CN1637151A - 结肠直肠癌预后 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种通过分析一组基因的表达判断结肠直肠癌预后的方法。其中包括显示在微阵列等各种介质上的基因表达模式，以及含有基因表达模式的试剂盒。

Description

结肠直肠癌预后
技术背景
本申请为2003年8月28日美国申请NO.10/651,237的部分后续申请。
本发明涉及基于生物样品的基因表达模式的结肠直肠癌的预后。
结肠直肠癌是具有复杂起源的异源性疾病，结肠直肠癌患者接受治疗后复发的概率与肿瘤在肠壁浸润的程度以及结节累及的出现与否有关。这些因素也是目前进行Duke’s分期的基础。Duke’s A期病变限于结肠或直肠的粘膜下层。Duke’s B期肿瘤侵染肌肉层并且能浸润直肠或结肠肠壁。Duke’s C期疾病包括出现区域淋巴结转移以及任何程度的肠壁侵染。
外科切除术在治疗早期的结肠直肠癌方面效果显著，对于Duke’s A期和B期患者分别有95％和75％的治愈率。Duke’s C期阳性淋巴结的存在，预示着患者在五年内复发的可能性为60％。目前对于Duke’s C期患者进行治疗的标准作法是在手术后进行化疗，这样能够将复发率降到40％-50％。但是由于相对较低的复发率，对Duke’s B期患者进行术后化疗的好处难以察觉并且依然存在争议。然而，由于Duke’s B期的分级存在一定的缺陷，大约有20-30％的这类患者表现的更像是在Duke’s C期，并且在5年内复发。
因此显然需要一种比结节累及更好的预后因子，来区分Duke’s B期患者中可能复发的群体和将存活的群体。在Wang的美国专利申请US10/403,499中提到了利用基因表达模式进行结肠癌的预测。本说明书中提供了与之不同的基因表达模式。
发明概述
本发明为一种评估诊断为结肠直肠癌或接受结肠直肠癌治疗的人群中结肠直肠癌复发的可能性的方法。该方法包括对基因表达模式的分析。
在本发明的一方面，基因表达模式包括至少7个特定的基因。
在本发明的另一方面，基因表达模式包括至少15个特定的基因。
在本发明的又一方面，基因表达模式包括上述的7个特定基因和15个特定的基因。在一个实施方案中，基因表达模式包括23个基因。
用于实施本发明方法的制品也是本发明的一个方面。这些制品包括固定于机器可读介质比如计算机可读介质上的基因表达模式或其表示物。
识别基因表达模式的制品也包括用于捕获和/或显示基因是否表达或表达的水平的基质或表面，比如微阵列。
在本发明的再一方面的试剂盒，试剂盒中包含根据基因表达分析结肠直肠癌预后复发的试剂。
附图简述
图1是在根据7基因组合的实施例中所述的，由27名患者(其中14名存活，13名复发)的独立患者数据组构建的标准Kaplan-Meier图。按照芯片数据预测的结果将患者分为两类。纵轴显示每一类中无病存活患者的概率。
图2是在根据15基因组合的实施例中所述的，由9名患者(其中6名存活，3名复发)的独立患者数据组构建的标准Kaplan-Meier图。按照芯片数据预测的结果将患者分为两类。纵轴显示在每一类中无病存活患者的概率。
图3是根据实施例中所述的患者数据构建的标准Kaplan-Meier图，其中使用22-基因模式以及钙粘着蛋白17(Seq.ID 6)组成的基因组合。测试了36个样品(20个存活，16个复发)。根据23-基因面板的芯片数据预测的结果，将患者分为两类。纵轴显示在每一类患者中无病存活的概率。
发明详述
仅仅发现组织样品中特定的核酸序列存在与否并没有多少诊断或预测价值。另一方面，不同的蛋白、多肽或mRNA表达的信息正逐渐受到重视。基因组中存在具有表达蛋白、多肽或mRNA的潜在可能的核酸序列(这样的序列被称为“基因”)本身并不能决定是否在指定的细胞中表达该蛋白、多肽或mRNA。基因是否表达蛋白、多肽或mRNA以及表达到什么程度取决于许多复杂的因素。不考虑在理解和评估这些因素上的困难，检测基因的表达能够为比如肿瘤发生、转移、细胞凋亡以及其它临床相关现象等重要事件的发生提供有用信息。通过基因表达模式能够发现基因激活或失活程度的相对指标。本发明的基因表达模式用于对结肠直肠癌患者进行预后和治疗。
需要收集患者样本制备样品。本发明方法中使用的患者样本是怀疑含有病变细胞的样本，比如来自结肠样品的原发肿瘤或来自手术边缘的上皮细胞。激光捕获显微切割(LCM)技术是一种选择待研究细胞的方法，并使由于细胞种类的异质性所导致的变异性最小化。因此，正常细胞和癌细胞在基因表达方面中度或是微小的改变均易于检测到。样本也包括在外周血中提取的循环上皮细胞。许多方法可以获得样本细胞，最优选使用Immunivest Corp公司申请的美国专利US6,136,182中的磁分离技术，在此引入其内容作为参考。一旦获得了含有目的细胞的样本，提取RNA并且扩增，并优选通过微阵列同时获得适当基因组合中基因的表达模式。
优选的构建基因表达模式的方法包括，测定编码蛋白或多肽的基因产生的RNA的量。这可以通过逆转录酶PCR(RT-PCR)、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、差异显示RT-PCR、Northern Blot分析和其他相关实验实现。尽管可以使用单个PCR反应来实施这些技术，最好是扩增来自mRNA的互补DNA(cDNA)或是互补RNA(cRNA)并且通过微阵列来进行分析。大量不同的阵列构型及其生产方法已经是本领域技术人员公知的，并且公开于如下的美国专利中：US5,445,934；US5,532,128；US5,556,752；US5,242,974；US5,384,261；US5,405,783；US5,412,087；US5,424,186；US5,429,807；US5,436,327；US5,472,672；US5,527,681；US5,529,756；US5,545,531；US5,554,501；US5,561,071；US5,571,639；US5,593,839；US5,599,695；US5,624,711；US5,658,734和US5,700,637；在此引入其公开内容作为参考。
