CN111323598A - 检测细胞胞外囊泡的膜蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物检测领域，具体而言，涉及一种检测细胞胞外囊泡的膜蛋白的方法。该方法包括：a)将含有细胞胞外囊泡(EVs)的组合物与固相载体共孵育；所述固相载体包被有抗EVs的膜蛋白的第一抗体组；b)洗去非特异性结合的EVs及其它杂质；c)加入用于检测的第二抗体组进行信号检测；所述第二抗体组为EVs的生物标志物的抗体，且偶联有用于显示信号强度的标记物。该方法操作简便，可根据情况灵活调整检测通量，灵敏度高。

Description

检测细胞胞外囊泡的膜蛋白的方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体而言，涉及一种检测细胞胞外囊泡的膜蛋白的方法。
背景技术
细胞胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是由细胞分泌到细胞外的20-1000nm大小的膜囊泡结构群体，广泛分布于细胞培养上清以及各种体液(血液、尿液、唾液等)。EVs主要由蛋白质，核酸以及磷脂分子组成，作为细胞与细胞间遗传物质与信息的传递者[Colombo M,Raposo G,Théry,Clotilde.Biogenesis,Secretion,and IntercellularInteractions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles[J].Annual Review ofCell and Developmental Biology,2014,30(1):255-289.]。
EVs发挥着重要的生物学功能，参与调控各种生物学进程以及疾病过程，例如肿瘤、神经性疾病、心血管疾病和组织损伤修复等。并且EVs在疾病诊断以及疾病治疗方面具有广泛的应用前景，可以作为疾病诊断的生物标志物和药物载体，尤其EVs可以作为早期肿瘤的标志物[Stremersch S,De Smedt S C,Raemdonck K.Therapeutic and diagnosticapplications of extracellular vesicles[J].Journal of Controlled Release,2016:S0168365916305004.]。因此，EVs的分子调控机制及其功能研究具有非常重要的理论和实用意义。
阐述EVs的分子调控机制及其功能的关键在于EVs膜蛋白组成的研究。因为EVs膜蛋白组成决定着EVs的来源及其作用于下游细胞的靶向性。并且EVs膜蛋白也是非常重要的疾病诊断标志物以及靶点。例如，表达GPC1膜蛋白的EVs能够作为早期胰腺癌的诊断标志物[Melo S A,Luecke L B,Kahlert C,et al.Glypican-1identifies cancer exosomes anddetects early pancreatic cancer[J].Nature,2015,523(7559):177-182.]。表达CD47膜蛋白的EVs能够增强EVs作为药物载体治疗胰腺癌的传递和吸收效率[Kamerkar S,LebleuV S,Sugimoto H,et al.Exosomes Facilitate Therapeutic Targeting of OncogenicKras inPancreatic Cancer[J].Nature,2017,546(7659):498-503.]。综上，EVs膜蛋白组成的研究，有助于阐述EVs的分子调控机制及其功能，从而推动EVs作为疾病诊断标志物以及疾病治疗的应用。
现有的EVs膜蛋白组成研究方法需要经过EVs的分离，提取EVs蛋白，然后进行蛋白质组成的检测。如通过传统的EVs分离技术(超速离心、过滤离心等方法)实现EVs的分离，然后结合蛋白质检测方法(蛋白免疫印迹，蛋白质质谱等方法)进行EVs蛋白质的组成分析。上述传统的EVs分离和蛋白检测方法都存在着其局限性：EVs分离需要的样本量大，操作繁琐，耗时长；而且很难实现EVs膜蛋白的高通量检测。如蛋白免疫印迹一次实验只能检测一种膜蛋白，存在操作繁琐、检测通量低、灵敏度低的缺点。蛋白质质谱技术，对蛋白纯度要求较高，而EVs的传统分离方法常常会引入杂蛋白质污染。因此，有必要开发一种新型的EVs分离和EVs膜蛋白检测方法，以克服现有技术中待解决的问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测细胞胞外囊泡的膜蛋白的方法，其包括：
