CN107064524A - Igkc、c9、ahsg和kng1在区分结核性胸腔积液和恶性胸腔积液中的应用 - Google Patents

Igkc、c9、ahsg和kng1在区分结核性胸腔积液和恶性胸腔积液中的应用 Download PDF

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CN107064524A CN201710438798.1A CN201710438798A CN107064524A CN 107064524 A CN107064524 A CN 107064524A CN 201710438798 A CN201710438798 A CN 201710438798A CN 107064524 A CN107064524 A CN 107064524A
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张宗德
李琦
张霞
贾红彦
孙会姗
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Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute
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Abstract

本发明公开了IGKC、C9、AHSG和KNG1在区分结核性胸腔积液和恶性胸腔积液中的应用。本发明公开的检测IGKC、C9、AHSG和KNG1含量的系统包括通过酶联免疫反应或液相色谱‑电喷雾电离串联质谱检测IGKC含量的系统、检测C9含量的系统、检测AHSG含量的系统和检测KNG1含量的系统。利用本发明的检测IGKC、C9、AHSG和KNG1含量的系统区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者的准确性为97.5％；筛查恶性胸腔积液患者的灵敏度为100％，特异度为96％；筛查结核性胸腔积液患者的灵敏度为96％，特异度为100％。

Description

IGKC、C9、AHSG和KNG1在区分结核性胸腔积液和恶性胸腔积液 中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，IGKC、C9、AHSG和KNG1在区分结核性胸腔积液和恶性胸腔积液中的应用。
背景技术
正常人胸腔内约有5-15ml液体将两层胸膜分开，在呼吸运动时起润滑作用。胸腔液体量并非固定不变，正常人每24小时亦有500-1000ml的液体渗出与再吸收，两者处于平衡状态。任何原因造成其渗出增多和(或)再吸收减少，出现胸膜腔内液体增多时则产生胸腔积液。胸腔积液常见为结核性胸腔积液和恶性胸腔积液。结核性胸腔积液由结核性胸膜炎导致，结核性胸膜炎由结核分枝杆菌导致，结核性胸膜炎是临床上常见的肺外结核病，发病率较高，但由于诊断技术限制，确诊比例非常低。恶性胸腔积液由恶性胸膜疾病导致，恶性胸膜疾病包括原发性恶性胸膜肿瘤以及其他部位恶性肿瘤的胸膜转移，大约50％转移性肿瘤患者在疾病过程中会出现胸腔积液。结核性胸腔积液与恶性胸腔积液的预后和治疗完全不同，若得不到及时的诊断治疗，将直接影响预后，但目前鉴别这两种胸腔积液仍然是临床的一大难题。
结核性胸膜炎的确诊依据之一是在胸腔积液中找到结核分枝杆菌，但目前在胸腔积液涂片找到抗酸杆菌的灵敏度极低(0％-1％)，胸腔积液培养结核分枝杆菌灵敏度在11％-50％，而且需要2-4周的培养时间；另一种方法是胸膜组织活检发现结核性肉芽肿、干酪性坏死或有抗酸杆菌存在，但此项检查创伤较大，手术风险较高。胸腔积液细胞学检查对恶性胸腔积液的诊断具有重要的意义，胸腔积液中查到癌细胞或取得组织学诊断乃是恶性胸腔积液的金标准，但常规的细胞学检查阳性率较低(30％-60％)，尤其是较早期异形性不太明显的癌细胞与间皮细胞几乎无法区别，以至造成诊断结果中存在着相当数量的假阴性。胸腔镜检查对恶性胸腔积液的诊断具有较高的价值，但因费用昂贵，操作难度大且有一定的手术风险，患者较难接受。传统的生化免疫学检查如纤维连接蛋白、腺苷脱氨酶、铁蛋白、溶菌酶以及胸腔积液血清白蛋白比值检测，有利于胸腔积液的诊断，但敏感性和特异性均不令人满意。近年来，一些先进的分子生物学技术应用于胸腔积液的检测，如核酸扩增检测技术在结核病领域的发展比较快，但其诊断结核性胸腔积液的阳性率并非如人们所预料的那样高，依然存在假阳性和假阴性问题，而且实验条件要求高，目前难以推广。因此，开发一种新的快速的早期诊断方法或技术，对于诊断和鉴别诊断结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病，减少医疗资源消耗，将有重要意义。
