CN115656510A - 用于肝细胞癌诊断的血浆外泌体蛋白标志物vcam1、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于肝细胞癌诊断的血浆外泌体蛋白标志物VCAM1、试剂盒及其应用，属于分子标志物技术领域，所要解决的技术问题是如何提高肝细胞癌诊断的灵敏度和/或特异性。本发明提供了生物标志物和/或检测所述生物标志物的物质在肝细胞癌诊断或制备用于肝细胞癌诊断的产品中的应用；所述生物标志物为血浆外泌体VCAM1蛋白或血浆外泌体VCAM1蛋白和血浆AFP的组合。本发明的生物标志物VCAM1蛋白及检测方法具有敏感性强、特异性高的特点，将其应用于临床肝细胞癌患者的诊断中可提高早期肝癌的诊断率，将亚临床肝癌或隐匿性肝癌从人群中筛查出来，有助于提高肝癌的治愈率及降低死亡率。

Description

用于肝细胞癌诊断的血浆外泌体蛋白标志物VCAM1、试剂盒及 其应用

技术领域

本发明涉及借助于测试材料的化学或物理性质来测试或分子材料的分子标志物技术领域，具体涉及用于肝细胞癌诊断的血浆外泌体蛋白标志物VCAM1、试剂盒及其应用。

背景技术

原发性肝细胞癌(Primary liver cancer，PLC)是全球发病率排名第六，死亡率排名第三的消化系统恶性肿瘤。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)约占原发性肝细胞癌的75％-85％。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是与HCC的发生发展相关的最主要的风险因素，超过50％的HBV感染者最终发展为HCC。肝细胞癌发病隐匿，难以诊断，超过70％-80％的患者确诊时已是中晚期，并且晚期HCC切除术后的5年复发转移率高达40％～70％，患者5年生存率也仅为14.1％。最近的研究显示，HCC的诊断可将患者的5年生存率提高到50％-75％。因此，研发更为有效的肝细胞癌诊断方法或策略，提高高危人群肝细胞癌的早诊率，将有望改善患者的预后。

血清/血浆生物标志物是一种高效、无创的疾病诊断方法。目前临床使用的与肝细胞癌相关的血清/血浆标志物主要包括甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)、甲胎蛋白异质体L3(AFP-L3)和脱-γ-羧基凝血酶原(Des-γ-decarboxy prothrombin，DCP)等。然而，现有的数据显示这些标志物检测肝细胞癌的能力仍然有限，在针对肝细胞癌临床病例的诊断中，AFP、AFP-L3和DCP的敏感性和特异度分别只有18％～60％和85％～90％、28％～56％和92％～97％以及56％～77％和82％～87.2％。因此，急需研发新的敏感性和特异度更高的肝细胞癌诊断标志物。

外泌体(Exosome)是一种直径约为40～200纳米(Nanometer，nm)、由细胞内多囊泡胞内体(Multi-vesicular endosome，MEV)成熟过程中膜向内出芽形成的具有脂质双分子层的腔内小泡。近年来，研究人员发现外泌体所包含的蛋白质、核酸和脂类物质等，可以作为癌症的诊断和/或预后标志物，具有潜在的临床应用价值。有研究报道，某些癌症患者的肿瘤组织和血浆来源的细胞外囊泡中的蛋白质鉴别癌症患者的敏感性和特异性可达90％以上。在肝细胞癌患者中，血清外泌体中高表达的半乳糖凝集素3结合蛋白(Lectingalactoside-binding soluble 3binding protein，LGALS3BP)可能作为鉴别肝细胞癌患者和对照个体的候选标志物。但截至目前，尚未有肝细胞癌血浆来源的外泌体蛋白标志物及分子分类器的报道。因此，发现肝细胞癌血浆来源的血浆外泌体蛋白标志物及相应的分子分类器，将有助于进一步建立非侵入性、易操作性、高灵敏性和高特异性的肝细胞癌诊断或诊断检测方法，对肝细胞癌早发现、早诊断、早治疗具有巨大的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于肝细胞癌诊断的生物标志物，所要解决的技术问题是如何提高肝细胞癌诊断的灵敏度和/或特异性。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了生物标志物和/或检测所述生物标志物的物质的下述任一种应用：

A1)在肝细胞癌诊断或制备用于肝细胞癌诊断的产品中的应用；

A2)在肝细胞癌筛查或制备用于肝细胞癌筛查的产品中的应用；

A3)在评估肝细胞癌风险或制备用于评估肝细胞癌风险的产品中的应用；

A4)在肝细胞癌预后评估或制备用于肝细胞癌预后评估的产品中的应用；

A5)在鉴别区分肝细胞癌和肝硬化或制备鉴别区分肝细胞癌和肝硬化的产品中的应用；

A6)在鉴别区分肝细胞癌和慢性乙型肝炎或制备鉴别区分肝细胞癌和慢性乙型肝炎的产品中的应用；

所述生物标志物可为下述任一种：

B1)血浆外泌体中的VCAM1蛋白和血浆中的AFP；

B2)血浆外泌体中的VCAM1蛋白。

进一步地，所述血浆外泌体中的VCAM1蛋白在肝细胞癌样品(肝癌患者血浆样品)中与对照样品(健康人或肝硬化患者或慢性乙型肝炎患者血浆样品)中的表达水平有显著性差异。