微阵列技术能够同时测量上千个基因稳定状态的mRNA的水平，因而可以作为一种很好的工具用来识别失控细胞增殖的启动、抑制或调节。两种微阵列技术目前正被广泛地应用。第一种是cDNA阵列，第二种是寡核苷酸阵列。虽然这些芯片在结构上存在不同，但本质上两者其所有下游的数据分析和输出都是相同的。分析的结果通常是来自标记探针的信号强度测定结果，其中所述探针用来探测样本中与芯片已知位点的核酸序列杂交的来自样品的cDNA序列。典型地，信号的亮度与样本细胞中cDNA的含量，以及相应的mRNA的量成比例。大量这种技术是可获得的并且是有用的。优选的检测基因表达的方法公开于Linsley等的美国专利US6,271,002；Friend等的US6,218,122；Peck等的US6,218,114；和Wang等的US6,004,755中，在此引入其公开内容作为参考。
表达水平的分析是通过比较信号的强度实现的。最好建立一个测试样本中基因表达强度相对于对照样本中基因表达强度的比值基质，例如，来自病变组织的基因表达强度可以与同类正常组织中产生的基因表达强度比较(例如，病变的结肠组织样本与正常的结肠组织样本相比较)。表达强度的比率显示了测试样本与对照样本间基因表达的倍数变化。
基因表达模式可以用多种方式显示。最常用的方式是将原始荧光强度或比值基质排列以树状图表示，其中列表示试验样本，行表示基因。处理数据使具有相似表达模式的基因彼此相互接近。每个基因的表达比率将会用颜色标记出来。例如，小于1的比率(表明下调)将会显示为图谱上的蓝色部分，而大于1的比率(表明上调)将会显示为光谱上的红色部分。商业上可购买到的用于显示这种数据的计算机软件包括Silicon Genetics公司的“GENESPRING”以及Partek公司的“DISCOVERY”和“INFER”。
本发明方法中所使用的被调控基因显示于实施例中。相对于不复发的患者，复发的结肠癌患者中差异表达的基因或是上调或是下调。上调或下调是相对的术语，是指基因的表达量相对某种基线有可检测到的差异(超出了检测系统的噪音影响)。在本发明中，上述基线是指在不复发患者所测量得到的基因表达量。因而在病变细胞(来自复发患者)中目的基因相对于使用相同测量方法测定的基线水平而言或是上调或是下调。本发明上下文中所述“病变”是指随着失控细胞增殖的出现，身体状态发生变化从而阻断、扰乱或是可能扰乱正常的身体机能。当患者的基因型或表型的某些方面与患有某种疾病的表现一致时就被诊断为患有该疾病。然而，实施诊断或预后还包括确定病变/状态组织，例如确定复发的可能性和治疗监控。在治疗监控方面，通过比较全过程的基因表达情况，确定基因表达模式是否发生变化，或者是否改变到与正常组织的模式更为一致来对给定疗程的效果作出临床判断。
优选地，上调和下调的水平根据杂交的微阵列探针测量强度的成倍变化来进行区分。2.0倍的差异或是p值小于.05对于作出这种区分是优选。也就是说，当基因在病变/复发细胞中相对于正常/不复发细胞表现出表达水平差异时，其在病变细胞中的表达强度至少是正常细胞中的2倍以上，或是在正常细胞的2倍以下。优选倍数差异大的基因用于诊断或预后工具中。用于本发明的基因表达模式的基因，其产生区别于正常或非调控基因的信号的表达水平，该信号量超过临床试验仪器的背景噪音。
统计值能够确定地将经调控基因与未调控基因和噪音进行区分。统计学试验能够识别不同样本群体间差异最大的基因。t检验是一种可靠的用于寻找两个群体间明显的差异的统计学方法。p值越低，不同组之间基因显示差异的证据就越有说服力。然而，由于微阵列每次测量不止一个基因，将有上万个统计学检测同时进行。因此，不太可能看到完全是偶然出现的小的p值，同时能够根据Sidak校正和随机/排列试验来进行p值的修正。t检验中在.05以下的p值是该基因存在显著差异的证据。经过Sidak因子校正后小于.05的p值则是更加显著的证据。当每个群体中均有大量的样本存在时，随机/排列试验后在0.05以下的p值是存在明显差异最具说服力的证据。
用于选择能够产生比非调控基因或噪音产生的信号更强信号的基因的另一个参数是使用绝对信号差异值。优选地，受调控的基因表达产生的信号至少与正常或非调控基因的信号有20％的差异(在绝对值的基础上)。更优选地，上述基因与正常或非调控基因的表达模式间至少有30％的差异。
基因被分为几组，从一组基因中获得的一套基因的信息可以作为进行诊断、预后或治疗选择等临床判断的可靠的基础。这些套基因构成了发明的基因组合。本发明中，根据所用基因组合作出的判断包括对结直肠癌及其复发概率的判断，最优选对Duke B期患者进行判断。象常见的诊断标记一样，通常希望能够仅使用最少量的标记即可足以进行正确的医学判断。这避免了使用那些悬而未决需作进一步分析的治疗措施带来的延误，同时又避免了时间和资源的不合理使用。
优选地，构建这样的组合以致该组合中的基因组合相对于单个基因或随机的基因组合而言，具有更好的灵敏度和特异性。在本发明中，组合的灵敏度反映在基因在病变状态下相对于正常状态下所表现出的基因表达的倍数差异上。特异性反映于基因表达信号与目的情况相关程度的统计学测量中。例如，标准偏差能够用于这种测量。对于在一个基因组合中的一组基因，表达测量值的标准偏差越小其特异性越大。检测其他变量比如相关系数也能够实现同样的功能。
一种建立基因表达组合的方法是通过使用优化算法，例如常用于建立股票投资组合的平均方差算法。该方法在Tim Jatkoe等人于2003年3月21日申请的名为“组合选择”的专利申请中有详细的描述。基本上，该方法需要建立一组输入值(金融应用中的股票，本发明中指通过强度测定的表达)并且优化回报值(例如产生的信号)，对其进行接收并使用，同时最小化回报值的可变性。许多商务软件可以进行这种操作。优选使用“Wagner联合均值—方差优化应用程序”，本说明书中将其简称为“Wagner软件”。该软件优选使用“Wagner联合均值—方差优化应用程序”的函数来测定有效界值和Markowitz意义上优选的优化组合。使用软件时需要转换微阵列数据以便其能够作为输入处理，如同将软件用作预期的金融分析目的时进行股票回报和风险检测的方式相同。
