KR100980031B1

KR100980031B1 - 대장암 진단 및 스크리닝용 단백질 마커 및 대장암 진단을 위한 상기 마커의 측정방법

Info

Publication number: KR100980031B1
Application number: KR1020090054033A
Authority: KR
Inventors: 김철우; 박필제; 이경애; 강경남; 신용성; 황대용
Original assignee: 주식회사 바이오인프라
Priority date: 2009-06-17
Filing date: 2009-06-17
Publication date: 2010-09-06
Also published as: KR20090121259A

Abstract

본 발명은 대장암 진단 및 스크리닝용 단백질 마커, 및 대장암 진단을 위한 상기 마커의 측정방법에 관한 것으로, 구체적으로 대장암 환자에게서 특이적으로 발현이 증가 또는 감소하는 단백질 마커를 이용하여 통계학적으로 대장암을 진단 및 스크리닝할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 단백질 마커 및 이들을 이용한 대장암 진단 및 스크리닝용 방법은 대장암 조기 진단 및 스크리닝, 및 대장암 진행 정도 평가를 가능하게 함으로써 신속한 치료가 가능하게 하여 대장암 환자의 생존율을 향상시키고 암 치료로 인한 국가적 손실을 줄이는데 기여할 수 있다.

대장암, 단백질 마커, 진단, 스크리닝, 바이오칩

Description

대장암 진단 및 스크리닝용 단백질 마커 및 대장암 진단을 위한 상기 마커의 측정방법{Protein markers for diagnosis and screening and the method of mesurement thereof for colon cancer diagnosis}

본 발명은 대장암 진단 및 스크리닝용 단백질 마커 및 대장암 진단을 위한 상기 마커의 측정방법에 관한 것이다.

대장암은 결장과 직장에 생기는 악성 종양을 말하며, 세계적으로 2000년 발생률(945,000명 신규 발생, 세계 전체 암의 9.4%)과 사망률(492,000명 사망, 전체 암중 7.9%)이 모든 암 중 세 번째로 높고, 성별로 비교해보면 남자와 여자에게서 비슷한 비율로 발생한다(남:여 1.1:1). 다른 암들에 비해 상대적으로 예후가 좋기 때문에 유병률은 유방암에 이어 세계적으로 두 번째로 높은데, 과거 5년 이내에 대장암으로 진단되어 생존하고 있는 사람이 약 240만 명으로 추정된다(Parkin DM, Global cancer statistics in the year 2000, Lancet Oncol 2:533-543, 2001). 대장암 예후는 초기(1기) 환자의 경우 5년 생존율이 90% 이상인데 반해 전이된(4기) 환자의 5년 생존율은 5%에 불과하다(Cancer Facts and Figures 2004. American Cancer Society, 2004).

우리나라에서는 최근 식생활 문화의 서구화로 대장암의 발생률과 사망률이 현저히 증가하고 있다. 보건복지부와 한국중앙암등록본부에서 발간한 한국중앙암등록사업 연례 보고서(2002.1 ~ 2002. 12)에 따르면 2002년에 대장암 발생건수가 11,097건으로 전체 발생 암의 11.2%를 차지하는 네 번째로 많은 암이다. 성별로는 남성이 6,423명으로 여성(4,674명)보다 많으며 연령별로는 60대가 가장 많고(3,751명), 50대가 그 뒤를 잇고 있다(2,400명). 1999년부터 2002년까지 4년간 자료에 의하면 대장암의 발생률이 꾸준히 증가하고 있으며 조발생률(인구 100,000명당 새로 발생한 암환자수)을 보면 1999년에 비해 2002년에 남자의 경우 22.5에서 30.7로 36.4% 증가하였으며, 여자의 경우 18.8에서 23.1로 22.9% 증가하여 전체적으로 20.6에서 26.9로 30.6%나 크게 증가하였다(1993-2002년 암발생자의 생존율 및 1999-2002년 암 발생률, 보건복지부, 2007. 7.). 2006년에 대장암으로 사망한 사람은 총 6,277명으로 전체 암 사망의 4위(9.5%)이며 남자는 3,453명으로 4위(8.0%), 여자는 2,824명으로 3위(11.5%)를 차지하였다. 또한 대장암은 폐암 다음으로 지난 10년 동안 사망률이 가장 많이 증가한 암이다(2006년 사망 및 사망원인통계결과, 통계청, 2007. 9.).

대장암의 경우 제거할 수 있는 전암성 병변이나 치료할 수 있는 초기단계 암으로부터 발달이 느리기 때문에 대장암 스크리닝은 이 질병의 발생률과 사망률을 줄일 수 있는 가능성이 있다. 50세 이상의 성인 남녀 모두에 대한 대장암 스크리 닝 검사를 통해 대장암으로 인한 사망률을 감소시킬 수 있다고 믿어진다(Walsh JM & Terdiman JP, JAMA 289:1288-96, 2003). 그러나 현재 가장 신뢰성 있는 스크리닝 방법인 대장내시경에 대한 순응도와 보급률이 낮다. 반대로 현재 가장 널리 시행되는 비침입성 스크리닝(noninvasive screening) 옵션인 분변 잠혈검사(fecal occult blood test, FOBT)는 무엇보다 민감도가 낮다는 문제를 포함하여 여러 중요한 한계점들이 있다. 미국의 경우 2002년에 50세 이상 성인 중 40%만 지난 5년 이내에 대장내시경 검사를 받았고, 12개월 이내에 분변 잠혈검사를 받은 사람은 22%에 불과했다(Behavior risk factor survey, National center for chronic disease prevention and health promotion. Centers for disease control and prevention, 2002). 대장암 스크리닝 검사에 대한 참여율이, 특히 유방암과 자궁경부암에 비해 낮은 이유는 환자의 불편함, 비용, 인지도 부족, 현재 스크리닝 방법에 대한 낮은 수용성 등을 포함하는 여러 요인들 때문이다.

혈액 마커의 경우 분변 마커에 비해 검체를 얻기 쉽고 환자도 쉽게 참여할 수 있으며 시료처리가 쉽고 바이오 마커를 분해하거나 분석을 방해할 수 있는 미생물들이 없다는 장점이 있다. 암태아성 항원(Carcinoembryonic antigen; CEA)이 1969년 처음 발견되었을 때 대장암 검출을 위한 민감하고 특이적인 마커라고 생각되었으나(Thomson DM et al., Proc Natl Acad Sci USA 64:161-7, 1969), 계속된 연구에서 원래 결과를 재현할 수 없었다(Duffy MM, Clin Chem 47:624-30, 2001). 현재 이 검사는 대장암의 수술 전 단계나 암 치료의 효과를 검사하기 위해서 또는 대장암과 다른 암의 재발 확인을 위한 검사에서 보조적으로 쓰이고 있다.

상기 언급한 문제점들을 극복하기 위해서는 대장암 조기진단이 가능한 새로운 방법의 개발이 필요한 상황이다. 최근 혈액 마커를 찾기 위해 단백질을 대상으로 하여 ELISA, RIA와 같은 표준방법뿐 아니라 크로마토그래피 검사나 질량분석 검사 방법도 시도되고 있으며 세포학적 마커, DNA 마커 혹은 mRNA 마커 등을 찾기 위한 다양한 연구가 진행되고 있다(Sabrina H et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 16(10):1935-53, 2007). 그리고 SELDI-TOF-MS(Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry) 기술을 이용한 단백질 프로파일링에 의해 바이오마커를 발굴하고 바이오마커 패널의 패턴을 비교함으로써 질병(암)을 진단하고자 하는 방법(Petricoin EF et al., Lancet 359(9306);572-577, 2002)도 이러한 연구들 중 하나이다.

이에, 본 발명자들은 대장암 환자와 정상인 혈청 샘플의 단백질 양상을 다중 면역분석방법 및 통계적 기법을 이용함으로써 대장암을 진단 및 스크리닝할 수 있는 단백질 마커들을 규명하였으며, 상기 단백질 마커들의 조합을 대장암 진단 및 스크리닝에 적용하였을 때, 대장암 환자와 정상인을 높은 정확도로 구별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 대장암 진단 및 스크리닝용 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 마커를 이용하여 대장암을 진단 및 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 마커를 이용한 대장암 진단 및 스크리닝용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 마커를 이용한 대장암 진단 및 스크리닝용 바이오칩을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 D-Dimer, sCD40L(Soluble CD40 ligand), EGF(Epidermal growth factor), A1AT(Alpha-1-antitrypsin), tPAI-1(Total plasminogen activator inhibitor-1), ApoA-4(Apolipoprotein-A4), ApoA-1(Apolipoprotein-A1), TTR(Transthyretin), Hp(Haptoglobin), proApoA-1(Proapolipoprotein-A1), ApoA-1/proApoA-1(ApoA-1과 Proapolipoprotein-A1의 비율), CRP/Kininogen(CRP와 Kininogen의 비율) 및 Cathepsin B로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 포함하는 대장암 진단 및 스크리닝용 마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 13개 마커 중 하나 이상의 발현량을 측정하여 정상인보다 발현량이 높거나 혹은 낮은 개체를 선별하는 단계를 포함하는 대장암 진단 및 스크리닝용 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 13개 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는 대장암 진단 및 스크리닝용 키트를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 13개 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 생물 분자가 고형 기질에 집적된 대장암 진단 및 스크리닝용 바이오칩을 제공한다.