所述VCAM1蛋白为血管细胞粘附分子1(Vascular cell adhesion molecule 1，VCAM1)。

进一步地，所述血浆外泌体中的VCAM1蛋白在肝癌样品中表达水平上调。

对于健康人(Healthy control，HC)、肝硬化(Live cirrhosis，LC)患者、慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)患者与肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)患者，血浆外泌体中的VCAM1蛋白可以作为用于区分HCC和LC、CHB、HC的生物标志物。

健康人、肝硬化患者和慢性乙型肝炎患者血浆外泌体中的VCAM1表达水平低于肝细胞癌患者。

上述应用中，所述物质可为用于检测VCAM1蛋白含量(即血浆外泌体中的VCAM1蛋白的浓度)的试剂(如检测血浆外泌体中的VCAM1蛋白含量的试剂)和用于检测AFP含量的试剂或试剂盒(如检测血浆中的AFP含量的试剂或试剂盒)；或所述物质为用于检测VCAM1蛋白含量的试剂(如检测血浆外泌体中的VCAM1蛋白含量的试剂)。

上述应用中，所述检测所述生物标志物的物质可包括通过酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、放射免疫测定法、免疫共沉淀法、免疫印迹法、高效液相色谱法、毛细管凝胶电泳法、近红外光谱法、质谱法、免疫化学发光法、胶体金免疫技术、荧光免疫层析技术、表面等离子共振技术、免疫-PCR技术或生物素-亲和素技术检测所述生物标志物的物质。

上述应用中，所述用于检测VCAM1蛋白含量的试剂可包括VCAM1蛋白(如Ag1993，Proteintech，USA)和结合VCAM1蛋白的抗体(如ab216035，Abcam，UK)；所述用于检测AFP含量的试剂包括AFP和结合AFP的抗体。

所述用于检测AFP含量的试剂盒包括AFP和结合AFP的抗体。

所述用于检测VCAM1蛋白含量的试剂中包括VCAM1蛋白作为标准品。

所述用于检测AFP含量的试剂中包括AFP蛋白作为标准品。

进一步地，所述用于检测VCAM1蛋白表达水平的物质可为特异性结合VCAM1蛋白的抗体(如ab216035，Abcam，UK)。

本发明还提供一种肝细胞癌诊断试剂盒，所述肝细胞癌诊断试剂盒包括定量检测本发明所述标志物(血浆外泌体中的VCAM1蛋白)的试剂，进一步地，上述肝细胞癌诊断试剂盒还包括对照样品，上述对照样品可为健康人血浆外泌体或肝硬化患者血浆外泌体或慢性乙型肝炎患者血浆外泌体。

本发明还提供了组合物，所述组合物含有所述用于检测VCAM1蛋白含量的试剂和用于检测AFP含量的试剂，所述组合物具有下述至少一种用途：

U1)肝细胞癌诊断或制备用于肝细胞癌诊断的产品；

U2)肝细胞癌筛查或制备用于肝细胞癌筛查的产品；

U3)评估肝细胞癌风险或制备用于评估肝细胞癌风险的产品；

U4)肝细胞癌预后评估或制备用于肝细胞癌预后评估的产品；

U5)鉴别区分肝细胞癌和肝硬化或制备鉴别区分肝细胞癌和肝硬化的产品；

U6)鉴别区分肝细胞癌和慢性乙型肝炎或制备鉴别区分肝细胞癌和慢性乙型肝炎的产品。

所述组合物中所述用于检测VCAM1蛋白含量的试剂和所述用于检测AFP含量的试剂均独立包装。

所述产品可以血浆为待测样本。

本发明还提供了试剂盒，所述试剂盒包括所述组合物或所述用于检测VCAM1蛋白含量的试剂，所述试剂盒具有下述至少一种用途：

F1)肝细胞癌诊断或制备用于肝细胞癌诊断的产品；

F2)肝细胞癌筛查或制备用于肝细胞癌筛查的产品；

F3)评估肝细胞癌风险或制备用于评估肝细胞癌风险的产品；

F4)肝细胞癌预后评估或制备用于肝细胞癌预后评估的产品；

F5)鉴别区分肝细胞癌和肝硬化或制备鉴别区分肝细胞癌和肝硬化的产品；

F6)鉴别区分肝细胞癌和慢性乙型肝炎或制备鉴别区分肝细胞癌和慢性乙型肝炎的产品。

上述试剂盒中，所述试剂盒的检测样本可为血浆。

进一步地，所述试剂盒包括定量检测血浆外泌体中的VCAM1蛋白的试剂。

进一步地，所述试剂盒还包括标准品，所述标准品可为VCAM1蛋白标准品。

进一步地，所述试剂盒还可包括外泌体富集纯化试剂。

进一步地，所述试剂盒可为肝细胞癌诊断试剂盒，所述肝细胞癌诊断试剂盒还包括对照样品，所述对照样品可为健康人血浆外泌体和/或肝硬化患者血浆外泌体和/或慢性乙型肝炎患者血浆外泌体。