在选择基因组合的过程中也可以使用直接推断规则。优选的，该规则在生物学和对产生临床结果的技术的理解的基础上进行公式化。更优选地，它们用于优化方法的输出。例如，组合选择的平均方差法，能够用于分析结肠直肠癌患者中大量基因差异表达的微阵列数据。该方法获得的输出是一组优化了的基因，其中包括一些在外周血和病变组织中都表达的基因。如果用于测试方法的样本来自于外周血，而一些在乳腺癌样本中差异表达的基因在外周血中同样也差异表达，此时可使用直接推断规则，其中从去除了在外周血中差异表达基因的有效界值中，选择基因组合。当然，该规则也可以在有效界值生成前使用，例如在数据预选的时候应用该规则。
其他与所述生物学问题无关的直接推断规则同样能被应用。例如，能够应用基因组合中仅有一定比例能够被一个或一组特殊的基因表示的规则。商业软件例如Wagner软件能够容易的提供这种直接推断规则。这是很有用的，例如，当除了准确性和精密度以外的其他因素(例如预期许可费)对包括一个或多个基因的需求有影响的时候。
本发明的方法包括通过比较不同基因(或基因组合)的基因表达模式进行预测。组成基因组合的每个基因的基因表达模式固定在介质上，例如计算机可读的介质。其存在许多种形式。例如，可以建立表格，其输入值表示疾病的信号范围(例如强度值)。真实患者的数据用来与表格中的值进行比较，以判断患者样本是正常的还是发生了病变。在更复杂的实施方案中，表达信号(如荧光强度)的模式以数字化或图形化的形式记录下来。与患者样本结合的基因组合中的基因表达模式用来与上述表达模式比较。应用模式比较软件来判断是否患者样本具有显示疾病复发的模式。当然，这些比较也能用来判断是否患者不可能复发疾病。然后将样本的表达模式与对照细胞的基因组合相比较。如果样本表达模式与结肠直肠癌复发的表达模式一致时，那么(在缺乏其它医学考虑的情况下)患者将被当作即将复发的患者来进行治疗。如果样本表达模式与正常/对照细胞的表达模式一致时，患者将诊断为结直肠癌阴性。
本发明优选的表达模式为表2中给出的7基因组合和表3中给出的15基因组合。更优选，使用将上述7基因与15基因组合起来构成的基因组合。最优选，由其它能够独立检验结直肠预后的基因，如钙粘着蛋白17(Seq.ID No.6)与表2和表3中给出的基因组合组成的基因表达组合(表4)。该最优选的组合能够最好的区分Duke’s B期患者中复发高危群体与不会复发的群体。一旦确定了高危患者，将能够通过辅助性疗法对其进行治疗。其它能够替代钙粘着蛋白17的独立预后鉴定基因包括，但不限于，序列为Seq ID No.29-94的基因。
本发明中，最优选的分析患者基因表达模式进行结肠癌预测的方法是通过使用Cox风险分析程序。最优选地，该分析使用S-Plus软件(可购于Insightful公司)进行。使用该方法，对基因表达模式与足以表明复发的表达模式(即模式中基因组合的表达水平预示了复发)进行比较。使用已经确定了临界值的Cox风险模型比较两种模式的相似性(已知复发的与患者比较)，判断患者的模式是否超过了临界值。如果超过了，那么患者将被确定为会复发的病人并且进行相应的治疗，例如辅助性治疗。如果患者的表达模式没有超过临界值，那么他们将被确定为不会复发的病人。其他的分析工具也能用来解决该问题，例如线性鉴别分析，逻辑回归分析以及神经网络方法。
许多其它常见的模式识别方法也是可行的。下面的参考文件提供了其中的一些例子：
加权表决：
Golub，TR.，Slonim，DK.，Tamaya，P.，Huard，C.，Gaasenbeek，M，Mesirov，JP.，Coller，H.，Loh，L.，Downing，JR，Caligiuri，MA.，Bloomfield，CD.，Lander，ES.癌症的分子分级：通过检测基因的表达进行等级的确定和预测.Science 286：531-537，1999
支持矢量机器：
Su，AI.，Welsh，JB.，Sapinoso，LM.，Kern，SG.，Dimitrov，P.，Lapp，H.，Schultz PG.，Powell，SM.，Moskaluk，CA.，Frierson，HF.Jr.，Hampton，GM.使用基因表达信号进行人类癌症的分子分级.Cancer Research 61：77388-93，2001
Ramaswamy，S.，Tamayo，P.，Rifkin.，Mukherjee，S.，Yeang，CH.，Angelo，M.，Ladd，C.，Reich，M.，Latulippe，E.，Mesirov，JP.，Poggio，T.，Gerald，W.，Loda，M.，Lander，ES.，Gould，TR.根据肿瘤基因表达信号诊断多类癌症Proceedings of National Academy ofSciences of the USA 98：15149-15154，2001
K-最临近值：
Ramaswamy，S.，Tamayo，P.，Rifkin，R.，Mukherjee，S.，Yeang，CH.，Angelo，M.，Ladd，C.，Reich，M.，Latulippe，E.，Mesirov，JP.，Poggio，T.，Gerald，W.，Loda，M，Lander，ES.，Gould，TR.根据肿瘤基因表达信号诊断多类癌症Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the USA 98：15149-15154，2001
相关系数
van’t Veer LJ，Dai H，van de Vijver MJ，He YD，Hart AA，Mao M，Peterse HL，vander Kooy K，Marton MJ，Witteveen AT，Schreiber GJ，Kerkhoven RM，RobertsC，Linsley PS，Bernards R，Friend SH.根据基因表达模式预测乳腺癌的临床结果.Nature.2002 Jan 31；415(6871)：530-6.