胸腔积液中蛋白质组组成成分、表达水平和疾病有密切联系，用蛋白质组学方法分析动态变化的蛋白质组，对鉴别诊断结核行胸膜炎和恶性胸膜疾病有重要意义。Lablefree 2D-LC-MSMS将非同位素标记技术、二维液相色谱串联质谱技术相联用，信号离子表现为不同质荷比的峰，根据波峰的高度及面积可得到准确的蛋白质定量信息。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者。
本发明首先提供了检测IGKC、C9、AHSG和KNG1含量的系统在制备区分或辅助区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者产品中的应用。
上述应用中，所述检测IGKC、C9、AHSG和KNG1含量的系统可包括检测IGKC含量的系统、检测C9含量的系统、检测AHSG含量的系统和检测KNG1含量的系统。
上述应用中，所述检测IGKC含量的系统可为下述a1)或a2)：
a1)通过酶联免疫反应检测IGKC含量所需的试剂和/或仪器；
a2)利用液相色谱-电喷雾电离串联质谱检测蛋白质含量所需的试剂和/或仪器；
所述检测C9含量的系统可为下述b1)或b2)：
b1)通过酶联免疫反应检测C9含量所需的试剂和/或仪器；
b2)利用液相色谱-电喷雾电离串联质谱检测蛋白质含量所需的试剂和/或仪器；
所述检测AHSG含量的系统可为下述c1)或c2)：
c1)通过酶联免疫反应检测AHSG含量所需的试剂和/或仪器；
c2)利用液相色谱-电喷雾电离串联质谱检测蛋白质含量所需的试剂和/或仪器；
所述检测KNG1含量的系统可为下述d1)或d2)：
d1)通过酶联免疫反应检测KNG1含量所需的试剂和/或仪器；
d2)利用液相色谱-电喷雾电离串联质谱检测蛋白质含量所需的试剂和/或仪器。
上述应用中，a1)所述通过酶联免疫反应检测IGKC含量所需的试剂可包括IGKC和/或IGKC的抗体；
b1)所述通过酶联免疫反应检测C9含量所需的试剂可包括C9和/或C9的抗体；
c1)所述通过酶联免疫反应检测AHSG含量所需的试剂可包括AHSG和/或AHSG的抗体；
d1)所述通过酶联免疫反应检测KNG1含量所需的试剂可包括KNG1和/或KNG1的抗体。
上述应用中，a1)可仅为IGKC和/或IGKC的抗体，也可仅为检测IGKC含量的酶联免疫反应试剂盒，也可由IGKC和/或IGKC的抗体或所述试剂盒与所述数据处理系统组成；
b1)可仅为C9和/或C9的抗体，也可仅为检测C9含量的酶联免疫反应试剂盒，也可由C9和/或C9的抗体或所述试剂盒与所述数据处理系统组成；
c1)可仅为AHSG和/或AHSG的抗体，也可仅为检测AHSG含量的酶联免疫反应试剂盒，也可由AHSG和/或AHSG的抗体或所述试剂盒与所述数据处理系统组成；
d1)可仅为KNG1和/或KNG1的抗体，也可仅为检测KNG1含量的酶联免疫反应试剂盒，也可由KNG1和/或KNG1的抗体或所述试剂盒与所述数据处理系统组成。
a1)、b1)、c1)和d1)中所述试剂盒均可为英国Abcam公司的酶联免疫反应(ELISA)试剂盒，a1)中所述试剂盒的货号可为cat#ab157709；b1)中所述试剂盒的货号可为cat#ab137972；c1)中所述试剂盒的货号可为cat#ab108875；d1)中所述试剂盒的货号可为cat#ab108855。
所述检测IGKC、C9、AHSG和KNG1含量的系统还可包括M1，M1为进行蛋白质的提取、蛋白质的定量和/或蛋白质的酶解所需的试剂和/或仪器。
上述应用中，所述检测IGKC、C9、AHSG和KNG1含量的系统还可包括数据处理系统，所述数据处理系统用于根据待测对象的IGKC、C9、AHSG和KNG1含量确定所述待测对象是结核性胸腔积液患者还是恶性胸腔积液患者；所述待测对象为胸腔积液患者。
