CN111560433A - 人nufip1的用途及相关产品 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药研究领域,具体涉及人NUFIP1在制备大肠癌治疗产品或者在制备大肠癌诊断产品中的用途。本发明首次发现NUFIP1可作为诊断大肠癌的诊断标志物,首次发现干扰NUFIP1表达可用于治疗大肠癌,NUFIP1可以作为一个潜在的靶位点应用在制备治疗大肠癌的药物中。NUFIP1基因及其表达产物作为诊断大肠癌或预后判断大肠癌的标志物,使大肠癌诊断更加准确、快速,有效预测出高风险、预后差的大肠癌组织,作为制备治疗大肠癌药物的靶基因为治疗大肠癌提供了新的治疗靶点和治疗途径。
Description
技术领域
本发明属于生物医药研究领域,具体涉及人NUFIP1的用途及相关产品。
背景技术
癌症是世界范围内的主要公共卫生问题,作为人类常见的恶性疾病之一,据2018年全球癌症数据显示,大肠癌发病率和死亡率在所有肿瘤中分别排第三位和第二位。2019年美国癌症协会统计数据显示:美国预计将出现1762450例新癌症病例和606880例癌症死亡,其中预计大肠癌(包括结、直肠癌)新增病例145600,死亡病例51020,是美国男性和女性第三常见的癌症类型,仅次于男性的前列腺癌、肺癌,女性的乳腺癌、肺癌。在我国大肠癌的发病率在世界消化道肿瘤位居第二位,其死亡率位居第五位,每年死亡的患者约占全世界癌症相关死亡人数的25%。
可见,大肠癌严重威胁着人类健康,也给社会带来沉重的经济负担。由于大肠癌早期起病隐匿,可无明显症状,早期诊断率低,大部分患者在诊断时已经是中晚期,甚至发生了转移,亟待寻找更加有效早期诊断手段。在治疗方法,尽管以手术为主包括化疗、放疗、生物治疗等综合治疗得到了长足的发展,大肠癌的预后有所改善,但仍有50%以上大肠癌根治术后患者最终发生复发转移。因此,寻找更加有效的早期诊断、靶向治疗及预后预测的基因对提高大肠癌治疗水平具有重要的意义。
目前还未有NUFIP1用于大肠癌诊断或治疗的相关报道。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题,本发明的目的在于提供人NUFIP1的用途及相关产品。
为了实现上述目的以及其他相关目的,本发明采用如下技术方案:
本发明的第一方面提供人NUFIP1在制备以下任一种或多种产品中的用途:(1)大肠癌治疗产品;(2)大肠癌诊断产品;(3)大肠癌预后判断产品。
本发明第二方面提供特异性识别NUFIP1的物质在制备大肠癌诊断产品和/或大肠癌预后判断产品中的用途。
本发明第三方面提供一种大肠癌诊断试剂盒和/或大肠癌预后判断试剂盒,所述试剂盒中包括特异性识别NUFIP1的物质
本发明第四方面提供8.NUFIP1抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途:
治疗大肠癌;
抑制大肠癌细胞生长;
降低大肠癌细胞活力;
抑制大肠癌细胞存活能力;
阻滞大肠癌的细胞周期;
诱导大肠癌细胞凋亡。
本发明第五方面提供一种降低生物体中NUFIP1表达的核酸分子,所述核酸分子包含:
a.双链RNA,所述双链RNA中含有能够与NUFIP1杂交的核苷酸序列;或者
b.shRNA,所述shRNA中含有能够与NUFIP1杂交的核苷酸序列;
其中,所述双链RNA包含第一链和第二链,所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体,并且所述第一链的序列与NUFIP1中的靶序列相同;所述shRNA包括正义链片段和反义链片段,以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构,所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补,并且所述正义链片段的序列与NUFIP1中的靶序列相同。
本发明第六方面提供一种NUFIP1干扰核酸构建体,含有编码前述核酸分子中的shRNA的基因片段,能表达所述shRNA。
本发明第七方面提供NUFIP1干扰病毒,由前述干扰核酸构建体在病毒包装质粒、细胞系的辅助下,经过病毒包装而成。
本发明第八方面提供前述核酸分子,或前述NUFIP1干扰核酸构建体,或前述NUFIP1干扰病毒的用途,为:用于制备治疗大肠癌的药物,或用于制备降低生物体中NUFIP1表达的试剂盒。
本发明第九方面提供一种用于预防或治疗大肠癌的组合物,其有效物质含有:前述的核酸分子;和/或,前述NUFIP1干扰核酸构建体;和/或,前述NUFIP1干扰病毒,以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明首次发现NUFIP1可作为诊断大肠癌的诊断标志物,首次发现干扰NUFIP1表达可用于治疗大肠癌,NUFIP1可以作为一个潜在的靶位点应用在制备治疗大肠癌的药物中。NUFIP1基因及其表达产物作为诊断大肠癌或预后判断大肠癌的标志物,使大肠癌诊断更加准确、快速,有效预测出高风险、预后差的大肠癌组织,作为制备治疗大肠癌药物的靶基因为治疗大肠癌提供了新的治疗靶点和治疗途径。
附图说明
图1-1 NUFIP1 mRNA在大肠癌组织和癌旁组织中的表达。基因芯片检测结果中NUFIP1在14对大肠癌癌组织和癌旁组织中的差异表达(A),Q-PCR检测结果中NUFIP1 mRNA在大肠癌癌组织(80例)和癌旁组织(15例)中的差异表达(B),GAPDH作为内参。T:癌组织,N:癌旁组织
图1-2 NUFIP1蛋白在大肠癌组织芯片中癌组织和癌旁组织中的表达。代表图选用×40和×200。T:癌组织,N:癌旁组织
图1-3 NUFIP1蛋白表达与大肠癌患者预后(生存期)之间的关系。
图1-4A NUFIP1沉默对大肠癌细胞NUFIP1表达的影响。HT-29和HCT116细胞经包被sh-Ctrl和sh-NUFIP1的慢病毒感染72h后,将细胞按1.0×105/mL密度接种到6孔板(2mL)中继续培养72h。采用Q-PCR(A)检测NUFIP1的表达,Q-PCR以GAPDH为内参和以目的基因在sh-Ctrl的表达为1,计算NUFIP1 mRNA的相对表达水平;注:与sh-Ctrl相比较,*P<0.05。
图1-4B NUFIP1沉默对大肠癌细胞NUFIP1表达的影响。HT-29和HCT116细胞经包被sh-Ctrl和sh-NUFIP1的慢病毒感染72h后,将细胞按1.0×105/mL密度接种到6孔板(2mL)中继续培养72h。采用Western-blot(B)检测NUFIP1的表达;Western-blot以GAPDH为内参以目的基因在sh-Ctrl的表达为1,计算NUFIP1蛋白的相对表达水平。注:与sh-Ctrl相比较,*P<0.05。
图1-5 NUFIP1沉默对大肠癌细胞形态和数目的影响。通过倒置显微镜拍照观察细胞形态的变化;通过细胞计数仪计算细胞数目。HT-29细胞(A);HCT116细胞(B)注:与sh-Ctrl相比较,*P<0.05
图1-6 NUFIP1沉默对大肠癌细胞活力的影响。
