KR20180094883A - 대식세포 분화 및 면역의 변형 방법 - Google Patents

대식세포 분화 및 면역의 변형 방법 Download PDF

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Abstract

Hom-1 폴리펩티드 또는 Hom-1 호메오박스 도메인(homeobox domain)을 포함하는 그의 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 대식세포 또는 단핵세포를 제공하는 단계로서, 상기 핵산 서열은 이종(heterologous) 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있고 상기 변이된 대식세포 또는 단핵세포는 Hom-1 폴리펩티드 또는 그의 단편을 발현하는 단계; 및 변이된 대식세포 또는 단핵세포를 암에 걸린 대상체에게 투여하는 단계; 를 포함하는 암을 치료하는 방법.

Description

대식세포 분화 및 면역의 변형 방법
종양 발생에서 면역의 역할은 점점 더 높게 평가되고 있다. 대식세포는 선천성(innate) 및 후천성(adaptive) 면역 모두의 수행자이며 종양 및 그의 미세환경에서 주요 구성요소로 인식되어 왔다. 광범위한 조사는 거의 모든 종양의 성장, 침윤(invasion) 및 전이(metastasis)에서 종양-관련 대식세포(tumor-associated macrophage: TAM)의 역할을 시사했다. 순환하는 단핵세포(monocyte)에서 유래한 TAM은, 선택된 종양의 초기 단계에서의 M1-유사 표현형부터 대부분의 진행된 종양에서의 M2-유사한 표현형에 이르기까지 넓은 스펙트럼의 표현형을 나타낸다. 종양 형성에서 그의 역할과 일치하게, M2-유사 TAM은 IL-10, IL4, MMP, 및 VEGF의 발현은 증가하지만, 종양파괴성(tumoricidial) 활성에 관련된 전-염증(pro-inflammatory) 사이토카인 및 세포독성 iNO 및 ROI의 발현은 감소되는 표현형 특징을 나타낸다. 종양 형성을 촉진하는 본질적인 기능 외에도, TAM은 또한 T-세포 반응을 변경하고 종양 미세환경을 조정함으로써 항-종양 면역의 억제에 기여한다. TAM의 기능 소성(plasticity)은 잘 알려져 있다. 그러나, TAM 소성이 세포 내재적 요소에 의해 어떻게 조절되는지에 대한 제한된 이해로 인해서 종양 치료에 있어서 TAM을 타겟으로 하는 것의 효율성 및 적용 가능성은 제한되어 왔다.
요약
한 실시 양태에서, 암 치료 방법이 본원에서 제공된다. 상기 방법은, Hom-1 폴리펩티드 또는 Hom-1 호메오박스 도메인(homeobox domain)을 포함하는 그의 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 대식세포 또는 단핵세포를 제공하는 단계로서, 상기 핵산 서열은 이종(heterologous) 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있고 상기 변이된 대식세포 또는 단핵세포는 Hom-1 폴리펩티드 또는 그의 단편을 발현하는 단계; 및 변이된 대식세포 또는 단핵세포를 암에 걸린 대상체에게 투여하는 단계; 를 포함하는 것이다. 한 구현예에서, 변이된 대식세포 또는 단핵세포는 외인성 발현 구조체를 대상체 또는 다른 대상체로부터 유래된 대식세포 또는 단핵세포에 도입함으로써 생성되는 것이다. 변이된 대식세포는 M1 표현형을 나타낸다. 방법은 투여 단계 이전에, 종양-관련 대식세포에서 대조군에 비해 Hom-1의 낮은 발현을 대상체에게서 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
다른 실시 양태에서, 암 치료 방법으로서, 상기 방법은, 대식세포 또는 단핵세포를 하나 또는 그 이상의, Hom-1의 발현을 유도하고 그로써 대식세포 또는 단핵세포의 내인성 Hom-1 의 발현 수준이 접촉 단계 이전보다 높아지는, 물질(agent)에 접촉시키는 단계; 및 변이된 대식세포 또는 단핵세포를 암에 걸린 대상체에게 투여하는 단계;를 포함하는 것인 방법이 본원에 설명되어 있다.
암 치료 방법으로서, 상기 방법은, M1 유전자의 발현을 유도하는 물질, 또는 M2 유전자의 발현을 억제하는 물질에 대식세포 또는 단핵세포를 접촉시키는, M1-표현형을 나타내는 대식세포가 생성되는 단계; 및 변이된 대식세포 또는 단핵세포를 암에 걸린 대상체에게 투여하는 것;을 포함하는 것인, 방법 또한 본원에 설명되어 있다.
또 다른 실시 양태에서, 대상체에서 암을 확인하는 방법이 본원에 설명되어 있다. 상기 방법은 암이 의심되는 조직 구역의 미세 환경(microenvironment)으로부터의 대식세포의 유전자 발현 수준을 검출하는 것을 포함하며, 상기 유전자는 Hom-1 유전자, M1 유전자, 또는 M2 유전자이고, 여기서 상응하는 대조군 수준에 비해 상기 (i) Hom-1 유전자 또는 M1 유전자의 낮은 수준 또는 (ii) M2 유전자의 높은 발현 수준의 검출은 의심되는 조직 구역이 암이거나 암이 될 위험이 있음을 나타내는 것이다.
암 치료 후보 화합물을 확인하는 방법 또한 본원에 설명되어 있다. 상기 방법은, 테스트 세포와 테스트 화합물을 접촉시키는 단계로, 여기서 상기 테스트세포는 대식세포 또는 단핵세포인 것; (i) Hom-1, (ii) Hom-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자, (iii) M1 유전자, 또는 (iv) M2 유전자의 발현 수준을 테스트 세포에서 검출하는 단계; 및 상응하는 대조군에 비해 발현 수준을 변경하는 테스트 화합물을 선택하는 단계로, 여기서 상기 선택된 화합물은 암 치료 후보 화합물인 것;을 포함하는 것이다. 한 구현예에서, 상기 방법은 전종양(protumor) 대식세포와 선택된 화합물을 접촉시키는 단계 및 접촉된 전종양 대식세포의 항종양(anti-tumor) 활성을 분석하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 전종양 대식세포는 종양-관련 대식세포 또는 M2 대식세포일 수 있다. 접촉 단계는 암 샘플을 포함하는 공동 배양 내의 테스트 세포와 수행되는 것일 수 있다. 테스트 세포는 M1 대식세포, M2 대식세포, 종양-관련 대식세포, 조직 대식세포, 또는 단핵세포-유래 대식세포에서 선택된 것일 수 있다.
한 실시 양태에서, 암 치료 후보 화합물을 확인하는 방법으로서, 상기 방법은, 테스트 세포 및 암 샘플을 포함하며, 상기 테스트 세포는 대식세포 또는 단핵세포인 것인, 공동 배양을 제공하는 단계; 공동 배양에 테스트 화합물을 첨가하는 단계; 및 상응하는 대조군에 비해 (i) 암 샘플을 억제하거나, (ii) 테스트 세포 내의 Hom-1 또는 Hom-1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자의 발현 수준을 증가시키거나, (iii) 테스트 세포 내의 M1 유전자의 발현을 증가시키거나, (iv) 테스트 세포 내의 M2 유전자의 발현을 감소시키거나, 또는 (v) 테스트 세포 내의 Hom-1 또는 Hom-1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자의 발현 수준의 상당한 감소를 억제하는, 테스트 화합물을 선택하는 단계; 를 포함하며, 여기서 상기 선택된 화합물은 암 치료 후보 물질인 것인, 방법이 본원에 설명되어 있다. 한 구현예에서, 암 샘플은 암 조직 샘플이다. 공동 배양 내에서, 테스트 세포 및 암 샘플은 서로 직접 접촉 또는 간접 접촉하는 것일 수 있다. 테스트 세포는 테스트 세포는 M1 대식세포, M2 대식세포, 종양-관련 대식세포, 조직 대식세포, 또는 단핵세포-유래 대식세포에서 선택된 것일 수 있다.