具体来说，所述检测IGKC、C9、AHSG和KNG1含量的系统可仅由所述检测IGKC含量的系统、所述检测C9含量的系统、所述检测AHSG含量的系统和所述检测KNG1含量的系统组成，还可由所述检测IGKC含量的系统、所述检测C9含量的系统、所述检测AHSG含量的系统和所述检测KNG1含量的系统以及所述M1组成，也可由所述检测IGKC含量的系统、所述检测C9含量的系统、所述检测AHSG含量的系统和所述检测KNG1含量的系统以及所述M1与所述数据处理系统组成。
上述应用中，a2)、b2)、c2)和d2)的所述数据处理系统可包括依据液相色谱-电喷雾电离串联质谱的检测结果确定IGKC、C9、AHSG和KNG1蛋白质含量的功能。所述数据处理系统可为进行数据分析所需的软件或模块，如提取一级质谱定量信息的软件或模块、进行蛋白质定量的软件或模块或进行数据检索和整合的软件或模块。所述提取一级质谱定量信息的软件或模块可为Trans-Proteomic Pipeline软件，所述进行蛋白质定量的软件或模块可为ProfileAnalysis2.0软件，所述进行数据检索和整合的软件或模块可为ProteinScape2.1软件。
所述数据处理系统可为利用CART算法(请核实)进行数据处理的数据处理系统。
所述IGKC、C9、AHSG和KNG1含量均可为胸腔积液中IGKC、C9、AHSG和KNG1的含量。
本发明还提供了以IGKC、C9、AHSG和KNG1作为标志物的区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者的系统在下述X1或X2中的应用：
X1、制备区分或辅助区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者产品；
X2、区分或辅助区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者。
上述应用中，所述区分或辅助区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者的系统可为所述检测IGKC、C9、AHSG和KNG1含量的系统。
本发明还提供了IGKC、C9、AHSG和KNG1作为区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者的标志物在区分或辅助区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者中的应用。
本发明还提供了区分或辅助区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者的产品，所述产品为所述检测IGKC、C9、AHSG和KNG1含量的系统。
本发明还提供了非诊断目的的区分或辅助区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者的方法，所述方法包括检测待测胸腔积液患者的IGKC、C9、AHSG和KNG1的含量，根据待测胸腔积液患者的IGKC、C9、AHSG和KNG1的含量确定待测胸腔积液患者是结核性胸腔积液患者还是恶性胸腔积液患者，具体如下：
A、在IGKC的含量<7.143mg/ml时，根据A1)和A2)区分两种患者：
A1)C9的含量≥134.727μg/mL，所述待测胸腔积液患者为或候选为结核性胸腔积液患者；
A2)C9的含量<134.727μg/mL，根据A11)和A12)区分两种患者：
A11)AHSG的含量<114.061μg/mL，所述待测胸腔积液患者为或候选为恶性胸腔积液患者；
A12)AHSG的含量≥114.061μg/mL，所述待测胸腔积液患者为或候选为结核性胸腔积液患者；
B、在IGKC的含量≥7.143mg/ml时，根据B1)和B2)区分两种患者：
B1)KNG1的含量≥64186.1μg/mL，所述待测胸腔积液患者为或候选为恶性胸腔积液患者；
B2)KNG1的含量<64186.1μg/mL，根据B21)和B22)区分两种患者：
B21)C9的含量<2.0613μg/mL，所述待测胸腔积液患者为或候选为恶性胸腔积液患者；
B22)C9的含量≥2.0613μg/mL，根据B221)和B222)区分两种患者：
B221)AHSG的含量<68.698μg/mL，所述待测胸腔积液患者为或候选为恶性胸腔积液患者；
B222)AHSG的含量≥68.698μg/mL，所述待测胸腔积液患者为或候选为结核性胸腔积液患者。
