CN113899904B - 用于胃癌免疫治疗疗效预测的细胞外囊泡膜蛋白检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医学诊断技术领域，公开了一种用于胃癌免疫治疗疗效预测的细胞外囊泡膜蛋白检测方法。本发明的检测方法主要用于检测细胞外囊泡膜蛋白PDL1、PDL2、CD3和ARG1。首先将特异性细胞外囊泡捕获抗体固定在基底上，得到抗体芯片；然后将待测样本施加到抗体芯片上，得到反应芯片；最后向反应芯片上加入检测探针，利用仪器检测细胞外囊泡特定膜蛋白的表达水平。操作便捷，与现有检测方法相比所需临床样本量小，无需进行细胞外囊泡的提取，并且检测灵敏度高、检测速度快。因此，更加适用于临床的检测，对于胃癌PD1/PDL1免疫治疗的疗效预测具有重要意义。

Description

用于胃癌免疫治疗疗效预测的细胞外囊泡膜蛋白检测方法

技术领域

本发明属于医学诊断技术领域，具体涉及一种用于胃癌免疫治疗疗效预测的细胞外囊泡膜蛋白检测方法。

背景技术

胃癌是世界上死亡率第三的恶性肿瘤，位居中国恶性肿瘤发病率和死亡率第2位，严重危害国人的生命和健康。目前胃癌的治疗方式包括通过胃镜或外科手术切除肿瘤，化疗和放疗等。尽管胃癌的治疗策略取得了进展，但治疗效果仍不理想。免疫治疗具有精准作用于肿瘤微环境和应答持久的特点，已经成为包括胃癌在内的各种肿瘤的治疗方法。其中，PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂是当前备受瞩目的新一类肿瘤免疫治疗药物，通过阻断PD-1/PD-L1信号通路调节T淋巴细胞抗肿瘤活性，最大限度的提高患者自身对肿瘤的免疫系统反应，从而达到对肿瘤细胞进行杀伤的目的，使肿瘤凋亡。PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂在胃癌治疗中表现出了不错的疗效，已经进入胃癌一线治疗。然而，目前还没有比较有效地胃癌免疫治疗疗效预测的方法。常见的肿瘤组织PDL1免疫组化检测，肿瘤突变负荷（TMB）检测，微卫星不稳定（MSI）检测，存在检测准确率低、取样有创、易引起肿瘤感染转移等问题。因此，胃癌PD-1/PD-L1免疫治疗亟需开发一种能够提高疗效预测的检测方法。

细胞外囊泡膜蛋白与机体的免疫反应密切相关。细胞外囊泡膜蛋白可以激活或抑制免疫信号通路。例如，肿瘤细胞来源的细胞外囊泡，其膜上表达的PDL1蛋白能够识别T细胞表面PD1，从而抑制免疫。并且细胞外囊泡膜蛋白PDL1的表达水平与PD1/PDL1免疫治疗的疗效密切相关，可以作为黑色素瘤等肿瘤免疫治疗疗效预测的标志物。因此，检测与胃癌免疫相关的细胞外囊泡膜蛋白的表达水平，可能能够实现胃癌免疫治疗的疗效预测。

然而，目前细胞外囊泡膜蛋白的检测方法主要采用传统的流式细胞仪法、酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫胶体金电镜等技术手段。传统的方法需要大量临床样本，并且需要进行细胞外囊泡的分离纯化（超速离心法），操作繁琐，无法在临床实施，不适于临床推广。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种样本用量少、取样便捷、操作简便、检测灵敏度高的用于胃癌免疫治疗疗效预测的细胞外囊泡膜蛋白检测方法。