다른 실시 양태에서, 암 치료 후보 화합물을 확인하는 방법으로서, 암 조직 샘플을 제공하는 단계, 테스트 화합물과 조직 샘플을 접촉시키는 단계, 대조군에 비해 (i) 조직 샘플을 억제하거나, (ii) 조직 샘플 내의 종양-관련 대식세포 또는 단핵세포의 Hom-1 발현 수준을 증가시키거나, (iii) 조직 샘플 내의 종양-관련 대식세포 또는 단핵세포의 M1 유전자의 발현을 증가시키거나, (iv) 조직 샘플 내의 종양-관련 대식세포 또는 단핵세포의 M2 유전자의 발현을 감소시키거나, (v) 조직 샘플 내의 종양-관련 대식세포 또는 단핵세포의 Hom-1 발현 수준의 상당한 감소를 억제한 테스트 화합물을 선택하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 설명되어 있다.
하나 또는 그 이상의 구현예의 세부 내용이 하기 설명에 제시되어 있다. 구현예의 다른 특성, 목적 및 이점은 설명 및 청구항에 의해 명백해질 것이다.
상세한 설명
놀랍게도 정상 조직으로부터 분리된 대식세포에 비하여 TAM에서의 Hom-1 발현이 상당히 감소한다는 것이 밝혀졌다. 또한 놀랍게도 TAM에서 Hom-1의 발현 증가는 종양파괴 활성을 갖는 M1-유사 대식세포로 그들을 전환시킨다는 것이 밝혀졌다.
인간 호메오박스(homeobox) 전사 인자인 Hom-1은, 전형적(canonical) Wnt 시그널링의 길항제(antagonist)이다. Hom-1의 핵산 서열(서열번호 1) 및 그것이 코딩하는 아미노산 서열(서열번호 2)이 하기에 제시되어 있다:
Figure pct00001
Figure pct00002
항-종양 활성을 나타내는 대식세포를 대상체에게 투여함으로써 대상체에게서 암을 치료하는 방법이 본원에 설명되어 있다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "항-종양 활성을 나타내는 대식세포(macrophages that exhibit anti-tumor activity)", "M1-유사 대식세포(M1-like macrophages)", 및 "M1 표현형을 나타내는 대식세포(macrophages that exhibit an M1 phenotype)"는 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
M1-유사 대식세포는 (1) 대식세포 또는 단핵세포에서 Hom-1 발현 증가, (2) 대식세포 또는 단핵세포에서 하나 또는 그 이상의 M1 유전자의 발현 증가, 및/또는 (3) 대식세포 또는 단핵세포에서 하나 또는 그 이상의 M2 유전자의 발현 억제에 의해 생성될 수 있다.
단핵세포로부터 대식세포에 이르는 분화(monocyte-to-macrophage differentiation)에 Hom-1 발현이 모두 필수적이고 충분하다는 것이 나타나 있는 바, 단핵세포(예를 들어, 대상체의 말초 혈액으로부터 유래한 것)가 본 방법에 사용될 수 있다. 달리 말하면, 단핵세포에서 Hom-1의 발현 증가는 그들이 대식세포로 분화하도록 유도할 수 있다.
체외에서(ex vivo) 대식세포 또는 단핵세포는 내인성(endogenous) Hom-1을 더 높은 수준으로 발현하도록 유도될 수 있다. Hom-1 발현을 유도하기 위해 예를 들어, LPS, 콜레라독소(cholera toxin: CTX), 화학요법 물질, 방사선, 사이토카인(예를 들어, GM-CSF), 포르볼 12-미리스트산염 13-아세트산염(phorbol 12-myristate 13-acetate: PMA), 및 Hom-1 발현 억제제에 대한 항체 또는 RNAi와 같은 다양한 물질 또는 치료가 이용될 수 있다
Hom-1의 발현 수준이 증가되도록 유전적으로 변이된 대식세포 또는 단핵세포는 또한 암 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전적으로 변이된 대식세포 또는 단핵세포는 Hom-1 폴리펩티드 또는 Hom-1 호메오박스 도메인을 포함하는 그의 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있으며 변이된 대식세포 또는 단핵세포는 Hom-1 폴리펩티드 또는 그의 단편을 발현한다. 그러한 변이된 대식세포 또는 변이된 단핵세포(대식세포로 분화할 수 있는 것)는 항-종양 활성 및/또는 M1 표현형을 나타내기에 충분히 높은 수준의 Hom-1을 발현한다.
유전적으로 변이된 대식세포 또는 단핵세포는 또한 Hom-1 유전자의 여분의 카피를 대식세포 또는 단핵세포에 도입함으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 내인성 Hom-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 Hom-1 핵산 서열(Hom-1 폴리펩티드 또는 Hom-1 호메오박스 도메인을 포함하는 그의 단편을 코딩하는 것)을 포함하는 발현 구조체는 대식세포 또는 단핵세포에 도입될 수 있다.
Hom-1 폴리펩티드 또는 Hom-1 호메오박스 도메인을 포함하는 그의 단편은 또한 직접 펩티드 전달에 의해 대식세포 또는 단핵세포 내로 도입될 수 있다.
당업계에 공지된 방법은 대식세포 및 단핵세포를 유전적으로 변이시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, Hom-1을 발현하기 위한 외인성 발현 구조체(예를 들어, 안정적으로 또는 일시적으로 형질주입되는 것)가 대식세포 또는 단핵세포에 도입될 수 있다. 한 구현예에서, Hom-1 핵산 서열은 이종(즉, Hom-1 프로모터가 아닌 것) 구조 또는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 한 구현예에서, Hom-1 핵산 서열은 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
M1-유사 종양파괴성 대식세포는 또한 대식세포 또는 단핵세포에서 M1 유전자의 발현을 유도함으로써 생성될 수 있다. M1 유전자를 유도할 수 있는 물질은, LPS, CTX, PMA, GM-SCF, INFγ, 및 화학요법 물질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 대식세포 또는 단핵세포는 또한 M1 유전자의 발현 수준을 증가시키도록 유전적으로 변이될 수 있다. M1 유전자는 IL1b, IL6, IL12, IL23, TNFα, iNOs, CD40, CD80, CD86, CD68, TLR4, TLR2, IL-1R, MHCII, CCL15, CCL20, CXCL9, CXCL1, 및 SOCS3을 포함한다.
대식세포 또는 단핵세포에서의 M2 유전자의 발현 억제는 또한 M1-유사한 종양파괴성 대식세포를 생성할 수 있다. M2 유전자를 억제하는 물질은 항-IL4 물질(예를 들어, 항체 또는 RNAi 물질), 항-IL13 물질(예를 들어, 항체 또는 RNAi 물질), M2 단백질에 대한 항체 및 M2 유전자를 타겟으로 하는 RNAi 물질을 포함한다. M2 유전자는 ARG1, MMP9, CCL18, VEGF, IL10, IL4, TGFb, CD163, CD206, CD68, TLR8, TLR1, MHCII, TGM2, DcoyR, IL-1RII, Ym1/2, MMR/CD206, 및 SR을 포함한다.
이종 또는 자가(autologous) 대식세포 또는 단핵세포가 M1-유사 대식세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이종 대식세포 또는 단핵세포가 사용되는 경우, 숙주 반응을 회피하거나 최소화하기 위해 HLA-매칭이 수행될 수 있다. HLA 비매칭된 대식세포 또는 단핵세포 또한 사용될 수 있다. 자가 대식세포 또는 단핵세포는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 암환자로부터 수득될 수 있다.