a)将含有细胞胞外囊泡(EVs)的组合物与固相载体共孵育；所述固相载体包被有抗EVs的膜蛋白的第一抗体组；
b)洗去非特异性结合的EVs及其它杂质；
c)加入用于检测的第二抗体组进行信号检测；所述第二抗体组为EVs的生物标志物的抗体，且偶联有用于显示信号强度的标记物。
该方法操作简便，可根据情况灵活调整检测通量，灵敏度高。
本发明还涉及上述所提及的第一抗体组。
本发明还涉及上述所提及的固相载体。
本发明还涉及试剂盒，其含有上述所提及的固相载体以及第二抗体组。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2所述的前处理样本中的EVs浓度检测结果；
图2为本发明实施例3所述的抗体芯片结果扫描图像；
图3为本发明实施例4所述的被捕获的EVs粒径与浓度特征鉴定图。
具体实施方式
根据本发明的一方面，本发明涉及一种检测细胞胞外囊泡的膜蛋白的方法，其包括：
a)将含有细胞胞外囊泡(EVs)的组合物与固相载体共孵育；所述固相载体包被有抗EVs的膜蛋白的第一抗体组；
b)洗去非特异性结合的EVs及其它杂质；
c)加入用于检测的第二抗体组进行信号检测；所述第二抗体组为EVs的生物标志物的抗体，且偶联有用于显示信号强度的标记物。
所述方法包括诊断及非诊断目的。
在本发明中，细胞胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)被定义为20-1000nm大小的膜囊泡结构群体，其可包括外泌体(exosomes)、微泡(microvesicles)和凋亡小体(apoptosis body)等。
由于细胞胞外囊泡存在于原核生物和真核生物中，并且跨越所有的进化，所以本发明可以使用得自原核生物、真核生物、细菌、真菌、酵母、无脊椎动物、脊椎动物、爬行动物、鱼、昆虫、植物或动物(包括哺乳动物，例如啮齿动物和灵长目动物)的任何组合物。例如组合物来源可以为鸡、小鼠、大鼠、兔、山羊、羔羊、绵羊、马、猪、牛(胎牛)和人类。组合物的优选的实例为鼠、牛或人类，其用于制备分别为鼠、牛或人类的细胞胞外囊泡；更优选的，所述组合物来源于人类。
在一些实施方式中，所述组合物衍生自肿瘤细胞或病原体感染的细胞。
示例性肿瘤包括但不限于肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食道癌、睾丸癌、肝癌、腮腺癌、胆道癌、结肠癌、直肠癌、子宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、甲状腺癌、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、黑素瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤等。从这些实例中，通常使用得自黑素瘤、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌的样品。
示例性的病原体包括但不限于病毒、细菌、寄生虫、真菌。
病原体的概念还可以理解为具有致病性/激活免疫功能的有机大分子，有机小分子，或无机分子。
在一些实施方式中，所述组合物选自细胞培养物上清液、全血、血清、血浆、腹水、脑脊液、骨髓穿刺液、支气管肺泡洗液、尿、精液、阴道分泌物、黏液、唾液、痰或者从生物组织样品得到的澄清的裂解液。
所述组合物可以是新鲜的或事先冷冻的，然后解冻。
在一些实施方式中，所述组合物在基本上不破坏EVs形态学特征或功能特征或者细胞表面抗原的条件下被分离；
上述，EVs在所述组合物中应该保持了它们的原始抗原图谱，这样它们是“抗原性完整的”，由此被检测的EVs才能用以分析其浓度/粒径。
EVs的富集方式可通过密度梯度离心、超速离心、超滤、聚乙二醇沉淀和试剂盒提取等进行；在一些实施方式中，所述组合物为经过如下处理的细胞培养物上清液：
1)250～350g离心8～12min，收集上清；
2)2500～3500g离心8～12min，收集上清；
3)8000～12000g离心25～35min，收集上清；
4)用80～120KD超滤离心管进行浓缩。
在一些实施方式中，所述组合物为经过如下处理的细胞培养物上清液：
1)270～330g离心9～11min，收集上清；
2)2700～3300g离心9～11min，收集上清；
3)9000～11000g离心27～33min，收集上清；
4)用90～110KD超滤离心管进行浓缩。
