CN116559107A - 基于外泌体红外光谱特征诊断早期肝癌的系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于外泌体红外光谱特征诊断早期肝癌的系统，鉴定系统包括输入显示模块、预处理模块、光谱校正模块、存储模块、分析模块以及控制模块。本发明系统仅用200微升血清样本，在30分钟内得到诊断结果。对比结果显示，本发明方法的诊断特异性和灵敏性远高于常用临床血清诊断指标。同时，我们基于数据库开发的肝癌早期诊断系统，也为红外光谱技术应用于早期癌症临床诊断奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于外泌体检测技术领域，具体涉及一种基于外泌体红外光谱特征诊断早期肝癌的系统。
背景技术
肝癌(liver cancer)是全球范围内恶性癌症，严重威胁着人民生命健康。在我国由肝炎引起的肝硬化是肝癌发生的主要诱因[1]，肝癌确诊多为晚期，这样造成癌症患者的生存率较低，2014年统计我国肝癌患者5年相对生存率仅为10％[2]，因此肝癌早期诊断对提高肝癌患者生存率至关重要。尽管近年来肝癌诊断技术不断发展，但肝癌的早期诊断依然是个难题。
外泌体(Exosome)是一种直径在40～100nm的圆形单层膜结构，起源于细胞内吞系统的晚期胞内体(endosome)，可由机体众多类型细胞主动释放，并广泛分布于唾液、血浆、尿液等体液中[3]。
肿瘤细胞分泌的外泌体(Tumor-derived exosomes，TDEs)中包含蛋白质、脂质、核酸和糖类等多种组分，能够参与细胞间的信息交流，调节肿瘤发生、血管生成、侵袭和转移等，在肿瘤发生发展中起到重要作用[4-7]。此外，外泌体内含有的丰富内容物还具有肿瘤异质性，因此，TDEs可作为极佳的肿瘤诊断工具，实时监测肿瘤发展[8]。
自上世纪人们发现红外光以来，红外光谱检测技术得到了长足的发展，尤其是同步辐射光源的应用，使得获取稳定而又高质量的生物样本红外光谱成为可能。已有人对外泌体红外光谱特征进行过表征，结果表明外泌体红外光谱具有区分不同来源外泌体的能力，具有作为生物学标记鉴定外泌体的潜力[9,10]。然而，肝癌发生发展过程中相关外泌体同步辐射红外光谱特征尚未被系统研究，对于血清来源外泌体同步辐射红外光谱是否能够用来诊断早期肝癌尚不清楚。
发明内容
本发明在上述研究的基础上进行，提供了一种基于外泌体红外光谱特征诊断早期肝癌的系统。
本发明的原理如下：肝癌、肝硬化、健康人群肝细胞来源外泌体的红外光谱特征存在差异。本发明先摸索血清来源外泌体红外光谱收集方法，然后基于该收集方法建立肝癌患者、肝硬化患者和健康患者血清来源外泌体红外光谱数据库并进行机器学习，进而基于外泌体红外光谱特征分析实现肝癌早期诊断。
本发明的主要方案如下：收集肝癌、肝硬化、健康人群肝细胞来源外泌体，在上海光源BL01B线站收集外泌体红外光谱，并对光谱数据进行预处理，构建数据库；然后根据该数据库进行机器学习，构建肝癌早期诊断系统。
为了实现上述目的，本发明采取的具体技术方案如下：
本发明的第一方面，提供了一种基于外泌体红外光谱特征诊断早期肝癌的系统，包括输入显示模块、预处理模块、光谱校正模块、存储模块、分析模块以及控制模块。
(1)输入显示模块用于导入待测血清外泌体的原始图谱数据，输入该原始图谱数据对应的基本信息，并对分析结果进行显示。
其中，外泌体的原始图谱数据的获取方法如下：将一定量(3μL)重悬浮的外泌体滴到红外光谱收集窗口上，室温下干燥5min后，利用光谱仪在BL01B光束线上收集外泌体吸收光谱，对光谱范围为800至4000cm-1，以4cm-1光谱分辨率进行64～256次(优选128次)共加扫描。优选的，红外光谱收集窗口由氟化钡、氟化钙、硫化锌、硒化锌、溴化钾和金刚石晶体中的任一种材料制备；光谱仪的光源选自同步辐射光源或激光光源。
原始图谱数据对应的基本信息至少包括采集时间、采集人、患者基本信息，便于进行追溯和发布检测结果。
(2)预处理模块对原始图谱进行基线校正，对3100-2900cm-1和1850-900cm-1中的光谱进行平滑处理，并进一步得到二阶导数光谱；具体的，采用OMIC9软件对原始光谱进行基线校正，然后通过13点Savitzkye-Golay平滑3100-2900cm-1和1850-900cm-1中的光谱；二阶导数光谱通过Savitzkye-Golay方法进行。