본 발명의 대장암 진단 및 스크리닝용 단백질 마커 및 대장암 진단을 위한 상기 마커의 측정방법은 체액 내 특정 단백질 발현량의 확인만으로 간편하게 대장암 조기 진단 및 스크리닝, 및 대장암 진행 정도 평가를 가능하게 함으로써 신속한 치료가 가능하게 하여 대장암 환자의 생존율을 향상시키고 암 치료로 인한 국가적 손실을 줄이는데 기여할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 D-Dimer, sCD40L(Soluble CD40 ligand), EGF(Epidermal growth factor), A1AT(Alpha-1-antitrypsin), tPAI-1(Total plasminogen activator inhibitor-1), ApoA-4(Apolipoprotein-A4), ApoA-1(Apolipoprotein-A1), TTR(Transthyretin), Hp(Haptoglobin), proApoA-1(Proapolipoprotein-A1), ApoA-1/proApoA-1(ApoA-1과 Proapolipoprotein-A1의 비율), CRP/Kininogen(CRP와 Kininogen의 비율) 및 Cathepsin B로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 포함하는 대장암 진단 및 스크리닝용 마커를 제공한다.

랜덤 포레스트(random forest, RF; Breiman L, Machine Learning 45(1):5-32, 2001)는 CART의 의사결정나무의 조합으로 이루어진 Bagging 알고리즘의 일종으로 Leo Breiman과 Adele Cutler에 의해 제안된 방법이다. 각 나무들의 마디들은 고차원을 갖는 자료를 하위 차원들의 작은 조각으로 나눠 빠르게 분류할 수 있도록 구성되어 있다. 이런 각 나무들은 조합(Ensemble)과 투표(Voting)에 의해 최종적인 분류를 완료하게 된다. 확률 분포가 같은 랜덤 벡터(Random Vector)에 의해 생성된 나무들은 각각 독립적으로 구성되고, 구성된 나무들의 개수를 무한으로 가져가면 오분류가 일반화되어 수렴하게 되는데, RF는 불규칙성(Randomness)과 Out-of-bag(Random Selection without Replacement) 기법을 이용하여 Adaboost 만큼의 정확도를 낼 수 있게 하고 경계면과 잡음(Noise)에 강한 성능을 보이며, Bagging과 Boosting 보다 빠르게 수렴하도록 도와주는 효과를 낸다.

본 발명자들은 정상적인 개체 및 대장암 질환 개체의 혈청 시료를 수득하여 정상인과 대장암 환자에서 AFP(Alpha-fetoprotein), CEA(Carcinoembryonic antigen), D-Dimer, sICAM-1(Soluble Intercellular cell adhesion molecule-1), sCD40L(Soluble CD40 ligand), EGF(Epidermal growth factor), A1AT(Alpha-1-antitrypsin), tPAI-1(Total plasminogen activator inhibitor-1), ApoA-4(Apolipoprotein-A4), ApoA-1(Apolipoprotein-A1), TTR(Transthyretin), Hp(Haptoglobin), proApoA-1(Proapolipoprotein-A1), CRP(c-Reactive protein), Kininogen, VDBP(Vitamin D-binding protein) 및 Cathepsin B 등의 17가지 단백질들을 발현량을 RBM 키트, Linco 키트 및 바이오인프라에서 제조한 키트를 이용하여 각각의 프로토콜을 이용하여 측정하였으며, 측정 결과의 데이터를 구축하고 바이오인포매틱스(bioinformatics) 및 통계적 분석방법인 R 패키지(R Development Core Team (2007). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org.)를 사용하여 랜덤 포레스트 방법으로 분석함으로써, 양자(정상 또는 대장암 환자)간 발현량의 변화를 나타내는 단백질 및 상기 양자를 구별할 수 있는 최적의 마커를 찾아내었다. 그 결과, 상기 17개의 단백질들과 2개의 두 단백질 비율(ApoA-1/proApoA-1, CRP/Kininogen) 중 특성 중요도(feature importance) 순서로 상위 13개 마커[D-Dimer, sCD40L, EGF, A1AT, tPAI-1, ApoA-4, ApoA-1, TTR), Hp, proApoA-1, ApoA-1/proApoA-1, CRP/Kininogen 및 Cathepsin B]를 선정하였고, 상기 13개 단백질은 Mann-Whitney U-test 결과 대장암 환자와 정상인 그룹 간에 유의성 있는 차이가 있었다. 상기 선택된 13개 마커 중 D-Dimer, sCD40L, EGF, Hp, proApoA-1, CRP/Kininogen 및 Cathepsin B는 정상인에 비해 대장암 환자의 혈청에서 발현량이 유의성 있게 증가하였고, A1AT, tPAI-1, ApoA-4, ApoA-1, ApoA-1/proApoA1 및 TTR 단백질은 정상인에 비해 대장암 환자에서 발현량이 유의성 있게 감소하는 것을 확인하였다(표 3 참조). 상기 13개 단백질들은 정상인의 혈청에 비해 유의성 있게 발현량의 차이가 있음을 확인하였는 바, 대장암의 진단 및 스크리닝용 마커로 사용될 수 있으며 상기 마커는 하나 또는 둘 이상을 동시에 진단에 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은

1) 환자의 시료로부터 상기 13개 마커 중 하나 이상의 발현량을 측정하는 단계; 및

2) 단계 1)의 상기 마커의 발현량이 정상인보다 높거나 혹은 낮은 개체를 선별하는 단계를 포함하는 대장암 진단을 위한 상기 마커의 측정방법을 제공한다.

상기 마커를 이용하면, 대장암 질환의 발병 여부를 확인하고자 하는 분석 대상 혈청 프로테옴을 입력받아 상기한 바와 같이 바이오인포매틱스 및 통계적 분석방법에 의해 분석하여 질환 특이적 마커의 패턴을 가진 표본과 비교하거나 혈청 내 본 발명의 마커의 양과 정상 표본의 단백질 양을 수치화한 후 비교하여, 비교 결과에 따라 분석 대상 혈청 프로테옴 패턴이 정상인지 대장암 질환 상태인지 확인하는 진단 및 스크리닝이 가능하다.

상기 통계적 분석방법은 LDA(linear discriminant analysis), SVM(support vector machine), tree 또는 랜덤 포레스트(random forest)에 의해 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

SVM[Support Vector Machine, 서포트 벡터 머신(Vapnik VN et al., Technical Report CSD-TR-96-17, Univ. of London, 1996)]은 패턴 인식에 유용하게 사용되는 학습용 알고리즘으로서, 결정되는 표면이 서포트 벡터 및 그에 대응하는 가중치의 집합으로 이루어지는 변수에 의해 결정되며, 다수의 변수를 각각 따로 취 급하지 않고 동시에 처리하는 방법을 제시한 것을 의미하고, 이는 벡터를 분류하는 유용한 도구로 사용될 수 있다. 서포트 벡터 머신에 의하면 입력 공간의 비선형적인 높은 차수를 특징면(feature space)에서 선형적으로 투영하여 해석할 수 있도록 하며, 각 특징 사이의 최적의 경계(최적 분리면)을 제시한다. 서포트 벡터 머신은 크게 훈련 과정(training)과 평가 과정(testing)의 두 부분으로 이루어진다. 훈련 과정에서는 서포트 벡터가 생성되며 평가 과정에서는 특정 규칙에 의한 판단이 수행된다(대한민국 특허 제 2002-0067298호 참조).

LDA(linear discriminant analysis, 선형판별분석)은 변수들의 선형 결합을 통해 집단들(class) 사이의 특성을 가장 잘 분류하는 판별함수를 찾아내는 분석기법으로서 Fisher RA(Annals of Eugenics, 7:179-188, 1936)에 의해 제안된 방법이다. 판별분석은 독립적인 변수들의 선형결합을 통해 집단간 차이를 가장 크게 하고 집단 내 차이를 가장 작게 하는 새로운 변수 Y를 정의하고, 이 Y값의 크기를 통해 집단을 선택하는 고전적인 방법이다.