在一些实施方式中，所述组合物为经过如下处理的细胞培养物上清液：
1)290～310g离心10min，收集上清；
2)2900～3100g离心10min，收集上清；
3)9500～10500g离心10min，收集上清；
4)用100KD超滤离心管进行浓缩。
在一些实施方式中，上述离心和浓缩操作均在基本上不影响膜蛋白检测的低温环境下进行，例如0℃～8℃，优选4℃。
在本发明所提供的实施方案中，经过纯化后，所述组合物的特定群体的制备“基本上不具有”其他的成分。例如基本上不具有非疾病相关的(例如得自正常细胞)的EVs，例如外来体；在所有此类的内容中，“基本上不具有”和“实质上不具有”其他列举成分的组合物用于指这样的组合物，其基本上不具有其他列举的成分，使得其他列举的成分在实质上对组合物不具有实质的作用，直至并包括无可检测的作用，这可以例如在针对此类其他列举的成分进行标准的定量或优选的功能测定法中进行测量。换言之，其他列举的成分不会实质上地、或者甚至可测量地干扰组合物的功能，或者以其他方式导致任何意外的反映、性质或其中的缺陷，这可以例如在针对组合物的活性成分进行标准的定量或优选的功能测定法中进行测量。
在一些实施方式中，所述组合物中EVs的浓度为105～108个/μl。
在一些实施方式中，所述组合物中EVs的浓度为106个/μl或107个/μl
在一些实施方式中，所述第一抗体组选自下列蛋白的抗体：
ACP1，ACVR1B，ACVR2A，ACVR2B，ACVRL1，ADA，ADAM15，ADGRD1，AGER，AIF1，AK2，AKT1，ALOX5AP，ALPI，ALPL，AMIGO2，ANPEP，APLP1，APP，ARG1，ARL2BP，ART3，ASGR1，ASGR2，ATF2，ATL3，ATP1B4，ATP5D，AXL，BACE1，BAMBI，BCAM，BCL2，BCL2L1，BCL2L2，BIN2，BLNK，BMPR1A，BMPR1B，BMPR2，BNIP3L，BPI，BSG，BST1，BST2，BTN3A3，BVES，C1QBP，CA12，CA14，CA2，CA4，CA9，CADM1，CADM3，CAMKV，CD14，CD164，CD177，CD19，CD2，CD200，CD200R1L，CD22，CD226，CD244，CD247，CD27，CD274，CD276，CD28，CD300A，CD300C，CD300LG，CD33，CD34，CD36，CD38，CD3D，CD3E，CD4，CD40，CD40LG，CD44，CD46，CD47，CD48，CD5，CD55，CD58，CD59，CD63，CD68，CD69，CD7CD74，CD80，CD81，CD82，CD83，CD84，CD86，CD8A，CD93，CD96，CDC42，CDC42BPB，CDH1，CDH12，CDH16，CDH17，CDH2，CDH4，CDH5，CDH6，CDH8，CDK4，CDON，CEACAM1，CEACAM3，CEACAM5，CEACAM6，CEACAM8，CFL1，CHL1，CHRNB3，CIB2，CKMT1A，CLEC1B，CLEC4A，CLEC4D，CLIC4，CLMP，CLSTN1，CLTRN，CNTN1，CNTN2，CNTN3，CNTN5，COQ7，COX5B，CPE，CPLX3，CPM，CR2，CREB3L1，CRELD1，CRTAM，CSF1，CSF1R，CSF2RB，CTLA4，CTNNB1，CX3CL1，DCBLD2，DCXR，DDOST，DDR2，DHRS9，DLL1，DLL4，DMBT1，DPEP1，DPEP2，DPP10，DSC2，EBAG9，ECE1，EDA2R，EDAR，EFNA1，EFNA3，EFNA5，EFNB1，EFNB2，EGF，EGFR，EIF5A2，ENG，ENO1，ENPP5，ENPP7，ENTPD3，EpCAM，EPHA1，EphA2，EphA4，EphB2，EphB3，EphB4，EphB6，EPOR，ERBB3，ERN1，ESAM，EZR，F11R，F3，FAM171B，FCER1A，FCER2，FCGR2A，FCGR2B，FCGR3A，FCGR3B，FCRL1，FCRL2，FES，FGF1，FGF2，FGFR1，FLRT1，FLRT2，FLRT3，FLT3，FLT3LG，FLT4，FOLH1，FOLR2，FUT10，GALNT2，GALNT7，GAPDH，GBP2，GFER，GFRA2，GFRA3，GGT5，GLT8D2，GNG13，GNGT1，GOLM1，GOPC，GPA33，GPIHBP1，