本发明中的基因表达模式同样可以与其它的用于癌症诊断、预后或治疗监控的非遗传诊断方法联合使用。例如，在一些情况下将上述基于基因表达的诊断方法与传统标记如血清蛋白标记(例如癌胚抗原)的数据结合是很有益的。有很多种这样的标记物其中包括CEA分析物。在一种上述方法中，治疗的患者被定期抽血，而后进行上述一种血清标记的酶免疫测定。当标记的浓度显示肿瘤复发或是治疗失败，对样本源作基因表达分析。在怀疑肿块存在的地方，进行针吸采样，对从肿块中获得的细胞的基因表达模式进行上述分析。可选择地，组织样本也能够从以前进行肿瘤切除的组织附近的区域中提取。这种方法在使用其他测试结果不明确的时候尤其有效。
本发明的制品包括用于治疗、诊断、预后以及其他疾病评估的基因表达模式的表示物。表达模式的表示物将归结为能够被机器自动读取的介质，例如计算机可读介质(磁盘，光盘等等)。本发明的制品还包括分析这些介质上基因表达模式的操作指南。例如，制品包括具有比较上述基因组合中基因表达模式的计算机操作指南的CD-ROM。制品也包括数字记录的基因表达模式，以用于与来自患者样本的基因表达数据进行比较。可选择地，表达模式可以用不同的表现格式记录。图形记录是其中的一种。像整合在上述Partek公司的软件“DISCOVERY”和“INFER”中的聚类算法就能最好的协助显示这类数据。
本发明不同类型的制品是用来显示基因表达模式的介质或格式化检测。例如，这些可以包括微阵列，其中互补序列或探针被固定在基质上，当与目的基因的序列结合后能产生表示其存在的可读信号。可选择地，本发明的制品包括试剂盒，其能够进行杂交、扩增以及产生表明目的基因表达水平的信号以判断结肠直肠癌。
本发明制备的试剂盒包括用于测定基因表达模式的格式化检测。其中包括进行检测所需的全部或部分材料，例如试剂和操作指南。
本发明进一步用下列非限定性的实施例说明。
实施例：本发明的基因分析典型地与编码蛋白或多肽产物的全长核酸序列相关。但本领域技术人员知道从分析的观点而言鉴定全长序列不是必需的。也就是说，根据公知的原则，部分序列或ESTs同样能够选作用来设计评估相应基因的基因表达的探针。
实施例1样本处理和LCM
收集来自于外科切除结肠直肠癌肿瘤患者的新鲜冷冻组织样本。使用的样本来自63个根据标准诊断学和病理学被划分为Duck’s B期的患者。患者的临床结果是已知的。36名患者超过3年没有复发，而27名患者在3年内出现了肿瘤复发的情况。
在获得组织后的20-30分钟内快速用液氮将其冷冻，并且随后保存在-80℃的条件下。为了能够激光捕获，将样本切片(6μm)，其中一片封固于载玻片上，另一片封固于薄膜上(P.A.L.M.)，该薄膜已经被固定在载玻片上(Micro Slides Colorfrost，VWR Scientific，Media，PA)。封固于载玻片上的切片于冷的丙酮中固定，并且用Mayer’s苏木精(Sigma，St.Louis，MO)染色。病理学家通过分析样本进行诊断和分级。根据附带的外科病理学和临床报告进行临床分级评估以核实Dukes分类。封固于薄膜上的切片在100％的乙醇中固定5分钟，于曙红/100％乙醇(100μg曙红溶于100ml无水乙醇)中负染1分钟，在100％乙醇中快速浸泡一次以除去未结合的染料，空气中干燥10分钟。
用于LCM前，膜(LPC-MEMBRANE PEN FOIL 1.35μm No 8100，P.A.L.M.GmbH Mikrolaser Technologie，Bernried，Germany)和载玻片需进行预处理以除去RNA酶，并且增强组织样本在膜上的附着。简要地说，载玻片用DEP H2O洗涤，膜用RNase AWAY(Molecular Bioproducts，公司，SanDiego，CA)洗涤并在DEP H2O中漂洗。在将膜附着在载玻片以后，玻载片于+120℃烘烤8小时，用TI-SAD(Diagnostic Products Corporation，LosAngeles，CA，1∶50溶于DEP H2O中，脱脂棉花过滤)处理，+37℃温育30分钟。使用前，需在膜上封固组织样本的位置涂布10μl的RNA酶抑制溶液(Rnasin Inhibitor 2500U＝33U/μl N211A，Promega GmbH，Mannheim，Germany，0.5μl溶于400μl冰冷的溶液中，包括0.15mol NaCl，10mmol TrispH8.0，0.25mmol二硫苏糖醇)。
封固于膜上的组织切片用于进行LCM。使用PALM自动微光束技术(RA.LM.Mikrolaser Technologie，Carl Zeiss，公司，Thornwood，NY)，能够捕获大约2000个上皮细胞/样本，并连接到Zeisis Axiovert 135显微镜中(Carl ZeissJena GmbH，Jena，Germany)。其中包括正常粘膜的周围基质与癌症样本中偶然的干扰基质成分。捕获的细胞置于100％乙醇的小管中于-80℃保存。
实施例2RNA提取与扩增
使用Zymo-Spin Column(Zymo Research，Orange，CA 92867)从LCM捕获的样本中提取总RNA。大约2ng的总RNA重悬于10μl水中，并使用T7RNA聚合酶进行2轮扩增，从而获得大约50μg的扩增RNA。
实施例3DNA微阵列杂交与定量
用可商购的Affymetrix公司的人U133a，通过由大约23,000个人DNA克隆组成的一组DNA微阵列测定样本。根据前述方法制备并获得的总RNA用于所述芯片，使用Agilent BioAnalyzer参照产品说明书进行分析。所有63个样本均符合质量控制标准，并且其数据被用于标记的选择。
芯片强度数据通过Affymetrix公司的软件MAS VERSION 5.0进行分析。通过自动的分析确定了两个能够用以区分复发患者与不复发患者的基因。
上述获得的芯片强度数据作为PARTEK 5.1等商业自动聚类软件的输入值。使用该自动聚类算法识别有20个患者的高复发率群体(13个复发，7个存活)。从最初的23,000个基因中，t检验分析选出了276个在这些病人中显著差异表达的基因。其中，两个基因能够最好地区分复发患者与不复发患者：人肠肽相关转运蛋白(Seq.ID.No.3)和人脂肪酸结合蛋白1(Seq.ID No.1)。这两个基因在该患者群体中的复发患者中下调(实际上是被关闭或是没有表达)。