本发明还提供了所述试剂盒的下述任一种应用：

C1)在肝细胞癌诊断或制备用于肝细胞癌诊断的产品中的应用；

C2)在肝细胞癌筛查或制备用于肝细胞癌筛查的产品中的应用；

C3)在评估肝细胞癌风险或制备用于评估肝细胞癌风险的产品中的应用；

C4)在肝细胞癌预后评估或制备用于肝细胞癌预后评估的产品中的应用；

C5)在鉴别区分肝细胞癌和肝硬化或制备鉴别区分肝细胞癌和肝硬化的产品中的应用；

C6)在鉴别区分肝细胞癌和慢性乙型肝炎或制备鉴别区分肝细胞癌和慢性乙型肝炎的产品中的应用。

本文中，所述产品可为试剂、试剂盒或芯片。

本发明还提供了所述生物标志物(血浆外泌体中的VCAM1蛋白)作为靶点在制备治疗或预防肝细胞癌的药物中的应用。

本发明还提供了筛查或辅助诊断肝细胞癌的方法，所述方法可为下述任一种：

D1)所述方法包括利用所述组合物检测待测患者血浆中的VCAM1蛋白含量和AFP含量，根据VCAM1蛋白含量和AFP含量确定待测患者是否为肝细胞癌患者；

D2)所述方法包括利用所述用于检测VCAM1蛋白含量的试剂检测待测患者血浆中的VCAM1蛋白含量，根据VCAM1蛋白含量确定待测患者是否为肝细胞癌患者。

进一步地，所述检测待测患者血浆中的VCAM1蛋白含量可包括检测待测患者血浆外泌体中的VCAM1蛋白含量。

本发明所述肝细胞癌诊断可包括以下步骤：

E1)采集肝细胞癌样品；

E2)用所述肝细胞癌诊断试剂(检测所述生物标志物的物质)检测肝细胞癌样品和对照样品中的血浆外泌体VCAM1的蛋白表达水平；

E3)若肝细胞癌样品中的VCAM1蛋白绝对表达量高于对照样品，则有患肝细胞癌的风险。

所述肝细胞癌样品可为血浆样品。

进一步地，所述检测可为通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测血浆外泌体中VCAM1蛋白的表达水平。

本发明所述生物标志物可适用于ELISA常规的蛋白检测实验。

本发明还提供了血浆外泌体中VCAM1蛋白的ELISA检测方法。

在本发明的一个实施方案中，所述ELISA方法包括如下步骤：

采用ELISA方法1检测外泌体中VCAM1蛋白的表达水平，步骤如下：(1)在96孔酶标板(95029180，Thermo Fisher Scientific，USA)中包被100μL兔抗人CD63单克隆抗体(1:1000；ab68418，Abcam，UK)，4℃孵育过夜后洗涤、拍干水珠；(2)每孔中加入200μL含0.05％吐温-20的5％脱脂奶粉溶液，室温孵育2h后洗涤、拍干水珠；(3)每孔中加入100μL血浆样本和外泌体，37℃下孵育2h后洗涤、拍干水珠；(4)每孔中加入100μL鼠抗人VCAM1蛋白单克隆抗体(1:500；ab216035，Abcam，UK)，37℃孵育2h后洗涤、拍干水珠；(5)每孔中加入100μL结合HRP的羊抗鼠IgG多克隆抗体(1:1000；ab205719，Abcam，UK)，37℃孵育1h后洗涤、拍干水珠；(6)每孔加入90μL TMB，室温下孵育15min后，每孔加入50μL终止液(2M H₂SO4)；(7)采用SunriseTM读板机在450nm处读取反应信号，根据标准曲线定量血浆样本中的VCAM1蛋白含量。

上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。

本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现VCAM1蛋白在肝细胞癌(HCC)患者的血浆外泌体中高表达，并以此开发了用于肝细胞癌诊断检测的生物标志物，VCAM1蛋白作为生物标志物可应用于肝细胞癌的非创诊断、筛查、预后评估。此外，VCAM1蛋白还可作为药物作用靶点，应用于肝细胞癌药物的筛选和开发中。具体可通过检测患者血浆外泌体中VCAM1蛋白的表达水平来判断患者是否患有肝细胞癌，当检测发现VCAM1表达量显著高于对照个体时，可作为判定其为肝细胞癌的诊断依据，从而指导临床医生进行早期干预和治疗，具有较大的应用前景。