GPNMB，GPR37，GRK5，GUCA1A，GYPA，GYPC，HAVCR1，HAVCR2，HJV，HRAS，HSPA1A，HTRA2，ICAM1，ICAM2，ICAM3，ICAM5，ICOSLG，IFNAR1，IFNGR1，IGF1R，IGSF11，IGSF3，IGSF8，IL10RB，IL11RA，IL12RB1，IL13Ra1，IL13Ra2，IL17RA，IL17RB，IL17RC，IL17RD，IL18R1，IL18RAP，IL1R1，IL1RAPL1，IL1RAPL2，IL1RL1，IL20RA，IL21R，IL2RA，IL2RG，IL31RA，IL3Ra，IL4R，IL6R，IL6ST，INSR，ITCH，IZUMO1，JAML，KCNIP3，KIR2DL1，KIR2DL3，KIR2DL4，KIRREL2，KLK7，KLRC1，KLRK1，KREMEN1，L1CAM，LAMP1，LAMP2，LAMP3，LAYN，Lck，LEPR，LIFR，LILRB1，LILRB2，LILRB3，LMAN2，LOXL2，LRP10，LRP11，LRRC3B，LRRN3，LTA，LTC4S，LXN，LY75，LYPD3，MAP1LC3B，MAPK9，MAPT，MCAM，MEP1A，MEP1B，MERTK，MET，MICA，MICB，MME，MMP2，MOB4，MOG，MS4A1，MSN，MSR1，MST1R，MUC1，NAALADL1，NAPA，NCAM2，NCKIPSD，NCR3，NCR3LG1，NCSTN，NDRG1，NECTIN3，NLGN1，NLGN3，NLGN4X，NPC1，NPTN，NRAS，NRG1，NRG3，NRG4，NRP1，NRP2，NRXN3，NT5E，NTNG1，NTRK1，NTRK2，NTRK3，OLFM4，OLR1，OMG，OPTN，OSMR，OSTM1，P4HB，PARK7，PARM1，PARVA，PDCD1，PDCD1LG2，PDE2A，PDGFC，PDGFRA，PDGFRB，PECAM1，PGD，PIGR，PLAUR，PPM1A，PRKAR1A，PRLR，PROCR，PTGDS，PTH1R，PTP4A2，PTPMT1，PTPN1，PTPRC，PTPRJ，RAB11B，RAB27B，RAB31，RAB6A，RAC1，RAET1E，RAET1L，RELT，REN，RET，RGMA，RHOA，RNF43，ROM1，RTN4，RUVBL1，S100A12，S100A6，S100A8，S100A9，S100P，SCGN，SCN2B，SDC1，SDC3，SECTM1，SELE，SELL，SELP，SELPLG，SEMA4A，SEMA4D，SEMA6A，SerpinA5，SFRP1，SIGIRR，SIRPA，SIRPG，SIRT1，SLAMF1，SLAMF6，SLAMF7，SLC27A4，SLC3A2，SLITRK1，SLITRK4，SLITRK6，SNAP25，SNCA，SPARC，SPINT2，ST6GAL1，STIM1，STK10，STXBP1，SUMO1，SYT6，TACSTD2，TDGF1，TEK，TFRC，TGFBR1，TGFBR2，THY1，Tie1，TIMD4，TLR4，TMEM156，TMIGD1，TMIGD2，TMUB2，TNFRSF10A，TNFRSF10B，TNFRSF10D，TNFRSF11A，TNFRSF13B，TNFRSF14，TNFRSF17，TNFRSF18，TNFRSF19，TNFRSF1A，TNFRSF21，TNFRSF4，TNFRSF8，TNFRSF9，TNFSF10，TNFSF13B，TPO，TREM1，TREML1，TREML2，TSPAN1，TSPAN7，TYRP1，UCHL1，ULBP2，UNC5A，USP30，VAPB，VASN，VCAM1，VLDLR，VNN2，VSIG2，VSIG4，VSTM1，VTCN1，VWC2，XPNPEP2。
其中上述第一抗体组的抗体数目不少于100种，例如约150种、200种、250种、300种、350种、400种、450种、500种或503种。