在余下的43名患者中采用手动分析以进一步的区分复发患者与不复发患者。这组患者的数据被进一步分为以下两组：27名患者被分到训练组，16名患者被分到测试组。这保证了不会将相同的数据同时用于确定标记和检验标记的效用。
不等方差t检验用于训练组。从具有有效的校正p值的28个基因中选出MHC II-DR-B。这些基因在复发患者中下调。MHC II-DR-B(Seq.IDNo.2)也具有最小的p值。
在另一轮的手动分析过程中，使用上述的Partek Version 5.0软件运行变量选择程序进行线性鉴别分析以区分训练组的存活和复发患者。搜寻的方法采用预选。用最小后验误差选择的变量为免疫球蛋白样转录物5蛋白(Seq.ID No.4)。Cox比例风险模型(使用Insightful公司的“S Plus”软件)用于基因选择以确定上述基因选择的存活时间。在全部27轮的每一轮中，训练组中27个患者中的一个被取出，剩下的26个患者被用于单变量Cox模型回归以评估基因表达与患者存活时间之间的关联度。该关联度由从Cox模型回归返回的相应的标准参数估计值和P值评估。0.01的P值作为界限用来从每一轮排除一个样本的基因选择中选取上基因(top gene)。比较每一轮挑选出的上基因(top gene)，选出在全部27轮排除一个基因的选择循环中至少有26次被选中的基因。总共70个基因被选出，并且MHC II-DR-B与免疫球蛋白样转录物5蛋白均在其中(又显示为下调)。
构建多基因预测因子：MHC II-DR-B与免疫球蛋白样转录物5蛋白这两个基因用于通过线性鉴别分析产生预测因子。投票值表示复发的后验概率。当患者的值大于0.5时被认为是复发患者。当患者的值小于于0.5时则被认为是存活患者。该预测因子在训练组中进行测验。
交叉确认和预测因子评估：预测因子的性能将在独立的数据组中进行测定，因为多数的分类方法均在构建它的实例中效果良好。16名患者的测试组用来评估预测的准确性。分类的中止由ROC曲线来决定。选择中止后，将确定测试组中准确预测的复发和存活患者数量。
全面预测：对63个Duke’s B期结肠癌患者的基因表达模式进行分析，确定了在患者中差异表达的4个基因(下调或关闭)。这些基因是Seq.IDNo.1，Seq.ID No.2，Seq.ID No.3和Seq.ID No.4。36名患者在3年以上病情没有复发，而27名患者在3年内肿瘤复发。使用Seq.ID No.2，Seq.ID No.3和Seq.ID No.4这3个基因标记组合进行预测，27个复发患者中的22个以及36个存活患者中的27个能够被正确的确定。这一结果显示了82％的灵敏度和75％的特异性。阳性预测值为71％，阴性预测值为84％。
实施例4：更多的样本
对74名已编号的Dukes’B结肠癌患者的冰冻肿瘤样本进行研究。外科手术时收集原发肿瘤以及附近无瘤结肠组织。对每个样本重新进行组织病理学分析以确定诊断结果以及肿瘤累及的一致性。选择用于分析的区域包含超过50％的肿瘤细胞结构并且没有混入其它组织。还可以获得一致性的后续信息。
实施例5：基因表达分析
根据实施例1-3中描述的方法从实施例4的样本中提取总RNA。阵列用标准的Affymetrix方法和扫描仪进行扫描。为了进行后续分析，每个探针组被当作一个分离的基因。通过Affymetrix GeneChip分析软件MAS 5.0计算每个基因的表达值。所有用于后续分析的数据均符合质量控制标准。
统计学方法
基因表达数据首先通过变量筛选以除去在所有样本中均“不存在”的基因。在22,000个基因中，17,616个基因通过了筛选用于聚类。在分级聚类前，每个基因根据患者的中间表达水平进行划分。在至少10％患者中的表达水平超过平均表达水平4倍以上变化的基因用于聚类。为了确定具有不同基因表达模式的子患者群，分别使用软件GeneSpring 5.0(SanJose，CA)和Partek 5.1(St.Louis，MO)进行平均连锁分级聚类和k平均值聚类。使用经过Bonferroni修正的T检验，根据聚类结果识别在两个子患者群中具有不同表达水平的基因。Bonferroni修正P值为0.01被选作基因选择的界限。每类中具有不同表达模式的患者将进一步根据输出信息进行检查。
为了鉴定能够区分复发患者和存活患者的基因标记，每个子患者群分开进行下面的分析。所有的统计学分析都是通过软件S-Plus(Insightful，VA)进行的。
患者与肿瘤性质
表1中列出了患者的临床和病理学特征以及肿瘤的情况。包括的信息有患者的年龄、性别、TNM阶段、等级、肿瘤大小和肿瘤的位置。74名患者中有73名有测定的淋巴结数量的数据，74名患者中有72名有估计的肿瘤大小信息。复发患者与存活患者间在病情和肿瘤特征方面没有显著差异。没有患者接受过手术前治疗。研究中所有的患者都具有接下来最少3年的病情数据。
根据基因表达模式鉴定子患者群
自动分级聚类分析根据17,000个主要基因的表达模式相似性生成了含有74名患者的群。其中确定了两个子患者群，子群间有超过600个差异表达的基因(p＜0.00001)。较大的子群和较小的子群分别包括54名和20名患者。在含有54名患者的较大子群中仅有18名患者(33％)在3年内肿瘤复发，而在含有20名患者的较小子群中有13名患者(65％)出现了后续病变。卡方分析给出了0.028的p值。
筛选和检测出了两个主要的基因群，其在两类肿瘤间有明显不同的表达。第一个基因群在20名患者的较小子群中含有一组下调的基因，例如肝肠特异性钙粘着蛋白17、脂肪酸结合蛋白1、尾类同源框转录因子(caudaltype homeo box transcription factor)CDX1和CDX2、粘蛋白和类钙粘着蛋白MUCDHL。第二个基因群以一组在较小患者子群中上调的基因为代表，包括血清诱导激酶SNK、膜联蛋白A1、B细胞RAG相关蛋白、钙结合蛋白2和肿瘤抗原L6。有20名患者较小的的子群根据基因表达模式代表低分化的肿瘤。
基因信号及其预测值