采用CCK8法检测HT-29和HCT116细胞活力,并以第一天的吸光值为1,计算出2-5天细胞活力的改变倍数。HT-29细胞(A);HCT116细胞(B)
注:与sh-Ctrl相比较,*P<0.05
图1-7集落形成实验检测NUFIP1沉默对大肠癌细胞存活能力的影响。细胞集落形成后经结晶紫染色并用数码相机拍照,计算各组细胞形成集落的数量,以sh-Ctrl组存活能力为100%,计算sh-NUFIP1组细胞的存活能力。HT-29细胞(A);HCT116细胞(B)
注:与sh-Ctrl相比较,*P<0.05
图1-8 NUFIP1沉默后诱导G0/G1期阻滞。HT-29和HCT116细胞分别经sh-Ctrl和sh-NUFIP1感染72h+72h后,采用PI染色和流式细胞仪检测细胞周期。HT-29细胞(A);HCT116细胞(B)
注:与sh-Ctrl相比较,*P<0.05
图1-9A NUFIP1沉默对大肠癌细胞凋亡的影响。HT-29和HCT116细胞分别经sh-Ctrl和sh-NUFIP1感染72h+72h后,采用Annexin V/PI双染法和流式细胞仪检测细胞凋亡比例(A)图1-9B NUFIP1沉默对大肠癌细胞凋亡的影响。HT-29和HCT116细胞分别经sh-Ctrl和sh-NUFIP1感染72h+72h后,Western-blot方法检测细胞凋亡相关蛋白BAX和Bcl-2的蛋白表达(B)。
注:与sh-Ctrl相比较,*P<0.05
图1-10 NUFIP1沉默对大肠癌细胞体内生长的影响。通过游标卡尺测量瘤体的长径和横径,计算出瘤体体积后绘制瘤体的生长曲线(A,B)。注:与sh-Ctrl相比较,*P<0.05
图1-11 NUFIP1沉默对大肠癌细胞体内生长的影响。采用小动物活体成像系统检测瘤体中GFP荧光强度,并分析荧光强度值(C,D)。注:与sh-Ctrl相比较,*P<0.05
图1-12 NUFIP1沉默对大肠癌细胞体内生长的影响。瘤体剥离后进行拍照和称重,分析瘤体的大小和重量(E,F)。注:与sh-Ctrl相比较,*P<0.05
具体实施方式
大肠癌发病机制极其复杂,是一个相当复杂的病理过程。相关分子基因的研究为大肠癌的诊断和治疗提供了方向和思路。大量研究证实P53、APC、KRAS、BRAF等基因突变或Bcl-2、PTEN、NDST4等基因的异常表达及信号转导通路的异常活化对大肠癌等恶性肿瘤的发生发展具有重要意义。NUFIP1(也命名为Nuclear FMR1 Interacting Protein 1,Nuclear Fragile X Mental Retardation Protein Interacting Protein 1或NuclearFMRP-Interacting Protein 1),编码一种包含C2H2锌指基序和核定位信号的核RNA结合蛋白,该蛋白定位于细胞质中与染色质周围纤维中的核基质有关,在神经元中与内质网核糖体有关。目前研究证实NUFIP1与核糖体功能紊乱导致的疾病相关,在饥饿诱导的核糖体吞噬过程中,NUFIP1蛋白是核糖体的自噬受体,NUFIP1穿梭于细胞核外,通过与自噬体蛋白结合,直接定位于核糖体载物。也有研究证实,当MTOR活性被抑制时,自噬开始诱导,除了溶酶体外,NUFIP1还可以与自噬体共聚,NUFIP1在溶酶体内的积累是由于其在自噬中的潜在作用且NUFIP1向溶酶体的转运依赖于自噬,可见NUFIP1是从细胞核重新分布到自噬体和溶酶体的蛋白;同时,当MTOR活性被抑制时,NUFIP1的耗竭可以防止核糖体蛋白和rRNA的自噬降解,可见当MTOR抑制时,NUFIP1是核糖体选择性的自噬受体。此外,也有研究表明,NUFIP1是与活性突触小体相关的核质穿梭蛋白,NUFIP1参与mRNA的输出和定位,并与FMRP(FragileX Mental Retardation Protein)一起参与突触附近局部蛋白合成的调节,因此,NUFIP1可能也参与了神经元的成熟过程。然而NUFIP1在大肠癌等恶性肿瘤中的作用和临床意义尚未见报道。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法,通常按照常规条件,或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
本发明一实施例提供人NUFIP1在制备以下任一种或多种产品中的用途:(1)大肠癌治疗产品;(2)大肠癌诊断产品;(3)大肠癌预后判断产品。
NUFIP1的genbank号为:
人(Human):Gene ID:26747
所述人NUFIP1在制备大肠癌治疗产品的用途具体是指:将NUFIP1作为作用对象,对待测产品进行筛选,以找到可以抑制人NUFIP1表达的产品作为大肠癌治疗备选产品。如本发明所述的NUFIP1干扰RNA(shRNA)即是以人NUFIP1为作用对象筛选获得的,可用作具有抑制大肠癌作用的药物。除此之外,诸如抗体药物,小分子药物等也可将NUFIP1作为作用对象。
进一步的,在制备大肠癌诊断产品和/或大肠癌预后判断产品的用途中,NUFIP1为生物标志物。
所述将人NUFIP1在制备大肠癌诊断产品的用途具体是指:将NUFIP1表达产物作为一项大肠癌诊断指标应用于大肠癌诊断产品的制备。
通过Q-PCR和Western blot方法检测NUFIP1在大肠癌组织和癌旁组织中的表达水平。研究发现:NUFIP1在大肠癌组织中的表达量显著高于癌旁组织。提示NUFIP1的表达水平可能成为大肠癌诊断的标志。
所述大肠癌诊断产品用于大肠癌的判断、诊断。
对大肠癌组织的受试者的生存期进行分析,结果发现,NUFIP1高表达与大肠癌患者生存期缩短密切相关。
所述大肠癌预后判断产品用于对大肠癌病人的病程和/或结局进行预后判断。
进一步的,将测得的大肠癌组织的检测结果分为NUFIP1高表达和低表达两组,并分析NUFIP1高低表达与大肠癌患者预后和/或生存周期的相关,结果显示NUFIP1在大肠癌组织中高表达与大肠癌患者总生存期短密切相关,提示NUFIP1高表达患者预后差和/或生存周期短;NUFIP1低表达患者预后好和/或生存周期长。
在一种实施方式中,高表达和低表达可以采用以下方法作为判断指标:
统计NUFIP1阳性表达细胞的数量和总细胞数并计算阳性细胞百分数,阳性表达百分数<5%者为0分,5%~25%为1分,26%~50%者为2分,50%~75%者为3分,>75%者为4分。细胞染色强度的评定标准以阳性表达细胞内的着色深度判定:基本不着色(阴性)为0分,染色弱(浅黄色)但明显强于阴性对照者为1分,染色强度中等者(黄色)为2分,染色强者(棕黄色)为3分。
NUFIP1表达(IHC score)=阳性百分数×阳性表达细胞着色深度;
NUFIP1评分>8为高表达,≤8则为低表达。
所述大肠癌治疗产品为能够特异性抑制NUFIP1的转录或翻译,或能够特异性抑制NUFIP1蛋白的表达或活性的分子,从而降低生物体中NUFIP1的表达水平,达到抑制大肠癌的目的。
所述通过NUFIP1制备获得的大肠癌治疗产品或者大肠癌诊断产品可以为但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