抗体芯片技术是一种应用于蛋白质检测的常用方法。可以同时检测上百个蛋白指标，具有检测速度快、样本用量少、灵敏度高、稳定性好、集成度高等优点，是用来开发多指标同时检测的最优技术选择。最新的研究发现，利用抗体芯片技术，通过抗体特异性地识别EVs膜蛋白，可以进行EVs的捕获[Malene J,Rikke B,Shona P,et al.ExtracellularVesicle(EV)Array:microarray capturing of exosomes and other extracellularvesicles for multiplexed phenotyping[J].Journal of Extracellular Vesicles,2013,2(2):1-9.]。该研究预示着，可以利用抗体芯片，无需提取EVs蛋白，只需少量的样本，就可以同时实现EVs的分离和EVs膜蛋白的检测。但已报道捕获EVs的抗体芯片，其包含的抗体数量较少，针对EVs膜蛋白的特异性较低，严重制约了利用抗体芯片开展EVs膜蛋白组成的高通量检测。
因此，通过开发一种针对EVs膜蛋白的高通量和高特异性的抗体芯片，将可以同时实现EVs的高效分离和EVs膜蛋白组成的高通量检测。从而极大地推进EVs膜蛋白组成的研究进展，推动EVs作为疾病诊断标志物以及疾病治疗的应用。
在一些实施方式中，所述第一抗体组选自表1中所描述的抗体。
在一些实施方式中，所述第一抗体组中的抗体以每种抗体180～220μg/ml的浓度，或190μg/ml、200μg/ml、210μg/ml的浓度包被在所述固相载体上。
在一些实施方式中，所述固相载体还包被有阳性对照抗体；
所述阳性对照为标记有所述用于显示信号强度的标记物，且与所述第二抗体组为同型对照抗体。
在一些实施方式中，所述阳性对照抗体按照浓度梯度设置于多个孔内。
在一些实施方式中，所述阳性对照抗体设置有3、4、5、6、7、8、9或10个孔。
在一些实施方式中，所述固相载体还设置有阴性对照孔；
所述阴性对照孔中仅添加孵育缓冲液。
在一些实施方式中，所述第二抗体组为CD9、CD63和CD81。
在一些实施方式中，所述第二抗体组还包括CD82。
在一些实施方式中，所述标记物选自荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种。
在一些实施方式中，所述荧光物质包括Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的任一种。
在一些实施方式中，所述放射性同位素包括110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb和83Sr中的任一种。
在一些实施方式中，所述荧光微球为：聚苯乙烯荧光微球，内部包裹有稀土荧光离子铕。
在一些实施方式中，所述标记物选自辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一种。
在一些实施方式中，所述固相载体为玻片或膜式基片。
在一些实施方式中，所述固相载体被高分子所修饰，或表面涂有高分子膜。
在一些实施方式中，所述高分子选自氨基、醛基、环氧树脂、巯基、聚糖。
在一些实施方式中，所述高分子膜选自聚乙烯醇薄膜、琼脂糖薄膜或聚乙烯醇-琼脂糖复合薄。
在一些实施方式中，所述固相载体还具有聚二甲基硅氧烷、聚乙烯或聚乙二醇衍生物涂层。
在一些实施方式中，所述方法还包括：分析EVs的粒径特征和/或浓度特征。
在一些实施方式中，所述分析以纳米颗粒跟踪分析技术进行；例如Malvern纳米颗粒跟踪分析仪NanoSight LM14。
在一些实施方式中，所述方法还包括，将EVs从所述固相载体洗脱下来，所用的洗脱液为80mM～120mM，pH 2.2～2.6的glycine-HCl溶液；
在一些实施方式中，所用的洗脱液为100mM，pH 2.4的glycine-HCl溶液。
本发明还请求保护上述所提及的第一抗体组。
本发明还请求保护上述所提及的固相载体。
本发明还请求保护试剂盒，其含有上述所提及的固相载体以及第二抗体组。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1抗体芯片的制备
正对照生物素标记的IgG抗体浓度为0.04μg/ml，0.2μg/ml，1μg/ml，5μg/ml，负对照为PBS溶液。针对EVs膜蛋白的特异性抗体浓度为200μg/ml,溶解在含有5％甘油的PBS中。特异性抗体的生产产商为Sino Biological Inc，特异性抗体的名称、货号的详细信息如表1所示。
表1特异性抗体名称、货号
Figure BDA0002051880160000121
Figure BDA0002051880160000131
Figure BDA0002051880160000132
Figure BDA0002051880160000141
Figure BDA0002051880160000142
Figure BDA0002051880160000151