本发明所采用的技术方案为：

本发明的一种用于胃癌免疫治疗疗效预测的细胞外囊泡膜蛋白检测方法，主要用于检测细胞外囊泡膜蛋白PDL1、PDL2、CD3和ARG1，包括如下步骤：

S1.将特异性细胞外囊泡捕获抗体固定在基底上，得到抗体芯片；

S2.将待测样本施加到步骤S1中所述的抗体芯片上，得到反应芯片；

S3.向步骤S2中所述的反应芯片上加入检测探针，利用仪器检测细胞外囊泡特定膜蛋白的表达水平。

进一步的，所述特异性细胞外囊泡捕获抗体包括抗PDL1抗体、抗PDL2抗体、抗CD3抗体和抗ARG1抗体。

更进一步的，所述检测探针为偶联标记物的抗CD63抗体、抗CD81抗体和抗CD9抗体中的一种或几种的组合。

更进一步的，所述基底包括但不限于：醛基、环氧树脂、聚糖高分子修饰的玻片或膜式基片。

更进一步的，所述待测样本包括但不限于全血、血清、血浆、腹水、脑脊液、骨髓穿刺液、支气管肺泡洗液、尿、精液、阴道分泌物、黏液、唾液、痰或者从生物组织样品得到的澄清组织液、或者细胞培养物上清液。所述待测样本可以是新鲜的或事先冷冻的，然后解冻。当所述待测样本为血浆时，只需少于或等于10μL的待测样本。

更进一步的，所述标记物为生物素、荧光物质、量子点、地高辛标记探针、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金和酶中的任意一种。

更进一步的，所述步骤S1包括：

（1.1）将所有特异性细胞外囊泡捕获抗体分别溶解在含有甘油的磷酸盐缓冲溶液中，得到不同种类的抗体溶剂；

（1.2）按照一定排列方式将不同种类的所述抗体溶剂分别点制到基体上，每种抗体溶剂点设置至少2个重复，得到抗体芯片。

更进一步的，所述步骤S2包括：

（2.1）取小于或等于10μL的样本，利用磷酸盐缓冲溶液稀释至100μL，得到反应液；

（2.2）向所述抗体芯片的每孔中加入100μL的封闭液，室温孵育后抽去每孔中的封闭液，得到处理芯片；

（2.3）将准备好的所述反应液加入到所述处理芯片上的孔中，室温孵育后抽去每个孔中的反应液，得到反应芯片。

更进一步的，所述步骤S3包括：

（3.1）向所述反应芯片的每个孔中加入检测探针，室温孵育后抽去每个孔中剩余的溶液，再向每个孔中加入Cy3-Streptavidin，避光室温孵育后得到检测芯片；

（3.2）将所述检测芯片干燥后，利用激光扫描仪扫描信号，读取抗体芯片的荧光值。

更进一步的，所述含有甘油的磷酸盐缓冲溶液中甘油的含量为5%，所述抗体溶液的浓度为200-400 μg/ml。

更进一步的，所述封闭液为浓度是3%的BSA封闭液。

本发明的有益效果为：

本发明的用于胃癌免疫治疗疗效预测的细胞外囊泡膜蛋白检测方法，操作便捷，与现有检测方法相比所需临床样本量小，无需进行细胞外囊泡的提取，并且检测灵敏度高、检测速度快。因此，更加适用于临床的检测，对于胃癌PD1/PDL1免疫治疗的疗效预测具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1的免疫胶体金电镜鉴定实验结果图。

图2为本发明实施例2的抗体芯片点阵图；

图3为本发明实施例3的胃癌免疫治疗患者血浆中细胞外囊泡膜蛋白PDL1的Kaplan-Meier生存曲线分析结果图；

图4为本发明实施例3的胃癌免疫治疗患者血浆中细胞外囊泡膜蛋白PDL2的Kaplan-Meier生存曲线分析结果图；

图5为本发明实施例3的胃癌免疫治疗患者血浆中细胞外囊泡膜蛋白CD3的Kaplan-Meier生存曲线分析结果图；

图6为本发明实施例3的胃癌免疫治疗患者血浆中细胞外囊泡膜蛋白ARG1的Kaplan-Meier生存曲线分析结果图；

图7为本发明实施例3的胃癌免疫治疗患者血浆中细胞外囊泡膜蛋白PDL1、PDL2、CD3、ARG1联合诊断标志物EV-Score的Kaplan-Meier生存曲线分析结果图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步阐述。

实施例1：

应用免疫胶体金电镜技术对胃癌血浆来源细胞外囊泡膜蛋白进行鉴定。具体步骤如下：

1、细胞外囊泡的制备

将1ml的血浆在2500~3500g条件下离心10min后收集上清，得到初次上清液；然后将初次上清液在9500~11000g条件下离心30min，收集上清液，得到二次上清液；再将二次上清液在100000g离心条件下70min，去除上清后，得到沉淀物；向沉淀物中加入1mLPBS洗涤溶解沉淀，得到处理沉淀；再将处理沉淀在100000g条件下离心70min，去除上清液后得到二次沉淀物；最后向二次沉淀物中加入50-100μL的磷酸盐缓冲溶液使其溶解，得到细胞外囊泡溶液。