所述核酸可以为但不限于:反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA或者短发夹RNA(shRNA)。
所述大肠癌治疗产品的施用量为足够降低人NUFIP1的转录或翻译,或者足够降低人NUFIP1蛋白的表达或活性的剂量。以使人NUFIP1的表达至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
采用前述大肠癌治疗产治疗大肠癌的方法,主要是通过降低人NUFIP1的表达水平来达到治疗的目的。具体的,治疗时,将能有效降低人NUFIP1表达水平的物质给药于患者。
所述大肠癌诊断产品和/或大肠癌预后判断产品包括特异性识别NUFIP1的物质。
在一种实施方式中,所述特异性识别NUFIP1的物质选自NUFIP1抗体或特异性识别NUFIP1的引物对或NUFIP1抗体。
在一种实施方式中,所述特异性识别NUFIP1的引物对包括SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物。
需要说明的是,所述大肠癌诊断产品和/或大肠癌预后判断产品并不限定为必须为液体形式。
本发明一实施例为特异性识别NUFIP1的物质在制备大肠癌诊断产品中的用途和/或大肠癌预后判断产品中的用途。
可选的,所述特异性识别NUFIP1的物质选自NUFIP1抗体或特异性识别NUFIP1的引物对或NUFIP1抗体。
本发明一实施例为大肠癌诊断试剂盒,所述试剂盒中包括特异性识别NUFIP1的物质。
在一种实施方式中,所述特异性识别NUFIP1的物质选自NUFIP1抗体或特异性识别NUFIP1的引物对。
在一种实施方式中,所述特异性识别NUFIP1的引物对包括SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物。
本发明一实施例为NUFIP1抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途:
治疗大肠癌;
抑制大肠癌细胞生长;
降低大肠癌细胞活力;
抑制大肠癌细胞存活能力;
阻滞大肠癌的细胞周期;
诱导大肠癌细胞凋亡。
所述NUFIP1抑制剂是指对于NUFIP1具有抑制效果的分子。对于NUFIP1具有抑制效果包括但不限于:抑制NUFIP1的表达或活性。
抑制NUFIP1活性是指使NUFIP1活力下降。优选地,相比抑制前,NUFIP1活力下降至少10%,较佳的降低至少30%,再佳的降低至少50%,更佳的降低至少70%,最佳的降低至少90%。
抑制NUFIP1表达具体的可以是抑制NUFIP1的转录或翻译,具体的,可以是指:使NUFIP1的基因不转录,或降低NUFIP1的基因的转录活性,或者使NUFIP1的基因不翻译,或降低NUFIP1的基因的翻译水平。
本领域技术人员可以使用常规方法对NUFIP1的基因表达进行调节,如基因敲除、同源重组,干扰RNA等。
NUFIP1的基因表达的抑制可以通过Q-PCR检测表达量验证。
优选地,与野生型相比,NUFIP1表达降低至少10%,较佳的降低至少30%,再佳的降低至少50%,更佳的降低至少70%,又佳的降低至少90%,最佳地NUFIP1完全没有表达。
所述产品必然包括NUFIP1抑制剂,并以NUFIP1抑制剂作为前述功效的有效成分。
所述产品中,发挥前述功用的有效成分可仅为NUFIP1抑制剂,亦可包含其他可起到前述功用的分子。
亦即,NUFIP1抑制剂为所述产品的唯一有效成分或有效成分之一。
所述产品可以为单成分物质,亦可为多成分物质。
所述产品的形式无特殊限制,可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述产品主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
所述产品包括但不限于药物、保健品、食品等。
所述NUFIP1抑制剂可以为核酸分子、抗体、小分子化合物。
小分子化合物在本发明中指由几个或几十个原子组成,分子质量在1000以下的化合物。
如本发明实施例列举的,所述NUFIP1抑制剂可以为降低生物体中NUFIP1表达的核酸分子。具体的,可以是双链RNA或shRNA。
本发明一实施例为一种治疗大肠癌的方法,为向对象施用NUFIP1抑制剂。
所述的对象可以为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
所述对象可以是罹患大肠癌的患者或者期待治疗的大肠癌的个体。
所述NUFIP1抑制剂可以在接受大肠癌治疗前、中、后向对象施用。
本发明一实施例为降低生物体中NUFIP1表达的核酸分子,所述核酸分子包含双链RNA或shRNA。
其中,所述双链RNA中含有能够与NUFIP1杂交的核苷酸序列;
所述shRNA中含有能够与NUFIP1杂交的核苷酸序列。
进一步的,所述双链RNA包含第一链和第二链,所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体,并且所述第一链的序列与NUFIP1中的靶序列相同。
所述NUFIP1中的靶序列即为核酸分子用于特异性沉默NUFIP1表达时,被所述核酸分子识别并沉默的mRNA片段所对应的NUFIP1中的片段。
进一步的,所述shRNA或双链RNA的靶序列如SEQ ID NO:3所示。具体的CAGGCAGTCACTTGTGTGATT
进一步的,所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。
所述shRNA包括正义链片段和反义链片段,以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构,所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补,并且所述正义链片段的序列与NUFIP1中的靶序列相同。
所述shRNA经酶切加工后可成为小干扰RNA(siRNA)进而起到特异性沉默生物体内源NUFIP1表达的作用。
进一步的,所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一:UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU和CCACACC。
如本发明实施例所述,所述shRNA为shNUFIP1,其正义链片段核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。
本发明一实施例为NUFIP1干扰核酸构建体,含有编码前述核酸分子中的shRNA的基因片段,能表达所述shRNA。
所述的NUFIP1干扰核酸构建体可以是将编码前述人NUFIP1shRNA的基因片段克隆入已知载体获得。
在一种实施方式中,所述NUFIP1干扰核酸构建体为NUFIP1干扰慢病毒载体。
本发明公开的NUFIP1干扰核酸构建体是将编码前述NUFIP1shRNA的DNA片段克隆入已知载体获得,所述已知载体多为慢病毒载体,所述NUFIP1干扰核酸构建体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后,感染生物体,进而转录出本发明所述shRNA,通过酶切加工等步骤,最终获得所述siRNA,用于特异性沉默NUFIP1的表达。