Figure BDA0002051880160000152
Figure BDA0002051880160000161
固相载体采用德国SCHOTT公司NEXTERION环氧基包被玻片，使用自动点样仪按照一定排列方式将上述抗体点制到包被玻片上，每个抗体点设置两个重复。
实施例2样本前处理
本实施例为针对CCC-HEL-1细胞培养上清进行EVs的初步分离：收集CCC-HEL-1细胞培养上清，300g离心10min，收集上清，去除细胞；再3000g离心10min，收集上清，去除细胞碎片；再10000g离心30min，收集上清，去除亚细胞成分；再用100KD超滤离心管进行浓缩，PBS洗涤3次，最终体积浓缩约100倍。
然后，利用Malvern纳米颗粒跟踪分析仪NanoSight LM14进行初步分离获得的EVs的粒径以及浓度分析。检测结果如图1所示，经过前处理的样品中EVs浓度为2.3×108个/μl，粒径主要分布在150nm左右。
实施例3抗体芯片分离EVs并进行EVs膜蛋白组成的分析
将经过初步处理的样本加入到抗体芯片，分离EVs。具体方法如下：
(1)加样：加入抗体芯片的经过前处理的EVs浓度为105-108个/μl,加入的体积为100μl。水平摇床上较低转速(60rpm/min)室温孵育2h。然后转移至4℃继续孵育18h。
(2)洗涤：从样品池里吸出样品，加入100μl含有0.2％Tween20的PBS溶液洗涤3次，每次5min。
(3)检测：加入检测抗体的混合液(针对EVs膜蛋白标志物CD9，CD63，CD81的生物素标记抗体)，水平摇床上较低转速(60rpm/min)室温孵育2h。从样品池中吸出生物素标记的抗体混合液，重复步骤(2)的洗涤过程。加入100μl的Cy3-Streptavidin,用锡箔纸包住玻片避光室温孵育2h，再重复步骤(2)的洗涤过程。检测抗体的名称、来源、浓度的详细信息如表2所示。
表2检测抗体名称、来源和浓度
检测抗体名称 货号 浓度 产商
anti-human CD9/biotin 156-030 1ug/ml Ancell
anti-human CD63/biotin 215-030 1ug/ml Ancell
anti-human CD81/biotin 302-030 1ug/ml Ancell
(4)扫描：利用激光扫描仪例如Axon GenePix扫描信号，采用激发频率532nm的通道。具体扫描结果如图2所示，CD226，CX3CL1的信号值较强，因此可以作为CCC-HEL-1细胞的EVs膜蛋白标志物。
实施例4抗体芯片捕获的EVs的特征鉴定
将200μl洗脱液(100mM of glycine-HCl,pH 2.4)加入到捕获了EVs的抗体芯片样品池里，室温孵育30min。吸取上清，利用Malvern纳米颗粒跟踪分析仪NanoSight LM14进行被捕获的EVs粒径以及浓度分析。具体检测结果如图3所示，芯片捕获的EVs浓度达到3.75×105个/μl，粒径分布为100～300nm。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.检测细胞胞外囊泡的膜蛋白的方法，其特征在于，包括：
a)将含有细胞胞外囊泡(EVs)的组合物与固相载体共孵育；所述固相载体包被有抗EVs的膜蛋白的第一抗体组；
b)洗去非特异性结合的EVs及其它杂质；
c)加入用于检测的第二抗体组进行信号检测；所述第二抗体组为EVs的生物标志物的抗体，且偶联有用于显示信号强度的标记物。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述组合物来源于人类；
优选的，所述组合物衍生自肿瘤细胞或病原体感染的细胞；
优选的，所述组合物选自细胞培养物上清液、全血、血清、血浆、腹水、脑脊液、骨髓穿刺液、支气管肺泡洗液、尿、精液、阴道分泌物、黏液、唾液、痰或者从生物组织样品得到的澄清的裂解液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述组合物在基本上不破坏EVs形态学特征或功能特征或者细胞表面抗原的条件下被分离。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组合物为经过如下处理的细胞培养物上清液：
1)250～350g离心8～12min，收集上清；
2)2500～3500g离心8～12min，收集上清；
3)8000～12000g离心25～35min，收集上清；