本发明中，IGKC为免疫球蛋白κ链C蛋白(immunoglobulin kappa constantIGKC)；C9为补体C9(complement component 9)；KNG1为激肽原-1(kininogen 1)蛋白；AHSG为α2-HS-糖蛋白(alpha-2-HS-glycoprotein)。
本发明中，所述IGKC、C9、AHSG和KNG1含量均可为胸腔积液中IGKC、C9、AHSG和KNG1的含量。
本发明中，所述结核性胸腔积液患者可符合以下第①～③项以及第④～⑥项这三项中的至少一项：①临床有低热、盗汗、消瘦、胸痛、干咳等临床症状；②胸腔积液符合渗出液改变，胸腔积液细胞成份以淋巴细胞和单核细胞为主，胸腔积液腺苷脱氨酶(ADA)大于45U/L；③经抗结核治疗后胸腔积液吸收，临床症状缓解，并除外合并有其它细菌感染等其它原因所致胸腔积液；④胸腔积液结核分枝杆菌培养阳性；⑤胸膜活组织检查病理有典型的结核病变；⑥合并有肺结核，痰结核分枝杆菌培养或集菌阳性。
所述恶性胸腔积液患者可符合以下条件：胸腔积液脱落细胞学检查找到恶性肿瘤细胞或胸膜活检确诊胸膜组织中存在肿瘤细胞，并除外合并有细菌和结核感染等其它原因所致胸腔积液。
所述结核性胸腔积液患者和所述恶性胸腔积液患者均可无以下任意一项特征：①患者在入院前的既往3个月内，曾接受任何关于有创性胸膜腔检查和(或)治疗，或者罹患有胸部外伤者；②患者曾接受过抗肿瘤治疗，或患者曾接受抗结核治疗超过2周。患者使用过糖皮质激素、非甾体抗炎药，或免疫抑制剂者；③患者还合并有其他免疫因素性疾病；④患者胸腔积液的病因诊断不清楚者；⑤合并肝脏、肾脏等影响蛋白质的疾病。
所述结核性胸腔积液患者和所述恶性胸腔积液患者均可大于等于18岁和/或HIV阴性。
利用本发明的检测IGKC、C9、AHSG和KNG1含量的系统区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者的准确性为97.5％；筛查恶性胸腔积液患者的灵敏度为100％，特异度为96％；筛查结核性胸腔积液患者的灵敏度为96％，特异度为100％。表明，可利用本发明的检测IGKC、C9、AHSG和KNG1含量的系统区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者。
附图说明
图1为标准曲线。
图2为四种蛋白质通过ELISA验证在结核性胸腔积液(TB-PE)和恶性胸腔积液(MPE)的变化趋势。
图3为四种蛋白质建立疾病诊断模型。tumor表示恶性胸腔积液患者，
tuberculosis表示结核性胸腔积液患者。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者的差异性蛋白
一、结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者差异性蛋白的发现
1、样本和仪器
5例选自TPE(结核性胸腔积液)患者，另外5例为MPE(恶性胸腔积液)患者，均有实验室及临床诊断报告确定。
结核性胸腔积液患者，入选标准：年龄≥18岁，HIV阴性。具有以下第1～3项合并4～6项中任何一项者可纳入：①临床有低热、盗汗、消瘦、胸痛、干咳等临床症状；②胸腔积液符合渗出液改变，胸腔积液细胞成份以淋巴细胞和单核细胞为主，胸腔积液腺苷脱氨酶(ADA)大于45U/L；③经抗结核治疗后胸腔积液吸收，临床症状缓解，并除外合并有其它细菌感染等其它原因所致胸腔积液；④胸腔积液结核分枝杆菌培养阳性；⑤胸膜活组织检查病理有典型的结核病变；⑥合并有肺结核，痰结核分枝杆菌培养或集菌阳性。
恶性胸腔积液患者，入选标准：年龄≥18岁，HIV阴性。胸腔积液脱落细胞学检查找到恶性肿瘤细胞或胸膜活检确诊胸膜组织中存在肿瘤细胞，并除外合并有细菌和结核感染等其它原因所致胸腔积液。
排除标准：上述结核性胸腔积液患者或者恶性胸腔积液患者，凡是符合以下任意一项者皆排除：①患者在入院前的既往3个月内，曾接受任何关于有创性胸膜腔检查和(或)治疗，或者罹患有胸部外伤者；②患者曾接受过抗肿瘤治疗，或患者曾接受抗结核治疗超过2周。患者使用过糖皮质激素、非甾体抗炎药，或免疫抑制剂者；③患者还合并有其他免疫因素性疾病；④患者胸腔积液的病因诊断不清楚者；⑤合并肝脏、肾脏等影响蛋白质的疾病。
所有的患者胸水(即胸腔积液)样本均在清晨空腹下抽取，分离胸腔积液后储存在-80低温冰箱中。
