KR102268963B1 - 머신러닝 기법으로 말초혈액 내 암 면역력을 평가하여 암을 진단하거나 치료반응을 예측하는 방법 및 이를 이용한 진단키트 - Google Patents

머신러닝 기법으로 말초혈액 내 암 면역력을 평가하여 암을 진단하거나 치료반응을 예측하는 방법 및 이를 이용한 진단키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 머신러닝 기법으로 말초혈액 내 암 면역력을 평가하여 암을 진단하거나 치료반응을 예측하는 방법에 있어서, (A) 말초혈액(전혈 시료) 내 백혈구 백분율 혈액 검사 결과를 자동혈구분석기를 이용하여 얻는 단계;(B) 형광 항체염색법으로 말초혈액(전혈 시료) 내 면역세포의 표지 마커 및 활성화(activating) 또는 억제(inhibitory) 마커를 염색하는 단계;(C) 유세포 분석기를 이용하여 세포의 크기(FSC, forward scatter), 과립의 정도(SSC, side scatter), 및 CD45 발현 분석을 통하여 림프구, 단핵구, 및 과립구 세포로 분류하고 그 서브 그룹 내에서 표지 마커의 염색 정도에 따라 면역세포를 NK 세포, T 세포, B 세포, 수지상 세포, 조절 T 세포, 조절 B 세포, 및 골수유래 억제세포로 분류하는 단계;(D) 유세포 분석기를 이용하여 각각의 면역세포들의 활성화 또는 억제 마커 발현을 분석하는 단계;(E) 백혈구 백분율 데이터와 유세포 분석 데이터를 모아서 머신 러닝 알고리즘에 학습시키고 모델을 생성하는 단계; 및(F) 생성된 알고리즘 모델을 통하여 정상인과 암 환자의 결과 값을 분류 값 또는 확률 값으로 구하고, 민감도와 특이도 및 ROC curve를 기초로 하여 cut-off value 값을 구한 후 암 면역력을 판단하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

Description

머신러닝 기법으로 말초혈액 내 암 면역력을 평가하여 암을 진단하거나 치료반응을 예측하는 방법 및 이를 이용한 진단키트{A method and kit for cancer diagnostics or predict response to treatment by evaluating cancer immunity in peripheral blood by machine learning technique}
본 발명은 암 환자와 정상인의 말초혈액 내 자연살해 세포(NK cell), T 세포(T cell), B 세포(B cell), 수지상 세포(Dendritic cell), 조절 T (Regulatory T, Treg) 세포, 조절 B (Regulatory B, Breg) 세포, 골수유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cell, MDSC)의 숫자와 퍼센트, 그리고 마커 발현율에 대한 유세포 분석 데이터 및 백혈구 백분율 혈액검사 데이터를 머신 러닝 부스팅(boosting) 알고리즘에 학습시켜서 정상인 및 암 환자의 암 면역력을 분류하고 이를 통해 암의 존재를 예측, 또는 암 환자의 치료 경과 관찰 및 치료 반응을 예측하는데 활용하는 기술에 관한 것이다.
면역체계 또는 면역기능은 인체의 정상 방어기전으로 감염, 종양 등의 질환으로부터 인체를 보호하는 기능을 갖고 있다. 인체 내로 세균이나 바이러스가 침투하거나 인체 내에 이상세포가 발견될 경우 면역체계는 이를 파괴하고 제거한다. 정상 세포와 달리 암세포는 이상세포로 인지될 수 있고 면역세포에 의하여 파괴 및 제거됨으로써 암의 진행이 억제된다. 따라서 암의 진행은 면역체계의 이상을 의미할 수 있다.
정상 세포가 암세포로 변이되었을 때 암세포의 파괴를 위한 면역반응을 유도하기 위하여 NK 세포, T 세포, B 세포, 및 수지상 세포 등 다양한 선천면역계와 후천면역계의 세포들 및 활성 분자들이 상호작용해야 한다. NK 세포는 선천면역 세포 중의 하나로 암세포에 대해 선택적인 세포독성을 보이며 다른 면역세포와 달리 암세포를 즉각적으로 감지하여 바로 제거할 수 있고, 이것은 NK 세포 표면에 존재하는 다양한 면역 수용체(immune receptor)를 통하여 암세포와 정상 세포를 구분할 수 있기 때문이다. T 세포는 T 림프구(T lymphocyte)라고도 불리며 항원 특이적인 면역반응을 주관하는 림프구 세포로 도움 T 세포(helper T cell)와 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)로 나뉘며, 세포독성 T 세포는 비정상적인 암세포를 직접 죽이는 역할을 하고, 도움 T 세포는 B 세포가 항체를 생산할 수 있도록 도와주어 암세포를 제거하며, 같은 항원에 대하여 기억능력을 가질 수 있다. 수지상 세포는 항원전달 세포(antigen-presenting cell)로 주로 조직이나 피부 밑에 분포하며, 암 형성과정에서 생성된 항원을 획득한 후 가까운 림프절로 이동하여 미접촉 T(Naive T) 세포에 항원을 제시하고 항원 감작을 통해 미접촉 T 세포를 효과 T(effector T) 세포로 분화시키고 활성화한다. 항원에 감작된 암 특이적인 효과 T 세포는 암으로 이동해가서 종양 중심으로 침투하고 퍼포린(perforin)과 그랜자임(granzyme) 및 세포사멸수용체인 Fas와 Fas 리간드의 상호 작용에 의해 암세포를 사멸시킨다.
암 발생의 초기 단계에서는 면역세포들에 의해 암세포들이 제거되나, 면역계가 감당할 수 없을 정도로 암세포가 빨리 성장하여 살아남는 암세포의 숫자가 증가하게 되면 암세포들은 면역감시를 회피하여 계속 증식하게 된다. 암 덩어리가 발견되는 단계에서는 면역억제 암 미세환경(tumor microenvironment, TME)이 주로 형성되어서 면역계가 암을 쉽게 제거하기 어려운 상황에 놓이게 된다. 암 미세환경에서는 암세포가 면역억제 작용을 담당하는 조절 T 세포, 조절 B 세포, 암 관련대식세포, 및 골수유래 억제세포 등을 불러들여서 광범위한 면역억제 효과를 나타내며 암세포의 증식 및 전이가 일어나게 된다. 이 외에도 암세포는 세포 사멸 단백질 리간드-1(PD-L1)을 포함한 여러 면역관문 분자들을 발현하여 T 세포의 활성을 억제하고 면역감시를 회피하거나, 전환성장인자(Transforming growth factor, TGF)와 같은 사이토카인을 분비하여 T 세포는 물론 대식세포와 수지상 세포 등의 면역작용을 억제할 수 있다.