생성된 M1-유사 대식세포는 주입(infusion) 또는 주사(injection)(예를 들어, 정맥내, 경막내(intrathecal), 관내(intraluminal), 기관내(intratracheal), 복강내(intraperitoneal), 두개내(intracranial), 피하(subcutaneous), 또는 다른 종류의 조직 내 경로를 통한 것)를 통한 투여, 경피(transdermal)투여, 또는 당업계에 공지된 다른 경로를 통해 대상체에게 투여될 수 있다. 한 예시에서, 대식세포 또는 단핵세포는 종양이 발견된 부위 또는 조직(예를 들어, 간 또는 췌장) 내 또는 그의 주변 구역에 직접 주사될 수 있다.
대상체는 암을 치료하기에 필요한 만큼 종종(예를 들어, 매 1일 내지 매 30일) 및 다수 회(예를 들어, 1-30회) M1-유사 대식세포로 치료될 수 있다. 본원에 설명된 M1-유사 대식세포는 또한 방사선, 화학요법, 항체, 및 소분자 약제와 같은 다른 암 치료 방법과 조합 치료로 사용될 수 있다.
하기에 설명된 데이터는 종양 종류와 무관하게 Hom-1 발현이 TAM을 종양파괴성 세포로 전환시킨다는 것을 나타낸다. 따라서, 본원에 설명된 M1-유사 대식세포를 이용하여 어떤 암이라도 치료될 수 있으며, 특히 Hom-1의 발현 수준이 낮은 TAM과 관련된 암이 치료될 수 있다. 상기에 설명한 것과 같이 M1-유사 대식세포로 대상체를 치료하기 이전에, 대상체의 TAM에서 Hom-1 발현 수준이 대조군에서 발견되는 것보다 낮은지 결정하는 것이 유용할 수 있다(예를 들어, 대상체의 정상 조직에서 발견되는 대식세포).
M1-유사 대식세포로 치료될 수 있는 암의 예시는 백혈병, 육종(sarcoma), 골육종, 림프종, 흑색종(melanoma), 신경아교종(glioma), 아교모세포종(glioblastoma), 크롬친화세포종(pheochromocytoma), 간암(hepatoma), 난소암, 피부암, 고환암, 위암, 췌장암, 신장암, 유방암, 전립선암, 대장암, 두경부암, 뇌암, 식도암, 방광암, 부신 피질 암, 폐암, 기관지암, 갑상선암, 자궁내막암(endometrial cancer), 비인두암(nasopharyngeal cancer), 자궁경부암, 간암, 전이암(metastatic cancer), 및 1차 부위를 알 수 없는 암과 같은 암종(carcinoma) 및 육종을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
대조군의 그것(예를 들어, 정상 조직에서의 대식세포의 상응하는 수준)에 비해 조직 구역의 미세 환경에서 발견되는 대식세포에서 Hom-1 또는 M1 유전자의 낮은 발현 수준 또는 M2 유전자의 높은 발현 수준을 검출하는 것은 그 조직 구역이 암이거나 암이 될 위험이 있음을 나타낸다. 따라서, 의심되는 조직 구역이 암이거나 암이 될 위험이 있는지 확인하는 방법이 또한 본원에서 고려된다.
암 치료 후보 화합물을 확인하는 방법이 본원에 추가로 설명된다. 테스트 세포(즉, 대식세포 또는 단핵세포)는 테스트 화합물과 접촉할 수 있으며, 테스트 세포에서의 (i) Hom-1, (ii) Hom-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자, (iii) M1 유전자, (iv) M1 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자, (v) M2 유전자, 또는 (vi) M2 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자의 발현 수준이 검출된다. 대조군(예를 들어, 테스트 화합물에 접촉하지 않은 테스트 세포 내의 상응하는 수준)에 비하여 (i)-(iv) 중 어느 것의 발현 수준 증가, 및/또는 (v) 또는 (vi)의 발현 수준 감소를 일으키는 테스트 화합물은 암 치료 후보 화합물이다.
한 스크리닝 방법에서, 테스트 화합물은 테스트 세포 및 암 샘플을 포함하는 공동-배양에 첨가된다. 테스트 화합물은, 만약 대조군에 비해 (i) 테스트 세포 내의 Hom-1, Hom-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자, M1 유전자, 또는 M1 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자의 발현 수준을 증가시키거나, (ii) 테스트 세포 내의 Hom-1, Hom-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자, M1 유전자, 또는 M1 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자의 발현 수준의 상당한 감소를 억제하거나, 또는 (iii) 테스트 세포 내의 M2 유전자 또는 M2 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자의 발현 수준을 감소시킨다면, 암 치료 후보 화합물이다.
공동 배양 시스템에서, 테스트 화합물이 암 샘플에 억제 효과를 갖는지 또한 결정될 수 있다. 대조군에 비해 암 샘플을 억제하는 테스트 화합물(예를 들어, 암 세포의 성장을 억제하거나, 암 세포를 살해하거나, 또는 암 샘플의 크기를 감소시키는 것)은 암 치료 후보 화합물이다. 테스트 세포 및 암 샘플은 서로 직접 접촉한 것일 수 있다. 대안으로, 테스트 세포 및 암 샘플은 직접 접촉하지 않는 것일 수 있다(예를 들어, 트랜스웰(transwell) 삽입의 사용으로 인해). 암 샘플은 예를 들어, 암 조직 샘플, 암 조직 샘플에서 분리된 암세포, 또는 암세포주(cancer cell line)의 세포인, 암 세포를 포함하는 샘플일 수 있다. 암 조직 샘플은 암환자로부터 외과적으로 절제된 표본으로부터 수득될 수 있다. 그러한 암 조직 샘플은 TAM을 포함하는 것일 수 있다.
테스트 세포 부존재 하에 암 조직 샘플에 대한 스크리닝 방법 또한 수행될 수 있다. 암 조직 샘플은 테스트 화합물과 접촉할 수 있다. 시간이 경과한 뒤, TAM은 암 조직 샘플로부터 분리될 수 있으며 TAM의 Hom-1, M1 유전자, 또는 M2유전자의 발현 수준이 결정될 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 조직 샘플 내의 Hom-1의 발현 수준이 결정될 수 있다. 테스트 화합물은, 만약, 대조군에 비해 (i) Hom-1 또는 M1 유전자의 발현 증가, (ii) Hom-1 또는 M1 유전자의 발현의 상당한 감소 억제, 및/또는 (iii) M2 유전자의 발현 감소를 일으킨다면, 암 치료 후보 화합물이다. 대조군에 비해 암 조직 샘플을 억제하는 테스트 화합물(예를 들어, 샘플의 사이즈를 감소시키는 것) 또한 암 치료 후보 화합물로 고려될 수 있다.
스크리닝되는 테스트 화합물(예를 들어, 단백질, 펩티드, 펩티도미메틱(peptidomimetic), 펩토이드(peptoid), 항체, RNAi, 소분자, 또는 다른 약제)은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수득될 수 있다.
본원에 설명된 임의의 방법에서, Hom-1, M1 유전자, 또는 M2 유전자의 발현 수준은 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 결정될 수 있다. 프로모터 활성 또한 측정될 수 있다. mRNA 수준, 단백질 수준, 및 프로모터 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
상기 설명된 임의의 스크리닝 방법에서, 테스트 세포는 대식세포 또는 단핵세포일 수 있다. 대식세포는 M1 대식세포, M2 대식세포, 종양-관련 대식세포, 조직 대식세포, 또는 단핵세포-유래 대식세포일 수 있다. 테스트 세포는 또한 단핵세포일 수 있다.