本发明提出用于肝细胞癌诊断的血浆外泌体蛋白标志物及其应用。本发明筛选并进一步鉴定出肝细胞癌相关的特异性蛋白(血浆外泌体中的VCAM1)及其与血浆AFP所组成的分子分类器，通过检测其蛋白表达量，实现肝细胞癌的诊断，其可适用于ELISA肝细胞癌相关检测试剂盒的开发，从而应用于临床肝细胞癌患者的诊断。

本发明用于肝细胞癌诊断检测的生物标志物血浆外泌体中的VCAM1蛋白及用于检测该VCAM1蛋白表达水平的物质、试剂盒及检测方法具有敏感性强、特异性高的特点；而灵敏度越高则漏诊率(假阴性率)越低。在肝癌的诊断和筛查中，由于肝癌通常发现晚，一发现则几乎难以治愈，所以灵敏度的提高尤为重要，灵敏度的提高能够提高早期肝癌的诊断率，将亚临床肝癌或隐匿性肝癌从人群中筛查出来，有助于提高肝癌的治愈率及降低死亡率。

附图说明

图1为提取血浆外泌体的质量评估；A：纳米粒子跟踪分析显示富集到的外泌体大小在30～150nm之间，其粒径峰值约为74.49nm；B：透射电镜观察到的外泌体的大小及结构图；C：在富集到的外泌体中标志物分子FLOT1和TSG101蛋白的表达水平图。

图2为本发明中血浆外泌体蛋白与外泌体数据库ExoCarta和Vesiclepedia的比对结果；A：对各组样本的质谱数据进行归一化图；B：鉴定到的血浆外泌体标记物的丰度在所有蛋白质中排名居前；C：HCC与LC、CHB、HC组血浆外泌体蛋白质的比对韦恩图；D：各组血浆外泌体蛋白质与外泌体数据库ExoCarta和Vesiclepedia的比对韦恩图。

图3为HCC与LC、CHB、HC组血浆外泌体蛋白质差异表达的分析图；A：质控后HCC与LC、CHB、HC组中保留用于分析的高质量蛋白质的韦恩图；B：HCC和LC组之间差异表达蛋白质的火山图；C：HCC和CHB组之间差异表达蛋白质的火山图；D：HCC和HC组之间差异表达蛋白质的火山图。

图4为差异表达的外泌体蛋白Hallmark通路富集分析结果；A：HCC与HC组差异表达的外泌体蛋白质的Hallmark通路富集分析图；B：HCC与CHB组差异表达的外泌体蛋白质的Hallmark通路富集分析图；C：HCC与LC组差异表达的外泌体蛋白质的Hallmark通路富集分析图。

图5为基于发掘人群鉴定与肝细胞癌相关的外泌体蛋白图；A：HCC与LC、CHB、HC组之间差异表达蛋白质的韦恩图；B：10种差异表达蛋白质的热图；C：差异表达蛋白质在四组之间的表达水平箱式图。

图6为检测血浆外泌体中VCAM1蛋白水平ELISA方法的建立与评估图；A：通过免疫荧光染色检测出完整外泌体中的VCAM1；B：自建检测血浆外泌体中的VCAM1蛋白ELISA方法的示意图；C：ELISA方法1在提纯的外泌体中的标准曲线图；D：ELISA方法1在血浆中的标准曲线图；E：ELISA方法1在提纯的外泌体和血浆中检测结果的相关性图；F：ELSIA方法2在VCAM1蛋白标准品中的标准曲线；G：ELISA方法1检测血浆外泌体中的VCAM1蛋白在验证队列各组中的表达水平；H、ELSIA方法2检测血浆VCAM1在验证队列各组中的表达水平。

图7为血浆外泌体中VCAM1蛋白用于肝细胞癌诊断价值的评估图；A：血浆外泌体中的VCAM1蛋白在验证队列各组中的表达水平；B：血浆AFP在验证队列各组中的表达水平；C：血浆外泌体中的VCAM1蛋白单独及联合AFP鉴别HCC的ROC。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

蛋白的提取

采用本领域常规的外泌体蛋白的提取方法，提取健康人与确诊为肝细胞癌患者血浆外泌体作为本发明的试验材料，健康人与确诊为肝细胞癌的患者人数满足统计学样本最低采集要求，因此，具有统计学意义上的代表性。

样本纳入标准：

健康人(HC)：①未患肿瘤；②无高脂血症、高血压；③无全身性炎症反应；④无囊肿、可疑性结节等。

慢性乙型肝炎(CHB)患者：HBsAg阳性6个月以上的患者。

肝硬化(LC)患者：通过病理活检或两种影像学检查确诊(超声检查合并CT或MRI)。

肝细胞癌(HCC)患者：根据美国肝病协会(American association for the studyof liver diseases，AASLD)临床分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期的HCC患者。

采用试剂盒检测血浆AFP(甲胎蛋白)的表达

采用酶联免疫吸附试剂盒(KA0202，Abnova，China)，按照厂家的说明书进行血浆中AFP表达水平的检测。过程简要如下：(1)将血浆样本稀释液和蛋白质标准品(AFP，KA0202，Abnova)依次加入反应孔中，孵育后清洗；(2)每孔中加入生物素化检测抗体，孵育后清洗；(3)每孔中加入亲和素辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)，孵育后清洗；(4)每孔中加入3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB)，其在HRP的催化下产生蓝色产物，加入酸性停止液后变成黄色；(5)采用SunriseTM读板机(Tecan，Switzerland)在450nm处读取反应信号，根据标准曲线定量血浆样本中的AFP含量。