새로운 변수 Y는 다음과 같이 정의된다:

Y = c₁X₁ + c₂X₂ + …… +c_nX_n

(c_i: 판별계수[discriminant coefficient], X_i: 독립변수).

tree(decision tree, 의사결정 나무)는 분류와 예측을 하는데 있어서 효과적으로 많이 쓰이는 데이터마이닝 기법으로 흐름도(flow chart)와 유사한 트리구조로 적용결과에 의해 규칙을 명확하게 나타내는 방법이다. 의사결정나무는 마디라고 불리는 구성요소 들로 이루어진 나무의 뿌리모양을 이루고 있으며 마디는 기능에 따라 분류할 수 있다. 중간 마디(intermediate node)에는 속성에 대한 검사를 표시하고, 가지는 검사의 결과를 나타내며, 잎(leaf 또는 단말)마디는 집단이나 집단의 분포를 나타낸다. 나무의 최상위 마디는 뿌리(root)마디가 된다. 의사결정나무를 만드는 데는 다양한 알고리즘들이 있는데, 이중 많이 쓰이는 것으로는 CART(Classification and Regression Tree), CHAID(Chi-squared Automatic Interaction Detection) 및 C4.5가 있다.

상기 단계 1)의 발현량은 2차원 전기영동, 바이오칩 또는 상기 마커 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 측정될 수 있으며, 상기 바이오칩은 바람직하게는 단백질칩 또는 핵산 어레이 등이 있다. 또한, 상기 마커 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 측정하는 방법에는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법 등이 있을 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 본 발명자들은 대장암 환자 및 정상인의 혈청에서 AFP, CEA, D-Dimer, sICAM-1, sCD40L, EGF, A1AT, tPAI-1, ApoA-4, ApoA-1, TTR, Hp, proApoA-1, CRP, Kininogen, VDBP 및 Cathepsin B 등의 17가지 단백질들을 정량하였으며, 정량 결과는 통계분석인 R 패키지를 사용하여 랜덤 포레스트 방법으로 분석하였다. 상기 분석 결과, D-Dimer, sCD40L, EGF, A1AT, tPAI-1, ApoA-4, ApoA-1, TTR, Hp, proApoA-1, ApoA-1/proApoA-1, CRP/Kininogen 및 Cathepsin B 등의 13개 단백질은 Mann-Whitney U-test 결과 대장암과 정상인 그룹 간에 유의성 있는 차이가 있었다. 선택된 13개 마커 중 D-Dimer, sCD40L, EGF, Hp, proApoA-1, CRP/Kininogen 및 Cathepsin B는 정상인에 비해 대장암 환자의 혈청에서 발현량이 유의성 있게 증가하였고, A1AT, tPAI-1, ApoA-4, ApoA-1, ApoA-1/proApoA1 및 TTR 단백질은 정상인에 비해 대장암 환자에서 발현량이 유의성 있게 감소하는 것을 확인하였다(표 3 참조). 따라서, 상기 13개의 단백질은 대장암 진단 및 스크리닝용 마커로 이용할 수 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명자들은 선택한 단백질들의 진단 및 스크리닝 능력을 평가하기 위해, 상기 선택된 13개 마커(D-Dimer, sCD40L, EGF, A1AT, tPAI-1, ApoA-4, ApoA-1, TTR, Hp, proApoA-1, ApoA-1/proApoA-1, CRP/Kininogen 및 Cathepsin B)로 조합할 수 있는 모든 종류(8,190가지)의 조합에 대해 LDA(linear discriminant analysis), RF(Random Forest) 및 SVM(support vector machine) 방법으로 훈련 집단(training set)을 이용하여 분류모델을 만든 후 평가 집단(test set)으로 평가하였다.

그 결과, 상기 개별 단백질로 모델을 만들어 분류했을 때는 13가지 마커 중 대장암 분류에 70% 이상의 정확도를 보이는 것은 EGF, sCD40L, ApoA-1/proApoA-1 및 proApoA-1 등 4가지인 반면에, 개별 단백질들의 조합으로 이루어진 분류모델에서 더 높은 정확도를 얻을 수 있었다(표 6 내지 10 참조). 예를 들어 EGF, proApoA-1, ApoA-4 및 TTR의 4개 마커로 이루어진 모델의 정확도는 91.43%(민감도 87.8%, 특이도 95.1%)로 단일 마커인 경우에 비해 훨씬 높은 정확도의 분류모델을 만들 수 있었다(표 5 참조). 따라서, 대장암 진단을 위해서는 개별 마커를 이용하는 것보다 둘 이상의 마커를 이용하는 것이 더 높은 정확도를 얻을 수 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명자들은 별도의 실험대상에 대해, 상기 분류모델들을 대상으로 블라인드 테스트를 하였고, 블라인드 테스트에서도 높은 정확도를 나타냄을 확인하였다(표 11 참조).

본 발명의 구체적인 실시예에서 대장암 환자의 혈청에서 발현량이 유의하게 변화하는 13개 단백질을 대장암 진단 및 스크리닝용 마커로 선정하였고(표 3 참조), 상기 13개 마커를 이용한 조합으로 이루어진 분류모델에서 더 높은 정확도로 대장암 분류를 수행할 수 있음을 확인하였다(표 6 내지 10 참조). 이는 블라인드 테스트를 통해 한 번 더 검증되었다(표 11 참조). 이에, 본 발명의 키트는 대장암 환자와 정상인에서 발현에 차이가 있는 상기와 같은 13개 마커 중 하나 이상의 마커를 정량하는데 사용하기 위해, 상기 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있고, 또는 두 종류 이상의 상기 특이적인 항체의 조합을 포함할 수 있다.

상기 키트는 환자가 대장암인지 아닌지를 구별하여 의사 등 진료 행위자가 대장암을 진단 및 스크리닝하는 것을 가능하게 할 뿐 아니라, 치료에 대한 환자의 반응을 모니터하여 그 결과에 따라 치료를 변경하는 것을 가능하게 한다. 또한, 대장암 모델(예: 마우스, 랫트 등의 동물모델)의 생체 내 또는 생체 외에서 하나 이상의 마커의 발현을 조절하는 화합물을 동정하는데 사용될 수 있다. 이에, 본 발명의 마커는 표준 물질로 상기 키트에 추가로 포함될 수 있다.

본 발명의 키트에 사용될 수 있는 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다.

다클론 항체는 상기 13개 단백질 중 어느 하나를 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다.

단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다(Kohler G et al., Nature 256:495-497, 1975; Kozbor D et al., J Immunol Methods 81:31-42, 1985; Cote RJ et al., Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030, 1983; 및 Cole SP et al., Mol Cell Biol 62:109-120, 1984).

또한 상기 13개 단백질 중 어느 하나에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 제조될 수 있다. 예를 들면 이들로 한정되는 것은 아니지만 F(ab')2 단편은 항체 분자를 펩신으로 분해시켜 제조할 수 있으며, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 방도로서, Fab 발현 라이브러리를 작제하여 원하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편을 신속하고 간편하게 동정할 수 있다(Huse WD et al., Science 254: 1275-1281, 1989).

상기 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질(solid substrate)에 결합될 수 있다. 고형 기질은 예를 들어 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드 등이 있다. 또한, 상기 합성수지에는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 및 나일론 등이 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 고형 기질에 결합시키기 위해, 미세구체를 현탁한 후 마이크로튜브(microtube)에 옮겨 원심분리로 상층액을 제거한 후 재현탁하고, N-하이드록시-설포숙시니마이드(N-hydroxy-sulfosuccinimide) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이마이드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride)를 차례로 처리한 후 원심분리로 상층액을 제거한 후 세척하여 보관하였다.

또한, 환자로부터 수득된 시료를 고형 기질에 결합된 본 발명의 13개 단백질 중 어느 하나의 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키는 경우, 시료는 항체와 접촉 전에 알맞은 정도로 희석될 수 있다.