하기의 구체적인 실시예는 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하며, 어떤 방식으로든 본 발명의 나머지 부분을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 추가적인 상세한 설명 없이도, 당업계의 통상의 기술자는 본원의 설명에 기초하여 본 개시 발명을 최대한 활용할 수 있다고 믿는다. 본원에 언급된 모든 간행물은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
실시예
우리는 인간 대식세포의 대식세포 기능 분극화(polarization)에서 인간 호메오박스 단백질 Hom-1의 역할을 확인한다. Hom-1은 인간 대식세포의 M1 활성화를 촉진하고 그에서 필요로 하지만, M2 활성화에 관여하는 결정적인 유전자의 발현에는 필요하지 않다는 것을 알아냈다.
암에서 분리된 1차 TAM을 이용하여, 우리는 TAM에서의 Hom-1 발현은 정상 대조군 조직으로부터 분리된 대식세포에 비해 상당히 감소했음을 알아냈다. 우리는 TAM에서의 Hom-1 발현 프로파일이 TAM 표현형과 연관되어 있다는 것을 밝혀냈다. 게다가, Hom-1의 이소성 발현은 TAM을 M1-유사한 표현형으로 전환시켰다. 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 데이터 모두는 Hom-1이 TAM에 종양파괴성(tumoricidal) 활성을 부여했다는 것을 나타냈다. 종합하면, 우리의 연구는 Hom-1이 TAM을 종양파괴성 세포로 전환시켰음을 나타낸다. 우리는 Hom-1-발현 TAM(M1 표현형을 나타냄)이 다양한 암의 성장에 강한 억제 효과를 나타냄을 밝혀냈으며, 이는 Hom-1-조절된 TAM의 역할이 암 치료에 있어서 새로운 양식임을 시사한다.
TAM에서 Hom-1 발현이 감소됨
발달된 종양에서, TAM은 전종양 M2-유사 표현형을 나타낸다. Bronte and Murray (2015), Nat Med 21, 117-119를 참고하라. TAM의 소성(plasticity)은 잘 알려져 있으며, 다양한 사이토카인이 TAM의 M2 표현형으로의 분극화에 관련되어 있다. Noy and Pollard (2014), Immunity 41, 49-61을 참고하라. 이에 비해, TAM 분극화를 조절하는 전사 기전은 대부분 알려져 있지 않다.
하기에 설명한 것과 같이 결장암(colon cancer) 절제술로부터 버려진 외과적 표본이 종양 조직으로부터 TAM의 분리 및, 종양 부위로부터 15cm 떨어진 정상 점막으로부터 대식세포를 분리하기 위해 사용되었다. 앞에서 설명한 것과 같이, FACS 분석은 정상 대조군 점막으로부터 분리된 대식세포에 비해, TAM은 CD68, CD163, CD206과 같은 M2 표현형과 관련된 세포 표면 마커 발현을 상당히 높은 수준으로 나타냈다. Zhang et al. (2013), Eur J Cancer 49, 3320-3334를 참고하라. 우리는 식별력이 없는 대식세포 마커인 CD33의 발현에 있어서 TAM과 대조군 대식세포 사이에 상당한 차이가 없음을 알아냈다.
Hom-1이 TAM에서 역할을 하는지 결정하기 위해, 우리는 qRT-PCR에 의해 TAM의 발현을 정량화하였고, 대조군 대식세포에서 그의 발현에 비해, Hom-1 발현은 TAM에서 상당히 감소된다는 것을 알아냈다.
VentX 조절된 TAM 소성 및 M1 표현형으로 분극된 TAM
이전의 연구는 TAM이 M1 표현형을 나타내도록 LPS에 의해 유도될 수 있음을 나타냈다. Zhang et al을 참고하라. Hom-1이 TAM 소성에 대해 역할을 하는지 여부를 결정하기 위해, 우리는 LPS에 노출된 TAM에서의 Hom-1 발현을 조사했다. 우리는 LPS에 의해 자극된 이후 TAM에서의 Hom-1 발현이 상당히 증가함을 알아냈다. 이전의 연구와 일치하게 그리고 Hom-1의 증가된 발현과 평행하게, TAM의 LPS 자극은 염증성 사이토카인 및 세포독성 iNO의 증가된 분비를 유도했다.
Hom-1이 TAM 소성의 조절 역할을 하는지 결정하기 위해, 우리는 TAM 표현형에서 Hom-1의 넉다운 효과를 조사했다. 항-Hom-1 모르폴리노(morpholino: MO)를 TAM에 처리한 결과 Hom-1 발현이 약 80% 감소했다. TAM 소성의 주요 조절자로서의 Hom-1의 역할과 일치하게, 우리는 Hom-1 MO가 TAM에서의 LPS 유도된 염증성 사이토카인 및 세포독성 iNO의 분비를 중단시킨다는 것을 알아냈다. CD206은 TAM 에서 높게 발현되는 만노오스 수용체이고 M2 세포 표면 마커이다. TAM의 소성을 반영하여, TAM의 LPS에 대한 노출은 CD68+CD206+ 개체군의 상당한 감소 및 CD68+CD206- 세포 수의 증가를 유발했다. Hom-1 MO는 TAM에 대한 LPS의 영향 양쪽 모두를 중단시켰다(p<0.01).
Hom-1 발현 수준 및 TAM 표현형 간의 상관관계는 우리로 하여금 Hom-1이 TAM 소성을 조절한다는 개념을 더 연구하도록 촉진하였다. TAM은 분리되어 GPF-Hom-1 또는 대조군 GFP를 코딩하는 플라스미드로 형질주입되었다. 대조군 GFP가 형질주입된 TAM에 비해, GFP-Hom-1이 형질주입된 TAM은 길어진/섬유아세포-유사한 세포 형태를 갖는 M1 형태의 특성을 나타냈다. FACS 분석은 GFP-Hom-1이 형질주입된 TAM에서 M1 마커인 CD40, CD80, 및 CD86의 표면 발현이 상당히 증가되었다는 것을 나타냈다. 게다가, GFP-Hom-1이 형질주입된 TAM에서 전-염증(pro-inflammatory) 사이토카인인 TNFα, IL-1β, 및 IL-12 의 분비는 상당히 증가한 반면, M2 사이토카인인 IL-10의 분비는 상당히 감소했다. 일관되게, 유전자 분석은 IL-1β, IL-6, TNF-α, 및 iNO와 같은 M1 유전자는 GFP-Hom-1이 형질주입된 TAM에서 상당히 증가한 반면, CCL18, MMP9, VEGFA, 및 Arg1과 같은 M2 유전자는 GFP-Hom-1이 형질주입된 TAM에서 상당히 감소했다는 것을 나타냈다. 종합하면, 우리의 데이터는 Hom-1이 TAM 소성을 조절하였으며 TAM의 M1 분극화를 촉진했다는 것을 시사한다.