磷酸盐缓冲溶液以下简称PBS。

2、免疫胶体金电镜实验

（1）将细胞外囊泡溶液与4%（w/v）多聚甲醛（PFA）按1：1比例混合，得到混合液；取20μL混合液滴在干净的塑料膜上，将电镜碳网的正面扣在混合液上，放置20min。

（2）将电镜碳网放置于100μL PBS液滴上，洗两次，每次3 min，得到初处理碳网。

（3）将初处理碳网放置于100μL浓度为50 mM的甘氨酸液滴上，3 min，重复3次后得到二次处理碳网。

（4）封闭：将二次处理碳网放置于100μL浓度为5% BSA封闭液上，封闭10 min，得到封闭碳网。

（5）一抗用稀释液（浓度为1%的BSA）进行稀释，稀释比例为1:20，封闭碳网放置于20μL一抗液滴上孵育2h后得到一抗碳网。

（6）将一抗碳网置于100μL浓度为0.1%的BSA液滴上，洗6次，每次3 min，得到洗涤碳网。

（7）标记有胶体金颗粒的二抗用稀释液进行稀释，稀释液为浓度为1%的BSA，稀释比例为1:20，将洗涤碳网置于20μL二抗液滴上孵育1h后得到二抗碳网。

（8）将二抗碳网置于100μL浓度为0.5%的BSA液滴上，洗6次，每次3min得到二次洗涤碳网。

（9）将二次洗涤碳网置于100μLPBS液滴上，洗6次,每次2 min，得到三次洗涤碳网。

（10）将三次洗涤碳网置于100μL浓度为1%的戊二醛液滴上，放置2 min，后得到三次处理碳网。

（11）将三次处理碳网置于100μL去离子水液滴上，洗6次,每次2 min，得到四次处理碳网。

（12）将四次处理碳网置于10μL醋酸双氧铀负染90s，得到五次处理碳网。

（13）五次处理碳网室温干燥30min后得到检测碳网，利用透射电子显微镜对检测碳网进行上机检测。

免疫胶体金电镜实验中，所使用抗体的生产厂家、货号等详细信息如表1所示。

表1

免疫胶体金电镜实验结果如图1所示。从图1中可以看出：

（1）透射电镜结果显示，细胞外囊泡呈现典型的椭球状特征，粒径大小分布在100nm左右。

（2）典型的细胞外囊泡标志物蛋白CD63、CD81和CD9定位于细胞外囊泡的膜上。

（3）PDL1、PDL2、CD3和ARG1定位于细胞外囊泡的膜上。

实施例2：

应用抗体芯片检测胃癌免疫治疗患者血浆细胞外囊泡膜蛋白PDL1、PDL2、CD3和ARG1，具体步骤如下：

1、抗体芯片的制备：

将特异性的细胞外囊泡捕获抗体PDL1、PDL2、CD3和ARG1分别溶解在含有5%甘油的PBS中，最终浓度为200-400 μg/ml，得到不同种类的抗体溶剂。阴性对照为PBS溶液。

使用自动点样仪按照一定排列方式将不同种类的上述抗体溶剂点制到包被玻片上，该包被玻片为德国SCHOTT公司NEXTERION环氧基包被玻片，每个抗体溶剂点设置3个重复，得到抗体芯片，抗体芯片点阵图如图2所示，每张芯片可以点制16个阵列。将抗体芯片置于2-8℃环境中保存备用。

2、应用抗体芯片检测胃癌免疫治疗患者血浆细胞外囊泡膜蛋白PDL1、PDL2、CD3和ARG1：

针对62例胃癌免疫治疗患者（G1-G62）进行在治疗前的血浆细胞外囊泡膜蛋白PDL1、PDL2、CD3和ARG1的检测。上述免疫治疗的方式主要包括：抗PD1抗体药物、抗PDL1抗体药物和抗CTLA4抗体药物。

（1）样品准备：每例患者分别取10μL血浆，利用样品稀释液PBS稀释至100μL，得到反应液。

（2）芯片封闭：取出抗体芯片，向抗体芯片上的每个孔中加入100 μL封闭液，该封闭液为浓度为3%的BSA，室温孵育30 min后抽去每孔中的封闭液，得到处理芯片。