본 발명의 키트는 추가로 상기 마커에 특이적으로 결합하는 검출용 항체를 포함할 수 있다. 상기 검출용 항체는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지한 접합체(conjugate)일 수 있고, 바람직하게는 상기 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 1차 항체일 것이다. 예를 들어, 상기 발색효소는 퍼록시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 또는 산성 포스파타제(acid phosphatase)(예: 양고추냉이 퍼록시다제(horseradish peroxidase))일 수 있고; 형광물질인 경우, 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레신 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 등을 사용하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명의 키트는 추가로 (1) 상기 마커에 특이적으로 결합하는 검출용 항체 및 (2) 상기 검출용 항체에 결합할 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드에는 단백질 A 또는 검출용 항체에 특이적으로 결합하는 2차 항체 등이 있다. 또한 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지한 접합체(conjugate)일 수 있다. 상기 검출용 항체는 상기 리간드를 위해, 바이오틴화(biotinylation) 또는 다이곡시제닌(digoxigenin) 처리한 1차 항체를 이용하는 것이 바람직하나, 상기 검출용 항체의 처리방법은 이에 한정되지 않는다. 또한 상기 리간드로는 상기 검출용 항체에 결합하기 위해, 스트렙타비딘, 아비딘 등이 사용되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 상기 검출체로 형광물질을 부착한 스트렙타비딘(streptavidin)을 리간드로 사용하였으며, 상기 리간드를 위해 바이오틴화(biotinylation)시킨 검출용 항체를 이용하였다.

본 발명의 진단 및 스크리닝용 키트는 상기 항체 및 마커 복합체에 검출용 항체를 처리한 후 검출용 항체의 양을 탐색함으로써 대장암을 진단 및 스크리닝할 수 있다. 또는 상기 항체 및 마커 복합체에 검출용 항체 및 리간드를 순차적으로 처리한 후, 검출체용 항체의 양을 탐색함으로써 대장암을 진단 및 스크리닝할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 검출용 항체를 세척된 항체-마커 복합체와 정온배치한 후 세척하여 검출용 항체를 측정함으로써 상기 마커의 양을 측정할 수 있다. 검출용 항체의 양 측정이나 존재 검출은 형광, 발광, 화학발광(chemiluminescence), 흡광도, 반사 또는 투과를 통해 이루어질 수 있다.

또한, 상기 검출용 항체 또는 리간드의 양을 탐색하는 방법으로는 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템을 이용하는 것이 바람직하고, 여기에는 검출체로 형광물질이 부착되어 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로 방사선 동위원소가 부착되어 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법; 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

예를 들어 상기 형광법은 형광 스캐너 프로그램을 이용하여 상기 검출용 항체를 형광물질로 라벨링한 후 스포팅하여 신호를 확인하는 방법으로, 이 방법을 적용하여 결합 정도를 확인할 수 있다. 상기 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 SPR 시스템은 형광법과는 달리 시료를 형광물질로 표지할 필요가 없이 항체의 결합 정도를 실시간으로 분석하는 것이 가능하나 동시다발적인 시료 분석이 불가능하다는 단점이 있다. SPRI의 경우에는 미세정렬 방법을 이용하여 동시다발적인 시료 분석이 가능하지만 탐지 강도가 낮은 단점이 있다.

또한, 본 발명의 진단 및 스크리닝용 키트는 효소와 발색 반응할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 마커만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 추가로 포함할 수 있다. 분석을 위해 사용되는 시료는 혈청, 뇨, 눈물 타액 등 정상적인 상태와 구별될 수 있는 질환 특이적 폴리펩타이드를 확인할 수 있는 생체 시료를 포함한다. 바람직하게는 생물학적 액체 시료, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장, 더욱 바람직하게는 혈청으로부터 측정될 수 있다. 시료는 마커의 탐지감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데 예를 들어 환자로부터 수득한 혈청 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출(sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있으나, 이에 한 정되지 않는다.

아울러, 본 발명은 상기 13개 단백질 중 어느 하나의 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 생물 분자가 고형 기질에 집적된 대장암 진단 및 스크리닝용 바이오칩을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 대장암 환자의 혈청에서 발현량이 유의하게 변화하는 13개 단백질을 선정하였고(표 3 참조), 상기 13개 단백질을 이용한 조합으로 이루어진 분류모델에서 더 높은 정확도로 대장암 분류를 수행할 수 있음을 확인하였다(표 6 내지 10 참조). 이는 블라인드 테스트를 통해 한 번 더 검증되었다(표 11 참조). 이에, 본 발명의 바이오칩은 대장암 환자와 정상인에서 발현에 차이가 있는 상기와 같은 13개 단백질 중 하나 이상의 단백질을 측정하는데 사용하기 위해, 상기 13개 단백질 중 어느 하나의 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있고, 또는 두 종류 이상의 상기 특이적인 항체의 조합을 포함할 수 있다.

상기 생물 분자는 저분자 화합물, 리간드, 앱타머, 펩티드, 폴리펩티드, 특이적 결합 단백질, 고분자 물질 및 항체 등으로 이루어진 군으로부터 선택되며 상기 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 물질이면 무엇이든 사용 가능하며, 항체 또는 앱타머를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 항체는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체를 사용하는 것이 바람직하며, 모노클로날 항체를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으 로 제작하여도 무방하며, 상업적으로 알려진 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 상기 항체는 당업자에게 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 단백질을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여할 수 있다. 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 형상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리할 수 있다.

또한, 본 발명의 바이오칩의 고형 기질은 플라스틱, 유리, 금속 및 실리콘으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 그 표면에 상기 항체를 부착시키기 위해 화학 처리되거나 링커 분자가 결합하여 있을 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바이오칩은 시료에서 전체 단백질을 채취하여 바이오칩과 반응시켜 손쉽고 정확하게 대장암을 진단 및 스크리닝을 수행할 수 있다.

상기 바이오칩의 기판에 코팅된 활성기는 상기 물질을 결합하는 역할을 하며, 아민기(amine group), 알데하이드기(aldehyde group), 카르복실기(carboxyl group) 및 티올기(thiol group)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 당업자에게 단백질 분자를 기판에 결합할 수 있는 활성기로 알려진 모든 활성기가 사용 가능하며, 이제 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 혈청 수득

본 발명의 실험을 위해 정상인 145명(남자 70명, 여자 75명)과 대장암 환자 69명(남자 42명, 여자 27명)을 대상으로 하였다. 연령 분포를 보면 정상인의 경우 나이는 44세 ~ 69세(mean : 53.9, median : 53)였으며, 대장암 환자 나이는 45세 ~ 85세(mean : 61.6, median : 62)였다. 대장암 환자의 병기별 분포는 1기-6명, 2기-24명, 3기-34명, 4기-5명이었다. 그리고 실험 대상과 별개로 분류모델 검증을 위해, 블라인드 테스트에 정상인 37명(남자 16명, 여자 21명)과 대장암 환자 25명(남자 10명, 여자 15명)을 대상으로 하였다.

상기 정상인 또는 대장암 환자로부터 Vacutainer SST Ⅱ tube(Becton Dickinson)에 말초혈액 5 ㎖을 채취하여 상온에 한 시간 동안 둔 후, 3000 g에서 5분 동안 원심 분리한 후 상층액을 취해 혈청을 얻었으며 사용하기 전까지 -80℃에 보관하였다.

<실시예 2> 다중분석 키트의 준비

<2-1> 항체

본 발명자들은 AFP(Alpha-fetoprotein), CEA(Carcinoembryonic antigen), D-Dimer, sICAM-1(Soluble Intercellular cell adhesion molecule-1), sCD40L(Soluble CD40 ligand), EGF(Epidermal growth factor), A1AT(Alpha-1- antitrypsin), tPAI-1(Total plasminogen activator inhibitor-1), ApoA-4(Apolipoprotein-A4), ApoA-1(Apolipoprotein-A1), TTR(Transthyretin), Hp(Haptoglobin), proApoA-1(Proapolipoprotein-A1), CRP(c-Reactive protein), Kininogen, VDBP(Vitamin D-binding protein) 및 Cathepsin B 등의 17가지 단백질을 분석하기 위해, 표 1에 나타난 바와 같이 여러 제조사로부터 키트(AFP, CEA, sICAM-1, sCD40L, EGF 및 tPAI-1) 혹은 항체(D-Dimer, A1AT, ApoA-4, ApoA-1, TTR, Hp, proApoA-1, CRP, Kininogen, VDBP 및 Cathepsin B)를 구입하거나 항체를 위탁제조(ApoA-4, proApoA-1, Hp)하여 다중 시스템(multiplex system)을 구축하였다.