进一步的,所述NUFIP1干扰核酸构建体载体还含有启动子序列和/或编码生物体中被检测的标记物的核苷酸序列;较优的,所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白(GFP)。
本发明的NUFIP1siRNA可用于抑制大肠癌,进一步地可以用作治疗大肠癌的药物或制剂。NUFIP1干扰核酸构建体可用于制备所述NUFIP1siRNA。当用作治疗大肠癌的药物或制剂时,是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明一实施例为NUFIP1干扰病毒,由前述NUFIP1干扰核酸构建体在病毒包装质粒、细胞系的辅助下,经过病毒包装而成。该病毒可感染生物体并产生针对NUFIP1的小分子干扰RNA,从而抑制大肠癌。该NUFIP1干扰病毒可用于制备预防或治疗大肠癌的药物。
所述病毒可以为慢病毒。
本发明一实施例为前述核酸分子,或前述NUFIP1干扰核酸构建体,或前述NUFIP1干扰病毒的用途,为:用于制备治疗大肠癌的药物,或用于制备降低生物体中NUFIP1表达的试剂盒。
可以利用降低生物体中NUFIP1表达的核酸分子;和/或,NUFIP1干扰核酸构建体;和/或,NUFIP1干扰病毒,作为有效成分,制备治疗大肠癌的药物。通常,所述药物中除了有效成分外,根据不同剂型的需要,还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。
“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时,它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
“药学上可接受的载体或辅料”应当与所述有效成分相容,即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类,如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉,如玉米淀粉和土豆淀粉;纤维素及其衍生物,如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素;西黄蓍胶粉末;麦芽;明胶;滑石;固体润滑剂,如硬脂酸和硬脂酸镁;硫酸钙;植物油,如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油;多元醇,如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇;海藻酸;乳化剂,如Tween;润湿剂,如月桂基硫酸钠;着色剂;调味剂;压片剂、稳定剂;抗氧化剂;防腐剂;无热原水;等渗盐溶液;和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
本发明中,除非特别说明,药物剂型并无特别限定,可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型,可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。
所述预防或治疗大肠癌的药物的应用为大肠癌的治疗提供了一种方法,具体为一种预防或治疗对象体内大肠癌的方法,包括将有效剂量的所述的药物施用于对象中。
进一步的,所述药物用于预防或治疗对象体内大肠癌时,需要将有效剂量的所述的药物施用于对象中。采用该方法,所述大肠癌被抑制。所述方法的对象可以为人。
本发明一实施例为种用于预防或治疗大肠癌的组合物,其有效物质含有:
前述的核酸分子;和/或,前述NUFIP1干扰核酸构建体;和/或,前述NUFIP1干扰病毒,以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
所述组合物可以为药物组合物。
当所述组合物用于预防或治疗对象体内大肠癌时,需要将有效剂量的所述的组合物施用于对象中。
所述组合物的形式无特殊限制,可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述组合物主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
NUFIP1基因及其表达产物作为诊断大肠癌的标志物,使大肠癌诊断更加准确、快速,作为制备治疗大肠癌药物的靶基因为治疗大肠癌提供了新的治疗靶点和治疗途径。
上述应用中,可特别针对大肠癌进行制备用于大肠癌的诊断试剂,也可制作用于治疗的药物和方法。
实施例1
1.1实验材料
1.1.1细胞株
人大肠癌细胞HT-29和HCT116细胞购买自中科院上海细胞库。
1.1.2实验动物及饲养环境
SPF级雄性BABL/c裸鼠12只(6-8周龄,20±2g。购置于上海斯莱克实验动物有限责任公司),饲养于动物实验中心的层流架中,自由活动,自由进食、饮水,通风,光照充足,室温控制在(22-25)℃,相对湿度50%-60%。
1.1.3常用试剂等配制
(1)培养基的配制:在McCoy’s 5A培养基(已经含1%的青霉素和链霉素)中加入10%培养基体积的胎牛血清(FBS),配制后置于4℃储存。
(2)多聚甲醛溶液的配制
称取多聚甲醛粉末40g溶于1L的超纯水中后于超声仪中加速溶解并储存于4℃备用。
1.1.4试剂
PBS缓冲液,结晶紫,0.4%台盼蓝,SDS-PAGE凝胶试剂盒,5×电泳液,20×TBS,Tween-20(北京索莱宝科技有限公司);McCoy’s 5A培养基(江苏凯基生物技术有限公司);0.25%EDTA胰酶,胎牛血清(FBS),BCA蛋白定量试剂盒,NUFIP1抗体(美国Thermo FisherScientific公司,PA531183,Stripping buffer(美国Thermo Fisher Scientific公司);Western及IP裂解液,PMSF,5×Loading buffer,Western封闭液,一抗稀释液,二抗稀释液,超敏ECL化学发光试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);Cocktail(德国merck-calbiochem公司);GAPDH抗体,CCK8,Annexin V-PI染色(中国Abbkine公司);兔二抗,BAX,Bcl-2(美国CST公司)。
1.1.5主要仪器
Western-blot电泳仪,转膜仪,化学发光成像系统,PCR仪器(美国Bio-Rad公司);ELX800酶标仪(美国BioTek公司);水平摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);恒温金属浴(上海培清科技有限公司);移液器(德国Eppendorf);小动物活体成像系统(美国PERKINELMER公司);NanoDrop 2000超微量分光光度计,细胞培养箱,离心机(美国ThermoFisher Scientific公司);Countstar细胞计数仪(美国Inno-Alliance Biotech公司)。