为了鉴定能够区分复发患者与存活患者的基因标记，分别单独分析每个患者子群。每个子群的患者首先被分为训练组和测试组，两组中患者的数量大致相同。训练组用于筛选基因标记并且建立预后信号。测试组用于进行独立的检验。在含有54名患者的较大子群中，有36名患者在首次诊断后至少3年没有复发，而18名患者在3年内出现了肿瘤复发。这54名患者被分为两组。训练组中含有21名存活患者和6名复发患者。在较小的含有20名患者的子群中，7名患者在至少3年内没有复发和13名患者在3年内出现肿瘤复发。这20名患者被分为两组。训练组中含有4名存活患者和7名复发患者。为了确定一个基因信号以区分预后良好的群体和预后不良的群体，手动的分类方法应用于每个训练组。单变量Cox比例风险回归被用来确定表达水平与患者存活时间相关的基因。基因的选择以p值小于0.02为选择标准。然后，对选择的基因进行t检验以测定在复发患者和存活患者间差异表达的显著性(P＜0.01>。为了避免选择的基因只适合该训练组，重新取样100次进行t检验以找到在超过80％的重新取样测试中具有显著p值的基因。在含有27名患者的训练组中选出了7个基因(表2)，在含有11名患者的训练组中选出了15个基因(表3)。根据这22个基因和钙粘着蛋白17，用S-Plus软件构建Cox模型来预测患者的复发情况。Kaplan-Meier存活分析显示，预测为预后良好的群体与预测为预后不良的群体间患者存活的概率存在明显的差异。
其中几个基因与细胞增殖和肿瘤发生有关。例如，酪氨酸3单加氧酶色氨酸5单加氧酶激活蛋白(YWHAH)属于14-3-3蛋白家族，其与人类细胞DNA损伤后的G2细胞周期控制有关。RCC1是另一个细胞周期基因，其参与调控染色体凝聚的启动。BTEB2是一种锌指转录因子，其被认为是β连环蛋白不依赖的Wnt-1应答基因。少量基因可能参与局部免疫应答。免疫球蛋白样转录物5蛋白是一种常见的MHC I分子抑制受体。CAPG是凝溶胶蛋白/绒毛蛋白家族帽状蛋白的唯一成员，其主要在巨噬细胞中表达。LAT是高酪氨酸磷酸化蛋白，其连接T细胞受体导致细胞活化。这样肿瘤细胞和免疫细胞表达的基因均可作为预测因子来判断患者的复发情况。
为了检验23-基因的预后信号，将27名患者的较大子群和9名患者的较小子群的两个测试组的患者被合并在一起，所做的预测结果均是根据测试组中这36名独立患者作出的。该测试组中包括18名在3年内肿瘤复发的患者和18名3年以上没有复发的患者。预测的结果是有13个正确的复发分类和15个正确的存活分类。整体的准确率为78％(36名中的28名)，其中灵敏度为72％(18名中的13名)，特异性为83％(18名中的15名)。这一性能显示在Dukes’B期患者中，测量值低于预后信号极限的患者在3年内肿瘤复发的概率比测量值高于预后信号极限的患者高13倍(95％CI:2.6，65；P＝0.003)。此外，Kaplan-Meier存活分析显示，预测为预后良好的群体与预测为预后不良的群体间患者存活的概率存在显著差异(P＜0.0001)。在多变量Cox比例风险回归中，肿瘤复发的估计风险率为0.41(95％置信区间，0.24到0.71；P＝0.001)表明23-基因组代表了预后信号，而且它与更高的肿瘤复发率负相关。使用含有7个基因的组合(表2)，可以得到83％的灵敏度和80％的特异性(根据12个复发者和15个存活者的样本组)。使用含有15个基因的组合(表3)，可以得到50％的灵敏度和100％的特异性(根据6个复发者和3个存活者的样本组)。图1和2图形显示了分别对含7基因组合和15基因组合进行Kaplan-Meier分析的图形描述。
此外，如这些结果所示，可以通过分析原发肿瘤的基因表达模式进行预后判断。
表1.患者及其肿瘤的临床和病理学特征
特征                存活              复发                P值*
                    患者比例(％)
年龄                43                31                  0.7649
平均值              58.93             58.06
性别                43                31                  0.8778
女                  23(53)            18(58)
男                  20(47)            13(42)
T阶段               43                31                  0.2035
2                   12(28)            5(16)
3                   29(67)            26(84)
4                   2(5)              0(0)
分化                43                31                  0.4082
差                  5(12)             6(19)
中                  37(86)            23(74)
好                  1(2)              2(6)
肿瘤大小            41                310.1575
＜5                 29(71)            16(52)
＞＝5               12(29)            15(48)
位置                43                31                  0.7997
LC                  1(2)              1(3)
RC                  17(40)            10(32)
TC                  6(14)             3(10)
SC                  19(44)            17(55)
检查到的LN数量      43                30                  0.0456
平均值              12.81             8.63
*年龄、淋巴结数量和肿瘤信息的P值是通过t检验获得的；其他的P值是通过χ2检验得到。
表2：7基因列表
登录号                                Seq.ID No.