항체 또는 키트 구입처

마커	제조사	카달로그 번호
AFP, CEA	Rules based medicine (RBM) (USA)	600-1009
sICAM-1, tPAI-1	LINCO Research (USA)	HCVDI-67AK
sCD40L, EGF	LINCO Research (USA)	HCYTO-60K
D-Dimer	Biodesign (USA)	N86436M, N86043M
A1AT	Chemicon (USA)	MAB1261
A1AT	Abcam (USA)	Ab14226
ApoA4	Santa Cruz Biotechnology (USA)	SC-19036
ApoA4	AB frontier (한국)	주문제작
ApoA1	Chemicon (USA)	MAB011
ApoA1	AbD Serotec (USA)	650-0154
TTR	DAKO (USA)	A0002
TTR	AB frontier (한국)	LF-MA0174
Hp	USBiological (USA)	H1820-10
Hp	Jeon-Nam University (한국)	주문제작
proApoA1	Biodesign (USA)	H45402M
proApoA1	AB frontier (한국)	주문제작
CRP	바디텍메드 (한국)	1C1, 18C2
Kininogen	R & D Systems (USA)	MAB1569,MAB15692
VDBP	Abcam (USA)	ab23480, ab23484
Cathepsin B	R & D Systems (USA)	AF953,MAB2176

<2-2> 표준 단백질

표준 단백질의 경우, AFP, CEA 단백질은 RBM사의 키트에 포함된 것, sICAM-1, sCD40L, EGF 및 tPAI-1 단백질은 LINCO사의 키트에 포함된 것을 사용하였다. D-Dimer는 Abcam(USA); A1AT, TTR, Hp 및 Kininogen은 Sigma(USA); VDBP와 Cathepsin B는 Biodesign(USA); CRP는 바디텍메드(한국); ApoA1 단백질은 Calbiochem(USA)에서 구입하여 사용하였고, ApoA-4와 proApoA1은 바이오인프라(한국)에서 제조하여 사용하였다.

<2-3> 항체 결합한 미세구체(micorsphere)

하기 방법으로 미세구체(micorsphere)에 항체를 결합시켰다.

<2-3-1> 미세구체의 카복실기 활성화

미세구체 저장액(Microsphere stock solution; Hitachi, Japan)을 볼텍스(vortex)한 후 음파 용기(sonification bath; Sonicor Instrument Corporation, USA)에서 20초 동안 현탁하였다. 2 × 10⁶개의 미세구체를 마이크로튜브(microtube)에 옮겨 원심분리로 상층액을 제거한 후, 3차 증류수 100 ㎕로 세척하고 다시 0.1 M 인산나트륨 완충용액(Sodium phosphate buffer; pH 6.2) 80 ㎕에 재현탁하였다. 이후, 50 ㎎/㎖의 N-하이드록시-설포숙시니마이드(N-hydroxy-sulfosuccinimide, Sulfo-NHS) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride)(Pierce, USA)를 각각 10 ㎕씩 차례로 처리한 후 실온에서 20분 동안 섞어주었고, 원심분리로 상층액을 제거한 다음 50 mM MES, pH 5.0으로 두 번 세척하였다.

<2-3-2> 항체 결합한 미세구체

상기 카복실기 활성화된 미세구체를 50 mM MES 400 ㎕로 재현탁(resuspension)한 후, 실시예 2-1의 25 ㎍의 항체를 포함한 50 mM MES 100 ㎕를 첨가하여 섞어준 후 실온에서 두 시간 동안 섞어주었다. 상기 반응은 암실에서 실행하였다. 항체 결합 반응이 끝난 미세구체는 원심분리를 이용하여 500 ㎕ PBS-TBN[PBS, 1% BSA, 0.02% Tween, 20-0.05% 소듐 아자이드(sodium azide)]으로 두 번 세척하였고, 혈구 계산기(hemocytometer)로 개수를 측정하였다. 상기 항체 결합한 미세구체는 1 × 10⁶개/500 ㎕ PBS-TBN 농도로 4℃의 암실에서 보관하였다.

<2-3-3> 항체 결합 효율 측정

상기 항체 결합 미세구체를 20초 동안 볼텍스 & 소니케이션 한 후, 필터형 바닥 96-웰 마이크로플레이트에 웰 당 2,000개 미세구체를 넣고 미세구체에 결합된 항체의 종(species)에 맞는, PE(Phycoerythrin)가 결합된 2차 항체(anti-antibody antibodyPE conjugate, Jackson Immunoresearch, USA)를 2% BSA/PBS 용액에 1/10로 희석하여 50 ㎕/웰로 넣고 실온에서 30분 동안 섞어주었다. 상기 반응은 빛이 들어가지 않게 암실에서 실행하였다. 반응이 끝난 후 PBST로 2번 세척하였고 Luminex^TM200(Luminex, USA)으로 읽어 MFI 값이 10,000 이상임을 확인하였다.

<2-4> 검출 항체의 바이오틴화

검출(detection) 항체는 바이오틴화(biotinylation)시킨 항체를 이용하였다. 구체적으로, EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation 키트(Pierce, USA)를 이용하여 제조사의 방법의 따라 바이오틴화 반응을 수행하였고, 바이오틴(biotin) 결합의 정도는 키트에 포함된 HABA(4'-hydroxyazobenzene-2-carboxylic acid)를 이용하여 키트 제조사에서 지시한 방법에 따라 수행함으로써 확인하였다.

그 결과, 항체 하나당 결합된 바이오틴양은 8 ~ 12 개로 측정되었다.

<2-5> 통계분석

개발된 분석은 검출 항체의 농도와 실험 반응시간을 더 최적화하였고, 민감도(sensitivity)는 연속 희석한 마커의 분석 측정 수치로 확인하였다. 인트라-어세이 변이성(Intra-assay variability)은 9개의 다른 농도의 혈청 샘플을 12 웰(well)/1 플레이트(plate) 씩 2개의 플레이트로 3번의 다른 시간대에 실험하여 나온 측정치로 CV(coefficient of variation)를 계산하여 확인하였고, 5 ~ 15%로 평균 10%로 계산되었다. 개발된 키트는 교차반응(cross-reactivity)이 없음을 확인하였다.

<실시예 3> 다중 면역분석(multiplex immunoassay) 수행

<3-1> RBM 프로토콜

RBM사의 프로토콜에 따라 AFP 및 CEA의 다중 면역분석을 96웰(well)의 V형 바닥 마이크로플레이트에서 수행하였다. 이때 제조사에서 제공한 표준(standard) 단백질은 혈청 기질 희석액(serum matrix diluent)으로 연속 희석하여 사용하였다.

구체적으로, 표준(duplication) 단백질, 대조군(duplication) 혈청 및 환자 혈청을 각각 20 ㎕씩 웰에 첨가하였고, 키트에 포함된 블로킹 완충용액(blocking buffer) 및 비드 혼합액(bead mixture)을 10 ㎕씩 웰에 첨가하여 섞어준 후 실온에서 한 시간 동안 반응시켰다. 실시예 2-4에서 준비한 검출 항체와 스트렙타비딘(streptavidin)-PE(Jackson Immunoresearch, USA)는 순차적으로 각각 한 시간, 30분씩 반응시켰고, 필터형 바닥 96-웰 마이크로플레이트(Millipore, USA)로 반응액을 옮긴 후 진공 다기관(vacuum manifold)을 이용하여 두 번씩 씻어주었다. 키트에 포함된 분석 완충용액 100 ㎕ 처리한 반응액을 96 웰 마이크로플레이트에 옮겨 Luminex^TM200(Luminex, USA)으로 분석하였다. 결과는 업스테이트사(Upstate, USA)의 비드뷰 소프트웨어(beadview software)를 이용하여 5-파라메트릭 커브 피팅(5-parametric-curve fitting)으로 분석하였다.

<3-2> LINCO 프로토콜

LINCO사의 프로토콜에 따라 sICAM-1, sCD40L, EGF 및 tPAI-1의 다중 면역분석을 필터형 바닥 96-웰 마이크로플레이트(Millipore, USA)에서 수행하였다. 상기 필터형 바닥 96-웰 마이크로플레이트에 키트에서 제공된 분석 완충용액을 처리하여 10분 동안 블로킹 후 진공 다기관을 이용하여 완충용액을 제거하였다. 이때 제조사에서 제공한 표준(standard) 단백질은 혈청 기질 희석액으로 연속 희석하여 사용하였다.

구체적으로, 표준(duplication) 단백질, 대조군(duplication) 혈청 및 환자 혈청을 25 ㎕씩 웰에 처리하였고, 각 웰에 비드 혼합액 25 ㎕씩을 더한 후 실온에서 한 시간 동안 반응시켰다. 반응 플레이트를 진공 다기관을 이용하여 두 번 씻어준 후 검출 항체 및 스트렙타비딘-PE를 순차적으로 각각 한 시간, 30분씩 반응시켰다. 반응이 끝난 플레이트를 씻어준 다음 키트에서 제공된 분석 완충용액을 100 ㎕ 처리하여 Luminex^TM 200으로 분석하였다. 결과는 업스테이트의 비드뷰 소프트웨어를 이용하여 5-파라메트릭 커브 피팅으로 분석하였다.