(3)光谱校正模块采用扩展多元散射校正对预处理后的光谱进行校正。
(4)存储模块存储有健康人群、肝癌、肝硬化人群血清来源外泌体的经校正处理后的标准红外光谱。
(5)分析模块将校正后的待测血清外泌体光谱与标准红外光谱进行特征比对，对该外泌体对应的健康程度属性进行鉴定。具体的，分析模块先采用多变量分析方法对预处理后光谱进行特征分析，区分健康捐献者、肝硬化患者、肝癌早期患者以及肝癌晚期患者，然后将校正后的光谱存储在存储模块中进行机器学习；进行实际检测时，基于特征比对分析对诊断结果进行判定。
(6)控制模块控制输入显示模块、预处理模块、光谱校正模块、存储模块、分析模块的正常运行。
本发明的第二方面，提供了一种基于红外光谱特征进行肝癌早期诊断的方法，包括如下步骤：
A、外泌体红外光谱收集
将3μL重悬浮的外泌体滴到红外光谱收集窗口上，室温下干燥5min后，利用光谱仪在BL01B光束线上收集外泌体吸收光谱，对光谱范围为800至4000cm-1的光谱以4cm-1光谱分辨率进行128次共加扫描；
B、光谱数据预处理
收集原始光谱，进行基线校正后通过13点Savitzkye-Golay对3100-2900cm-1和1850-900cm-1中的光谱进行平滑处理，然后通过Savitzkye-Golay方法得到二阶导数光谱；
C、外泌体鉴定
采用多变量分析方法对校正后的光谱进行特征分析，区分健康捐献者、肝硬化患者、肝癌早期患者以及肝癌晚期患者；其中，多变量分析方法包括PCA-LDA、偏最小二乘法或聚类分析法；
D、光谱校正
利用扩展多元散射校正对预处理后的光谱进行校正，并建立数据库；
E、肝癌早期诊断
将数据库作为训练集进行机器学习，验证后基于学习结果进行早期肝癌诊断。
重新收集新的早期肝癌患者与健康捐献者血清中外泌体，利用上海光源BL01B光束线按照前面描述收集红外光谱，输入诊断系统中进行判定。以临床常用血清诊断指标为参考，利用ROC曲线评价基于外泌体SR-IF数据库临床应用价值。结果显示，利用诊断系统诊断结果特异性以及灵敏度均高于常用血清诊断指标AFP、AFP-L3以及DCP(图2)。本发明的有益保障及效果：
本发明建立了人血清来源外泌体红外光谱收集方法，基于此方法建立了中国人的肝癌患者和健康患者血清来源外泌体红外光谱数据库，并利用数据库开发了基于机器学习的肝癌早期诊断系统。基于此方法，仅用200微升血清样本，在30分钟内得到诊断结果。对比结果显示，本发明方法的诊断特异性和灵敏性远高于常用临床血清诊断指标。同时，我们基于数据库开发的肝癌早期诊断系统，也为红外光谱技术应用于早期癌症临床诊断奠定基础。基于同步辐射红外技术为快速表征外泌体全部生物大分子提供可能，并且由于同步辐射红外技术检测所需样本量少，检测速度快，具有巨大临床应用潜力。
附图说明
图1是本发明基于外泌体红外光谱特征诊断早期肝癌的系统的结构框图。
图2是本发明基于外泌体红外光谱特征诊断早期肝癌的系统的鉴定流程图。
图3是对血清来源外泌体同步辐射红外光谱进行PCA-LDA处理的结果。
图4是采用本发明方法进行早期肝癌诊断的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
根据图1，本实施例提供的基于外泌体红外光谱特征诊断早期肝癌的系统100安装在电脑、手机等电子设备上，包括输入显示模块1、预处理模块2、光谱校正模块3、存储模块4、分析模块5以及控制模块6。
输入显示模块1用于导入待测外泌体的原始图谱数据，并输入该原始图谱数据对应的基本信息如采集时间、采集人、患者基本信息，便于进行追溯和发布检测结果，同时对分析结果进行显示。
预处理模块2对原始图谱进行基线校正，对3100-2900cm-1和1850-900cm-1中的光谱进行平滑处理，并进一步得到二阶导数光谱；具体的，采用OMIC9软件对原始光谱进行基线校正，然后通过13点Savitzkye-Golay平滑3100-2900cm-1和1850-900cm-1中的光谱；二阶导数光谱通过Savitzkye-Golay方法进行。
光谱校正模块3采用扩展多元散射校正对预处理后的光谱进行校正。