AF009643.1                            7
NM_003405.1                           8
X06130.1                              9
AB030824.1                            10
NM_001747.1                           11
AF036906.1                            12
BC005286.1                            13
表3：15基因列表
登录号                                   Seq.ID.No.NM_012345.1                              14NM_030955.1                              15NM_001474.1                              16AF239764.1                               17D13368.1                                 18NM_012387.1                              19NM_016611.1                              20NM_014792.1                              21NM_017937.1                              22NM_001645.2                              23AL545035                                 24NM_022078.1                              25AL133089.1                               26NM_001271.1                              27AL137428.1                               28
表4.23个基因构成的预测信号
改变方向  Seq.ID No.  P值     基因描述
                      (Cox)
-         7           0.0011  免疫球蛋白样转录物5蛋白
-         8           0.0016  酪氨酸3单加氧酶色氨酸5单加氧酶激活蛋白
-         9           0.0024  细胞周期基因RCC1
+         10          0.0027  转录因子BTEB2
-         11          0.0045  帽状蛋白(肌动蛋白丝)，凝溶胶蛋白一样
                              (CAPG)
-         12          0.0012  激活T细胞的接头(LAT)
-         13          0.0046  Lafora病(laforin)
-         14          0.0110  核脆性X智力迟钝蛋白作用蛋白1(NUFIP1)
+         15                  解离素样和金属蛋白酶(reprolysin型)与血小板
                      0.0126  反应蛋白型1基序，12(ADAMTS12)
+         16          0.0126  G抗原4(GAGE4)
+         17          0.0130  包括粘蛋白样受体EMR3的EGF的分子
+         18          0.0131  丙氨酸：乙醛酸转氨酶
+         19          0.0131  肽基精氨酸deiminase，V类(PAD)
+         20          0.0136  钾内调通道，K亚家族，成员4(KCNK4)
+         21          0.0139  KIAA0125基因产物
+         22          0.0142  假定蛋白FLJ20712(FLJ20712)
+         23          0.0145  载脂蛋白C-I(APOC1)
+         24          0.0146  包括gb：AL545035的共有序列
+         25          0.0149  假定蛋FLJ12455(FLJ12455)
+         26          0.0150  包括gb：AL133089.1的共有序列
+         27          0.0151  染色体解旋酶DNA结合蛋白2(CHD2)
+         28          0.0152  包括gb：AL137428.1的公有序列
N/A       6          未测     钙粘着蛋白17
                                    序列表
<110>奥索临床诊断有限公司
Wang，Yixin
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<213>人
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ctttttggag acagattcgc agtggtcgct tcttctcctt ggatttgtta aggattccaa     60
gtaactctta tttggagaga agacgatctg cacttcgcat tttggcattg acatttaatt    120
ttagggtcct ttatatagaa gggagagtag ctacatgaat gtgtaagatc ttggaggaag    180
acagcagaga gagagagaga gatcagagat cccagggtta aaagttggag aaatttcaca    240
gtacatcatc caaaagagga gtccatgatg gaggcagagg taaacttgga gaggacagga    300
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gcaagaaggt gaaggtctca cacaggtccc acagcacaga acccggcttg gtgctgacac    420
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tgtgtctaag caaaagtggc caggtctatt ccttcggctg caatgatgag ggtgccctgg    600
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tcttcctctg gggctccttc cgggacaata acggtgtgat tggactgttg gagcccatga    780
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<210>10
<211>1622
<212>DNA
<213>人
<400>10
cgttggcgtt tacgtgtgga agagcggaag agttttgctt ttcgtgcgcg ccttcgaaaa     60
ctgcctgccg ctgtctgagg agtccacccg aaacctcccc tcctccgccg gcagccccgc    120
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at                                                                  1622
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<212>DNA
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<400>11
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accccatctt catctggcct tgactctgcc cttgaggggc ctaggggtgc agccagcctg     60
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gtgacctcaa tcctgttcat cacgacgtgg ctgtccttct caccagaaag gacatctgtg   1380
ctggtttcaa tcgcccctgc gagaccctgg gcctgtctca cctttcagga atgtgtcagc   1440
ctcaccgcag ttgtaacatc aatgaagatt cgggactccc tctggctttc acaattgccc   1500
atgagctagg acacagcttc ggcatccagc atgatgggaa agaaaatgac tgtgagcctg   1560
tgggcagaca tccgtacatc atgtcccgcc agctccagta cgatcccact ccgctgacat   1620
ggtccaagtg cagcgaggag tacatcaccc gcttcttgga ccgaggctgg gggttctgtc   1680
ttgatgacat acctaaaaag aaaggcttga agtccaaggt cattgccccc ggagtgatct   1740
atgatgttca ccaccagtgc cagctacaat atggacccaa tgctaccttc tgccaggaag   1800
tagaaaacgt ctgccagaca ctgtggtgct ccgtgaaggg cttttgtcgc tctaagctgg   1860
acgctgctgc agatggaact caatgtggtg agaagaagtg gtgtatggca ggcaagtgca   1920
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cccactgttc caggacctgt ggggctggag tccagagcgc agagaggctc tgcaacaacc   2040
ccgagccaaa gtttggaggg aaatattgca ctggagaaag aaaacgctat cgcttgtgca   2100
acgtccaccc ctgtcgctca gaggcaccaa catttcggca gatgcagtgc agtgaatttg   2160
acactgttcc ctacaagaat gaactctacc actggtttcc catttttaac ccagcacatc   2220
cttgtgagct ctactgccga cccatagatg gccagttttc tgagaaaatg ctggatgctg   2280
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tatgtaagat ggttggctgt gactatgaga tcgattccaa tgccaccgag gatcgctgcg   2400