<3-3> 바이오인프라 프로토콜

바이오인프라사의 프로토콜에 따라 D-Dimer, A1AT, TTR, Hp, Kininogen, VDBP, Cathepsin B, CRP, ApoA1, ApoA-4 및 proApoA1의 다중 면역분석을 필터형 바닥 96-웰 마이크로플레이트(Millipore, USA)에서 수행하였다. 상기 필터형 바닥 96-웰 마이크로플레이트에 분석 완충용액(PBS/2% BSA)을 처리하여 10분 동안 블로킹 후 진공 다기관을 이용하여 완충용액을 제거하였다. 이때 제조사에서 제공한 표준(standard) 단백질은 혈청 기질 희석액으로 연속 희석하여 사용하였다.

<실시예 4> 데이터의 통계분석

모든 통계분석은 R 패키지(R Development Core Team (2007). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org)를 사용하였다.

<4-1> 대장암 진단용 마커 선정

상기 각각의 17가지 단백질(AFP, CEA, D-Dimer, sICAM-1, sCD40L, EGF, A1AT, tPAI-1, ApoA-4, ApoA-1, TTR, Hp, proApoA-1, CRP, Kininogen, VDBP 및 Cathepsin B)과 단백질 비율 2가지(ApoA-1/proApoA-1, CRP/Kininogen) 중 대장암 진단에 적당한 진단 마커를 찾기 위해 변수를 임의 추출하여 여러 개의 분류자를 생성하고 이로부터 하나의 분류자를 만드는 통계적 기법인 랜덤 포레스트(random forest; Breiman L, Machine Learning 45(1):5-32, 2001) 방법을 사용하였다.

구체적으로, 먼저 무작위로 대장암 환자 50명과 정상인 50명으로 이루어진 샘플 조합을 100개 만들고, 그 샘플 조합들로 만들어진 100개의 랜덤 포레스트(random forest) 분류모델들의 특성 중요도(feature importance) 순서로 상위 13개 마커[D-Dimer, sCD40L(Soluble CD40 ligand), EGF(Epidermal growth factor), A1AT(Alpha-1-antitrypsin), tPAI-1(Total plasminogen activator inhibitor-1), ApoA-4(Apolipoprotein-A4), ApoA-1(Apolipoprotein-A1), TTR(Transthyretin), Hp(Haptoglobin), proApoA-1(Proapolipoprotein-A1), ApoA-1/proApoA-1 및 CRP/Kininogen, Cathepsin B]를 선정하였다.

특성 중요도의 수치 데이타

순위	마커	특성 중요도 (feature importance)
1	EGF	1104.6
2	sCD40L	807.4
3	ApoA-1/proApoA-1	506.9
4	proApoA-1	491.2
5	ApoA-4	395.1
6	D-Dimer	329.1
7	ApoA-1	190.3
8	Hp	148.8
9	TTR	145.7
10	tPAI-1	129.3
11	Cathepsin B	122.7
12	CRP/Kininogen	121.1
13	A1AT	98.8
14	CRP	97.9
15	CEA	56.6
16	AFP	53.5
17	Kininogen	51.9
18	VDBP	51.4
19	sICAM-1	47.8

선택된 13개 마커 중 D-Dimer, sCD40L, EGF, Hp, proApoA-1, CRP/Kininogen, Cathepsin B는 정상인에 비해 대장암 환자의 혈청에서 농도가 증가하는 경향을 보였고, A1AT, tPAI-1, ApoA-4, ApoA-1, ApoA-1/proApoA1, TTR 단백질은 정상인에 비해 대장암 환자의 혈청에서 농도가 감소하는 경향을 보였다(표 3).

<4-2> 마커의 통계분석

상기 13개 마커의 대장암 환자와 정상인 간의 혈청 농도 차이의 유의성을 확인하기 위해 Mann-Whitney U-test를 실시하였다. 그 결과 13개 마커 모두 대장암 환자와 정상인 간의 혈청 농도 차이에 유의성이 있었다(p-value <0.05; 표 3).

상기 13개 마커의 AUC 값을 살펴보았을 때 tPAI-1을 제외하면 모두 0.7 이상의 값을 갖는 좋은 마커였으며, 특히 EGF와 sCD40L은 AUC 값이 각각 0.94와 0.91인 아주 훌륭한 마커였다.

혈청 단백질의 수준

마커	대장암환자		정상인		p-value	대장암/정상인 비율	^*AUC
마커	평균	표준편차	평균	표준편차	p-value	대장암/정상인 비율	^*AUC
D-Dimer^#	4290.55	18567.48	571.32	487.45	3.56 x 10^-13	7.51	0.81
sCD40L^##	19067340.38	90326154.95	28376.16	30051.41	< 2.2 x 10^-16	671.95	0.91
EGF^##	322.07	166.69	69.02	70.58	< 2.2 x 10^-16	4.67	0.94
A1AT^#	741.12	816.44	3656.41	15617.46	1.94 x 10^-4	0.20	0.66
tPAI-1^#	21.41	20.70	23.51	8.66	1.54 x 10^-5	0.91	0.68
ApoA-4^#	6435.65	4426.19	10800.83	4124.68	4.20 x 10^-15	0.60	0.83
ApoA-1^#	163165.22	76469.21	273728.28	134077.60	6.86 x 10^-11	0.60	0.78
TTR^#	153785.51	59538.28	211772.41	67910.64	9.16 x 10^-9	0.73	0.74
Hp^#	1555362.32	833555.83	925657.93	454309.62	7.83 x 10^-8	1.68	0.73
proApoA-1^#	35689.13	13861.78	22000.83	8206.82	2.22 x 10^-16	1.62	0.85
Apoa-1/proApoA1^###	4.57	194.20	12.44	12.62	1.09 x 10^-16	0.36	0.85
CRP/Kininogen^###	0.63	1.87	0.10	0.55	1.59 x 10^-7	6.61	0.72
Cathepsin B^#	1822.84	1289.01	1036.10	846.09	2.13 x 10^-6	1.76	0.70

* AUC(Area under the receiver operator characteristic(ROC) curve): ROC 곡선 아래 부위

삭제

^#: ng/㎖

^##: pg/㎖

^###: 비율 (

)

또한, 각 마커간 관련성을 검증하기 위해 상관관계분석을 하였다. 13가지 개별 단백질들 간의 스피어만 상관계수를 보면 ApoA-1/proApoA-1은 ApoA-1(r=0.85), proApoA-1(r=-0.78)과 EGF는 sCD40L(r=0.75)과 상관관계가 있었으나 나머지 마커의 경우 모두 0.5보다 작은 값으로 각 단백질 간에 관련성은 낮았다.

<실시예 5> 대장암 분류모델 구축 및 검증

<5-1> 분류모델 생성

실시예 4에서 통계적으로 선택한 13개 마커(D-Dimer, sCD40L, EGF, A1AT, tPAI-1, ApoA-4, ApoA-1, TTR, Hp, proApoA-1, ApoA-1/proApoA-1, CRP/Kininogen, Cathepsin B)들의 대장암 진단 능력을 평가하여 분류모델을 생성하였다.

구체적으로, 정상인 145명과 대장암 환자 69명 데이터에서 정상인 50명과 대장암 환자 50명으로 이루어진 훈련 집단(training set)과 정상인 95명, 대장암 환자 19명으로 된 평가 집단(test set)을 각각 무작위로 50개씩 만들었고, 또한 상기 13개 마커로 생성할 수 있는 모든 조합(8,190가지)을 작성하였다. 이후, 훈련 집단을 이용하여 상기 조합에 대해 LDA(linear discriminant analysis; Fisher RA, Annals of Eugenics, 7:179-188, 1936), 랜덤 포레스트 및 SVM(support vector machine; Vapnik VN et al., Technical Report CSD-TR-96-17, Univ. of London, 1996) 방법으로 분류모델을 만들었다. 아울러, 평가 집단을 이용하여 상기 분류모델의 민감도(%; 수학식 1), 특이도(%; 수학식 2) 및 정확도(%; 민감도와 특이도의 평균)를 평가하였다.