检测血浆外泌体中VCAM1蛋白水平ELISA方法建立

采用ELISA方法1检测外泌体中VCAM1蛋白的表达水平，步骤如下：(1)在96孔酶标板(95029180，Thermo Fisher Scientific，USA)中包被100μL兔抗人CD63单克隆抗体(1:1000；ab68418，Abcam，UK)，4℃孵育过夜后洗涤、拍干水珠；(2)每孔中加入200μL含0.05％吐温-20的5％脱脂奶粉溶液，室温孵育2h后洗涤、拍干水珠；(3)每孔中加入100μL血浆样本和外泌体标准品，37℃下孵育2h后洗涤、拍干水珠；(4)每孔中加入100μL鼠抗人VCAM1单克隆抗体(1:500；ab216035，Abcam，UK)，37℃孵育2h后洗涤、拍干水珠；(5)每孔中加入100μL结合HRP的羊抗鼠IgG多克隆抗体(1:1000；ab205719，Abcam，UK)，37℃孵育1h后洗涤、拍干水珠；(6)每孔加入90μL TMB，室温下孵育15min后，每孔加入50μL终止液(2M H₂SO4)；(7)采用SunriseTM读板机在450nm处读取反应信号，根据标准曲线定量血浆样本中的VCAM1蛋白含量。

采用ELISA方法2检测血浆中VCAM1蛋白的表达水平，步骤如下：(1)在96孔酶标板(95029180，Thermo Fisher Scientific，USA)中包被100μL兔抗人VCAM1多克隆抗体(1:1000；11444-1-AP，Proteintech，USA)，4℃孵育过夜后洗涤、拍干水珠；(2)每孔中加入200μL含0.05％吐温-20的5％脱脂奶粉溶液，室温孵育2h后洗涤、拍干水珠；(3)每孔中加入100μL血浆样本和VCAM1蛋白标准品(Ag1993，Proteintech，USA)，37℃下孵育2h后洗涤、拍干水珠；(4)每孔中加入100μL鼠抗人VCAM1单克隆抗体(1:500；ab216035，Abcam，UK)，37℃孵育2h后洗涤、拍干水珠；(5)每孔中加入100μL结合HRP的羊抗鼠IgG多克隆抗体(1:1000；ab205719，Abcam，UK)，37℃孵育1h后洗涤、拍干水珠；(6)每孔加入90μL TMB，室温下孵育15min后，每孔加入50μL终止液(2M H₂SO4)；(7)采用SunriseTM读板机在450nm处读取反应信号，根据标准曲线定量血浆样本中的VCAM1蛋白含量。

免疫荧光法(Immunofluorescence，IF)鉴定VCAM1蛋白在外泌体上的定位，步骤如下：(1)取20μL分离纯化的外泌体与500μL 2％的多聚甲醛(80096618，sinopharm，China)混合，并滴加在盖玻片上固定20min，用PBS洗涤2次；(2)5％正常马血清(16050122，Gibco，USA)封闭外泌体30min，用PBS洗涤2次；(3)在盖玻片上加入400mL的兔抗人VCAM1单克隆抗体(1:250；ab134047，Abcam，UK)孵育20min，用PBS洗涤2次；(4)在盖玻片上加入400μL的山羊抗兔IgG(1:200，A27034，Thermo Fisher Scientific，USA)孵育20min，用PBS洗涤2次；(5)在盖玻片上加入400μL的抗荧光淬灭封片液(P10144，Thermo Fisher Scientific，USA)。在激光扫描共聚焦显微镜(GE Healthcare，USA)观察拍照。仅用山羊抗小鼠IgG处理的外泌体作为对照。

实施例1、血浆外泌体的提取与鉴定

发明人首先采用尺寸排阻色谱法提取了发掘人群中11个HCC、9个LC、10个CHB和10个HC个体(表1)的血浆外泌体，并分别采用纳米粒径分析、透射电镜分析和免疫印迹分析评估所提取的外泌体的质量。纳米粒子跟踪分析结果显示，富集到的外泌体直径大小约为30～150nm，其粒径峰值约为74.49nm，浓度约为2.19×10⁹particles/mL(图1中A)，与文献报道的外泌体大小相近。通过透射电镜分析可以清晰地观察到血浆外泌体的大小在40～150nm之间(图1中B)，形状如“茶托型”或“椭圆形”，与外泌体的形貌特征相符。免疫印迹分析显示，所富集的外泌体高表达特异性标记物FLOT1和TSG101(图1中C)。综上，这些结果表明分离富集到了高质量的血浆外泌体颗粒。