存储模块4存储有健康人群、肝癌、肝硬化人群血清来源外泌体的经校正处理后的标准红外光谱。
分析模块5将校正后的待测血清外泌体光谱与标准红外光谱进行特征比对，对该外泌体对应的健康程度属性进行鉴定。具体的，分析模块先采用多变量分析方法对预处理后光谱进行特征分析，区分健康捐献者、肝硬化患者、肝癌早期患者以及肝癌晚期患者，然后将校正后的光谱存储在存储模块中进行机器学习；进行实际检测时，基于特征比对分析对诊断结果进行判定。
控制模块6控制输入显示模块、预处理模块、光谱校正模块、存储模块、分析模块的正常运行。
下对上述早期肝癌的诊断系统的构建进行说明，流程参见图2：
实施例1：健康捐献者、肝癌及肝硬化患者血清来源外泌体同步辐射红外光谱数据收集及数据库的建立
1、健康捐献者及患者血清收集：
招募了2016年1月至2017年7月间在东方肝胆外科医院接受治愈性肝切除术的肝细胞癌和肝内胆管癌患者的治疗前血清样本。以2500g离心10分钟以提取血清，并在分析之前保存在-80℃。样本收集已从每个参与者处获得书面知情同意，并且该研究方案已获得东方肝胆外科医院伦理委员会的批准。健康对照组为献血者，肝脏生化正常，无肝病史，无病毒性肝炎，无恶性疾病。同样收集血样，以2500g离心10分钟以提取血清，并在分析之前保存在-80℃。
2、血清中外泌体收集：
通过ExoQuick试剂盒(SBI，EXOQ5A)按照说明书步骤获得血清来源的外泌体。
本实施例中，外泌体来源可替代有尿液、唾液、尿液、脑脊液、乳汁中以及组织破碎后上清。
外泌体获得还可利用超速离心，以及其他品牌市售商品化外泌体提取试剂盒获得外泌体。其中超速离心步骤：将250μl无细胞血清在4℃融化过夜，并用PBS稀释至15ml。用0.22μm滤膜过滤后，于4℃以150,000g离心2小时。然后，丢弃上清液，并用15ml PBS重悬外泌体沉淀。在4℃下将150,000g的血清再次离心2h，然后用纯水将重悬的外泌体沉淀物。商品化其他外泌体试剂盒按照说明书步骤提取。
3、外泌体红外光谱收集
将3μL重悬浮的外泌体滴到红外光谱收集窗口上，并在室温下干燥5分钟。利用Nicolet Continnum红外显微镜(Thermo)的Nicolet 6700 FTIR光谱仪在上海同步辐射装置(SSRF)的BL01B光束线上收集外泌体吸收光谱。对光谱范围为800至4000cm-1，以4cm-1光谱分辨率进行128次共加扫描。对于每个细胞系，测量约20个独立样品。
该方法中，除上述方案外，还可采用如下替代方案：
a.外泌体红外光谱收集窗口可替代有氟化钡、氟化钙、硫化锌、硒化锌、溴化钾和金刚石晶体。b共加扫描可从64-256次。c光源除同步辐射光源外还可以是激光光源。
4、光谱数据预处理
收集原始光谱，并通过OMIC 9(Thermo)软件进行基线校正；然后通过13点Savitzkye-Golay平滑3100～2900cm-1和1,850～900cm-1中的光谱；进一步通过Savitzkye-Golay方法(7个平滑点)进行得到二阶导数光谱。
5、外泌体红外光谱特征分析
利用PCA-LDA分析光谱数据，程序如下：
[P,S,laten]＝princomp(X')；
N＝[ones(45,1)*1；ones(20,1)*2；ones(45,1)*3；ones(45,1)*4]；
L＝S(:,1:100)；
[eigvector,eigvalue]＝LDA(L,N)；
Y＝L*eigvector；
V1＝P(:,1:100)；
Loading＝V1*eigvector；
figure
for i＝1:45
plot3(Y(i,1),Y(i,2),Y(i,3),'*g')；
hold on
end
for i＝46:65
plot3(Y(i,1),Y(i,2),Y(i,3),'sm')；
hold on
end
for i＝67:110
plot3(Y(i,1),Y(i,2),Y(i,3),'pc')；
hold on
end
for i＝111:155
plot3(Y(i,1),Y(i,2),Y(i,3),'db')；
hold on
end
figure
fori＝1:20
plot3(S(i,1),S(i,2),S(i,3),'*g')；
holdon