암을 진단하는 가장 보편화 된 방법은 CT, MRI, X선 등의 영상의학적인 방법과 조직학적인 방법이다. 그러나 이러한 검사는 환자가 통증이나 불편함으로 인하여 검사에 대한 적극적 의지를 갖고 있을 때 시행되며, 특정 조직에 국한하여 시행되기 때문에 암의 존재를 지나치기 쉬운 문제점이 존재한다. 간단하고 손쉬운 방법으로 혈액 내 종양 표지자를 이용하여 전립선암, 대장암, 난소암, 췌장암, 간암 등에 대한 발생 여부를 예측하는 방법이 있지만, 이는 위양성 및 위음성의 빈도가 높고 전체적인 특이도에 있어서 만족할만한 수준이 아니다. 따라서 다양한 유형의 암을 진단하기 위한 새로운 방법에 대한 요구가 계속되고 있다.
혈액 시료 안에는 종양 표지자와 같은 단백질 이외에도 많은 면역세포가 존재하며, 암의 발생 및 진행 과정에서 암과 면역세포가 밀접하게 상호작용하는 것으로 알려져 있으므로 이러한 면역세포들을 분석하여 암 면역력을 평가하고 이를 통해 암의 존재를 예측, 진단 및 치료 반응성 평가에 이용할 수 있다.
앞서 기술한 것처럼 면역력은 면역 시스템(Immune system)을 이루고 있는 다양한 세포와 단백질(Immune cells and proteins) 등과 같은 여러 요소들의 합(Net effect)으로 나타나게 되므로 개인 면역력(Personal immunity)은 서로 다를 수 있으며 시시각각 변화할 수 있다. 따라서 개인의 면역력을 측정하고 정량적으로 평가하는 것은 아직도 해결하지 못한 숙제로 남아있다. 본 발명에서는 머신러닝 기술을 이용하여 서로 다른 개인의 암 면역력을 정량화하고 평가 및 분류하여서 개인마다 서로 다른 면역력에 근거한 개인 맞춤형 치료(Tailored personal immunotherapy)에 도움을 주고자 한다. 일반적으로 치료(Treatment or Therapy)라고 하는 것은 어떠한 질병의 진단(Diagnosis)이 선행된 다음 그에 맞는 치료법이 결정되는 과정을 거치게 된다. 면역치료 역시 면역 진단(Immune diagnosis)이 선행 되어야만 그에 맞는 치료가 가능한데 대부분의 면역치료는 정확한 면역진단 없이 시행되고 있는 것이 현실이다. 이것은 앞서 언급한 바와 같이 개인의 면역력이 굉장히 복잡하여 면역력을 평가하고 진단하는 방법론적인 기준이나 근거가 정립되어 있지 않기 때문이다.
대한민국 공개특허공보 제10-2009-0121259호(2009.11.25) 대한민국 공개특허공보 제10-2010-0121949호(2010.11.19)
본 발명의 목적은 암의 발생 및 진행 과정에 관여하는 혈액 내 면역세포들의 분석결과를 이용하여 정상인과 암 환자의 암 면역력을 분류할 수 있는 머신 러닝 알고리즘 모델을 찾고 암 면역력의 평가를 통해 암의 존재를 예측하는 진단 기술 및 암 환자의 치료 경과 관찰 또는 반응 예측에 활용할 수 있는 기술을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 암 면역력의 평가를 통하여 1) 정상인의 암 면역력이 정상 수준인지 암 환자에 가깝게 위험한 수준으로 떨어졌는지를 평가하고 암의 존재 가능성을 예측하며, 2) 외과적 수술 또는 항암 및 방사선 치료 후 암 환자의 암 면역력을 평가하여 치료 경과를 관찰하고, 3) 면역항암제 치료 후 치료 반응을 예측할 수 있는 기술을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 머신러닝 기법으로 말초혈액 내 암 면역력을 평가하여 암을 진단하거나 치료반응을 예측하는 방법에 있어서, (A) 말초혈액(전혈 시료) 내 백혈구 백분율 혈액 검사 결과를 자동혈구분석기를 이용하여 얻는 단계;(B) 형광 항체염색법으로 말초혈액(전혈 시료) 내 면역세포의 표지 마커 및 활성화(activating) 또는 억제(inhibitory) 마커를 염색하는 단계;(C) 유세포 분석기를 이용하여 세포의 크기(FSC, forward scatter), 과립의 정도(SSC, side scatter), 및 CD45 발현 분석을 통하여 림프구, 단핵구, 및 과립구 세포로 분류하고 그 서브 그룹 내에서 표지 마커의 염색 정도에 따라 면역세포를 NK 세포, T 세포, B 세포, 수지상 세포, 조절 T 세포, 조절 B 세포, 및 골수유래 억제세포로 분류하는 단계;(D) 유세포 분석기를 이용하여 각각의 면역세포들의 활성화 또는 억제 마커 발현을 분석하는 단계;(E) 백혈구 백분율 데이터와 유세포 분석 데이터를 모아서 머신 러닝 알고리즘에 학습시키고 모델을 생성하는 단계; 및(F) 생성된 알고리즘 모델을 통하여 정상인과 암 환자의 결과 값을 분류 값 또는 확률 값으로 구하고, 민감도와 특이도 및 ROC curve를 기초로 하여 cut-off value 값을 구한 후 암 면역력을 판단하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
보다 상세히, 본 발명은(G) 상기 cut-off value 값에 따라 암 면역력을 평가하여 암의 존재를 예측하고 암 환자의 치료 경과 관찰 또는 반응 예측에 활용하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 말초혈액 내 면역세포를 1) NK 세포와 NKT 세포 2) T 세포의 아형(Naive T, Central memory T, Effector memory T, EMRA T cell) 3) 효과 T 세포의 아형(Th1, Th2, and Th17 cell) 4) 탈진된(exhausted) T 세포에서 면역관문 분자 발현 5) 수지상 세포 6) B 세포 7) 골수유래 억제세포 8) 조절 T 세포 9) 조절 B 세포와 같이 9가지 세포군으로 분류하여 분석하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 말초혈액 내 면역세포는 아래 표 9와 같은 면역세포들의 아형 또는 마커들 중 어느 하나 또는 조합의 분석결과를 얻어서 암 면역력을 평가하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 면역세포를 염색하는 방법은 세포막 표지 마커를 염색하는 방법과 세포 내(intracellular) 마커를 염색하는 방법으로 나뉘며, 세포막 표지 마커 염색과 세포 내 염색을 모두 수행해야 하는 경우 세포막 표지 마커를 먼저 염색한 후 세포 내 마커를 염색하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 NK 세포의 퍼포린, 골수유래 억제세포의 전환성장인자-베타(TGF-β), 아르기나제-1(arginase-1), T 세포, 및 조절 T 세포의 세포독성 T 림프구 단백질 4(Cytotoxic T Lymphocyte Associated Antigen 4 or CD152 or CTLA4)는 세포 내 염색을 수행하고, 이를 제외한 마커의 염색은 세포막 염색을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기(C) 또는(D) 단계에서 각 면역세포의 특이적인 마커의 발현을 분석하여 면역세포의 표현형을 분포도(%)와 세포 수 및 그 발현율로 분석하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기(E) 단계는 백혈구 백분율 데이터와 면역세포에 대한 유세포 분석 데이터를 모아서 머신 러닝 부스팅 알고리즘으로 모델을 생성하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
한편, 본 발명은 위와 같은 방법에 의해 암 면역력을 측정하거나 암 예측 정보를 제공하는 진단키트를 제공한다.