Hom-1이 TAM을 종양 억제 세포로 전환시켰음
Hom-1이 TAM의 M1 분극화를 촉진한다는 우리의 발견은 우리로 하여금 Hom-1-변형된 TAM이 종양 억제를 나타낼 수 있는지 연구하도록 촉진하였다. 결장암으로부터 분리된 신선한(fresh) TAM은 GPF-Hom-1 또는 대조군 GFP를 코딩하는 플라스미드로 형질주입되었다. 변형된 TAM은 그리고 나서 동일한 환자의 종양 또는 정상 조직과 트랜스-웰(trans-well) 배양 시스템을 이용하여 공동배양되었다. 주목할 만한 것은, 공동 배양 7-10일 이후, GFP-Hom-1 변형된 TAM과 인큐베이션하는 동안 종양 부피가 상당히 감소(약 70%)한 반면(p<0.01), GPF-형질주입된 TAM 또는 TAM과만 인큐베이션된 종양에서 크기의 상당한 변화가 없었다. 종양 부피의 감소가 암세포의 감소와 관련이 있는지 결정하기 위해, 우리는 조직 절단, 결장암 세포에 대한 CK20 항체로 H&E 염색 및 면역화학염색을 수행하였다. 우리는 TAM 또는 GFP 변형된 TAM과 인큐베이션된 종양의 네스트(nest), 코드(cord), 시트(sheet) CK20 양성 종양 세포가 나타났음을 알아냈다. 그러나, CK20 양성 종양 세포는 GPF-Hom-1 형질주입된 TAM과 인큐베이션하는 동안 사라졌다. Hom-1 변형된 TAM에서의 종양파괴성 효과의 특이성(specificity)은, Hom-1-변형된 TAM이 부피 및 GFP 또는 GFP-Hom-1로 형질주입된 TAM과 인큐베이션하는 동안 정상 결장 점막의 형태에 대한 최소한의 효과를 나타냈다는 것에 의해 증명된다.
생체내에서 Hom-1은 TAM의 종양파괴성 기능을 촉진함
시험관내에서 Hom-1이 TAM을 종양파괴성 세포로 전환시킨다는 우리의 발견은 우리로 하여금 생체내에서 Hom-1-조절된 TAM의 잠재적 역할을 연구하도록 촉진했다. 결장암은 약 0.5cm 조각으로 잘렸고 NSG 마우스의 복강의 피하 공간에 외과적으로 심어졌다. 1주일 후, MO-Hom-1 형질주입된 TAM(Hom-1 억제됨) 또는 GFP-Hom-1 형질주입된 TAM(Hom-1 발현함)이 마우스 꼬리 정맥을 통해 주사되었다. 이종이식 8주 이후, MO-Hom-1 형질주입된 TAM이 주사된 마우스에서 종양이 발달했으나, GFP-Hom-1 형질주입된 TAM이 주사된 마우스에서는 종양이 발달하지 않았다.
우리는 또한 TAM 또는 단핵세포가 M1 분화 배지에서 그들을 배양함으로써 M1 표현형을 나타내도록 유도될 수 있다는 것을 알아냈다. 이들 M1-분화된 TAM/단핵세포들은 MSG 마우스에 주입될 수 있으며 생체내에서 암 성장을 억제할 수 있다. M1 분화된 TAM의 암 성장에 대한 효과는 이들 TAM 또는 단핵세포에서 Hom-1 발현의 억제에 의해 중단될 수 있다.
다양한 암 종류에 대한 TAM에서의 Hom-1의 이소(ectopic) 발현의 효과
TAM은 필수적으로 모든 종양의 발생에 관련되어 왔다. 결장암 세포 내의 TAM에 대한 우리의 연구에 따라, 우리는 다른 종양 종류에 우리의 연구를 확장시켰다.
폐암, 흑색종, 식도암, 위암 및 췌장암의 외과적 종들이 수득되었으며, 상기에 설명한 것과 같이 TAM이 분리되었다. 동일한 환자의 상응하는 정상 조직으로부터 대식세포가 수득되었다. TAM 및 조직 대식세포에서 Hom-1 발현이 real time RT-PCR을 이용하여 정량화되었다. 이들 종양 모두에서의 TAM에서의 Hom-1 발현은 상응하는 원위(distant) 정상 조직의 Hom-1 발현에 비해 낮았다.
Hom-1이 이 TAM 을 종양파괴성 세포로 전환시키는지 결정하기 위해, GFP 또는 GFP-Hom-1이 TAM으로 형질주입되었다. 형질주입 48시간 이후, GFP 양성 세포들이 분류되었고 개별 종양과 공동배양되었다. GFP-Hom-1 형질주입된 TAM과 공동배양되는 동안 모든 종양에서 종양 부피가 감소되었으나, 대조군 GFP-형질주입된 TAM과는 그렇지 않았다. 우리의 결과는 종양 종류와 무관하게 Hom-1이 TAM을 종양파괴성 세포로 전환할 수 있다는 것을 시사했다.
결장 조직 샘플 수집
암 조직 및 정상 조직은 병리학 실험실의 환자로부터 외과적으로 절제된 표본으로부터 수득되었다. 약 5-10 그램의 조직이 각 종양 덩어리, 또는 종양 덩어리로부터 15cm 떨어진 정상 조직으로부터 수집되었다. 환자의 혈액 샘플 또한 수집되었다.
상피(intraepithelial) 림프구의 준비
점막 고유판 단핵세포(Lamina propria mononuclear cell: LPMC)들은 앞서 설명한 기술을 이용하여 변형되고(Kamada N, et al, 2008; Pignata C, et al, 1990) 분리되었다. 간단히, 절제된 신선한 점막 및 종양 덩어리는 점액을 제거하기 위해 2% FBS(fetal bovine serum) 및 1mM DTT(Dithiothreitol) (Sigma-Aldrich)를 포함하고 Ca2+ 및 Mg2+이 없는 HBSS(Hank's balanced salt solution) (life technologies)으로 10cm 페트리디쉬에서 헹궈졌다. 점막과 종양은 면도날에 의해 0.5cm 조각으로 절단되고 6-웰 플레이트에 1mM EDTA(Sigma-Aldrich)를 포함하는 5mL HBSS와 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션 된 후, gray-mesh를 통과했다(100 마이크론). 통과한 물질은 상피 림프구 및 상피세포를 포함하며 유세포 측정기(flow cytometer)에 의해 분석되었다.
종양 덩어리 및 정상 점막으로부터 대식세포 분리
이어서, 점막 및 종양은 2% FBS, 1.5mg/mL 콜라겐 분해효소(Roche), 0.1mg/mL DNA분해효소 I을 포함하는 HBSS(Ca2+ 및 Mg2+ 포함) 내에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션되었다. 소화된 조직들은 gray-mesh(70 마이크론) 필터를 통과했다. 통과한 물질은 수집되었고 40% Percoll 용액(Pharmacia) 내에 재현탁(resuspend)되었고, 그리고 나서 60% Percoll에 적층시킨 후, 30분동안 중단 없이 2000rpm으로 원심분리하였다. 경계면(interface)의 LPMC가 수집되었다. 제조자의 지시에 따라, CD16 고갈 없이(Stemcell Technologies) EasySep™사의 인간 단핵세포/대식세포 농축 키트를 이용하여 정상 점막 대식세포 및 TAM이 LPMC로부터 정제되었다. 이러한 기술들에 의해 분리된 세포들은 보통 PI(propidium iodide) 염색에 의해 98% 이상 생존할 수 있었다. 장내 대식세포의 순도는 95% 이상이었다.
말초혈액으로부터의 대식세포 준비
Brigham and Women 병원의 건강한 성인 공여자로부터의 말초혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell: PBMC)는 Ficoll 밀도 구배 원심분리에 의해 분리되었다. 제조자의 지시에 따라, CD16 고갈 없이(Stemcell Technologies) EasySep™사의 인간 단핵세포/대식세포 농축 키트를 이용하여 인간 단핵세포가 정제되었다. 정제된 세포들은 M-CSF(PeproTech) 10ng/mL를 포함하는 완전 RPMI 배지에 배양되었다. 농축 이후, 단핵세포는 M-CSF를 포함하는 완전 RPMI 배지에서 5일간 배양되었고, 세포들은 공동배양 시스템에 사용되었다.