4)用80～120KD超滤离心管进行浓缩。
5.根据权利要求1、2、4任一项所述的方法，其特征在于，所述组合物中EVs的浓度为105～108个/μl。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一抗体组选自下列蛋白的抗体：
ACP1，ACVR1B，ACVR2A，ACVR2B，ACVRL1，ADA，ADAM15，ADGRD1，AGER，AIF1，AK2，AKT1，ALOX5AP，ALPI，ALPL，AMIGO2，ANPEP，APLP1，APP，ARG1，ARL2BP，ART3，ASGR1，ASGR2，ATF2，ATL3，ATP1B4，ATP5D，AXL，BACE1，BAMBI，BCAM，BCL2，BCL2L1，BCL2L2，BIN2，BLNK，BMPR1A，BMPR1B，BMPR2，BNIP3L，BPI，BSG，BST1，BST2，BTN3A3，BVES，C1QBP，CA12，CA14，CA2，CA4，CA9，CADM1，CADM3，CAMKV，CD14，CD164，CD177，CD19，CD2，CD200，CD200R1L，CD22，CD226，CD244，CD247，CD27，CD274，CD276，CD28，CD300A，CD300C，CD300LG，CD33，CD34，CD36，CD38，CD3D，CD3E，CD4，CD40，CD40LG，CD44，CD46，CD47，CD48，CD5，CD55，CD58，CD59，CD63，CD68，CD69，CD7CD74，CD80，CD81，CD82，CD83，CD84，CD86，CD8A，CD93，CD96，CDC42，CDC42BPB，CDH1，CDH12，CDH16，CDH17，CDH2，CDH4，CDH5，CDH6，CDH8，CDK4，CDON，CEACAM1，CEACAM3，CEACAM5，CEACAM6，CEACAM8，CFL1，CHL1，CHRNB3，CIB2，CKMT1A，CLEC1B，CLEC4A，CLEC4D，CLIC4，CLMP，CLSTN1，CLTRN，CNTN1，CNTN2，CNTN3，CNTN5，COQ7，COX5B，CPE，CPLX3，CPM，CR2，CREB3L1，CRELD1，CRTAM，CSF1，CSF1R，CSF2RB，CTLA4，CTNNB1，CX3CL1，DCBLD2，DCXR，DDOST，DDR2，DHRS9，DLL1，DLL4，DMBT1，DPEP1，DPEP2，DPP10，DSC2，EBAG9，ECE1，EDA2R，EDAR，EFNA1，EFNA3，EFNA5，EFNB1，EFNB2，EGF，EGFR，EIF5A2，ENG，ENO1，ENPP5，ENPP7，ENTPD3，EpCAM，EPHA1，EphA2，EphA4，EphB2，EphB3，EphB4，EphB6，EPOR，ERBB3，ERN1，ESAM，EZR，F11R，F3，FAM171B，FCER1A，FCER2，FCGR2A，FCGR2B，FCGR3A，FCGR3B，FCRL1，FCRL2，FES，FGF1，FGF2，FGFR1，FLRT1，FLRT2，FLRT3，FLT3，FLT3LG，FLT4，FOLH1，FOLR2，FUT10，GALNT2，GALNT7，GAPDH，GBP2，GFER，GFRA2，GFRA3，GGT5，GLT8D2，GNG13，GNGT1，GOLM1，GOPC，GPA33，GPIHBP1，GPNMB，GPR37，GRK5，GUCA1A，GYPA，GYPC，HAVCR1，HAVCR2，HJV，HRAS，HSPA1A，HTRA2，ICAM1，ICAM2，ICAM3，ICAM5，ICOSLG，IFNAR1，IFNGR1，IGF1R，IGSF11，IGSF3，IGSF8，IL10RB，IL11RA，IL12RB1，IL13Ra1，IL13Ra2，IL17RA，IL17RB，IL17RC，IL17RD，IL18R1，IL18RAP，IL1R1，IL1RAPL1，IL1RAPL2，IL1RL1，IL20RA，IL21R，IL2RA，IL2RG，IL31RA，IL3Ra，IL4R，IL6R，IL6ST，INSR，ITCH，IZUMO1，JAML，KCNIP3，KIR2DL1，KIR2DL3，KIR2DL4，KIRREL2，KLK7，KLRC1，KLRK1，KREMEN1，L1CAM，LAMP1，LAMP2，LAMP3，LAYN，Lck，LEPR，LIFR，LILRB1，LILRB2，LILRB3，LMAN2，LOXL2，LRP10