한편, 본 발명은 위와 같은 방법에 의해 암 환자의 암 면역력을 평가하여 치료 경과에 대한 정보를 제공하는 진단키트를 제공한다.
한편, 본 발명은 위와 같은 방법에 의해 면역항암제 치료 후 치료 반응에 대한 정보를 제공하는 진단키트를 제공한다.
본 발명은 암의 발생 및 진행 과정에 관여하는 혈액 내 면역세포들의 분석결과를 이용하여 정상인과 암 환자의 암 면역력을 분류할 수 있는 머신 러닝 알고리즘 모델을 찾고 암 면역력의 평가를 통해 암의 존재를 예측하는 진단 기술 및 암 환자의 치료 경과 관찰 또는 반응 예측에 활용할 수 있는 기술을 제공한다.
또한, 본 발명은 혈액 내 면역세포에서 일어나는 변화 측정을 통하여 정상인과 암 환자의 암 면역력을 판별하고, 1) 정상인의 암 면역력이 암 환자에 가깝게 위험한 수준으로 떨어지는지에 대한 평가를 통하여 암의 존재 가능성을 예측하며, 2) 외과적 수술을 하거나 항암 또는 방사선 치료를 받은 암 환자의 암 면역력을 평가하여 치료 경과를 관찰하게 하고, 3) 면역항암제 치료 후 치료 반응을 예측하는데 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 면역세포의 표현형 마커를 이용하여 NK 세포와 NKT 세포를 구분하고 활성화 또는 억제 마커의 발현을 분석하는 방법을 설명한 도면.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 표현형 마커를 이용하여 T 세포의 아형을 구분하여 분석하는 방법을 설명한 도면.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 표현형 마커를 이용하여 효과 T 세포의 아형을 구분하여 분석하는 방법을 설명한 도면.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 표현형 마커를 이용하여 T 세포의 아형을 구분하고 면역관문분자 발현을 분석하는 방법을 설명한 도면.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 표현형 마커를 이용하여 수지상 세포의 아형을 구분하여 분석하는 방법을 설명한 도면.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 표현형 마커를 이용하여 B 세포의 아형을 구분하고 더 나아가서 조절 B 세포를 구분하여 분석하는 방법을 설명한 도면.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 표현형 마커를 이용하여 골수유래 억제세포를 구분하여 분석하고 면역억제 인자인 전환성장인자-베타와 아르기나제-1의 발현을 분석하는 방법을 설명한 도면.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 표현형 마커를 이용하여 조절 T 세포를 구분하여 분석하고 T 세포와 조절 T 세포에서 면역관문분자인 세포독성 T 림프구 단백질 4의 발현을 분석하는 방법을 설명한 도면.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 머신 러닝 부스팅 알고리즘 모델의 ROC 곡선을 도시한 도면.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 머신 러닝 부스팅 알고리즘으로 구한 정상인과 암 환자의 예측값을 도시한 도면.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 수술 전후 위암 환자의 예측값을 나타내는 도면.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 수술 전후 난소암 환자의 예측값을 나타내는 도면.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 수술 전후 결장암 환자의 예측값을 나타내는 도면.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 머신 러닝 알고리즘을 통해 얻은 대장직장암, 유방암, 위암, 난소암, 폐암, 간암 환자들의 암 면역력 예측값을 도시한 도면.
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 실시예를 예시로서 도시하는 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시예는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일 실시예에 관련하여 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시예로 구현될 수 있다. 또한, 각각의 개시된 실시예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 후술하는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다.
이하에서는, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시예들에 관하여 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.
본 발명에서는 1단계로 정상인과 암 환자의 말초혈액을 채혈하고, 2단계로 자동혈구분석기와 유세포분석기를 이용하여 검사를 시행하며, 3단계로 도 1 내지 도 8 에서 보여주는 분석방법에 따라서 각 면역세포를 구분하여 유세포 검사결과를 얻고, 4단계로 모든 데이터를 취합하고 머신 러닝에 학습시켜서 정상인과 암 환자의 암 면역력을 분류할 수 있는 알고리즘을 생성하며, 5단계로 알고리즘을 통해 계산된 분류값을 검증하여 암 면역력을 평가하고 암 발생을 예측하여 암 환자의 치료 경과 관찰 또는 반응 예측에 활용한다.
상기 머신 러닝은 컴퓨터 과학 중 인공지능의 한 분야로, 패턴인식과 컴퓨터 학습 이론의 연구로부터 진화한 분야이다. 머신 러닝은 경험적 데이터를 기반으로 학습을 하고 예측을 수행하고 스스로의 성능을 향상시키는 시스템과 이를 위한 알고리즘을 연구하고 구축하는 기술이라 할 수 있다. 머신 러닝의 알고리즘들은 엄격하게 정해진 정적인 프로그램 명령들을 수행하는 것이라기보다, 입력 데이터를 기반으로 예측이나 결정을 이끌어내기 위해 특정한 모델을 구축하는 방식을 취한다.
본 발명에서는 정상인과 암 환자 사이의 백혈구 백분율 검사와 면역세포 검사 결과의 차이를 머신 러닝 방법으로 정량화하고 암 면역력을 평가하는 기술에 이용한다. 이를 위하여 유세포 분석 데이터와 백혈구 백분율 데이터를 모아서 R 머신 러닝 패키지에서 8가지 머신 러닝 모델을 적용하여 그 분류 성능을 평가하였으며, 그 결과 8가지 머신 러닝 모델 중 비선형 기법인 부스팅 기법이 에러율이 적고 우수했으며, 81개의 자질 중 60개 내외의 자질이 분류에 영향을 주었음을 확인하였다.
부스팅 알고리즘으로 정상인과 암 환자의 결과를 분류하기 위한 구체적인 방법을 설명하면 데이터 속성을 확인하고 학습 전에 데이터를 훈련 세트와 테스트 세트로 나누게 된다. 머신 러닝 부스팅 알고리즘이 훈련 세트로 모델을 학습시킨 후 학습에 사용되지 않은 별도의 테스트 세트로 모델을 평가한다. 평균 민감도 및 특이도는 10배 교차 검증의 10회 반복에 의해 결정하며 머신 러닝의 파라미터를 조절하여 과적합을 해결하고 에러율이 적은 모델을 생성하게 된다.
생성된 알고리즘 모델을 통하여 정상인과 암 환자의 예측값을 0과 1 사이의 확률값으로 구하고 민감도와 특이도 및 ROC curve를 기초로 하여 cut-off value를 설정한다. 예측값이 cut-off value 보다 높거나 같으면 암 면역력이 암 환자와 같이 위험한 수준으로 떨어진 것으로 판단하며 암 존재 위험이 있을 것으로 예측한다. 또한, 외과적 수술 또는 항암 및 방사선 치료를 받은 암 환자의 예측값을 일정 기간 동안 지켜보면서 치료 경과를 관찰하는데 활용하고, 면역항암제 등의 치료 후 면역억제 작용을 담당하는 세포 또는 인자들이 감소되었거나 NK와 T 세포의 수 및 활성이 증가 되었는지 등의 항목 분석을 통하여 치료 반응성을 예측할 수 있다.