그 결과, 개별 마커로 모델을 만들어 분류했을 때는 13가지 마커 중 대장암 분류에 70% 이상의 정확도를 보이는 것은 EGF, sCD40L, ApoA-1/proApoA-1 및 proApoA-1 등 4가지였다. 나머지 마커들은 모두 70% 미만의 정확도를 보일 뿐이었다(표 4). 그러나 마커들의 조합으로 이루어진 분류모델에서는 더 높은 정확도를 얻을 수 있었다(표 6 내지 10). 예를 들어 EGF, proApoA-1, ApoA-4 및 TTR의 4개 마커로 이루어진 모델의 정확도는 91.43%(민감도 87.8%, 특이도 95.1%)로 단일 마커인 경우에 비해 훨씬 높은 정확도의 분류모델을 만들 수 있었다(표 5).

마커를 이용한 분류(LDA)

마커	정확도(%)	민감도(%)	특이도(%)
EGF	86.09	79.58	92.61
EGF, proApoA1	90.21	85.47	94.95
EGF, proApoA1, ApoA4	91.31	86.84	95.77
EGF, proApoA1, ApoA4, TTR	91.43	87.79	95.07

마커를 이용한 분류(RF)

마커	정확도(%)	민감도(%)	특이도(%)
sCD40L	77.47	78.32	76.63
sCD40L, ApoA4	82.76	81.89	83.62
sCD40L, ApoA4, D-Dimer	85.81	83.79	87.83
sCD40L, ApoA4, D-Dimer, ApoA1	89.13	88.53	89.73
sCD40L, ApoA4, D-Dimer, ApoA1, tPAI-1	90.21	89.47	90.95

마커를 이용한 분류(RF)

마커	정확도(%)	민감도(%)	특이도(%)
EGF	81.26	80.74	81.79
EGF sCD40L	87.17	88.00	86.34
EGF, sCD40L, ApoA1/proApoA1	91.33	92.32	90.34

마커를 이용한 분류(SVM)

마커	정확도(%)	민감도(%)	특이도(%)
ApoA1	72.56	80.00	65.12
ApoA1, TTR	72.92	73.68	72.15
ApoA1, TTR, tPAI-1	78.03	75.79	80.27

마커를 이용한 분류(SVM)

마커	정확도(%)	민감도(%)	특이도(%)
ApoA1	72.56	80.00	65.12
ApoA1, Hp	77.45	83.79	71.12
ApoA1, Hp, TTR	77.59	74.74	80.44
ApoA1, Hp, TTR, tPAI-1	82.46	80.00	84.93

마커를 이용한 분류(SVM)

마커	정확도(%)	민감도(%)	특이도(%)
ApoA4	77.16	72.32	82.00
ApoA4, ApoA1/proApoA1	78.77	73.68	83.85
ApoA4, ApoA1/proApoA1, Hp	81.55	78.63	84.46
ApoA4, ApoA1/proApoA1, Hp, TTR	81.74	76.74	86.74
ApoA4, ApoA1/proApoA1, Hp, TTR, CRP/Kininogen	82.38	78.42	86.34
ApoA4, ApoA1/proApoA1, Hp, TTR, CRP/Kininogen, tPAI-1	84.38	83.37	85.39

<5-2> 분류모델 검증

정상인 37명과 대장암 환자 25명으로 구성된 별도의 실험대상에 대해, 실시예 5-1에서 생성한 분류모델들을 테스트 세트(정상인과 대장암 환자를 아는 상태에서 검증) 및 블라인드 세트(정상인과 대장암 환자를 알지 못하는 상태에서 검증)를 이용하여 검증하였다.

그 결과, 표 11에서 나타난 바와 같이 예를 들어 Apoa-1/proApoA-1, EGF, proApoA-1 마커 조합과 ApoA-4, EGF, proApoA-1 마커 조합의 경우 LDA 방법을 사용했을 때 각각 정확도 91.8%(민감도 87.9%, 특이도 95.7%)와 정확도 91.3%(민감도 86.8%, 특이도 95.8%)를 나타내었고, 블라인드 세트에선 각각 민감도 87.0%, 특이도 96.4%와 민감도 88.7%, 특이도 96.1%를 나타내었고, ApoA-4, Cathepsin B, sCD40L, D-Dimer, EGF 마커 조합과 ApoA-1, ApoA-4, sCD40L, D-Dimer, tPAI-1, proApoA-1 마커 조합의 경우 RF 방법으로 만든 모델에 적용했을 때 각각 정확도 92.5%(민감도 93.7%, 특이도 91.3%)와 정확도 91.8%(민감도 89.6%, 특이도 94.0%)를 나타내었고, 블라인드 세트에선 각각 민감도 92.3%, 특이도 88.5%와 민감도 85.1%, 특이도 98.7%를 나타내었다. 아울러, ApoA-1, EGF, proApoA-1 마커 조합과 Cathepsin B, EGF, proApoA-1 마커 조합의 경우 SVM 방법을 사용했을 때 각각 정확도 92.1%(민감도 92.2%, 특이도 92.0%)와 정확도 92.6%(민감도 93.4%, 특이도 91.9%)를 나타내었고, 블라인드 세트에선 각각 민감도 91.1%, 특이도 91.2%와 민감도 89.8%, 특이도 93.7%를 나타내었다.

도 1은 각 마커에 대한 자료값을 크기 순서대로 나열하여 최대값, 최소값, 중앙값(median) 및 25%에 해당하는 제 1사분위 값 및 75%에 해당하는 제 3사분위 값을 구하고, 이 값들의 위치를 상자와 수염 모양으로 분포를 나타내는 상자수염도(Box-and-Whisker plot)를 보여주는 그림이다:

x축: cc- 대장암, nl- 정상인; 및

y축: 마커 농도 측정값의 상용 로그(log)를 취한 값.