表1发掘队列的临床特征

注：TNM，Tumor-Node-Metastasis(肿瘤-淋巴结-转移)；HBsAg，Hepatitis Bvirus surface antigen(乙型肝炎病毒表面抗原)；AFP，Alpha-fetoprotein(甲胎蛋白)；HCC，Hepatocellular carcinoma(肝细胞肝细胞癌)；LC，Live cirrhosis(肝硬化)；CHB，Chronic hepatitis B(慢性乙型肝炎)；HC，Healthy control(健康对照)。

实施例2、血浆外泌体的蛋白质组学分析

绘制肝细胞癌血浆外泌体的蛋白质组学图谱，采用鸟枪法策略和非数据依赖性采集(Data-independent acquisition，DIA)数据采集方式进行全蛋白质组的高通量质谱检测。

经质控过滤、数据归一化及蛋白质定性和定量分析(图2中A)，共鉴定到1463个蛋白质。其中，20个蛋白质为已知的外泌体表面的特征性标记物，其表达丰度在所有鉴定的蛋白质中排名居前(图2中B)。在HCC、LC、CHB、HC组中分别鉴定到1357、1381、1426、1386个蛋白质(图2中C)。四组之间有1296个共有的蛋白质，对鉴定到的1463个蛋白质与外泌体数据库ExoCarta和Vesiclepedia(图2中D)进行了比对，结果显示有87.3％的蛋白质是外泌体蛋白质，进一步提示富集到了高质量的血浆外泌体。

实施例3、血浆外泌体中与肝细胞癌相关的候选蛋白质标志物的鉴定

为了确保分析结果的可靠性，只保留了至少在7个样本中被检测到的蛋白质，并采用KNN(K最近邻，k-Nearest Neighbor)法对缺失值进行填充。在HCC组、LC组、CHB组和HC组中分别保留了885、882、1021和897个蛋白质(图3中A)，进一步，通过保留的血浆外泌体蛋白质进行了差异表达分析(图3中B、C、D)。

为了探究与肝细胞癌相关的代谢通路变化，采用Hallmark比较了HCC与HC、CHB和LC组差异表达蛋白富集的信号通路。结果显示，HCC与HC组差异的蛋白主要富集在补体、上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)、血红素代谢、KRAS信号和PI3K/AKT/mTOR信号等通路(图4中A)；HCC与CHB组差异的蛋白主要富集在补体、活性氧途径、EMT、炎症反应和胆汁酸代谢等通路(图4中B)；HCC与LC组差异的蛋白主要富集在凝血、补体、EMT、血管生成和炎症反应等通路(图4中C)。通过Hallmark通路富集分析发现在三组中都富集到的通路为补体和EMT。最新研究发现，补体系统与肝脏炎症、纤维化、癌变和HCC的发展有关，但是并没有关于外泌体与补体相互作用影响HCC进展的报道。有研究表明，EMT通路在HCC的进展中也起着重要的作用，例如，EMT会导致肿瘤细胞侵袭和转移相关的肝细胞恶性程度增加。其中，Hallmark通路富集到的EMT通路，主要涉及血管细胞粘附分子(Vascular cell adhesion molecule 1，VCAM1)和多能蛋白聚糖(versican，VCAN)。有研究报道，HCC细胞分泌的外泌体会通过MAPK/ERK信号通路介导EMT促进HCC的进展；HCC来源的外泌体的miR92a-3p通过抑制PTEN和激活Akt/Snail信号通路介导EMT促进HCC的转移。这些线索提示基于外泌体蛋白组学的研究对于揭示HCC的进展具有重要的意义。

最后，通过三组差异表达蛋白质的重叠分析，发现有10个共有的差异表达蛋白质(P<0.05、倍数变化>2或<0.5)(图5中A、B)，其中VCAM1蛋白与HC组相比，在HCC组、LC组、CHB组中表达水平明显递增(图5中C)，提示其可能具有作为肝细胞癌诊断标志物的潜在价值。

实施例4、检测血浆外泌体中VCAM1蛋白水平的ELISA方法的建立和评估

为了评估血浆外泌体中的VCAM1蛋白作为候选肝细胞癌标志物的诊断价值，首先招募了独立的肝细胞癌验证人群(表2)，包括22例HCC患者、22例LC患者、22例CHB患者和22例HC个体。

表2验证队列的临床特征

注：TNM，Tumor-Node-Metastasis(肿瘤-淋巴结-转移)；HBsAg，Hepatitis Bvirus surface antigen(乙型肝炎病毒表面抗原)；AFP，Alpha-fetoprotein(甲胎蛋白)；HCC，Hepatocellular carcinoma(肝细胞肝细胞癌)；LC，Live cirrhosis(肝硬化)；CHB，Chronic hepatitis B(慢性乙型肝炎)；HC，Healthy control(健康对照)。