본 발명에서는 암 면역력을 평가하여 암의 존재를 예측하고 나아가서 암 환자의 치료 경과 관찰 및 치료 반응 예측에 활용하기 위하여 2018년부터 2020년까지 I, II, III, IV기 암 환자 437명과 정상인 1,207명의 말초혈액을 분석하여 암 면역력을 평가할 수 있는 기술을 개발해 왔다. 정상인은 암, 심혈관계 중증 질환, 만성신장 질환 외 건강검진에서 다른 기저 질환이 없었다. 암 환자는 세부적으로 병기가 I, II, III기로 진단된 암 환자 230명에 대해 수술 전 혈액을 얻어서 분석하고, 전이 또는 재발이 일어난 IV기 암 환자 207명에 대해서는 면역항암제를 포함하여 다양한 치료요법을 받기 전과 후에 혈액 시료를 분석함으로써 치료과정 전후의 암 면역력을 평가하고 치료 경과 관찰 및 치료 반응을 예측할 수 있도록 하였다. 또한, 암 환자의 모집에 있어서 대장직장암 환자 228명, 유방암 환자 37명, 위암 환자 22명, 난소암 환자 19명, 폐암 환자 26명, 간세포암 및 간암 환자 11명 등 다양한 암 환자를 포함하여 다양한 암 종에 대하여 분석을 진행하였다. 이하, 본 발명에서 구현한 말초혈액 내 면역세포를 이용하여 암 발병 유무에 대한 정보를 제공하는 방법을 각 단계별로 구분하여 설명하겠다.
1단계: 인체의 말초혈액 채혈 및 보관방법
정상인 1,207명과 I, II, III, IV기 암 환자 437명으로부터 말초혈액을 채혈하였다. 214명의 대장직장암 환자와 소수의 위암, 난소암, 폐암 환자는 암 진단 후 수술 전 채혈을 하였으며, 전이 또는 재발이 일어난 IV기 암 환자는 면역항암제를 포함하여 다양한 치료요법을 받기 전과 후에 serial로 혈액을 채혈하였다.
자동혈구분석 검사를 위하여 말초혈액 3cc(ml)를 채혈하고 혈액 응고 방지를 위해 EDTA 튜브에 담아 즉시 검사하거나 또는 냉장 상태로 보관하면서 1일 이내에 검사하였다. 자동혈구분석장비에서 백혈구(WBC), 림프구(Lymphocytes), 호중구(Neutrophils), 단구(Monocytes), 호염구(Basophils), 그리고 호산구(Eosinophils)의 백분율 및 숫자를 구하였다.
유세포 분석 검사를 위하여 말초혈액 5cc(ml)를 채혈하고 혈액 응고 방지를 위해 즉시 헤파린(heparin) 튜브에 담아 바로 검사하거나 또는 반드시 실온 상태로 보관하면서 채혈 후 4∼6시간 이내에 검사를 시행한다. 유세포 검사 방법은 2단계에서 상세히 기술한다.
2단계: 유세포 검사 방법
유세포 분석기기에서 NK 세포, T 세포, B 세포 및 수지상 세포, 조절 T 세포, 조절 B 세포, 그리고 골수유래 억제세포를 구분하여 분석하기 위하여 각각의 면역세포 마커에 대한 다양한 형광항체 조합을 8개의 폴리스티렌 튜브에 나눠 담는다(표 1 내지 8 참조). 하기 표에서 Vol.(μl)은 테스트 당 필요한 양을 의미한다.
NK 세포와 NKT 세포를 분석하기 위한 형광항체 조합
Product Name(형광 항체) Catalog# Company Name Vol.(μl)
1 FITC Mouse Anti-Human CD3 555339 BD Pharmingen 0.5
2 PE Mouse Anti-Human CD56 555516 BD Pharmingen 2.5
3 PerCP-Cy™5.5 Mouse Anti-Human Perforin 563762 BD Pharmingen 2.5
4 PE-Cy™7 Mouse Anti-Human CD314(NKG2D) 562365 BD Pharmingen 2.5
5 Alexa Fluor® 647 anti-human CD11a/CD18(LFA-1) 363412 BioLegend 2.5
6 APC-H7 Mouse Anti-Human CD16 561306 BD Pharmingen 2.5
7 BV510 Mouse Anti-Human CD158b 743452 BD OptiBuild 0.5
8 Brilliant Violet 421™ anti-human TIGIT(VSTM3) 372710 BioLegend 0.5
Total 14
T 세포의 아형을 분석하기 위한 형광항체 조합
Product Name(형광 항체) Catalog# Company Name Vol.(μl)
1 FITC Mouse Anti-Human CD8 555366 BD Pharmingen 1
2 PE Mouse Anti-Human CD197(CCR7) 560765 BD Pharmingen 2.5
3 PE-Cy™7 Mouse Anti-Human CD45RO 560608 BD Pharmingen 0.25
4 Alexa Fluor® 647 anti-human CD11a/CD18(LFA-1) 363412 BioLegend 2.5
5 APC-Cy™7 Mouse Anti-Human CD3 557832 BD Pharmingen 1
6 BV510 Mouse Anti-Human CD278(ICOS) 744930 BD OptiBuild 2.5
Total 9.75
효과 T 세포의 아형을 분석하기 위한 형광항체 조합
Product Name(형광 항체) Catalog# Company Name Vol.(μl)
1 FITC Mouse Anti-Human CD3 555339 BD Pharmingen 0.5
2 PE Mouse Anti-Human CD194 551120 BD Pharmingen 0.5
3 PerCP-Cy™5.5 Mouse Anti-Human CD8 565310 BD Pharmingen 1
4 PE-Cy™7 Mouse Anti-Human CD28 560684 BD Pharmingen 1
5 APC Mouse Anti-Human CD196(CCR6) 560619 BD Pharmingen 0.2
6 APC-H7 Mouse anti-Human CD45 560178 BD Pharmingen 0.5
7 BV510 Mouse Anti-Human CD4 562970 BD Biosciences 0.5
8 BV421 Mouse Anti-Human CD183(CXCR3) 562558 BD Biosciences 2
Total 6.2
T 세포의 아형에서 면역관문분자 발현을 분석하기 위한 형광항체 조합
Product Name(형광 항체) Catalog# Company Name Vol.(μl)
1 FITC Mouse Anti-Human CD3 555339 BD Pharmingen 0.5
2 PE Mouse anti-Human CD279(PD-1) 560795 BD Pharmingen 2.5
3 PerCP-Cy™5.5 Mouse Anti-Human CD8 565310 BD Pharmingen 1
4 APC Mouse Anti-Human CD272(BTLA) 564800 BD Pharmingen 1
5 APC-H7 Mouse anti-Human CD45 560178 BD Pharmingen 0.5
6 BV510 Mouse Anti-Human CD4 563094 BD Horizon 0.5
7 Brilliant Violet 421™ anti-human TIGIT(VSTM3) 372710 BioLegend 0.5
Total 6.5