（3）杂交反应：取100μL准备好的反应液，将反应液加入到处理芯片上的每个孔中，室温孵育60min后得到反应芯片。

（4）检测抗体孵育：抽去反应芯片上每个孔中的液体，加入检测抗体Anti-CD63-Biotin、Anti-CD9-Biotin和Anti-CD81-Biotin，室温孵育1h后得到待测芯片。

（5）检测：抽去待测芯片上每个孔中的液体，然后向每个孔中加入100 μl的Cy3-Streptavidin，避光室温孵育30min后得到检测芯片。将检测芯片干燥，利用激光扫描仪，例如Axon GenePix，采用激发频率532nm的通道扫描信号，用GenePix软件来读取抗体芯片的荧光值。

实施例3：

对实施例2中的扫描结果进行胃癌免疫治疗疗效预测标志物分析，结果如图3-图7所示。

图3是细胞外囊泡膜蛋白PDL1的Kaplan-Meier生存曲线分析结果。结果表明细胞外囊泡膜蛋白PDL1表达量越高，无进展生存时间PFS以及总生存时间OS越短，表明细胞外囊泡蛋白PDL1是胃癌免疫治疗的不利因素。

图4-图6分别是细胞外囊泡膜蛋白PDL2、CD3和ARG1的Kaplan-Meier生存曲线分析结果。结果表明细胞外囊泡膜蛋白PDL2、CD3和ARG1表达量越高，无进展生存时间PFS以及总生存时间OS越长，表明细胞外囊泡蛋白PDL2、CD3和ARG1是胃癌免疫治疗的有利因素。

然后，将PDL1、PDL2、CD3和ARG1进行联合分析。采用EV-score计算方法，当PDL2、CD3、ARG1高表达时记为数值1，低表达时记为数值0；当PDL1高表达时记为数值-1，低表达时记为数值0。患者的PDL1、PDL2、CD3和ARG1的求和即为EV-score。然后对EV-score进行Kaplan-Meier生存曲线分析以及ROC曲线分析，结果如图7所示。

图7为联合诊断标志物EV-score的Kaplan-Meier生存曲线分析结果。当EV-score数值大于等于1时，胃癌免疫治疗患者的无进展生存时间PFS以及总生存时间OS显著高于EV-score小于1的患者。表明EV-score可以作为胃癌免疫治疗疗效预测的诊断标志物。

本发明不局限于上述可选实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是落入本发明权利要求界定范围内的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.特异性细胞外囊泡捕获抗体在制备用于胃癌免疫治疗疗效预测的检测细胞外囊泡膜蛋白的抗体芯片中的应用，其特征在于：所述细胞外囊泡膜蛋白包括PDL1、PDL2、CD3和ARG1，所述特异性细胞外囊泡捕获抗体包括抗PDL1抗体、抗PDL2抗体、抗CD3抗体和抗ARG1抗体。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗体芯片检测所述细胞外囊泡膜蛋白包括如下步骤：

（1）取待测样本，利用磷酸盐缓冲溶液稀释至100μL，得到反应液；

（2）向所述抗体芯片的每孔中加入100μL的封闭液，室温孵育后抽去每孔中的封闭液，得到处理芯片；

（3）将准备好的所述反应液加入到所述处理芯片上的孔中，室温孵育后得到反应芯片；

（4）抽去所述反应芯片上每个孔中的液体，加入检测抗体Anti-CD63-Biotin、Anti-CD9-Biotin和Anti-CD81-Biotin，室温孵育后得到待测芯片；

（5）抽去所述待测芯片上每个孔中的液体，然后向每个孔中加入100 μl的Cy3-Streptavidin，避光室温孵育后得到检测芯片；

（6）将所述检测芯片干燥，利用激光扫描仪，读取抗体芯片的荧光值。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：制备所述抗体芯片包括如下步骤：

S1.将所述特异性细胞外囊泡捕获抗体分别溶解在含有甘油的磷酸盐缓冲溶液中，得到不同种类的抗体溶剂；

S2.按照一定排列方式将不同种类的所述抗体溶剂分别点制到基体上，每种抗体溶剂点设置至少2个重复，得到抗体芯片。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述磷酸盐缓冲溶液中甘油的含量为5%，所述抗体溶剂的浓度为200-400 μg/ml。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述封闭液为浓度是3%的BSA封闭液。

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