2.2实验方法
2.2.1基因芯片检测NUFIP1 mRNA在大肠癌组织中的表达
2013-2014年于福建中医药大学附属第一人民医院和福建省立医院收集大肠癌样本(包括癌组织和癌旁组织),新鲜的组织一部分经4%多聚甲醛固定,一部分迅速保存于液氮中,用于后续基因芯片检测差异表达基因。
(1)总RNA提取:
取14例的大肠癌组织和癌旁组织样本,加入液氮后充分匀浆后加入1mL的Trizol,使其充分裂解5min,随后放入4℃低温高速离心机离心(4℃,12000rpm,15min)后,吸取上清液,转移到另一个无RNA酶的离心管中,每管中加入0.2mL的氯仿溶液,剧烈震荡15s后于室温里静置5min,待其分层后置于4℃低温高速离心机离心(4℃,12000rpm,15min)。离心后液体分为明显三层,用移液枪小心吸出上层液体转移到另一无RNA酶的离心管中,放入冰上。加入等体积异丙醇,轻轻的上下混匀,于室温静置10min,使RNA充分析出,放入4℃低温高速离心机离心(4℃,12000rpm,10min),弃上清,底部白色沉淀物即为RNA。每个样本里加入75%提前预冷的冰乙醇1mL,漂洗RNA沉淀物以去除残余的异丙醇,离心(4℃,10000rpm,10min),弃上清,将沉淀物放置于室温下自然干燥5-10min,待完全干燥后加入适量的DEPC水溶解。
(2)总RNA浓度测定:采用NanDrop2000超微量分光光度计测定样本OD260与OD280的比值(需为1.8-2.1)并计算RNA浓度。进一步通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整度。首先依据A260/A280≥1.90和经甲醛变性胶电泳检测核糖体亚基28S:18S rRNA,判断其条带的亮度是否大于或者接近2:1的标准来评价RNA的完整性和纯度。以上各项要求达到后方可用于后续的实验。
(3)差异基因检测及分析
通过上海吉凯基因公司采用基因芯片进行差异表达基因的检测,并以改变倍数>或<-2且P<0.05为阈值分析差异表达基因。
2.2.2 Q-PCR检测cDNA芯片中大肠癌癌组织和癌旁组织NUFIP1在mRNA水平的表达
大肠癌cDNA芯片(MecDNA-HColA095Su01)包括80例大肠癌组织和15例癌旁组织,购买自上海芯超生物科技有限公司。按照公司所给的说明书进行实验。依据下表的PCR反应体系进行配制后置于7500Fast Realtime PCR仪中进行mRNA表达检测。PCR反应体系和反应时间见下表。
表1-1 PCR反应体系配制
表1-2 PCR反应条件
表达量计算:扩增结束后,根据在每次循环延伸处收集荧光信号,分析整理数据。
mRNA表达量计算公式:
mRNA的△Ct=Ct(sample)-CT(内参);△△Ct=△Ct-△Ct(mean);mRNA的相对表达量为2-△△ct
表1-3 NUFIP1和GAPDH引物序列
2.2.3免疫组化检测NUFIP1在大肠癌组织芯片中的表达水平
大肠癌组织芯片载玻片(HColA180Su15)购买自上海芯超生物科技有限公司。
(1)脱腊、入水:
将组织芯片经二甲苯15min×2次、100%乙醇5min、95%乙醇5min、90%乙醇5min、85%乙醇5min、75%乙醇5min、自来水5min、PBS 5min×3次脱腊。
(2)修复、封闭、抗体孵育、显色
将抗原修复液倒入烧杯中于微波炉里加热至沸腾,将石蜡切片置于该烧杯中焖10min,然后将烧杯取出冷却至室温,用纯净水冲洗切片后,采用PBS洗去抗原修复液(5min×3次),加入100μL内源性过氧化物阻断剂,在湿盒中室温孵育10min,用PBS洗去内源酶阻断剂(5min×3次),吸干液体,加入非特异染色阻断剂,在湿盒中室温孵育30min进行封闭;吸干液体后,加入NUFIP1抗体(1:1000稀释),在湿盒中4℃孵育过夜,用PBS清洗(5min×3次)。滴加相适应的二抗在室温孵育1h,孵育结束后用PBS清洗(5min×3次)。加入适量的辣根酶卵白素工作液进行室温孵育30min后用PBS清洗(5min×3次)。再用DAB进行显色、苏木素复染并封片。最后显微镜观察并捕获图像,400倍视野下随机选取5个视野,计数阳性表达细胞的数量和总细胞数并计算阳性细胞百分数,阳性表达百分数<5%者为0分,5%~25%为1分,26%~50%者为2分,50%~75%者为3分,>75%者为4分。细胞染色强度的评定标准以阳性表达细胞内的着色深度判定:基本不着色(阴性)为0分,染色弱(浅黄色)但明显强于阴性对照者为1分,染色强度中等者(黄色)为2分,染色强者(棕黄色)为3分。
NUFIP1表达(IHC score)=阳性百分数×阳性表达细胞着色深度;
NUFIP1评分>8为高表达,≤8则为低表达。采用Kaplan-Meier法分析NUFIP1表达(低或高)与患者总生存期的关系,采用log-rank检验评估其意义。
2.2.4细胞培养
HT-29和HCT116细胞均使用含10%FBS和1%双抗的McCoy’s 5A完全培养基培养。细胞密度长至约80-90%时,弃培养基,并通过PBS清洗,0.25%EDTA胰蛋白酶消化,离心机低速离心(1000rpm,3min)。离心结束后,加入3-5mL的完全培养基重悬,并吸出10μL细胞悬液与10μL 0.2%台盼蓝1:1混匀加到Countstar细胞计数仪中,并根据自己的实验需要配制成不同的细胞密度悬液进行传代或其他实验,将细胞放回培养箱继续培养。
2.2.5慢病毒感染
(1)shRNA的设计、合成及慢病毒包被,慢病毒为(pLKD-CMV-EGFP-2A-Puro-U6-shRNA)针对NUFIP1(基因ID:26747)设计了shRNA,序列为:CAGGCAGTCACTTGTGTGATT(SEQ IDNO:3)
(2)细胞感染
人大肠癌细胞株HT-29和HCT116细胞按0.4×105/mL密度分别接种到12孔板(1mL)中,并在37℃培养箱中培养过夜,待细胞密度长至30-40%时,按照表1-4体系进行感染。
表1-4慢病毒感染体系配制
慢病毒 | sh-Ctrl | sh-NUFIP1 |
培养基(μL) | 1488.5 | 1488.5 |
Polybrene(μL) | 1.5 | 1.5 |
病毒(1×10<sup>8</sup>T/U,μL) | 10 | 10 |
通过以上方法配制,将培养基充分混匀后分别加入到12孔板中(0.5mL/孔),感染3个孔,并置于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养12h,感染结束后弃上清液,并换成完全培养基(1mL/孔),继续培养至72h,观察细胞形态及汇合度,判断其沉默效果,而后进行传代,根据实验目的,将细胞按照不同密度接板进行后期实验。
2.2.6 Q-PCR检测NUFIP1在mRNA水平的表达
人大肠癌细胞株HT-29和HCT116细胞经sh-NUFIP1慢病毒感染72h后,进行传代。将细胞按1.0×105/mL密度接种到6孔板(2mL)中继续培养72h。