수지상 세포의 아형을 분석하기 위한 형광항체 조합
Product Name(형광 항체) Catalog# Company Name Vol.(μl)
1 Anti-Human Lineage Cocktail 1(lin 1)(CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56) RUO(GMP) 340546 BD FastImmune 5
2 PE Mouse Anti-Human CD123 555644 BD Pharmingen 1
3 BB700 Mouse Anti-Human CD141(BDCA-3) 742245 BD OptiBuild 2.5
4 PE-Cy™7 Mouse Anti-Human HLA-DR 560651 BD Pharmingen 1
5 APC Mouse Anti-Human CD11C 559877 BD Pharmingen 8
6 BV510 Mouse Anti-Human CD1c 742747 BD OptiBuild 1
7 BV421 Mouse Anti-Human CD274(PD-L1) 563738 BD Horizon 6.5
Total 25
B 세포의 아형과 조절 B 세포를 분석하기 위한 형광항체 조합
Product Name(형광 항체) Catalog# Company Name Vol.(μl)
1 FITC Mouse Anti-Human CD38 555459 BD Pharmingen 2.5
2 PE Mouse Anti-Human CD24 555428 BD Pharmingen 10
3 PerCP-Cy™5.5 Mouse Anti-Human IgD 561315 BD Pharmingen 1
4 PE-Cy™7 Mouse Anti-Human CD20 560735 BD Pharmingen 0.5
5 APC Mouse anti-Human CD27 558664 BD Pharmingen 2.5
6 APC-H7 Mouse anti-Human CD45 560178 BD Pharmingen 0.5
7 BV510 Mouse Anti-Human CD19 562947 BD Horizon 0.5
Total 17.5
골수유래 억제세포를 구분하고 전환성장인자-베타와 아르기나제-1의 발현을 분석하기 위한 형광항체 조합
Product Name(형광 항체) Catalog# Company Name Vol.(μl)
1 FITC Mouse Anti-Human CD3
FITC Mouse Anti-Human CD19
FITC Mouse Anti-Human CD56		 555339
555412
340410		 BD Pharmingen
BD Pharmingen
BD Biosciences		 3.5
2 PE Mouse anti-Human TGF-β1 562339 BD Pharmingen 2.5
3 PerCP-Cy™5.5 Mouse Anti-Human HLA-DR 560652 BD Pharmingen 1
4 PE-Cy™7 Mouse Anti-Human CD15 560827 BD Pharmingen 2.5
5 Human/Mouse Arginase 1/ARG1 APC-conjugated Antibody IC5868A R&D Systems 2.5
6 APC-H7 Mouse anti-Human CD14 560270 BD Pharmingen 1
7 BV510 Mouse Anti-Human CD11b 563088 BD Horizon 2.5
8 BV421 Mouse Anti-Human CD33 562854 BD Horizon 1
Total 16.5
조절 T 세포를 구분하고 T 세포와 조절 T 세포에서 세포독성 T 림프구 단백질 4의 발현을 분석하기 위한 형광항체 조합
Product Name(형광 항체) Catalog# Company Name Vol.(μl)
1 BB515 Mouse Anti-Human CD25 564467 BD Horizon 1
2 PE Mouse anti-Human CD279(PD-1) 560795 BD Pharmingen 5
3 PE-Cy™5 Mouse Anti-Human CD152(CTLA-4) 555854 BD Pharmingen 5
4 APC Mouse Anti-Human CD8 555369 BD Pharmingen 2
5 BV510 Mouse Anti-Human CD4 562970 BD Horizon 1
6 BV421 Mouse Anti-Human CD127 562436 BD Horizon 5
Total 14
상기와 같이 각각의 형광항체 조합을 담은 8개의 폴리스티렌 튜브에 50 - 100 μL의 전혈을 각각 분주한다(수지상 세포와 조절 T 세포를 분석하기 위한 튜브에는 100 μL의 전혈이 필요하며, 그 외 튜브에는 50 μL의 전혈을 사용).
제조된 항체 조합물과 전혈을 마이크로피펫으로 잘 섞어준 후 빛을 차단하고 실온에서 30분간 세포막 표지 마커 염색을 한다.
FACS Lysing Solution(BD, Cat No. 349202)을 매뉴얼에 따라 1X가 되도록 희석하여 준비한다.
세포막 표지 마커 염색 후 혈액의 적혈구(red blood cell, RBC)를 제거하기 위하여 1 mL의 Lysing Solution(1X)을 각각의 폴리스티렌 튜브에 분주하고 vortex로 잘 섞은 후 20분간 빛을 차단한 실온에 둔다. 단, 수지상 세포와 조절 T 세포를 위한 튜브에는 100 μL의 전혈이 있으므로 2 mL의 lysing solution(1X)을 넣는다.
세포를 세척하기 위하여 각 튜브에 2 mL의 PBS를 가한 후 잘 섞어주고 250 중력가속도로 5분간 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 제거한다. 동일한 과정을 반복하여 세포를 한 번 더 세척한다.
세포막 표지 마커만 염색하는 5개의 튜브(표 2 내지 표 6의 항체조합 튜브)에는 200 μL의 PBS를 넣고 잘 섞어준 후 유세포 분석을 시행하거나 분석 전까지 냉장 보관한다.
한편, 세포 내 마커를 염색하기 위하여 Perm/Wash buffer(BD, Cat No. 554723)를 매뉴얼에 따라 1X가 되도록 희석하여 준비한다.
세포 내 마커를 염색하는 3개의 튜브(표 1, 7, 8의 항체조합 튜브)에 500 μL 또는 1 mL의 1X Perm/Wash buffer를 가해준 후 vortex로 잘 섞고 세포막 통과를 위해 5분간 빛을 차단한 실온에 둔다.
250 중력가속도로 5분간 원심분리한 후 상층액을 조심스럽게 따라버린다.
세포 내 마커에 대한 형광항체를 50 μL의 1X Perm/Wash buffer에 넣고 잘 섞어서 튜브에 분주하고 빛을 차단한 후 4℃에서 30분간 세포 내 염색을 한다.
30분 후 튜브에 1X PBS 2 mL을 넣고 votex로 잘 섞어주며 250 중력가속도로 5분간 원심분리하여 세포를 세척한다. 동일한 과정을 반복하여 한 번 더 세포를 세척한 후 상층액을 조심스럽게 따라버린다.
200 μL의 PBS를 넣고 잘 섞어준 후 유세포 분석을 시행하거나 분석 전까지 냉장 보관한다.
3단계: 유세포 검사결과를 얻는 방법
본 발명에서는 FACSCanto II 유세포 분석기기를 사용하였으며, 각 마커의 발현에 대한 MFI와 분포도(%)를 구하였다.