采用Lablefree 2D-LC-MSMS检测蛋白质含量，实验用仪器是液相色谱-电喷雾电离串联质谱(Q-Exactive Thermo Finnigan)，电泳仪(Bio-rad,美国)，MultiSkans酶标仪(Thermo,美国)，白蛋白/IgG去除试剂盒为德国Merck公司产品。
2、蛋白质提取
采用默克(Merck)公司的ProteoExtract Albumin/IgG Removal Kit去除样本中的高丰度蛋白(白蛋白/IgG)。去高速离心后的胸腔积液样本50μL，在冰上按使用说明书操作处理，处理后的样本体积1800μL。
由于样本经过去除高丰度蛋白处理后，浓度被稀释了300倍，因此需要对样本进行浓缩处理。1800μL处理后的样本加入8mL-20℃预冷丙酮，沉淀过夜。6000g离心后，弃去上清，晾干丙酮后，用100μL溶解液(7M尿素和2M硫脲)溶解沉淀。溶解后的样本4℃下40000g离心30min，作为待测样本，待用。
3、蛋白质定量
采用Thermo Scientific Pierce BCA蛋白定量分析试剂盒，货号：NCI3225CH。
A.方法
(1)开分光光度计预热20min，选择“光度测量”，调节λ＝595nm。
(2)用CK(2μL裂解缓冲液+18μL ddH2O+1mL Bradford)进行调零三次。(要点：第一次按“Zero”即可，观察第二、三次的OD值，如果都很小且相差不大即可。调零完毕后，显示“-0.301Abs”。)
(3)配置表1中的各牛血清标准蛋白溶液并测定OD595值，绘制标准曲线。
(4)测B2(2μL BSA+18μL ddH2O+1ml Bradford)、B5(5μL BSA+15μL ddH2O+1mlBradford)、B8(8μL BSA+12μL ddH2O+1ml Bradford)各三管，用于确定校正系数，校正蛋白浓度。其中，标准曲线计算方法为：在excel表格中，一列蛋白质浓度，一列对应OD值，插入图标，选择折线图，选项中选择显示R值和公式。
注：BSA表示牛血清标准蛋白溶液；要点：所有管加好BSA和ddH2O后，加一管Bradford，测一管；动作要领“三摇一拍”；读值为放入比色皿1s后的第一个值；如有数值异常可舍弃读值或多做一次重复。
(5)测待测样本蛋白OD595值。操作同上。将OD595值代入标准曲线方程，得到蛋白浓度测定值，进而计算实际蛋白浓度，实际蛋白浓度＝蛋白浓度测定值×校正系数。
表1、牛血清标准蛋白溶液的设置及OD595值测定结果
B.结果
根据表1测定结果，得到标准曲线方程为y＝0.038x+0.029，R2＝0.989。其中，x为OD595，y为蛋白浓度。具体见图1。
根据上述步骤(4)计算得到校正系数为0.989。
4、胰蛋白酶解样本
(1)蛋白质定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中，用8M尿素溶液将体系定至125μl；
(2)加入现配的5μl 1M DTT溶液至体系中，混匀后，37℃孵育1h；
(3)加入现配的20μl 1M IAA溶液至体系中，混匀后，避光，室温(25℃)反应1h；
(4)吸取所有样品加入到10kD超滤管中，12000rpm(不超过14000g)离心20min，弃掉收集管底部溶液；
(5)加入100μl尿素溶液(8M)至超滤管中，12000rpm离心10min，重复2次。
(6)在超滤管中加入胰蛋白酶(100U/μg)2-4μg(与蛋白质量比1:50-100)，体积50μl，37℃反应过夜20h；次日，12000rpm离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部。
5、液相分级以及蛋白质质谱检测