(1)总RNA提取及浓度测定:
弃上清,用1mL PBS清洗一遍,而后采用Trizol法提取总RNA。分别加入1mLTrizol,充分裂解3-5min,转移到无RNA酶的1.5mL离心管中,每管中加入0.2mL的氯仿溶液,剧烈震荡15s后于室温里静置5min,待其分层后置于4℃低温高速离心机离心(4℃,12000rpm,15min)。离心后液体分为明显三层,用移液枪小心吸出上层液体转移到另一无RNA酶的离心管中,放入冰上。加入等体积异丙醇,轻轻的上下混匀,于室温静置10min,使RNA充分析出,放入4℃低温高速离心机离心(4℃,12000rpm,10min),弃上清,底部白色沉淀物即为RNA。每个样本里加入75%提前预冷的冰乙醇1mL,漂洗RNA沉淀物以去除残余的异丙醇,离心(4℃,10000rpm,10min),弃上清,将沉淀物放置于室温下自然干燥5-10min,待完全干燥后加入适量的DEPC水溶解。
(2)逆转录:
根据RNA浓度,按以下体系(5μL体系)进行配制:
表1-5去DNA阶段反应体系
样本配制结束后,充分震荡混匀并离心,置于Bio-rad PCR仪上进行去DNA阶段反应,反应条件如下所示:
表1-6去DNA阶段反应条件
样本反应结束后,进行逆转录。按照以下方法进行配置。
表1-7逆转录阶段
配制好样本后,充分的混匀涡旋,短暂离心后,每个样本管里加入5μL,后放入Bio-rad PCR仪上进行逆转录,其反应条件如下:
表1-8逆转录反应条件
Q-PCR反应
将逆转录好的cDNA按照1:4用DEPC水进行稀释,而后按照以下的反应体系进行配制。其余步骤如前所述。
2.2.7Western-blot检测NUFIP1及Bcl-2等相关蛋白表达
人大肠癌细胞株HT-29和HCT116细胞经sh-NUFIP1慢病毒感染72h后,进行传代。将细胞按1.0×105/mL密度接种到6孔板(2mL)中继续培养72h。
(1)总蛋白提取
将上述6孔板中的细胞消化离心后,加入1mL PBS上下混匀离心后吸干净上清液,而后将6个样本加入适量的裂解液(1mL裂解液里添加了100×Cocktail、100×PMSF、10×Phosstop、880μL Western及IP裂解液),置于冰上充分裂解,每5min涡旋一次,共4次。而后将各样本置于4℃高速离心机中离心(14000rpm,15min),待离心结束后,将上清液转移到1.5mL离心管中,置于冰上待用。
(2)BCA法测定蛋白浓度
采用BCA法测定蛋白的总浓度,首先根据试剂盒说明书配制标准品,在96孔板中,每个标准品和样本品需要重复两个复孔,标准品孔内加入140μL超纯水和10μL标准品,样本孔内加入149μL超纯水和1μL蛋白样本,根据总数量按A液:B液=50:1配制BCA工作液,每孔均加入100μL。置于60℃烘箱孵育20min,用酶标仪在570nm波长处读取吸光值,根据标准曲线计算各个样本的蛋白浓度,并按照相同的质量(μg)计算各样本的上样量。
(3)蛋白样本变性
将各样本用5×SDS置于100℃金属锅5min进行变性。
(4)SDS-PAGE电泳:
各样本按相同质量的蛋白量进行SDS-PAGE电泳,而后转至PVDF膜上,用封闭液在室温里封闭1-2h。加入相应的一抗(按照说明书配制)置于4℃摇床过夜,回收一抗,用含0.2%Tween的TBST洗膜洗3次,5min/次,加入相对应的二抗(按照说明书配制)室温孵育1-2h,再用TBST洗3次,5min/次,加入1:1的ECL发光液,用Bio-Rad凝胶成像系统扫描并进行数据分析。蛋白灰度值分析先圈出每个上样孔的体积,依据相对应孔的目的蛋白体积/内参蛋白体积算出比值,再以对照组的比值为1,依次比较目的组的蛋白值。
2.2.8细胞计数实验检测NUFIP1沉默对大肠癌细胞数目的影响
人大肠癌细胞株HT-29和HCT116细胞经sh-NUFIP1慢病毒感染72h后,大体观察每组的细胞形态和细胞数目的变化情况,并用倒置显微镜进行拍照。评估沉默NUFIP1对大肠癌细胞形态和细胞数目的影响;而后将每组细胞进行消化、离心后,加入5mL完全培养基充分重悬和混匀,按照1:1比例,用10μL细胞悬液和10μL 0.4%台盼蓝上下均匀混匀后,吸取10μL混悬液加入Countstar计数板中,用Countstar细胞计数仪计数,记录活细胞数,每个组要重复计数3次后计算出平均值和标准差。
2.2.9 CCK8实验检测NUFIP1沉默对大肠癌细胞活力的影响
人大肠癌细胞株HT-29和HCT116细胞经sh-NUFIP1慢病毒感染72h后,进行传代。将细胞按0.2×105/mL密度接种到96孔板(100μL)中继续培养,分别于培养后24h、48h、72h、96h和120h加入10μL的CCK8溶液,随后放置37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中孵育2h,随后采用酶标仪在450nm波长处避光检测各孔的吸光度值,根据吸光度值计算出细胞活力,同时以第1天OD值为1,分别计算随后第2-5天细胞的相对活力,并绘制细胞的生长曲线。
细胞活力计算公式:细胞活力改变倍数=第n天OD值/第1天OD值。
2.2.10集落形成实验检测NUFIP1沉默对大肠癌细胞存活能力的影响
人大肠癌细胞株HT-29和HCT116细胞经sh-NUFIP1慢病毒感染72h后,进行传代。将细胞按0.5×103个/孔接种于12孔培养板中,置于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养8-10天,每2-3天给予更换新鲜培养液。待细胞培养结束后,用PBS清洗1遍后用4%多聚甲醛固定15-20min,随后用PBS清洗1遍后再用结晶紫染15-20min,用PBS清洗干净。采用数码相机拍照、计算各组细胞形成集落的数量,以对照组细胞存活率为100%计算其他各组细胞的存活率。
细胞存活率计算公式:细胞存活率(%)=(实验组集落数/对照组集落数)×100%
2.2.11 PI染色和流式细胞仪检测NUFIP1沉默对大肠癌细胞周期的影响
人大肠癌细胞株HT-29和HCT116细胞经sh-NUFIP1慢病毒感染72h后,细胞按1.0×105/mL接种到12孔板中,继续培养72h,而后消化离心细胞后,用1mL PBS上下混匀1遍,混匀细胞的时候要轻柔,避免将细胞吹成碎片,离心弃上清后,用70%冰乙醇在4℃中固定过夜。约24h后离心弃上清液,经预冷的PBS吸两遍后分别加入0.5mL的FxCycle PI/RNase染色液中避光孵育30min。孵育结束后,采用流式细胞仪检测细胞中DNA含量,并根据细胞DNA含量分析细胞的周期分布。
2.2.12 Annexin V-PI染色和流式细胞仪检测沉默NUFIP1对大肠癌细胞凋亡的影响