유세포 분석을 통해 얻게 되는 결과값은 분포도(%)로 얻어지게 되는데 각 분포도에 따른 세포 수(cells/μL)를 얻기 위해, 자동혈구 분석기를 이용해 얻은 백혈구 세포의 차등(differential)을 이용하여 분포도에 곱하는 방식으로 세포 수를 계산할 수 있다.
예를 들어, 자동혈구분석 결과 림프구 수가 3,000 cells/uL 이고 유세포 분석결과 NK 세포의 분포도는 15%일 경우, NK 세포의 수는 3,000 x 0.15 = 450 cells/uL로 계산한다. 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 면역세포의 표현형 마커를 이용하여 NK 세포와 NKT 세포를 구분하고 활성화 또는 억제 마커의 발현을 분석하는 방법을 설명한 도면으로, 유세포 분석 시 NK 세포는 도 1과 같이 림프구 세포를 먼저 게이팅(gating)한 후에 CD3 마커를 발현하지 않으면서 CD56 또는 CD16 마커를 발현하는 세포로 구분할 수 있어서 단위 혈액 당 존재하는 림프구 수와 림프구 세포 중 NK 세포의 분포도를 곱하면 단위 혈액 당 존재하는 NK 세포의 수를 산출할 수 있다.
표 1의 항체조합 튜브를 이용하여 NK 세포와 NKT 세포를 염색한 후 유세포 분석기를 사용하여 레이저 광선으로 세포를 분석하고, 도 1과 같이 NK 세포를 구분하여 Total NK(#), Total NK(%), CD56brightNK(%), CD56dimNK(%), NKG2D+NK(%), KIR2DL3+NK(%), TIGIT+NK(%), Perforin+NK(%), 그리고 NKT(%)를 구한다.
NK 세포의 cytotoxicity(%)는 유세포 분석방법으로 구하는 것이 아니라 따로 실험하며 NK 세포에 의해 K562 암세포가 사멸될 때 세포 밖으로 배출하는 LDH를 측정하는 방법으로 구한다.
표 2의 항체조합 튜브를 이용하여 T 세포의 아형을 염색한 후 유세포 분석기를 사용하여 레이저 광선으로 세포를 분석한다. 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 표현형 마커를 이용하여 T 세포의 아형을 구분하여 분석하는 방법을 설명한 도면으로, 도 2와 같이 CD3 T(%), CD4 T(%), CD8 T(%), CD3 T(#), CD4 T(#), CD8 T(#), Na
Figure 112020045171947-pat00001
ve CD4+T(%), CD4+ TCM(%), CD4+ TEM(%), CD4+ TEMRA(%), Na
Figure 112020045171947-pat00002
ve CD8+T(%), CD8+ TCM(%), CD8+ TEM(%), CD8+ TEMRA(%) 등을 구한다.
표 3의 항체조합 튜브를 이용하여 효과 T 세포의 아형을 염색한 후 유세포 분석기를 사용하여 레이저 광선으로 세포를 분석한다. 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 표현형 마커를 이용하여 효과 T 세포의 아형을 구분하여 분석하는 방법을 설명한 도면으로, 도 3과 같이 Th1(%), Th2(%), Th17(%), 그리고 Th2/Th1 ratio 등을 구한다. Th1 세포는 CD4+CXCR3+CCR6- 세포이며, Th2 세포는 CD4+CCR4+CCR6+. 그리고 Th17 세포는 CD4+CCR4+CCR6+로 구분된다.
표 4의 항체조합 튜브를 이용하여 T 세포의 면역관문분자 발현을 염색한 후 유세포 분석기를 사용하여 레이저 광선으로 세포를 분석한다. 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 표현형 마커를 이용하여 T 세포의 아형을 구분하고 면역관문분자 발현을 분석하는 방법을 설명한 도면으로, 도 4와 같이 TIGIT+CD4 T(%), TIGIT+CD8 T(%), BTLA+CD4 T(%), BTLA+CD8 T(%), PD-1+CD4 T(%), 그리고 PD-1+CD8 T(%) 등을 구한다.
표 5의 항체조합 튜브를 이용하여 수지상 세포를 염색한 후 유세포 분석기를 사용하여 레이저 광선으로 세포를 분석한다. 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 표현형 마커를 이용하여 수지상 세포의 아형을 구분하여 분석하는 방법을 설명한 도면으로, 도 5와 같이 Total mDC(%), CD1c+mDC(%), CD141+mDC(%), 그리고 CD123+pDC(%) 등을 구한다.
표 6의 항체조합 튜브를 이용하여 B 세포를 염색한 후 유세포 분석기를 사용하여 레이저 광선으로 세포를 분석한다. 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 표현형 마커를 이용하여 B 세포의 아형을 구분하고 더 나아가서 조절 B 세포를 구분하여 분석하는 방법을 설명한 도면으로, 도 6과 같이 Total B(#), Total B(%), Na
Figure 112020045171947-pat00003
ve B(%), Memory B(%), Non-class-switched memory B(%), 그리고 CD24hiCD27+Breg(%)과 CD24hiCD38+Breg(%) 등을 구한다.
표 7의 항체조합 튜브를 이용하여 MDSC 세포를 염색한 후 유세포 분석기를 사용하여 레이저 광선으로 세포를 분석한다. 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 표현형 마커를 이용하여 골수유래 억제세포를 구분하여 분석하고 면역억제 인자인 전환성장인자-베타와 아르기나제-1의 발현을 분석하는 방법을 설명한 도면으로, 도 7과 같이 MDSCs(%), Granulocytic MDSCs(%), Monocytic MDSCs(%), 그리고 Arg1+MDSCs(%)와 TGFb1+MDSCs(%) 등을 구한다.
표 8의 항체조합 튜브를 이용하여 Treg 세포를 염색한 후 유세포 분석기를 사용하여 레이저 광선으로 세포를 분석한다. 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 표현형 마커를 이용하여 조절 T 세포를 구분하여 분석하고 T 세포와 조절 T 세포에서 면역관문분자인 세포독성 T 림프구 단백질 4의 발현을 분석하는 방법을 설명한 도면으로, 도 8과 같이 Treg(%), CTLA4+Treg(%), PD-1+Treg(%), CTLA4+PD-1+Treg(%), CD4+CD25+T(%), 그리고 CTLA4+CD4 T(%), CTLA4+CD8 T(%) 등을 구한다.
상기 말초혈액 내 면역세포는 아래 표와 같은 면역세포들의 아형 또는 마커들 중 어느 하나 또는 조합의 분석결과를 얻어서 암 면역력을 평가하게 된다.