取酶解产物，按照定量结果取10μg进行LCMSMS分析。采用纳升流速HPLC液相系统EASY-nLC1000进行分离。液相A液为含有2％(体积分数)乙腈和0.1％(体积分数)甲酸的水溶液(即以100ml计算组成如下：2ml乙腈，0.1ml甲酸，余量为水)，B液为含有84％(体积分数)乙腈和0.1％(体积分数)甲酸的水溶液(即以100ml计算组成如下：84ml乙腈，0.1ml甲酸，余量为水)。色谱柱Thermo EASY column SC200 150μm×100mm(RP-C18)以100％的A液平衡。样品由自动进样器上样到Thermo EASY column SC001traps 150μm×20mm(RP-C18)(Thermo)，再经色谱柱分离，流速为400nl/min。相关液相梯度如下：0min-100min，B液线性梯度从0％到45％(体积百分比含量，下同)；100min-108min，B液线性梯度从45％到100％；108min-120min，B液维持在100％。酶解产物经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪(Thermo Finnigan)进行质谱分析。分析时长：120min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300-1800m/z，多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描(fullscan)后采集10个碎片图谱(MS2scan，HCD)。MS1在M/Z 200时分辨率为70000，MS2在M/Z 200时分辨率为17500。
6、质谱鉴定
先利用Trans-Proteomic Pipeline软件提取一级质谱定量信息(采用软件默认参数)，利用ProfileAnalysis2.0软件进行定量(采用软件默认参数)。然后利用ProteinScape2.1软件进行数据检索和整合，具体如下：
以Peptide FDR≤0.05对数据进行筛选过滤。导入Maxquant软件(属于ProteinScape2.1软件的一部分)进行Label-free分析。主要参数如下：
Main search ppm：6Missed cleavage：2
MS/MS tolerance ppm：20De-Isotopic：TRUE
enzyme：Trypsin database：ipi.human.3.87.fasta
Fixed modification：Carbamidomethyl(C)
Variable modification：Oxidation(M)，Acetyl(Protein N-term)
Decoy database pattern：reverse
Lable free quantification(LFQ)：TRUE
LFQ min ratio count：2
Match between runs：2min
Peptide FDR：0.05
Protein FDR：0.05
筛选出4个fold change(比值)＞1.5或者<0.6的差异蛋白，从而获得区分TPE(结核性胸腔积液)和MPE(恶性胸腔积液)患者蛋白特征谱。其中，比值＞1.5的蛋白为表达上调的蛋白，比值<0.6的蛋白为表达下调的蛋白，所述比值为所述TPE(结核性胸腔积液)患者的相应蛋白的平均表达量与所述MPE(恶性胸腔积液)患者的对应蛋白的平均表达量的比值。
最终所得区分TPE患者和MPE患者蛋白特征谱中含有表达差异的4种蛋白质，TPE患者和MPE患者比较存在差异的蛋白质包括表达上调的蛋白质和表达下调的蛋白质；所述表达上调的蛋白质为IGKC、C9和AHSG；所述表达下调的蛋白质为KNG1。
免疫球蛋白κ链C蛋白(immunoglobulin kappa constant,IGKC)，是免疫球蛋白分泌片段，参与机体的免疫应答反应。
补体C9(complement component 9，C9)，属于补体家族的一员，是存在于人和脊椎动物血清与组织液中的一种具有酶活性的蛋白质，是机体的重要防御因子。
激肽原-1(kininogen 1,KNG1)蛋白，由KNG1基因编码，属于激肽释放酶激肽系统。
α2-HS-糖蛋白(alpha-2-HS-glycoprotein,AHSG)，又称胎球蛋白A，是一种血清和组织蛋白，主要由肝脏分泌，是近年来发现的主要系统性钙化抑制物，与鼠PP63同源，属于半胱氨酸蛋白酶抑制因子超家族成员之一，是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
二、ELISA验证IGKC、C9、KNG1、AHSG蛋白在结核性胸腔积液和恶性胸腔积液中的差异
待测对象：50例TPE(结核性胸腔积液)患者，均符合步骤一结核性胸腔积液的条件；30例MPE(恶性胸腔积液)患者，均符合步骤一恶性胸腔积液的条件。