人大肠癌细胞株HT-29和HCT116细胞经sh-NUFIP1慢病毒感染72h后,细胞按1.0×105/mL接种到12孔板中,继续培养72h,随后用0.25%胰酶(不含EDTA)消化,离心,弃上清后用细胞计数仪计数,细胞总数为1-5×105个。经预冷的PBS离心洗涤后,离心细胞,弃上清,加入100μL的1×Annexin V Binding Buffer后轻轻混匀,再加入5μL的Annexin V-AbFlourTM647和2μL的PI染色液充分混匀,混匀后置于室温避光反应15min后加400μL 1×Annexin V Binding Buffer,染色后30min内采用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。
2.2.13皮下移植瘤模型评价沉默NUFIP1对大肠癌细胞体内生长的影响
(1)皮下移植瘤模型构建:
SPF级雄性BABL/c裸鼠12只(6-8周龄,20±2g。购置于上海斯莱克实验动物有限责任公司),饲养于动物实验中心的层流架中,自由活动,自由进食、饮水,通风,光照充足,室温控制在(22-25)℃,相对湿度50%-60%。适应性饲养3天后进行实验。经慢病毒感染72h后的HT-29和HCT116细胞株,消化、离心、计数细胞后,用无血清的细胞悬液和基质胶1:1混合后,按0.1mL/只(即1×106个/只),于裸鼠右前和左前肢腋窝处皮下接种细胞。两细胞株分别接种6只裸鼠,每只裸鼠左、右前肢腋窝处分别接种sh-Ctrl和sh-NUFIP1慢病毒感染后细胞。
(2)瘤体的测量:
在接种三天后,采用游标卡尺测量肿瘤的长径和横径,每个长径和横径分别测量三次。根据瘤体体积大小绘制瘤体生长曲线。
瘤体体积计算公式:瘤体体积V=1/2长径×横径×横径
(3)小动物活体成像系统检测:
实验结束时,采用小动物活体成像系统检测瘤体的生长情况。先将小鼠放入麻醉盒中麻醉1-2min,待小鼠麻醉后转移到小动物活体成像系统中,应用小动物活体成像系统进行拍照,根据GFP的平均荧光强度判断瘤体的大小,评价沉默NUFIP1对瘤体生长的影响。
2.3数据分析与统计
所有实验数据均采用SPSS 26.0软件进行统计分析,结果采用平均值±标准差表示。先进行正态性检验和方差齐性检验,如数据符合正态分布,两组间数据间的差异通过Student-ttest分析即t检验;如果数据不符合正态分布,则采用秩和检验。P<0.05提示各组之间有显著性差异。
3结果
3.1 NUFIP1 mRNA在大肠癌癌组织中的表达显著高于癌旁组织
通过基因芯片检测14对大肠癌癌组织和癌旁中差异表达的基因,差异表达结果中发现:NUFIP1在大肠癌癌组织中的表达显著高于癌旁组织(图1-1A;*P<0.05,与癌旁组织相比)。通过Q-PCR检测从上海芯超生物科技有限公司购买的cDNA芯片(MecDNA-HColA095Su01)中NUFIP1 mRNA在大肠癌癌组织和癌旁组织中的表达,检测结果如图1-1B所示:NUFIP1 mRNA在80例大肠癌癌组织中的表达显著高于15例癌旁组织(*P<0.05,与癌旁组织相比)。
3.2 NUFIP1蛋白在大肠癌癌组织中的表达显著高于癌旁组织
采用IHC检测大肠癌组织芯片中NUFIP1的表达水平。实验结果如图1-2所示,与癌旁组织相比,NUFIP1表达在大肠癌组织中显著上调(*P<0.05,与癌旁组织相比)。
3.3 NUFIP1在大肠癌组织中高表达与大肠癌患者生存期短密切相关
基于NUFIP1蛋白在大肠癌癌组织中的表达,采用Kaplan-Meier法分析NUFIP1高低表达与患者总生存期(OS)的关系,采用log-rank检验评估其意义。实验结果如图1-3所示:NUFIP1蛋白高表达与患者OS短密切相关(P<0.05)。可见,NUFIP1对大肠癌预后具有预测潜能。
3.4包被有sh-NUFIP1的慢病毒感染显著降低大肠癌细胞NUFIP1表达
为了研究NUFIP1对大肠癌细胞生长的影响,本项目通过慢病毒包被针对NUFIP1(基因ID:26747)设计的shRNA-NUFIP1(sh-NUFIP1)和sh-Control(sh-Ctrl)感染大肠癌细胞株HT-29和HCT116细胞,并通过Q-PCR和Western-blot验证sh-NUFIP1的沉默效果。结果如图1-4A和图1-4B所示:与sh-Ctrl组相比,包被的sh-NUFIP1慢病毒能显著降低大肠癌细胞株HT-29和HCT116细胞中NUFIP1在mRNA和蛋白水平(*P<0.05,与sh-Ctrl相比)。
3.5 NUFIP1沉默抑制大肠癌细胞生长
大肠癌细胞株HT-29和HCT116细胞经sh-NUFIP1慢病毒感染72h后,观察sh-Ctrl组和sh-NUFIP1组的细胞形态并用倒置显微镜进行拍照,并采用细胞计数仪进行细胞计数。实验结果如图1-5A和B所示:与sh-Ctrl组对比,sh-NUFIP1组细胞密度、数量明显下降(*P<0.05,与sh-Ctrl相比)。可见,NUFIP1沉默能够抑制大肠癌细胞的生长。
3.6 NUFIP1沉默抑制大肠癌细胞活力
大肠癌细胞株HT-29和HCT116细胞经慢病毒感染72h后,将细胞重新接种于96孔板中。并于接种后24、48、72、96、120h分别通过CCK8检测细胞活力,并绘制细胞生长曲线。实验结果如图1-6A和B所示:与sh-Ctrl组相比,NUFIP1沉默能够显著降低HT-29和HCT116细胞的细胞活力(*P<0.05,与sh-Ctrl相比)。
3.7 NUFIP1沉默抑制大肠癌细胞存活能力
通过集落形成实验检测NUFIP1沉默对大肠癌细胞存活能力的影响。实验结果如图1-7A和B所示:与sh-Ctrl组相比,NUFIP1沉默能够显著降低HT-29和HCT116细胞的集落形成数目(*P<0.05,与sh-Ctrl相比)。可见,NUFIP1沉默显著抑制大肠癌细胞的存活能力。
3.8 NUFIP1沉默阻滞大肠癌的细胞周期
通过PI染色和流式细胞仪检测NUFIP1沉默对大肠癌细胞周期的影响。实验结果如图1-8A和B所示:与sh-Ctrl组相比,NUFIP1沉默后在G0/G1期的细胞比例显著增加,而在S期的细胞比例明显下降(*P<0.05,与sh-Ctrl相比)。由此可见,NUFIP1沉默显著阻滞细胞从G0/G1期向S期转换。
3.9 NUFIP1沉默诱导大肠癌细胞凋亡
通过Annexin V/PI双染法和流式细胞仪检测NUFIP1沉默对大肠癌细胞凋亡的影响。实验结果如图1-9A所示:与sh-Ctrl组细胞相比,NUFIP1沉默后凋亡细胞比例显著升高(*P<0.05,与sh-Ctrl相比)。进一步采用Western-blot方法检测细胞凋亡相关蛋白BAX和Bcl-2的表达结果如图1-9B显示:与sh-Ctrl对照组相比,NUFIP1沉默显著上调BAX蛋白水平在HT-29和HCT116细胞中的表达,而下调Bcl-2蛋白表达(*P<0.05,与sh-Ctrl相比),提示NUFIP1沉默通过调控BAX和Bcl-2蛋白的表达诱导大肠癌细胞凋亡。
3.10 NUFIP1沉默抑制大肠癌细胞在体内的生长
进一步通过移植瘤小鼠模型评价NUFIP1沉默对移植瘤生长的影响。移植瘤瘤体体积测量结果如图1-10A和B所示:与sh-Ctrl组相比,在整个实验观察期间sh-NUFIP1组瘤体体积显著降低(*P<0.05,与sh-Ctrl相比);小动物活体成像系统检测瘤体中GFP荧光强度结果如图1-11C和D所示:与sh-Ctrl组相比,sh-NUFIP1组的瘤体荧光强度值显著降低,甚至没有检测到荧光(*P<0.05,与sh-Ctrl相比);实验结束后瘤体重量测量及拍照观察结果如图1-12E和F所示:与sh-Ctrl组相比,NUFIP1沉默后显著抑制瘤体的重量和大小(*P<0.05,与sh-Ctrl相比)。由此可见,NUFIP1沉默能显著抑制大肠癌细胞在体内的生长。