Cell Type/Markers
WBC differential count WBC(#)
Neutrophil(#)
Neutrophil(%)
Lymphocyte(#)
Lymphocyte(%)
NLR
Monocyte(%)
Eosinophil(%)
Basophil(%)
NK Total NK(#)
Total NK(%)
CD56brightNK(%)
CD56dimNK(%)
NKG2D+NK(%)
KIR2DL3+NK(%)
TIGIT+NK(%)
Perforin+NK(%)
Cytotoxicity(%)
NKT 　NKT(%)
T cell subsets CD3 T(%)
CD4 T(%)
CD8 T(%)
CD8 T(#)
Naive CD4+T(%)
CD4+ TCM(%)
CD4+ TEM(%)
CD4+ TEMRA(%)
Naive CD8+T(%)
CD8+ TCM(%)
CD8+ TEM(%)
CD8+ TEMRA(%)
Effector T cell subsets Th1(%)
Th2(%)
Th2/Th1 ratio
Th17(%)
T cell Immune checkpoint TIGIT+CD4 T(%)
TIGIT+CD8 T(%)
BTLA+CD4 T(%)
BTLA+CD8 T(%)
PD-1+CD4 T(%)
PD-1+CD8 T(%)
CTLA4+CD4 T(%)
CTLA4+CD8 T(%)
Dendritic cell Total mDC(%)
CD1c+mDC(%)
CD141+mDC(%)
CD123+pDC(%)
B cell Total B(#)
Total B(%)
Naive B(%)
Memory B(%)
Non-class-switched memory B(%)
MDSC MDSCs(%)
Granulocytic MDSCs(%)
Monocytic MDSCs(%)
Arg1+MDSCs(%)
TGFb1+MDSCs(%)
Treg cell Treg(%)
CTLA4+Treg(%)
PD-1+Treg(%)
CTLA4+PD-1+Treg(%)
CD4+CD25+T(%)
Breg cell CD24hiCD38+Breg(%)
CD24hiCD27+Breg(%)
4단계: 정상인과 암 환자의 암 면역력을 분류할 수 있는 머신 러닝 알고리즘을 생성하는 방법
8개의 머신 러닝 기법(선형 분류기법인 Ridge, lasso 및 elastic net과 트리 기법인 일반적인 결정트리, random forest, gradient boosting, 그리고 Support Vector Machine(SVM)과 인공신경망 기법)을 적용하여 정상인과 암 환자의 분류(classification)를 위한 성능을 평가했으며, 분류에 영향을 주는 면역세포검사 항목(자질, feature)을 분석했고, false positive/negative 및 분류 경계 근처에 있는 표본들을 탐지하였다.
분류 성능 평가 기준으로 정확도(accuracy), area under the ROC curve(AUC) 및 area under the precision-recall curve(PR AUC)를 적용하였다.
8개 머신 러닝 기법의 비교 결과, 평균 정확도가 가장 높은 모델이 gradient boosting이었으며, AUC가 가장 높은 모델도 gradient boosting이어서 본 발명에서는 정상인과 암 환자를 분류하기 위하여 gradient boosting(R의 gbm 패키지 version 2.1.5) 알고리즘을 이용하기로 하였다. Gradient boosting은 앙상블(Ensemble) 기법 중 하나로, 다수의 약한 학습기(weak learner)를 만들고 예측결과와 실제 데이터와의 오차(잔차, residual)를 연속적으로 보완하여 모델을 만드는 알고리즘이다.
Gradient boosting 모델을 만드는 방법은 데이터 속성을 확인하고 학습 전에 데이터를 훈련 세트와 테스트 세트로 나눈다. 알고리즘이 훈련 세트로 모델을 학습시킨 후 학습에 사용되지 않은 별도의 테스트 세트로 모델을 평가한다. 평균 민감도 및 특이도는 10배 교차 검증의 10회 반복에 의해 결정하며 ntrees=1,200의 파라미터를 사용하여 모델을 생성하였다.
부스팅 알고리즘의 개념적 수식은 다음 수학식 1과 같다.
Figure 112020045171947-pat00004
초기 학습기(F0(x))를 만들고 잔차(r) 값을 계산한 후(1식), 잔차와 실제데이터를 훈련세트로 약한 학습기(hm(x))를 만들어 반복횟수(m) 만큼 반복하여 모델을 만든다(2식). 생성된 모델에 신규 데이터 값을 입력하면 각 샘플마다 1과 0 사이의 확률 값이 예측되며, 검증을 통하여 얻어진 최적의 cut-off value를 기준으로 암 환자(1의 값을 나타냄)와 정상인(0의 값을 나타냄)으로 분류한다.
5단계: 알고리즘을 통해 나온 분류값을 검증하여 암 면역력을 평가하고 암의 존재를 예측 및 암 환자의 치료 경과 관찰 또는 반응 예측에 활용하는 방법
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 머신 러닝 부스팅 알고리즘 모델의 ROC 곡선을 도시한 도면이고, 도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 머신 러닝 부스팅 알고리즘으로 구한 정상인과 암 환자의 예측값을 도시한 도면이다.
도 9 및 도 10을 참조하면, 생성된 알고리즘 모델을 통하여 정상인과 암 환자의 예측값을 0과 1 사이의 확률값으로 구하고 민감도와 특이도 및 ROC curve를 기초로 하여 최적의 cut-off value를 설정한다.
R에서 ROC curve를 그린 후 최적의 cut-off value 값이 0.3으로 구해졌으므로 정상인의 예측값이 0.3 보다 높거나 같으면 암 면역력이 암 환자와 같이 위험한 수준으로 떨어진 것으로 판단하며 암 존재 위험이 높을 것으로 본다. 또한, 외과적 수술 또는 항암 및 방사선 치료를 받은 암 환자의 예측값을 일정 기간 동안 지켜보면서 예측값이 0.3 보다 높을 경우 암 면역력이 떨어진 것으로 판단하여 치료 경과를 관찰하는데 활용한다.
본 발명에서 생성한 알고리즘 모델을 통해 대장직장암, 유방암, 위암, 난소암, 폐암, 간암 등의 암 환자에서 암 면역력이 정상인과 현저하게 다른 것으로 예측되었으나, 갑상선암 환자의 경우 다른 암 종과 다소 다른 결과값을 보여서 본 발명에서는 암 면역력을 예측하는데 있어서 갑상선암은 적용을 제외한다.
최적의 cut-off value 일 때 민감도와 특이도
Cut - off value Sensitivity(% ) Specificity(% )
0.3 91.5% 94.6%
R에서 ROC curve를 그린 후 최적의 cut-off value 값이 표 10에서와 같이 0.3으로 구해졌으므로 정상인의 예측값이 0.3 보다 높거나 같으면 암 면역력이 암 환자와 같이 위험한 수준으로 떨어진 것으로 판단하며 암 존재 위험이 높을 것으로 본다. 또한, 외과적 수술 또는 항암 및 방사선 치료를 받은 암 환자의 예측값을 일정 기간 동안 지켜보면서 예측값이 0.3 보다 높을 경우 암 면역력이 떨어진 것으로 판단하여 치료 경과를 관찰하는데 활용한다.
도 11 내지 도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 수술 전후 위암, 난소암, 결장암 환자의 예측값을 나타내는 도면이고, 도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 머신 러닝 알고리즘을 통해 얻은 대장직장암, 유방암, 위암, 난소암, 폐암, 간암 환자들의 암 면역력 예측값을 도시한 도면이다.