end
fori＝21:40
plot3(S(i,1),S(i,2),S(i,3),'sm')；
holdon
end
fori＝83:127
plot3(S(i,1),S(i,2),S(i,3),'pc')；
holdon
end
fori＝128:172
plot3(S(i,1),S(i,2),S(i,3),'db')；
holdon
end
X是输入光谱
Y(S)是得分
loading是载荷
结果如图1所示，血清来源外泌体红外光谱特征可以很好区分正常捐赠者(Healthy)、肝炎患者(Cirr)和肝癌患者(HCC)。进一步的，血清来源外泌体红外光谱特征还可以很好区分肝炎患者(Cirr)和早期肝癌患者(HCC-earlystage)。这表明血清来源外泌体红外光谱特征具有早期肝癌诊断潜力，外泌体红外光谱特征可以很好区分健康捐献者、肝硬化患者、肝癌早期患者以及肝癌晚期患者。
6、外泌体红外光谱校正及数据库构建
预处理后的光谱数据以Excel形式或TXT形式保存。所有光谱利用扩展多元散射校正(Extendedmultiplescatteringcorrection，EMSC)，校正后光谱建库。扩展多元散射校正利用MATLAB实现，程序如下：
实施例2：基于血清来源外泌体同步辐射红外光谱数据库的肝癌早期诊断系统
1、机器学习
以建立数据库为训练集，训练机器学习分类程序，建立诊断系统。此处以随机森林为例。通过MATLAB实施。实现程序如下：
trainData＝[xun']；
features＝trainData(:,(1:n-1))
classLabels＝trainData(:,n)；
nTrees＝200；
B＝TreeBagger(nTrees,features,classLabels,'OOBPrediction','On','Method','classification')；
oobErrorBaggedEnsemble＝oobError(B)；
plot(oobErrorBaggedEnsemble)；
newData＝[yan']；
predChar＝B.predict(newData)；
predictedClass＝str2double(predChar)；
建立训练集：
trainData＝[xun']；
features＝trainData(:,(1:n-1))
classLabels＝trainData(:,n)；
nTrees＝200；
B＝TreeBagger(nTrees,features,classLabels,'oobpred','on','Method','classification')；
oobErrorBaggedEnsemble＝oobError(B)；
plot(oobErrorBaggedEnsemble)；
验证：
newData＝[yan']；
predChar＝B.predict(newData)；
predictedClass＝str2double(predChar)；
使用
建立训练集：
trainData＝[xun']；
features＝trainData(:,(1:3262))
classLabels＝trainData(:,3263)；
nTrees＝125；
B＝TreeBagger(nTrees,features,classLabels,'oobpred','on','Method','classification')；
oobErrorBaggedEnsemble＝oobError(B)；
plot(oobErrorBaggedEnsemble)；
验证：
newData＝[yan']；
predChar＝B.predict(newData)；
predictedClass＝str2double(predChar)；
trainData＝[xun']；
features＝trainData(:,(1:546))
classLabels＝trainData(:,547)；
nTrees＝125；
B＝TreeBagger(nTrees,features,classLabels,'oobpred','on','Method','classification')；