，LRP11，LRRC3B，LRRN3，LTA，LTC4S，LXN，LY75，LYPD3，MAP1LC3B，MAPK9，MAPT，MCAM，MEP1A，MEP1B，MERTK，MET，MICA，MICB，MME，MMP2，MOB4，MOG，MS4A1，MSN，MSR1，MST1R，MUC1，NAALADL1，NAPA，NCAM2，NCKIPSD，NCR3，NCR3LG1，NCSTN，NDRG1，NECTIN3，NLGN1，NLGN3，NLGN4X，NPC1，NPTN，NRAS，NRG1，NRG3，NRG4，NRP1，NRP2，NRXN3，NT5E，NTNG1，NTRK1，NTRK2，NTRK3，OLFM4，OLR1，OMG，OPTN，OSMR，OSTM1，P4HB，PARK7，PARM1，PARVA，PDCD1，PDCD1LG2，PDE2A，PDGFC，PDGFRA，PDGFRB，PECAM1，PGD，PIGR，PLAUR，PPM1A，PRKAR1A，PRLR，PROCR，PTGDS，PTH1R，PTP4A2，PTPMT1，PTPN1，PTPRC，PTPRJ，RAB11B，RAB27B，RAB31，RAB6A，RAC1，RAET1E，RAET1L，RELT，REN，RET，RGMA，RHOA，RNF43，ROM1，RTN4，RUVBL1，S100A12，S100A6，S100A8，S100A9，S100P，SCGN，SCN2B，SDC1，SDC3，SECTM1，SELE，SELL，SELP，SELPLG，SEMA4A，SEMA4D，SEMA6A，SerpinA5，SFRP1，SIGIRR，SIRPA，SIRPG，SIRT1，SLAMF1，SLAMF6，SLAMF7，SLC27A4，SLC3A2，SLITRK1，SLITRK4，SLITRK6，SNAP25，SNCA，SPARC，SPINT2，ST6GAL1，STIM1，STK10，STXBP1，SUMO1，SYT6，TACSTD2，TDGF1，TEK，TFRC，TGFBR1，TGFBR2，THY1，Tie1，TIMD4，TLR4，TMEM156，TMIGD1，TMIGD2，TMUB2，TNFRSF10A，TNFRSF10B，TNFRSF10D，TNFRSF11A，TNFRSF13B，TNFRSF14，TNFRSF17，TNFRSF18，TNFRSF19，TNFRSF1A，TNFRSF21，TNFRSF4，TNFRSF8，TNFRSF9，TNFSF10，TNFSF13B，TPO，TREM1，TREML1，TREML2，TSPAN1，TSPAN7，TYRP1，UCHL1，ULBP2，UNC5A，USP30，VAPB，VASN，VCAM1，VLDLR，VNN2，VSIG2，VSIG4，VSTM1，VTCN1，VWC2，XPNPEP2；
优选地，所述第一抗体组中的抗体以每种抗体180～220μg/ml的浓度包被在所述固相载体上；
优选地，所述固相载体还包被有阳性对照抗体；
所述阳性对照为标记有所述用于显示信号强度的标记物，且与所述第二抗体组为同型对照抗体；
优选的，所述阳性对照抗体按照浓度梯度设置于多个孔内；
优选地，所述固相载体还设置有阴性对照孔；
所述阴性对照孔中仅添加孵育缓冲液；
优选地，其特征在于，所述第二抗体组为CD9、CD63和CD81；
优选地，其特征在于，所述标记物选自荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种；
优选地，所述固相载体为玻片或膜式基片；
优选地，所述固相载体被高分子所修饰，或表面涂有高分子膜；
优选地，所述高分子选自氨基、醛基、环氧树脂、巯基、聚糖；
优选地，所述高分子膜选自聚乙烯醇薄膜、琼脂糖薄膜或聚乙烯醇-琼脂糖复合薄；
优选地，所述固相载体还具有聚二甲基硅氧烷、聚乙烯或聚乙二醇衍生物涂层。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：分析EVs的粒径特征和/或浓度特征；
优选地，所述分析以纳米颗粒跟踪分析技术进行；
优选地，所述方法还包括，将EVs从所述固相载体洗脱下来，所用的洗脱液为80mM～120mM，pH2.2～2.6的glycine-HCl溶液。
8.权利要求1～7任一项中所提及的第一抗体组。
9.权利要求1～7任一项中所提及的固相载体。
10.试剂盒，其含有权利要求1～7任一项中所提及的固相载体以及第二抗体组。
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