도 11 내지 도 14를 참조하면, 본 발명에서 생성한 알고리즘 모델을 통해 대장직장암, 유방암, 위암, 난소암, 폐암, 간암 등의 암 환자에서 암 면역력이 정상인과 현저하게 다른 것으로 예측되었으나, 갑상선암 환자의 경우 다른 암 종과 다소 다른 결과값을 보여서 본 발명에서는 암 면역력을 예측하는데 있어서 갑상선암은 적용을 제외하였다.
본 발명에서는 일부 암 환자를 예를 들어 말초혈액 암 면역력을 이용하여 정상인과 암 고위험군 및 암 환자로 진단을 하였지만 방법론적으로 이들 암에만 한정되지 않고 다른 암 종에 있어서도 적용될 수 있음은 물론이다. 또한 위에서 예로 든 면역세포 마커를 이용하여 만든 모형은 향후 새롭게 발굴되는 마커를 이용하여 민감도와 특이도를 높여 암 진단의 유용성을 극대화 할 수 있으며, 본 발명에서 제시한 항목이 아닌 새로운 조합에 의해서도 모형이 만들어지고 암 진단에 사용될 수 있을 것이다.
이상에서 본 발명이 구체적인 구성요소 등과 같은 특정 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명이 상기 실시예들에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형을 꾀할 수 있다.
따라서, 본 발명의 사상은 상기 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등하게 또는 등가적으로 변형된 모든 것들은 본 발명의 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (11)

  1. 머신러닝 기법으로 말초혈액 내 암 면역력을 평가하고 암 발병 유무에 대한 정보를 제공하는 방법에 있어서,
    (A) 자동혈구분석기가, 말초혈액(전혈 시료) 내 백혈구 백분율 혈액 검사 결과를 분석하여 백혈구 백분율 데이터를 얻는 단계;
    (B) 유세포 분석기에, 형광 항체염색법으로 면역세포의 표지 마커 및 활성화(activating) 또는 억제(inhibitory) 마커가 염색된 말초혈액(전혈 시료) 내 면역세포가 제공되는 단계;
    (C) 유세포 분석기가, 세포의 크기(FSC, forward scatter), 과립의 정도(SSC, side scatter), 및 CD45 발현 분석을 통하여 림프구, 단핵구, 및 과립구 세포로 분류하고 그 서브 그룹 내에서 표지 마커의 염색 정도에 따라 면역세포를 NK 세포, T 세포, B 세포, 수지상 세포, 조절 T 세포, 조절 B 세포, 및 골수유래 억제세포로 분류하는 단계;
    (D) 유세포 분석기가 각각의 면역세포들의 활성화 또는 억제 마커 발현을 분석하여 유세포 분석 데이터를 얻는 단계;
    (E) 컴퓨터가, 상기 백혈구 백분율 데이터와 상기 유세포 분석 데이터를 모아서 머신 러닝 부스팅 알고리즘에 학습시키고 모델을 생성하는 단계; 및
    (F) 컴퓨터가, 생성된 알고리즘 모델을 통하여 정상인과 암 환자의 결과 값을 분류 값 또는 확률 값으로 구하고, 민감도와 특이도 및 ROC curve를 기초로 하여 cut-off value 값을 구한 후 암 면역력을 판단하는 단계를 포함하고,
    상기 (C) 단계에 있어서,
    1) NK 세포
    2) T 세포의 아형
    3) 효과 T 세포의 아형
    4) 탈진된(exhausted) T 세포에서 면역관문 분자 발현
    5) 수지상 세포
    6) B 세포
    7) 골수유래 억제세포
    8) 조절 T 세포
    9) 조절 B 세포
    와 같이 9가지 세포군으로 분류하고,
    상기 (D) 단계에 있어서,
    1) 상기 NK 세포의 분석은, 퍼포린(Perforin), LFA-1, CD16, TIGIT을 포함하는 마커의 발현을 확인하여, 상기 NK 세포의 세포 수 및 기능 마커 발현율을 분석하는 것을 포함하고,
    2) 상기 T 세포의 분석은, CD8을 포함하는 마커의 발현을 확인하여, cytotoxic T cell의 아형이 Naive T, Central memory T, Effector memory T, EMRA T cell로 존재하는 비율을 확인하는 것을 포함하고,
    3) 상기 효과 T 세포의 분석은, 효과 T 세포의 아형이 Th1, Th2, Th17 cell로 존재하는 비율을 확인하는 것을 포함하고,
    4) 상기 탈진된(exhausted) T 세포에서 면역관문 분자 발현의 분석은, CD45, CD3, CD4, CD8 마커의 발현을 확인하고, helper T cell 및 cytotoxic T cell에서 PD-1을 포함하는 마커의 발현을 확인하는 것을 포함하고,
    5) 상기 수지상 세포의 분석은, CD1c, CD123, CD141 및 PD-L1을 포함하는 마커의 발현을 확인하는 것을 포함하고,
    6) 상기 B 세포의 분석은, B 세포의 숫자 및 비율, B세포의 아형이 Native B, Memory B로 존재하는 비율을 확인하는 것을 포함하고,
    7) 상기 골수유래 억제세포의 분석은, 전환성장인자-베타(TGF-β) 및 아르기나제-1(arginase-1)을 포함하는 마커의 발현을 확인하는 것을 포함하고,
    8) 상기 조절 T 세포의 분석은, CD4, CD25, CD127을 포함하는 마커의 발현 및 면역관문 분자의 발현을 확인하는 것을 포함하고,
    9) 상기 조절 B 세포의 분석은, 조절 B 세포로 존재하는 비율을 확인하는 것을 포함하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    (G) 상기 cut-off value 값에 따라 암 면역력을 평가하여 암의 존재를 예측하고 암 환자의 치료 경과 관찰 또는 반응 예측에 활용하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 면역세포를 염색하는 방법은 세포막 표지 마커를 염색하는 방법과 세포 내(intracellular) 마커를 염색하는 방법으로 나뉘며, 세포막 표지 마커 염색과 세포 내 염색을 모두 수행해야 하는 경우 세포막 표지 마커를 먼저 염색한 후 세포 내 마커를 염색하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 NK 세포의 퍼포린, 골수유래 억제세포의 전환성장인자-베타(TGF-β), 아르기나제-1(arginase-1), T 세포, 및 조절 T 세포의 세포독성 T 림프구 단백질 4(Cytotoxic T Lymphocyte Associated Antigen 4 or CD152 or CTLA4)는 세포 내 염색을 수행하고, 이를 제외한 마커의 염색은 세포막 염색을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 (D) 단계에서 각 면역세포의 특이적인 마커의 발현을 분석하여 면역세포의 표현형을 분포도(%)와 세포 수 및 그 발현율로 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.

  8. 삭제
  9. 제1항, 제2항 및 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 암 면역력을 측정하거나 암 예측 정보를 제공하는 진단키트.
  10. 제1항, 제2항 및 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 암 환자의 암 면역력을 평가하여 치료 경과에 대한 정보를 제공하는 진단키트.
  11. 제1항, 제2항 및 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 면역항암제 치료 후 치료 반응에 대한 정보를 제공하는 진단키트.
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