取各患者的胸水(胸腔积液)，利用ELISA方法检测IGKC、C9、KNG1、AHSG蛋白的含量，检测IGKC、C9、KNG1、AHSG蛋白所使用的试剂盒分别为英国Abcam公司的ELISA试剂盒，检测IGKC的试剂盒的货号为cat#ab157709，该试剂盒中含有作为标准品的IGKC和IGKC抗体；检测C9的试剂盒的货号为cat#ab137972，该试剂盒中含有作为标准品的C9和C9抗体；检测KNG1的试剂盒的货号为cat#ab108875，该试剂盒中含有作为标准品的KNG1和KNG1抗体；检测AHSG的试剂盒的货号为cat#ab108855，该试剂盒中含有作为标准品的AHSG和AHSG抗体。所用仪器为Thermo Multiskan MK3。具体步骤如下：
1.加样：分别设标准孔、待测样本孔、空白孔。设标准孔7孔，依次加入100μl不同浓度的标准品，空白孔加100μl稀释液，余孔加待测样本100μl，酶标板加上覆膜，37℃温育2小时。
2.弃去液体，甩干，不用洗涤。
3.每孔加检测溶液A工作液100μl，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。
4.弃去孔内液体，每孔加350μl洗涤液洗涤，浸泡2min，甩掉酶标板内的液体，在试验台上铺几层吸水纸，酶标板朝下用力拍打，重复洗板3次，最后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液完全甩干。
5.每孔加检测溶液B工作液100μl，加上覆膜，37℃温育30min。
6.弃去孔内溶液，甩干，洗板5次，方法同步骤4。
7.每孔加底物溶液90μl，加上覆膜，37℃避光显色(反应时间控制在25min内)。
8.每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色变黄色，终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不均一，轻晃酶标板使溶液混合均匀。
9.在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。
结果如图2与表2所示。
表2、四种蛋白在结核性胸腔积液和恶性胸腔积液中的含量的ELISA结果
结果显示，IGKC、C9、AHSG蛋白在结核性胸腔积液中的含量显著高于相应蛋白在恶性胸腔积液的含量；KNG1蛋白在结核性胸腔积液中的含量显著低于相应蛋白在恶性胸腔积液的含量。
利用CART决策树分析建立根据待测对象胸水样本中IGKC、C9、AHSG和KNG1的含量区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者的模型，待测对象为胸腔积液患者，该模型如下：
A、在IGKC的含量<7.143mg/ml时，根据A1)和A2)确定两种患者：
A1)C9的含量≥134.727μg/mL，待测对象为结核性胸腔积液患者；
A2)C9的含量<134.727μg/mL，根据A11)和A12)确定两种患者：
A11)AHSG的含量<114.061μg/mL，待测对象为恶性胸腔积液患者；
A12)AHSG的含量≥114.061μg/mL，待测对象为结核性胸腔积液患者；
B、在IGKC的含量≥7.143mg/ml时，根据B1)和B2)确定两种患者：
B1)KNG1的含量≥64186.1μg/mL，待测对象为恶性胸腔积液患者；
B2)KNG1的含量<64186.1μg/mL，根据B21)和B22)确定两种患者：
B21)C9的含量<2.0613μg/mL，待测对象为恶性胸腔积液患者；
B22)C9的含量≥2.0613μg/mL，根据B221)和B222)确定两种患者：
B221)AHSG的含量<68.698μg/mL，待测对象为恶性胸腔积液患者；
B222)AHSG的含量≥68.698μg/mL，待测对象为结核性胸腔积液患者。
利用该模型区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者的结果如图3所示，正确筛查恶性胸腔积液患者30例(22例+5例+1例+2例)活动性结核病患者与48例(1例+2例+45例)结核性胸腔积液患者，准确性为(30+48)/(30+50)×100％＝97.5％；筛查恶性胸腔积液患者的灵敏度为30/30×100％＝100％，特异度为48/50×100％＝96％；筛查结核性胸腔积液患者的灵敏度为48/50×100％＝96％，特异度为30/30×100％＝100％。