以上所述,仅为本发明的较佳实施例,并非对本发明任何形式上和实质上的限制,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还将可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化,均为本发明的等效实施例;同时,凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变,均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 福建中医药大学
<120> 人NUFIP1的用途及相关产品
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccaggttctt gatagcagtg c 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatggtgtgt tcttggttcg 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caggcagtca cttgtgtgat t 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggggaagg tgaaggtcg 19
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggggtcattg atggcaacaa ta 22
Claims (17)
1.人NUFIP1在制备以下任一种或多种产品中的用途:(1)大肠癌治疗产品;(2)大肠癌诊断产品;(3)大肠癌预后判断产品。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,还包括以下特征中的一项或多项:
a.在制备大肠癌诊断产品和/或大肠癌预后判断产品的用途中,NUFIP1为生物标志物;
b.所述大肠癌诊断产品用于大肠癌的判断、诊断;
c.所述大肠癌预后判断产品用于对大肠癌病人的病程和/或结局进行预后判断;
d.所述大肠癌诊断产品和/或大肠癌预后判断产品包括特异性识别NUFIP1的物质。
3.如权利要求2所述的用途,其特征在于,所述特异性识别NUFIP1的物质选自NUFIP1抗体或特异性识别NUFIP1的引物对或NUFIP1抗体。
4.如权利要求3所述的用途,所述特异性识别NUFIP1的引物对包括SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物。
5.特异性识别NUFIP1的物质在制备大肠癌诊断产品和/或大肠癌预后判断产品中的用途。
6.如权利要求5所述的用途,其特征在于,所述特异性识别NUFIP1的物质选自NUFIP1抗体或特异性识别NUFIP1的引物对。
7.如权利要求5所述的用途,其特征在于,所述特异性识别NUFIP1的引物对包括SEQIDNO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物。
8.一种大肠癌诊断试剂盒和/或大肠癌预后判断试剂盒,所述试剂盒中包括特异性识别NUFIP1的物质。
9.NUFIP1抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途:
治疗大肠癌;
抑制大肠癌细胞生长;
降低大肠癌细胞活力;
抑制大肠癌细胞存活能力;
阻滞大肠癌的细胞周期;
诱导大肠癌细胞凋亡。
10.如权利要求9述的用途,其特征在于,还包括以下特征中的一项或多项:
1)所述NUFIP1抑制剂是指对NUFIP1具有抑制效果的分子;
2)所述NUFIP1抑制剂为产品的唯一有效成分或有效成分之一;
3)所述NUFIP1抑制剂选自双链RNA、shRNA、抗体或小分子化合物,所述双链RNA中含有能够与NUFIP1杂交的核苷酸序列;所述shRNA中含有能够与NUFIP1杂交的核苷酸序列;其中,所述双链RNA包含第一链和第二链,所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体,并且所述第一链的序列与NUFIP1中的靶序列相同;所述shRNA包括正义链片段和反义链片段,以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构,所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补,并且所述正义链片段的序列与NUFIP1中的靶序列相同。
11.如权利要求10述的用途,其特征在于,所述shRNA或双链RNA靶序列如SEQ ID NO:3示。
12.一种降低生物体中NUFIP1表达的核酸分子,所述核酸分子包含:
a.双链RNA,所述双链RNA中含有能够与NUFIP1杂交的核苷酸序列;或者
b.shRNA,所述shRNA中含有能够与NUFIP1杂交的核苷酸序列;
其中,所述双链RNA包含第一链和第二链,所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体,并且所述第一链的序列与NUFIP1中的靶序列相同;所述shRNA包括正义链片段和反义链片段,以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构,所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补,并且所述正义链片段的序列与NUFIP1中的靶序列相同。
13.如权利要求12所述的降低生物体中NUFIP1表达的核酸分子,其特征在于所述shRNA或双链RNA靶序列如SEQ ID NO:3所示。
14.一种NUFIP1干扰核酸构建体,含有编码权利要求12-13任一权利要求所述核酸分子中的shRNA的基因片段,能表达所述shRNA。
15.一种NUFIP1干扰病毒,由权利要求14所述干扰核酸构建体在病毒包装质粒、细胞系的辅助下,经过病毒包装而成。
16.如权利要求12-13任一权利要求所述的核酸分子,或权利要求14所述NUFIP1干扰核酸构建体,或权利要求15所述NUFIP1干扰病毒的用途,为:用于制备治疗大肠癌的药物,或用于制备降低生物体中NUFIP1表达的试剂盒。
17.一种用于治疗大肠癌的组合物,其有效物质含有:
权利要求12-13任一权利要求所述的核酸分子;和/或,权利要求14所述NUFIP1干扰核酸构建体;和/或,权利要求15所述的NUFIP1干扰病毒,以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
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