FACS 분석
TAM 및 다른 림프구의 표현형 분석은 형광 염료 연결된 항체로 세포를 면역 라벨링시킨 후 유세포 측정기를 사용하여 수행되었다. 다음 항체들이 사용되었다: PE-결합된 항-CD3 (OKT3), -CD25 (BC96), -CD14 (61D3), -CD68 (eBio Y182A), -CD163 (eBio GH161), -CD206, FITC-결합된 항-CD4 (RPA-T4), -CD33 (HIM3-4), APC-결합된 항-CD8 (OKT8), -CD4 (OKT4) (eBioscience, Inc). 제조자에 의해 제공된 프로토콜에 따라 PE-결합된 항체로 Foxp3 (236A/E7), IFN-γ, 퍼포린(Perforin), 및 그랜자임(Granzyme)B의 세포내 염색이 수행되었다. 동위원소 대조군 라벨링이 병행하여 수행되었다. 항체는 공급자에 의해 권장된 것과 같이 희석되었다. 라벨링된 세포는 Cell-Quest 소프트웨어(BD Biosciences)를 구비한 FACScan 유세포 측정기 상에서 수집되었으며 FlowJo 소프트웨어에 의해 분석되었다. 결과는 양성 세포의 비율로 표현된다.
종양 및 대식세포의 기관형적(Organotypic) 공동배양
트랜스웰 인서트(Transwell inserts) (공극 크기 0.4
Figure pct00003
m, Costar, Corning)는 12-웰 폴리스티렌(polystyrene) 조직 배양 플레이트(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에 놓여졌다. 점막 및 종양 덩어리는 무게가 측정된 후 1x PBS 버퍼에, 항생제를 더하여 세척되었고, 그리고 나서 0.5cm 조각으로 절단되었다. 조직 약 50mg가 12-웰 트렌스웰의 상부에 뿌려졌고 RPMI 1640 완전배지의 0.5mL로 채워졌다. 직접적인 세포-조직 접촉 없이, TAM 5 x 105개가 웰당 50만개의 세포의 밀도로 하부에 첨가되었고 2mL의 PRMI 완전배지로 채워졌다. 플레이트는 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션되었다. 배양 배지의 0.5mL가 사이토카인 분석을 위해 수집되었고 신선한 배지가 매 3일마다 첨가되었다. (길이x너비2) / 2 공식에 따라 종양 부피를 계산하기 위해 종양 및 정상 점막은 1주일에 2회 캘리퍼스에 의해 모니터되었다. Leica EZ4D 입체현미경의 3-메가픽셀 CMOS 카메라 또는 아이폰의 디지털 카메라로 조직 사진을 촬영하였다.
면역화학염색
종양 또는 정상 조직은 포르말린(Fisher Scientific Company, Kalamazoo, MI)으로 고정화되었다. CK20 염색(Dako, Carpinteria, CA, clone Ks20.8, 1:50) 및 헤마톡신/에오신(H&E) 염색이 수행되었다. CK20 염색은 Leica Bone III 염색 플랫폼 상에서 Epitope Retrieval 2를 이용하여 20분간 온라인으로 Bone Polymer 정밀 감지 키트를 이용하여 수행되었다. Nikon Eclipse Ti 형광 현미경으로 현미경 분석이 수행되었다. 이미지는 NIS Elements 이미징 소프트웨어(Nikon)를 적용한 컬러 카메라를 이용하여 원래 배율 40x 에서 캡쳐되었다. 대표 이미지의 밝기 및 대비는 그룹 간에 동일하게 조정되었다.
Hom-1 과발현
제조 프로토콜에 따라 lipofectamine 2000 (Life technologies)을 통해 혈액 대식세포 및 TAM에 GFP-Hom-1의 형질주입이 수행되었다. 형질주입 48시간 이후, 세포들은 세포 분류를 위해 70 um 필터에 걸러졌다. GFP 양성 세포는 무균 조건에서 Baker Bio-Protect Hood 하에서 BD FACSAria II에 의해 분류되었다. 분류 이후, 세포들은 RPMI 1640 완전 배지에 배양되었다.
Hom-1 넉다운
제조업자의 지시에 따라 인간 단핵세포 유전자 주입 키트(Lonza, Walkersville, MD)를 이용하여, 결장 TAM 또는 인간 1차 단핵세포는 MO(Morpholino) 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드로 형질주입되었다. 간단히, 5×106개의 세포는 Hom-1 MO 올리고뉴클레오티드 또는 표준 대조군 MO 올리고뉴클레오티드 2.5 nmol을 포함한 유전자 주입(nucleofector) 용액 100 ㎕ 내에 재현탁되었고 유전자 주입기 II 장치(Lonza)에 의해 전기천공되었다. 세포들은 그리고 나서 즉시 장치에서 제거되고 2mM 글루타민 및 10% FBS를 포함하는 예열된 인간 단핵세포 유전자 주입 배지 1ml와 하룻밤 동안 인큐베이션되었다. 세포들은 그리고 나서 완전 RPMI 배지에 재현탁되었고 대식세포로 분화를 유도하기에 적절한 사이토카인으로 처리되었다. 모든 MO 올리고뉴클레오티드들은 Gene Tools(Philomath, OR)에서 주문했다.
사이토카인 측정
E. coli LPS-(Sigma-Aldrich)처리된 혈액 대식세포 또는 LPS-처리된 TAM의 상청액 내의 IL-1β, IL-10, TNF-α 및 IL-12p70 수준은 eBiosciences에서 수득된 ELISA 키트를 이용하여 정량화되었다. 분석은 제조업자의 지시에 따라 수행되었다.
qRT-PCR
총 RNA는 TRIzol 시약을 이용하여 분리되었고 RNA 양은 NanoDrop 2000(Thermo Scientific)에 의해 측정되었다. 제조업자의 프로토콜에 따라 SuperScript III First-Strand Synthesis System을 이용하여 동일한 양의 RNA가 제1 스트랜드 cDNA 합성에 사용되었다. Hom-1 cDNA를 일반 PCR(conventional PCR)로 증폭하기 위해, 우리는 제조업자의 지시에 따라 AccuPrime Taq DNA 폴리머라아제 시스템(Life Technologies)을 사용하였다. PCR 산물은 2% 아가로오스 겔 상에 분리되었고 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색되었다. GADPH는 내부 대조군으로 사용되었다. 우리는 Hom-1 및 다른 유전자 cDNA를 LightCycler(480 Real-Time PCR System; Roche) 상에서 SYBR Green으로 정량적 측정하였다. mRNA의 상대적 발현 프로파일은 그리고 나서 비교 Ct(comparative Ct) 방법(DDCT 방법)을 사용하여 계산되었다.
아르기나아제 활성 및 NO 분석
세포 용해물에서의 아르기나아제(arginase) 활성은 QuantiChrom arginase Assay Kit (DARG-200; BioAssays Systems)를 이용하여 요소(urea)의 생성을 측정함으로써 정량화되었다. 배양 상청액 내의 아질산염(Nitrite) 농도는 Griess 시약 키트(Molecular Probes)를 이용하여 결정되었다.
통계적 분석
스튜던트 검정(Student's test)이 통계적 분석을 위해 사용되었다.
다른 구현예
본 명세서에 개시된 모든 특성은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 특성은 동일하거나, 동등하거나, 또는 유사한 목적을 수행하는 대안적인 특성으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 기술되지 않는 한, 개시된 각 특성은 동등하거나 유사한 특성의 일반적인 시리즈의 예시에 불과하다.