已有研究报道VCAM1是一个细胞膜定位的蛋白质。因此，为了评估ELISA作为检测血浆外泌体中VCAM1蛋白表达水平方法的可行性，通过免疫荧光(Immunofluorescence，IF)实验鉴定其在外泌体上的定位。结果显示，在没有破外泌体膜的情况下，采用VCAM1抗体标记的VCAM1蛋白在外泌体膜上有较高的丰度(图6中A)，提示可通过ELISA方法检测其表达水平。随后，建立了基于ELISA的VCAM1蛋白检测方法，并对其检测能力和适用范围进行了系统的评估(图6中B)。首先，分别采用外泌体特异性蛋白质标志物CD63的抗体作为捕获抗体，VCAM1的抗体作为检测抗体建立了ELISA方法1(图6中B)。我们分别评估了其在同体积血浆提纯的外泌体及同体积血浆中的检测能力。结果显示，ELISA方法1在血浆提纯的外泌体中的标准曲线的R²值达到了0.985(图6中C)；在血浆中直接检测的标准曲线的R²值也达到了0.984(图6中D)。更重要的是，通过上述两种检测策略得到的结果呈显著的正相关性(R＝0.999，P<0.001；图6中E)，并且通过血浆提纯的外泌体的浓度梯度对应的OD值(450nm)与血浆样本的浓度梯度对应的的OD值(450nm)相差不超过0.03，表明ELISA方法1可直接从血浆样本中检测外泌体蛋白，而不必从预先提纯的外泌体中检测。

为了排除血浆中游离的非外泌体中的VCAM1蛋白的干扰，将捕获抗体换成VCAM1的抗体而建立了ELISA方法2(图6中B)。结果显示，此方法在VCAM1蛋白标准品的浓度梯度实验中呈现较高的特异性(R²＝0.999；图6中F)。随后在验证人群中随机选取8例HCC患者和8例HC个体，同时采用ELISA方法1和ELISA方法2检测血浆中VCAM1蛋白的表达水平。采用ELISA方法1检测的结果显示，血浆外泌体中VCAM1蛋白的表达水平在HCC组中显著高于HC组(图6中G)；而采用ELISA方法2检测的结果显示血浆VCAM1蛋白的表达水平在HCC和HC样本间无统计学差异(图6中H)。上述结果不仅初步证实ELISA方法可以用于血浆外泌体蛋白质的定量检测，还提示血浆外泌体中的VCAM1蛋白可能作为潜在的肝细胞癌诊断标志物。

实施例5、血浆外泌体中VCAM1蛋白用于肝细胞癌诊断价值的评估

受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)反映了灵敏度与特异度间的平衡，ROC曲线下面积是重要的试验准确度指标，ROC曲线下面积越大，试验的诊断价值越大。

灵敏度(真阳性率)：实际为HCC患者而按实验标准被正确判断为HCC患者的百分率，灵敏度越大越好，理想灵敏度为100％。

特异度(真阴性率)：实际为非HCC患者而按实验标准被正确判断为非HCC患者的百分率，特异度越大越好，理想特异度为100％。

为了进一步评估血浆外泌体中VCAM1蛋白的肝细胞癌诊断价值，采用建立的ELISA方法1在验证人群样本(表2中的肝细胞癌验证人群，包括22例HCC患者、22例LC患者、22例CHB患者和22例HC个体)中检测血浆外泌体中VCAM1蛋白的表达水平。同时，采用ELISA方法(酶联免疫吸附试剂盒，Abnova公司产品，货号：KA0202)平行检测了血浆AFP的表达水平。结果显示，HCC组血浆外泌体中VCAM1蛋白的表达水平显著高于LC、CHB和HC组(P<0.05；图7中A)；同时，血浆AFP在HCC组中的表达水平也显著高于LC、CHB和HC组(P<0.05；图7中B)。

通过构建ROC曲线，进一步评估了血浆外泌体中的VCAM1蛋白和血浆AFP鉴别HCC患者和对照个体(LC患者、CHB患者和HC个体)的能力。结果显示，血浆外泌体中的VCAM1蛋白单独鉴别HCC的AUC为0.944，最佳截断点为16.591ng/mL，灵敏度和特异度分别为0.864和0.985；血浆AFP单独鉴别HCC的AUC为0.885，最佳截断点为4.923ng/mL，灵敏度和特异度分别为0.955和0.742。上述结果初步提示血浆外泌体中的VCAM1蛋白具有较高的特异度，而血浆AFP具有较高的灵敏度，两者具有明显的互补性。当血浆AFP和血浆外泌体中的VCAM1联合时，鉴别HCC的AUC达到了0.979，敏感度提升至0.955，特异度为0.924，均高于两者单独时的诊断能力。以上结果提示，血浆外泌体中的VCAM1蛋白可以作为HCC诊断的候选血浆标志物，并且，其与AFP联合使用时可能具有更高的诊断价值(表3，图7中C)。

表3：血浆AFP、血浆外泌体中的VCAM1单独检测及联合检测对HCC的诊断能力

注：AFP，Alpha-fetoprotein(甲胎蛋白)；HCC，Hepatocellular carcinoma(肝细胞癌)；AUC，Area under the curve(ROC曲线下面积)；CI，Confidence interval(置信区间)。

