蛋白具有较高的灵敏度，而血浆AFP具有较高的特异度，两者具有明显的互补性。值得注意的是，这两个蛋白质建立的肝癌预测Logistic回归模型（Logit[P = HCC]= 0.999 ×外泌体中CD48 + 0.067× AFP – 7.385）从肝硬化和健康对照个体中鉴别HCC患者的AUC达到了0.970，敏感度提升至0.929，特异度为0.971，均高于两者单独时的诊断能力。以上结果提示，血浆外泌体中的CD48蛋白可以作为HCC诊断的候选血浆标志物，并且，其与AFP联合使用时具有更高的诊断价值（表1，图5中C）。
表1：血浆AFP、血浆外泌体中的CD48单独检测及联合检测对HCC的诊断能力
标志物 AUC (95% CI) 灵敏度 特异度 阈值
外泌体中CD48 0.886 (0.830-0.941) 0.928 0.706 9.290 (ng/mL)
AFP 0.796 (0.715-0.878) 0.554 0.970 4.640 (ng/mL)
AFP +外泌体中CD48 0.970 (0.942-0.998) 0.929 0.971 13.816
注：AFP，Alpha-fetoprotein（甲胎蛋白）；HCC，Hepatocellular carcinoma（肝细胞癌）；AUC，Area under the curve（ROC曲线下面积）；CI，Confidence interval（置信区间）。高于阈值的诊断为HCC患者，低于阈值的诊断为非HCC患者。
同理，基于本发明的标志物组合，进一步开发出的检测试剂、检测试剂盒也对临床症状轻微不易被检出的肝细胞癌有较准确的提示作用，具有极高的医疗与实用价值。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.生物标志物和/或检测所述生物标志物的物质的下述任一种应用：
A1）在肝细胞癌诊断或制备用于肝细胞癌诊断的产品中的应用；
A2）在肝细胞癌筛查或制备用于肝细胞癌筛查的产品中的应用；
A3）在评估肝细胞癌风险或制备用于评估肝细胞癌风险的产品中的应用；
A4）在肝细胞癌预后评估或制备用于肝细胞癌预后评估的产品中的应用；
A5）在鉴别区分肝细胞癌和肝硬化或制备鉴别区分肝细胞癌和肝硬化的产品中的应用；
所述生物标志物为下述任一种：
B1）血浆外泌体中的CD48蛋白和血浆中的AFP；
B2）血浆外泌体中的CD48蛋白。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述物质为用于检测CD48蛋白含量的试剂和用于检测AFP含量的试剂；或所述物质为用于检测CD48蛋白含量的试剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测所述生物标志物的物质包括通过酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、放射免疫测定法、免疫共沉淀法、免疫印迹法、高效液相色谱法、毛细管凝胶电泳法、近红外光谱法、质谱法、免疫化学发光法、胶体金免疫技术、荧光免疫层析技术、表面等离子共振技术、免疫-PCR技术或生物素-亲和素技术检测所述生物标志物的物质。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述用于检测CD48蛋白含量的试剂包括CD48蛋白和结合CD48蛋白的抗体；所述用于检测AFP含量的试剂包括AFP和结合AFP的抗体。
5.组合物，所述组合物含有权利要求2或4中所述的用于检测CD48蛋白含量的试剂和用于检测AFP含量的试剂，所述组合物具有下述至少一种用途：
U1）肝细胞癌诊断或制备用于肝细胞癌诊断的产品；
U2）肝细胞癌筛查或制备用于肝细胞癌筛查的产品；
U3）评估肝细胞癌风险或制备用于评估肝细胞癌风险的产品；
U4）肝细胞癌预后评估或制备用于肝细胞癌预后评估的产品；
U5）鉴别区分肝细胞癌和肝硬化或制备鉴别区分肝细胞癌和肝硬化的产品。
6.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求5所述的组合物或权利要求2或4中所述用于检测CD48蛋白含量的试剂，所述试剂盒具有下述至少一种用途：
U1）肝细胞癌诊断或制备用于肝细胞癌诊断的产品；
U2）肝细胞癌筛查或制备用于肝细胞癌筛查的产品；
U3）评估肝细胞癌风险或制备用于评估肝细胞癌风险的产品；
U4）肝细胞癌预后评估或制备用于肝细胞癌预后评估的产品；
U5）鉴别区分肝细胞癌和肝硬化或制备鉴别区分肝细胞癌和肝硬化的产品。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为血浆。
8.权利要求6所述试剂盒的下述任一种应用：
C1）在肝细胞癌诊断或制备用于肝细胞癌诊断的产品中的应用；
C2）在肝细胞癌筛查或制备用于肝细胞癌筛查的产品中的应用；
C3）在评估肝细胞癌风险或制备用于评估肝细胞癌风险的产品中的应用；
C4）在肝细胞癌预后评估或制备用于肝细胞癌预后评估的产品中的应用；
C5）在鉴别区分肝细胞癌和肝硬化或制备鉴别区分肝细胞癌和肝硬化的产品中的应用。
9.权利要求1中所述生物标志物作为靶点在制备治疗或预防肝细胞癌的药物中的应用。
10.筛查或辅助诊断肝细胞癌的方法，其特征在于，所述方法为下述任一种：
D1）所述方法包括利用权利要求5所述的组合物检测待测患者血浆中的CD48蛋白含量和AFP含量，根据CD48蛋白含量和AFP含量确定待测患者是否为肝细胞癌患者；
D2）所述方法包括利用权利要求2或4中所述用于检测CD48蛋白含量的试剂检测待测患者血浆中的CD48蛋白含量，根据CD48蛋白含量确定待测患者是否为肝细胞癌患者。
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