상기 설명으로부터, 당업계의 통상의 기술자는 설명된 구현예의 본질적 특성을 용이하게 확인할 수 있으며, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 구현예를 다양한 용도 및 조건에 적용하기 위해 다양한 변경 및 수정을 가할 수 있다. 따라서, 다른 구현예 또한 본원 청구범위에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Zhu, Zhenglun <120> METHOD OF MODIFYING MACROPHAGE DIFFERENTIATION AND IMMUNITY <130> IPA180521-US <150> US 62/253,836 <151> 2015-11-11 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2428 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (12)..(788) <223> Hom-1 <400> 1 acctggccgc c atg cgc ctc tcc tcc tcc cca cct cgt ggc ccg cag cag 50 Met Arg Leu Ser Ser Ser Pro Pro Arg Gly Pro Gln Gln 1 5 10 ctc tcc agc ttt ggc tcc gtg gac tgg ctc tcc cag agc agc tgc tca 98 Leu Ser Ser Phe Gly Ser Val Asp Trp Leu Ser Gln Ser Ser Cys Ser 15 20 25 ggg ccg acc cac acc ccc agg cct gcc gac ttc tcc ctg ggg agc ctc 146 Gly Pro Thr His Thr Pro Arg Pro Ala Asp Phe Ser Leu Gly Ser Leu 30 35 40 45 cct ggc cca ggc cag aca tcc ggc gcc cgg gag ccc cct cag gcc gtc 194 Pro Gly Pro Gly Gln Thr Ser Gly Ala Arg Glu Pro Pro Gln Ala Val 50 55 60 agc atc aag gag gcc gcc ggg tcc tca aat ctg cct gcg ccg gag agg 242 Ser Ile Lys Glu Ala Ala Gly Ser Ser Asn Leu Pro Ala Pro Glu Arg 65 70 75 acc atg gcc ggg ttg agt aag gag cca aat acc ttg cgg gcc ccc cgt 290 Thr Met Ala Gly Leu Ser Lys Glu Pro Asn Thr Leu Arg Ala Pro Arg 80 85 90 gtc cgc aca gcc ttc acc atg gag cag gtc cgc acc ttg gag ggc gtc 338 Val Arg Thr Ala Phe Thr Met Glu Gln Val Arg Thr Leu Glu Gly Val 95 100 105 ttc cag cac cac cag tac ctg agc cct ctg gag cgg aag agg ctg gcc 386 Phe Gln His His Gln Tyr Leu Ser Pro Leu Glu Arg Lys Arg Leu Ala 110 115 120 125 agg gag atg cag ctc tca gag gtc cag ata aaa acc tgg ttt cag aat 434 Arg Glu Met Gln Leu Ser Glu Val Gln Ile Lys Thr Trp Phe Gln Asn 130 135 140 cgc cgc atg aaa cac aaa cgg caa atg cag gac ccc cag ctg cac agc 482 Arg Arg Met Lys His Lys Arg Gln Met Gln Asp Pro Gln Leu His Ser 145 150 155 ccc ttc tcg ggg tct ctc cat gcg ccc cca gct ttc tac tca acg tct 530 Pro Phe Ser Gly Ser Leu His Ala Pro Pro Ala Phe Tyr Ser Thr Ser 160 165 170 tct ggc ctt gcc aat ggc ctg cag ctg ctg tgc cct tgg gca ccc ctg 578 Ser Gly Leu Ala Asn Gly Leu Gln Leu Leu Cys Pro Trp Ala Pro Leu 175 180 185 tcc ggg ccc cag gct ctg atg ctg ccc cct ggc tcc ttc tgg ggt ctc 626 Ser Gly Pro Gln Ala Leu Met Leu Pro Pro Gly Ser Phe Trp Gly Leu 190 195 200 205 tgc caa gtg gca caa gag gcc ctg gca tct gcg gga gct tcc tgc tgc 674 Cys Gln Val Ala Gln Glu Ala Leu Ala Ser Ala Gly Ala Ser Cys Cys 210 215 220 ggg cag cct ctg gcg tcc cac ccc cct acc cca ggc cgg cct tcg ctg 722 Gly Gln Pro Leu Ala Ser His Pro Pro Thr Pro Gly Arg Pro Ser Leu 225 230 235 gga cca gcc ctg tcc acg ggg ccc cgg ggc ctg tgt gct atg cca cag 770 Gly Pro Ala Leu Ser Thr Gly Pro Arg Gly Leu Cys Ala Met Pro Gln 240 245 250 acg ggg gat gca ttt tga ggaggcacct ctgactccca cactcgcggt 818 Thr Gly Asp Ala Phe 255 cttgctgatc gcacctggct cctacctgga ggactcagtt gttctgttta catcctggtg 878 gcacctctca ccctgaccca cacaaaggtt ctggagatta ctggagaata tatataaata 938 tatatatgta cgtatatatg taaatacaca tatacgtata tataaatata tatatacata 998 tgtgtgtgta tatatatata tatttttttt tttttttttt tttttgagac ggagtgttgc 1058 tctgtcaccc aggctggagt gcaatgacgc aatctcggct cactgcaacc tccgcctcct 1118 gggttcaagc gattctccag cctcagcctc ccgagtagct gggattacag acacccgcca 1178 ccacgcccgg ctaatttttt ctatttttag tagaaatggg gtttcaccat gttagccagg 1238 ctggtctcaa actcctgacc ctgtgatccg cccgcctcgg cctcccaaag tgctgggatt 1298 acaggcatga gccactgcac ccggccctga gaatatattt attaaagcca cctcttcact 1358 gaaagttacc gaaagagtcg gtttaggaag gaaacgaagg gtcagtgaac agagtcaaat 1418 gcagaagtgg gcttgtcatg ggtagggctt tcggcgtacg ataaaaggat catttgtttt 1478 ttaaaagggg ttggaaaaac tggttttcca gttggaaaca gtaaaggttg taagctttgt 1538 gtgtacaaaa gaaaacaggg aatgcaggtg tgtttatagc gttgtggttc aagtccctct 1598 taacaagaac tccaaagctg gaaagcagga gggaacaaag gtgaacatga aggcgaggat 1658 gctggggccc tgcagtgcgc tctaggctgt gcgtgagccg ggactgtacc cacagcttgc 1718 tgagggctgc tcttcttggg ccagggaaag cagggcagcc gggacctgcg gctgtgcctg 1778 gactgaagct gtcccgcagg tccccaccct ccaacacgtg ctcacctgtc cccctcctcg 1838 cagcagcctc gggacaaaac aatgactcaa ggacagcact tctcgcagaa ggtctggaag 1898 tgcccagaat gggaggcacg gaagcccctc ccggggagga ctcccgcgtt gatggaccgt 1958 tcttggtgca gactcctgac tgcgtgcatg aaacctgaga caagtgcaat tccttccatg 2018 tcgccccaga gtgcccagga ggcaggcagt gcggggtgcc caggcagacg ggttcagcct 2078 gcagaactgg aggcgacctg tgaaacccac ccgggcaccc caacaggaac agaagcgtgg 2138 tcctgcggct gcgtccccag cgagtttcac tttccccttg ctcgtttctc ccttgttgta 2198 agtgtttaca actggcatgt gcttttaaac gtcaggtaag aggggaacag ctgctgtaca 2258 tcgtcctggc gagtgacaat gtgacagaag cctgggcgag gccctcggag ggcagcagct 2318 ggacaggggc tactgggttt ggcctggaca gcactgattt gtggatgtgg atgggggcac 2378 gttgtccgtg ataaaagtac aagtgcccct cacaaaaaaa aaaaaaaaaa 2428 <210> 2 <211> 258 