Claims (10)

1.检测IGKC、C9、AHSG和KNG1含量的系统在制备区分或辅助区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测IGKC、C9、AHSG和KNG1含量的系统包括检测IGKC含量的系统、检测C9含量的系统、检测AHSG含量的系统和检测KNG1含量的系统。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述检测IGKC含量的系统为下述a1)或a2)：
a1)通过酶联免疫反应检测IGKC含量所需的试剂和/或仪器；
a2)利用液相色谱-电喷雾电离串联质谱检测蛋白质含量所需的试剂和/或仪器；
所述检测C9含量的系统为下述b1)或b2)：
b1)通过酶联免疫反应检测C9含量所需的试剂和/或仪器；
b2)利用液相色谱-电喷雾电离串联质谱检测蛋白质含量所需的试剂和/或仪器；
所述检测AHSG含量的系统为下述c1)或c2)：
c1)通过酶联免疫反应检测AHSG含量所需的试剂和/或仪器；
c2)利用液相色谱-电喷雾电离串联质谱检测蛋白质含量所需的试剂和/或仪器；
所述检测KNG1含量的系统为下述d1)或d2)：
d1)通过酶联免疫反应检测KNG1含量所需的试剂和/或仪器；
d2)利用液相色谱-电喷雾电离串联质谱检测蛋白质含量所需的试剂和/或仪器。
4.根据权利要求3中所述的应用，其特征在于：
a1)所述通过酶联免疫反应检测IGKC含量所需的试剂包括IGKC和/或IGKC的抗体；
b1)所述通过酶联免疫反应检测C9含量所需的试剂包括C9和/或C9的抗体；
c1)所述通过酶联免疫反应检测AHSG含量所需的试剂包括AHSG和/或AHSG的抗体；
d1)所述通过酶联免疫反应检测KNG1含量所需的试剂包括KNG1和/或KNG1的抗体；
a2)、b2)、c2)和d2)包括进行蛋白质的提取、蛋白质的定量和/或蛋白质的酶解所需的试剂和/或仪器。
5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：所述检测IGKC、C9、AHSG和KNG1含量的系统还包括数据处理系统，所述数据处理系统用于根据待测对象的IGKC、C9、AHSG和KNG1含量确定所述待测对象是结核性胸腔积液患者还是恶性胸腔积液患者；所述待测对象为胸腔积液患者；
和/或，所述IGKC、C9、AHSG和KNG1含量均为胸腔积液中IGKC、C9、AHSG和KNG1的含量。
6.以IGKC、C9、AHSG和KNG1作为标志物的区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者的系统在下述X1或X2中的应用：
X1、制备区分或辅助区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者产品；
X2、区分或辅助区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述区分或辅助区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者的系统为权利要求1-5中任一所述的检测IGKC、C9、AHSG和KNG1含量的系统。
8.IGKC、C9、AHSG和KNG1作为区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者的标志物在区分或辅助区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者中的应用。
9.区分或辅助区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者的产品，为权利要求1-5中任一所述的检测IGKC、C9、AHSG和KNG1含量的系统。
10.区分或辅助区分结核性胸腔积液患者和恶性胸腔积液患者的方法，包括检测待测胸腔积液患者的IGKC、C9、AHSG和KNG1的含量，根据待测胸腔积液患者的IGKC、C9、AHSG和KNG1的含量确定待测胸腔积液患者是结核性胸腔积液患者还是恶性胸腔积液患者。
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