oobErrorBaggedEnsemble＝oobError(B)；
plot(oobErrorBaggedEnsemble)；
本实施例中，其他常用机器学习程序可替代随机森林，如支持向量机(SupportVector Machine)和神经网络(Neural Network)等。其他可实现机器学习的软件均可替代MATLAB。
2、验证诊断效果：
重新收集新的早期肝癌患者与健康捐献者血清中外泌体，利用上海光源BL01B光束线按照前面描述收集红外光谱，输入诊断系统中进行判定。以临床常用血清诊断指标为参考，利用ROC曲线评价基于外泌体SR-IF数据库临床应用价值。结果如图2所示，利用诊断系统诊断结果特异性以及灵敏度均高于常用血清诊断指标AFP、AFP-L3以及DCP，表明基于外泌体红外光谱数据库的机器学习诊断方法灵敏度和特异性更高。
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以上已对本发明的实例进行了具体说明，但本发明并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (7)
1.一种基于外泌体红外光谱特征诊断早期肝癌的系统，其特征在于，包括输入显示模块、预处理模块、光谱校正模块、存储模块、分析模块以及控制模块，
其中，所述输入显示模块用于导入待测血清外泌体的原始图谱数据，输入该原始图谱数据对应的基本信息，并对分析结果进行显示；
所述预处理模块对原始图谱进行基线校正，对3100-2900cm-1和1850-900cm-1中的光谱进行平滑处理，并进一步得到二阶导数光谱；
所述光谱校正模块对预处理后的光谱进行校正；
所述存储模块存储有健康人群、肝癌早期、肝癌晚期、肝硬化人群血清来源外泌体的经校正处理后的标准红外光谱；
所述分析模块将校正后的待测血清外泌体光谱与标准红外光谱进行特征比对，对该外泌体对应的健康程度属性进行鉴定；
所述控制模块控制输入显示模块、预处理模块、光谱校正模块、存储模块、分析模块的正常运行。
2.根据权利要求1所述的基于外泌体红外光谱特征诊断早期肝癌的系统，其特征在于：
其中，外泌体的原始图谱数据的获取方法如下：将一定量重悬浮的外泌体滴到红外光谱收集窗口上，室温下干燥后，利用光谱仪在BL01B光束线上收集外泌体吸收光谱，对光谱范围为800至4000cm-1，以4cm-1光谱分辨率进行128次共加扫描。
3.根据权利要求2所述的基于外泌体红外光谱特征诊断早期肝癌的系统，其特征在于：
其中，重悬浮外泌体溶液的量为3μL，室温干燥时间为5分钟；
红外光谱收集窗口由氟化钡、氟化钙、硫化锌、硒化锌、溴化钾和金刚石晶体中的任一种材料制备；
所述光谱仪的光源选自同步辐射光源或激光光源。
4.根据权利要求1所述的基于外泌体红外光谱特征诊断早期肝癌的系统，其特征在于：
其中，所述原始图谱数据对应的基本信息至少包括采集时间、采集人、患者基本信息。
5.根据权利要求1所述的基于外泌体红外光谱特征诊断早期肝癌的系统，其特征在于：
其中，所述预处理模块采用OMIC9软件对原始光谱进行基线校正，然后通过13点Savitzkye-Golay平滑3100-2900cm-1和1850-900cm-1中的光谱；二阶导数光谱通过Savitzkye-Golay方法进行。
6.根据权利要求1所述的基于外泌体红外光谱特征诊断早期肝癌的系统，其特征在于：
其中，所述光谱校正模块采用扩展多元散射校正对预处理后的光谱进行校正。
7.根据权利要求1所述的基于外泌体红外光谱特征诊断早期肝癌的系统，其特征在于：
其中，所述分析模块先采用多变量分析方法对预处理后光谱进行特征分析，区分健康捐献者、肝硬化患者、肝癌早期患者以及肝癌晚期患者，然后将校正后的光谱存储在存储模块中进行机器学习；进行实际检测时，基于特征比对分析对诊断结果进行判定。
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2023
- 2023-04-27 CN CN202310473802.3A patent/CN116559107A/zh active Pending
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