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Leu Ser Ser Ser Pro Pro Arg Gly Pro Gln Gln Leu Ser Ser 1 5 10 15 Phe Gly Ser Val Asp Trp Leu Ser Gln Ser Ser Cys Ser Gly Pro Thr 20 25 30 His Thr Pro Arg Pro Ala Asp Phe Ser Leu Gly Ser Leu Pro Gly Pro 35 40 45 Gly Gln Thr Ser Gly Ala Arg Glu Pro Pro Gln Ala Val Ser Ile Lys 50 55 60 Glu Ala Ala Gly Ser Ser Asn Leu Pro Ala Pro Glu Arg Thr Met Ala 65 70 75 80 Gly Leu Ser Lys Glu Pro Asn Thr Leu Arg Ala Pro Arg Val Arg Thr 85 90 95 Ala Phe Thr Met Glu Gln Val Arg Thr Leu Glu Gly Val Phe Gln His 100 105 110 His Gln Tyr Leu Ser Pro Leu Glu Arg Lys Arg Leu Ala Arg Glu Met 115 120 125 Gln Leu Ser Glu Val Gln Ile Lys Thr Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met 130 135 140 Lys His Lys Arg Gln Met Gln Asp Pro Gln Leu His Ser Pro Phe Ser 145 150 155 160 Gly Ser Leu His Ala Pro Pro Ala Phe Tyr Ser Thr Ser Ser Gly Leu 165 170 175 Ala Asn Gly Leu Gln Leu Leu Cys Pro Trp Ala Pro Leu Ser Gly Pro 180 185 190 Gln Ala Leu Met Leu Pro Pro Gly Ser Phe Trp Gly Leu Cys Gln Val 195 200 205 Ala Gln Glu Ala Leu Ala Ser Ala Gly Ala Ser Cys Cys Gly Gln Pro 210 215 220 Leu Ala Ser His Pro Pro Thr Pro Gly Arg Pro Ser Leu Gly Pro Ala 225 230 235 240 Leu Ser Thr Gly Pro Arg Gly Leu Cys Ala Met Pro Gln Thr Gly Asp 245 250 255 Ala Phe

Claims (22)

  1. 암 치료 방법으로서, 상기 방법은,
    Hom-1 폴리펩티드 또는 Hom-1 호메오박스 도메인(homeobox domain)을 포함하는 그의 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 대식세포 또는 단핵세포를 제공하는 단계로서, 상기 핵산 서열은 이종(heterologous) 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있고 상기 변이된 대식세포 또는 단핵세포는 Hom-1 폴리펩티드 또는 그의 단편을 발현하는 단계; 및
    변이된 대식세포 또는 단핵세포를 암에 걸린 대상체에게 투여하는 단계;
    를 포함하는 것인, 방법.
  2. 제2항에 있어서, 상기 변이된 대식세포 또는 단핵세포는 외인성 발현 구조체를 대상체 또는 다른 대상체로부터 유래된 대식세포 또는 단핵세포에 도입함으로써 생성되는 것인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 프로모터는 구성 프로모터(constitutive promoter)인 것인, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터(inducible promoter)인 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 변이된 대식세포는 M1 표현형을 나타내는 것인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 단계 이전에, 종양-관련 대식세포에서 대조군에 비해 Hom-1의 낮은 발현을 대상체에게서 검출하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  7. 암 치료 방법으로서, 상기 방법은,
    대식세포 또는 단핵세포를 하나 또는 그 이상의, Hom-1의 발현을 유도하고 그로써 대식세포 또는 단핵세포의 내인성 Hom-1 의 발현 수준이 접촉 단계 이전보다 높아지는, 물질(agent)에 접촉시키는 단계; 및
    변이된 대식세포 또는 단핵세포를 암에 걸린 대상체에게 투여하는 단계;
    를 포함하는 것인, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 대식세포 또는 단핵세포는 대상체에 대해 자가(autologous) 또는 이종(heterogolus)인 것인, 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 접촉 단계 및 투여 단계는 적어도 1회 반복되는 것인, 방법.
  10. 암 치료 방법으로서, 상기 방법은,
    M1 유전자의 발현을 유도하는 물질, 또는 M2 유전자의 발현을 억제하는 물질에 대식세포 또는 단핵세포를 접촉시키는, M1-표현형을 나타내는 대식세포가 생성되는 단계; 및
    변이된 대식세포 또는 단핵세포를 암에 걸린 대상체에게 투여하는 것;
    을 포함하는 것인, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 대식세포 또는 단핵세포는 대상체에 대해 자가 또는 이종인 것인, 방법.
  12. 대상체에게서 암을 확인하는 방법으로서, 상기 방법은
    암이 의심되는 조직 구역의 미세 환경(microenvironment)으로부터의 대식세포의 유전자 발현 수준을 검출하는 것을 포함하며, 상기 유전자는 Hom-1 유전자, M1 유전자, 또는 M2 유전자이고, 여기서 상응하는 대조군 수준에 비해 상기 (i) Hom-1 유전자 또는 M1 유전자의 낮은 수준 또는 (ii) M2 유전자의 높은 발현 수준의 검출은 의심되는 조직 구역이 암이거나 암이 될 위험이 있음을 나타내는 것인, 방법.
  13. 암 치료 후보 화합물을 확인하는 방법으로서, 상기 방법은,
    테스트 세포와 테스트 화합물을 접촉시키는 단계로, 여기서 상기 테스트세포는 대식세포 또는 단핵세포인 것;
    (i) Hom-1, (ii) Hom-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자, (iii) M1 유전자, 또는 (iv) M2 유전자의 발현 수준을 테스트 세포에서 검출하는 단계; 및
    상응하는 대조군에 비해 발현 수준을 변경하는 테스트 화합물을 선택하는 단계로, 여기서 상기 선택된 화합물은 암 치료 후보 화합물인 것;
    을 포함하는 것인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 전종양(protumor) 대식세포와 선택된 화합물을 접촉시키는 단계 및 접촉된 전종양 대식세포의 항종양(anti-tumor) 활성을 분석하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 전종양 대식세포는 종양-관련 대식세포 또는 M2 대식세포인 것인, 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 접촉 단계는 암 샘플을 포함하는 공동 배양 내의 테스트 세포와 수행되는 것인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 테스트 세포 및 암 샘플은 서로 직접 접촉 또는 간접 접촉하는 것인, 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 테스트 세포는 M1 대식세포, M2 대식세포, 종양-관련 대식세포, 조직 대식세포, 또는 단핵세포-유래 대식세포인 것인, 방법.
  19. 암 치료 후보 화합물을 확인하는 방법으로서, 상기 방법은,
    테스트 세포 및 암 샘플을 포함하며, 상기 테스트 세포는 대식세포 또는 단핵세포인 것인, 공동 배양을 제공하는 단계;
    공동 배양에 테스트 화합물을 첨가하는 단계; 및
    상응하는 대조군에 비해 (i) 암 샘플을 억제하거나, (ii) 테스트 세포 내의 Hom-1 또는 Hom-1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자의 발현 수준을 증가시키거나, (iii) 테스트 세포 내의 M1 유전자의 발현을 증가시키거나, (iv) 테스트 세포 내의 M2 유전자의 발현을 감소시키거나, 또는 (v) 테스트 세포 내의 Hom-1 또는 Hom-1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자의 발현 수준의 상당한 감소를 억제하는, 테스트 화합물을 선택하는 단계;
    를 포함하며, 여기서 상기 선택된 화합물은 암 치료 후보 물질인 것인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 암 샘플은 암 조직 샘플인 것인, 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 테스트 세포 및 암 샘플은 서로 직접 접촉 또는 간접 접촉하는 것인, 방법.
  22. 제19항에 있어서, 상기 테스트 세포는 M1 대식세포, M2 대식세포, 종양-관련 대식세포, 조직 대식세포, 또는 단핵세포-유래 대식세포인 것인, 방법.
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