同理，基于本发明的标志物组合，进一步开发出的检测试剂、检测试剂盒也对对临床症状轻微不易被检出的肝细胞癌有较准确的提示作用，具有极高的医疗与实用价值。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.生物标志物和/或检测所述生物标志物的物质的下述任一种应用：

A1)在肝细胞癌诊断或制备用于肝细胞癌诊断的产品中的应用；

A2)在肝细胞癌筛查或制备用于肝细胞癌筛查的产品中的应用；

A3)在评估肝细胞癌风险或制备用于评估肝细胞癌风险的产品中的应用；

A4)在肝细胞癌预后评估或制备用于肝细胞癌预后评估的产品中的应用；

A5)在鉴别区分肝细胞癌和肝硬化或制备鉴别区分肝细胞癌和肝硬化的产品中的应用；

A6)在鉴别区分肝细胞癌和慢性乙型肝炎或制备鉴别区分肝细胞癌和慢性乙型肝炎的产品中的应用；

所述生物标志物为下述任一种：

B1)血浆外泌体中的VCAM1蛋白和血浆中的AFP；

B2)血浆外泌体中的VCAM1蛋白。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述物质为用于检测VCAM1蛋白含量的试剂和用于检测AFP含量的试剂；或所述物质为用于检测VCAM1蛋白含量的试剂。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述检测所述生物标志物的物质包括通过酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、放射免疫测定法、免疫共沉淀法、免疫印迹法、高效液相色谱法、毛细管凝胶电泳法、近红外光谱法、质谱法、免疫化学发光法、胶体金免疫技术、荧光免疫层析技术、表面等离子共振技术、免疫-PCR技术或生物素-亲和素技术检测所述生物标志物的物质。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述用于检测VCAM1蛋白含量的试剂包括VCAM1蛋白和结合VCAM1蛋白的抗体；所述用于检测AFP含量的试剂包括AFP和结合AFP的抗体。

5.组合物，所述组合物含有权利要求2或4中所述的用于检测VCAM1蛋白含量的试剂和用于检测AFP含量的试剂，所述组合物具有下述至少一种用途：

U1)肝细胞癌诊断或制备用于肝细胞癌诊断的产品；

U2)肝细胞癌筛查或制备用于肝细胞癌筛查的产品；

U3)评估肝细胞癌风险或制备用于评估肝细胞癌风险的产品；

U4)肝细胞癌预后评估或制备用于肝细胞癌预后评估的产品；

U5)鉴别区分肝细胞癌和肝硬化或制备鉴别区分肝细胞癌和肝硬化的产品；

U6)鉴别区分肝细胞癌和慢性乙型肝炎或制备鉴别区分肝细胞癌和慢性乙型肝炎的产品。

6.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求5所述的组合物或权利要求2或4中所述用于检测VCAM1蛋白含量的试剂，所述试剂盒具有下述至少一种用途：

F1)肝细胞癌诊断或制备用于肝细胞癌诊断的产品；

F2)肝细胞癌筛查或制备用于肝细胞癌筛查的产品；

F3)评估肝细胞癌风险或制备用于评估肝细胞癌风险的产品；

F4)肝细胞癌预后评估或制备用于肝细胞癌预后评估的产品；

F5)鉴别区分肝细胞癌和肝硬化或制备鉴别区分肝细胞癌和肝硬化的产品；

F6)鉴别区分肝细胞癌和慢性乙型肝炎或制备鉴别区分肝细胞癌和慢性乙型肝炎的产品。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为血浆。

8.权利要求6所述试剂盒的下述任一种应用：

C1)在肝细胞癌诊断或制备用于肝细胞癌诊断的产品中的应用；

C2)在肝细胞癌筛查或制备用于肝细胞癌筛查的产品中的应用；

C3)在评估肝细胞癌风险或制备用于评估肝细胞癌风险的产品中的应用；

C4)在肝细胞癌预后评估或制备用于肝细胞癌预后评估的产品中的应用；

C5)在鉴别区分肝细胞癌和肝硬化或制备鉴别区分肝细胞癌和肝硬化的产品中的应用；

C6)在鉴别区分肝细胞癌和慢性乙型肝炎或制备鉴别区分肝细胞癌和慢性乙型肝炎的产品中的应用。

9.权利要求1中所述生物标志物作为靶点在制备治疗或预防肝细胞癌的药物中的应用。

10.筛查或辅助诊断肝细胞癌的方法，其特征在于，所述方法为下述任一种：

D1)所述方法包括利用权利要求5所述的组合物检测待测患者血浆中的VCAM1蛋白含量和AFP含量，根据VCAM1蛋白含量和AFP含量确定待测患者是否为肝细胞癌患者；

D2)所述方法包括利用权利要求2或4中所述用于检测VCAM1蛋白含量的试剂检测待测患者血浆中的VCAM1蛋白含量，根据VCAM1蛋白含量确定待测患者是否为肝细胞癌患者。

Images