Claims

1) 대상자의 혈액, 혈장 또는 혈청으로부터 ApoA-1/proApoA-1(ApoA-1과 Proapolipoprotein-A1의 비율), EGF(Epidermal growth factor) 및 proApoA-1(Proapolipoprotein-A1)의 조합, ApoA-4(Apolipoprotein-A4), EGF 및 proApoA-1의 조합, ApoA-1(Apolipoprotein-A1), EGF 및 proApoA-1의 조합, EGF, proApoA-1 및 TTR(Transthyretin)의 조합, A1AT(Alpha-1-antitrypsin),EGF 및 proApoA-1의 조합, ApoA-4, EGF 및 TTR의 조합, ApoA-1, EGF 및 Hp(Haptoglobin)의 조합, ApoA-1, EGF 및 TTR의 조합, ApoA-1, ApoA-1/proApoA-1, ApoA-4 및 EGF의 조합, A1AT, ApoA-1, ApoA-4, sCD40L(Soluble CD40 ligand) 및 EGF의 조합, A1AT, ApoA-1, ApoA-4, D-Dimer 및 EGF의 조합, A1AT, ApoA-1/proApoA-1, CRP/Kininogen(CRP와 Kininogen의 비율), EGF, Hp 및 TTR의 조합, A1AT, ApoA-1/proApoA-1, EGF, Hp, tPAI-1(Total plasminogen activator inhibitor-1) 및 TTR의 조합, Cathepsin B, EGF 및 tPAI-1의 조합, ApoA-1, Cathepsin B 및 EGF의 조합, Cathepsin B, EGF 및 proApoA-1의 조합, ApoA-1/proApoA-1, Cathepsin B 및 EGF의 조합, Cathepsin B, D-Dimer, EGF 및 TTR의 조합, ApoA-4, Cathepsin B, sCD40L, D-Dimer 및 EGF의 조합, ApoA-4, Cathepsin B, CRP/Kininogen, D-Dimer 및 EGF의 조합, A1AT, ApoA-4, Cathepsin B, sCD40L 및 EGF의 조합, A1AT, Cathepsin B, sCD40L, EGF 및 TTR의 조합, ApoA-4, Cathepsin B, sCD40L, EGF 및 TTR의 조합, Cathepsin B, sCD40L, CRP/Kininogen, EGF 및 TTR의 조합, ApoA-4, Cathepsin B, EGF, Hp 및 TTR의 조합, ApoA-4, Cathepsin B, CRP/Kininogen, EGF 및 TTR의 조합, ApoA-4, Cathepsin B, sCD40L, CRP/Kininogen, EGF 및 Hp의 조합, ApoA-1, ApoA-1/proApoA-1, ApoA-4, Cathepsin B, sCD40L, D-Dimer, Hp, tPAI-1 및 TTR의 조합, ApoA-1, ApoA-4, Cathepsin B, sCD40L, CRP/Kininogen, D-Dimer, Hp, tPAI-1 및 TTR의 조합, ApoA-1, ApoA-1/proApoA-1, ApoA-4, Cathepsin B, sCD40L, CRP/Kininogen, D-Dimer, Hp 및 TTR의 조합, A1AT, ApoA-1/proApoA-1, ApoA-4, Cathepsin B, CRP/Kininogen, D-Dimer, Hp, tPAI-1, proApoA-1 및 TTR의 조합, ApoA-1/proApoA-1 및 EGF의 조합, EGF 및 proApoA-1의 조합, ApoA-1 및 EGF의 조합, EGF 및 tPAI-1의 조합, ApoA-4, sCD40L 및 EGF의 조합, sCD40L, D-Dimer 및 EGF의 조합, A1AT, ApoA-4 및 EGF의 조합, D-Dimer, EGF 및 TTR의 조합, A1AT, D-Dimer 및 EGF의 조합, EGF, Hp 및 TTR의 조합, CRP/Kininogen, D-Dimer, EGF 및 Hp의 조합, ApoA-4, sCD40L, D-Dimer 및 Hp의 조합, ApoA-4, sCD40L, D-Dimer 및 TTR의 조합, A1AT, ApoA-4, sCD40L 및 D-Dimer의 조합, ApoA-4, sCD40L, CRP/Kininogen, D-Dimer 및 proApoA-1의 조합, ApoA-4, sCD40L, CRP/Kininogen, D-Dimer 및 tPAI-1의 조합, A1AT, ApoA-4, sCD40L, CRP/Kininogen 및 TTR의 조합, ApoA-1/proApoA-1, ApoA-4, D-Dimer, tPAI-1 및 TTR의 조합, A1AT, ApoA-1/proApoA-1, D-Dimer, tPAI-1 및 TTR의 조합, ApoA-1, ApoA-4, sCD40L, D-Dimer, tPAI-1 및 proApoA-1의 조합, A1AT, ApoA-4, sCD40L, CRP/Kininogen, Hp 및 proApoA-1의 조합, ApoA-1/proApoA-1, CRP/Kininogen, D-Dimer, Hp, tPAI-1 및 TTR의 조합, ApoA-1, ApoA-1/proApoA-1, ApoA-4, Hp, tPAI-1, proApoA-1 및 TTR의 조합, ApoA-1, ApoA-4, D-Dimer, Hp, tPAI-1, proApoA-1 및 TTR의 조합, ApoA-1, CRP/Kininogen, D-Dimer, Hp, tPAI-1, proApoA-1 및 TTR의 조합, A1AT, ApoA-1, CRP/Kininogen, D-Dimer, Hp, tPAI-1 및 proApoA-1의 조합, A1AT, ApoA-1, ApoA-1/proApoA-1, ApoA-4, CRP/Kininogen, D-Dimer, Hp, proApoA-1 및 TTR의 조합, sCD40L 및 ApoA-4의 조합, sCD40L, ApoA-4 및 D-Dimer의 조합, sCD40L, ApoA-4, D-Dimer 및 ApoA-1의 조합, sCD40L, ApoA-4, D-Dimer, ApoA-1 및 tPAI-1의 조합, EGF 및 sCD40L의 조합, EGF, sCD40L 및 ApoA-1/proApoA-1의 조합,

ApoA1, TTR 및 tPAI-1의 조합, ApoA1 및 Hp의 조합, ApoA1, Hp 및 TTR의 조합, ApoA1, Hp, TTR 및 tPAI-1의 조합, ApoA4 및 ApoA1/proApoA1의 조합, ApoA4, ApoA1/proApoA1 및 Hp의 조합, ApoA4, ApoA1/proApoA1, Hp 및 TTR의 조합, ApoA4, ApoA1/proApoA1, Hp, TTR 및 CRP/Kininogen의 조합, ApoA4, ApoA1/proApoA1, Hp, TTR, CRP/Kininogen 및 tPAI-1의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 조합의 단백질의 발현량 또는 단백질 발현량의 비율을 측정하는 단계; 및

2) 단계 1)의 상기 선택된 단백질의 발현량 또는 단백질 발현량의 비율이 D-Dimer, sCD40L, EGF, Hp, proApoA-1, Cathepsin B의 발현량은 정상인보다 높고, CRP/Kininogen의 비율은 정상인보다 높으며, A1AT, tPAI-1, ApoA-4, ApoA-1, TTR의 발현량은 정상인보다 낮고, ApoA-1/proApoA1의 비율은 정상인보다 낮은 경우 대장암 발병 위험이 높을 것으로 확인하는 단계를 포함하는, 대장암의 진단을 위한 상기 단백질들의 검출 방법.

1) 대상자의 혈액, 혈장 또는 혈청으로부터 CRP/Kininogen(CRP와 Kininogen의 단백질 발현량의 비율)을 측정하는 단계; 및

2) 단계 1)의 상기 단백질 발현량의 비율을 분석하여 정상인보다 높은 경우 대장암 발병 위험이 높을 것으로 확인하는 단계를 포함하는 대장암의 진단을 위한 상기 단백질의 검출 방법.

제 2항에 있어서, 단계 3) 대상자의 혈액, 혈장 또는 혈청으로부터 EGF(Epidermal growth factor), sCD40L(Soluble CD40 ligand), proApoA-1(Proapolipoprotein-A1), D-Dimer, Cathepsin B, A1AT, Hp(Haptoglobin), tPAI-1, ApoA-4, ApoA-1, ApoA-1/proApoA-1(ApoA-1과 Proapolipoprotein-A1의 단백질 발현량의 비율) 및 TTR로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현량 또는 단백질 발현량의 비율을 측정하는 단계; 및

4) EGF(Epidermal growth factor), sCD40L(Soluble CD40 ligand), proApoA-1(Proapolipoprotein-A1), D-Dimer, Cathepsin B, Hp(Haptoglobin)의 단백질의 발현량을 분석하여 이들이 정상인보다 높은 경우, A1AT, tPAI-1, ApoA-4, ApoA-1, TTR의 단백질의 발현량을 분석하여 이들이 정상인보다 낮은 경우 또는 ApoA-1/proApoA-1(ApoA-1과 Proapolipoprotein-A1의 단백질 발현량의 비율)을 분석하여 정상인보다 낮은 경우 대장암 발병 위험이 높을 것으로 확인하는 단계를 포함하는, 대장암의 진단을 위한 상기 단백질들의 검출 방법.

1) 대상자의 혈액, 혈장 또는 혈청으로부터 ApoA-4(Apolipoprotein-A4) 단백질의 발현량, TTR(Transthyretin) 단백질의 발현량 또는 ApoA-1/proApoA-1(ApoA-1과 Proapolipoprotein-A1의 단백질 발현량의 비율)을 측정하는 단계; 및

2) 단계 1)의 상기 단백질의 발현량 또는 단백질 발현량의 비율을 분석하여 이들이 정상인보다 낮은 경우 대장암 발병 위험이 높을 것으로 확인하는 단계를 포함하는 대장암 진단을 위한 상기 단백질의 검출 방법.

제 4항에 있어서, 단계3) 대상자의 혈액, 혈장 또는 혈청으로부터 tPAI-1(Total plasminogen activator inhibitor-1), ApoA-1(Apolipoprotein-A1), A1AT, D-Dimer, sCD40L, EGF, Hp, proApoA-1, CRP/Kininogen(CRP 및 Kininogen의 단백질 발현량의 비율) 및 Cathepsin B로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현량 또는 단백질 발현량의 비율을 측정하는 단계; 및

4) D-Dimer, sCD40L, EGF, Hp, proApoA-1, Cathepsin B의 단백질의 발현량을 분석하여 이들이 정상인보다 높은 경우, CRP/Kininogen(CRP 및 Kininogen의 단백질 발현량의 비율)을 분석하여 정상인보다 높은 경우 또는 tPAI-1(Total plasminogen activator inhibitor-1), ApoA-1(Apolipoprotein-A1), A1AT의 단백질의 발현량을 분석하여 이들이 정상인보다 낮은 경우 대장암 발병 위험이 높을 것으로 확인하는 단계를 포함하는, 대장암의 진단을 위한 상기 단백질들의 검출 방법.

제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 1)의 측정은 2차원 전기영동, 바이오칩 또는 상기 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 검출 방법.

제 6항에 있어서, 바이오칩은 단백질칩 또는 핵산 어레이인 것을 특징으로 하는 검출 방법.

제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 2)의 분석은 바이오인포매틱스 및 통계적 분석방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 검출 방법.

제 8항에 있어서, 통계적 방법은 LDA(linear discriminant analysis), SVM(support vector machine), tree 또는 랜덤 포레스트(random forest)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 검출 방법.