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tggaaattga gggagctgga aacttcctgg ccatcaggag tgaagatcct gaaaaatatt   2580
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ttcagtatga caggaaagga gacctggaaa agctgatggc cacaggtccc accaatgagt   2700
ctgtgtggat ccagcttcta ttccaggtga ctaaccctgg catcaagtat gagtacacaa   2760
tccagaaaga tggccttgac aatgatgttg agcagatgta cttctggcag tacggccact   2820
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agaagggccg cgggatggtg aaagctacat tctgtgaccc agaaacacag cccaatggga   2940
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ggagtgagtg ttctgtttcc tgtggtggtg gagtgcggat tcgcagtgtc acatgtgcca   3240
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gaaaaaaccc accaacacta aagcccgtcc ctccacctac atccaggccc agaatgctga   3420
ccacacccac agggcctgag tctatgagca caagcactcc agcaatcagc agccctagtc   3480
ctaccacagc ctccaaagaa ggagacctgg gtgggaaaca gtggcaagat agctcaaccc   3540
aacctgagct gagctctcgc tatctcattt ccactggaag cacttcccag cccatcctca   3600
cttcccaatc cttgagcatt cagccaagtg aggaaaatgt ttccagttca gatactggtc   3660
ctacctcgga gggaggcctt gtagctacaa caacaagtgg ttctggcttg tcatcttccc   3720
gcaaccctat cacttggcct gtgactccat tttacaatac cttgaccaaa ggtccagaaa   3780
tggagattca cagtggctca ggggaagaaa gagaacagcc tgaggacaaa gatgaaagca   3840
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acaacatgaa ccaaacaaaa agttctgaac cagtcctgac tgaggaggat gcaacaagtc   4200
tgattactga gggctttttg ctaaatgcct ccaattacaa gcagctcaca aacggccacg   4260
gctctgcaca ctggatcgtc ggaaactgga gcgagtgctc caccacatgt ggcctggggg   4320
cctactggaa aagggtggag tgcaccaccc agatggattc tgactgtgcg gccatccaga   4380
gacctgaccc tgcaaaaaga tgccacctcc gtccctgtgc tggctggaaa gtgggaaact   4440
ggagcaagtg ctccagaaac tgcagtgggg gcttcaagat acgcgagatt cagtgcgtgg   4500
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ccccattgag catgagctgt aacccggagc cctgtgaggc gtggcaggtg gagccttgga   4620
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<212>DNA
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cgccagggag ctgtgaggca gtgctgtgtg gttcctgccg tccggactct ttttcctcta     60
ctgagattca tctgtgtgaa atatgagttg gcgaggaaga tcgacctatt attggcctag    120
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<212>DNA
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<400>17
tttcttgagc taggaaaggt ggttggctta cggcacagta gagagcttcc agggctggct     60
ggcgtgggat acccgtacca cagaaatgca gggaccattg cttcttccag gcctctgctt    120
tctgctgagc ctctttggag ctgtgactca gaaaaccaaa acttcctgtg ctaagtgccc    180
cccaaatgct tcctgtgtca ataacactca ctgcacctgc aaccatggat atacttctgg    240
atctgggcag aaactattca cattcccctt ggagacatgt aacgacatta atgaatgtac    300
accaccctat agtgtatatt gtggatttaa cgctgtgtgt tacaatgtcg aaggaagttt    360
ctactgtcaa tgtgtcccag gatatagact gcattctggg aatgaacaat tcagtaattc    420
caatgagaac acctgtcagg acaccacctc ctcaaagaca accgagggca ggaaagagct    480
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gtgtaattgc agtcacctgt ccagcttcgc tgtcctgatg gccctgacca gccaggagga   1140
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ctgtgccatt ttctctgcga atttagtatt gtttatcttg gtcttttgga ttttgaaaag   1680
aaaactttcc tccctcaata gtgaagtgtc aaccatccag aacacaagga tgctggcttt   1740
caaagcaaca gctcagctct tcatcctggg ctgcacatgg tgtctgggct tgctacaggt   1800
gggtccagct gcccaggtca tggcctacct cttcaccatc atcaacagcc tccaaggctt   1860
cttcatcttc ttggtctact gcctcctcag ccagcaggtc cagaaacaat atcaaaagtg   1920
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<212>DNA
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aagtggctgg ccaacttctg gggctgtgac gaccagccca ggatgtacca tcacacaatc    900
cccgtcatca gcctgtacag cctgagagag agcctggccc tcattgcgga acagggcctg    960
gagaacagct ggcgccagca ccgcgaggcc gcggcgtatc tgcatgggcg cctgcaggca   1020
ctggggctgc agctcttcgt gaaggacccg gcgctccggc ttcccacagt caccactgtg   1080
gctgtacccg ctggctatga ctggagagac atcgtcagct acgtcataga ccacttcgac   1140
attgagatca tgggtggcct tgggccctcc acggggaagg tgctgcggat cggcctgctg   1200
ggctgcaatg ccacccgcga gaatgtggac cgcgtgacgg aggccctgag ggcggccctg   1260
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cacct                                                               1325
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ctggggtaga ggtgaccctg acgatgaaag cggccagtgg tagcacaggc gaccagaagg    300
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gctctaagaa gctgcaataa agttttttta agtcactttg tac                     2263
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aggcagggga gagagaatgg catctcgcgt ggagggctgt cgtttgaact ctcccagcgc   1920
gagagaccct gccccgcccc cttcctggag cgttgactcc cttctcgtct cgaggcctgt   1980
ggcgtctggg tccgttgggg cagaaccatg gaggaaaagc cttcgaaagt gtcgctcaag   2040
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atcggcaggg accacttcct gactaaggag ctgcagcgat acatcgaagg gctcaagaag   2580
cgccggagca agaggctgta cgtgaattaa aaacgccacc ttgggctcga gcagcgaccc   2640
gaaccagccc cgtgccagcc cggtccccag acccaagcct gaccccatcc gagtggaatt   2700
tgagtcctaa agaaataaaa gagtcgatgc atgaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa   2760
aaaaaaaaaa aa                                                       2772
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ttcaagtatg gcagacaaag gatgttctgc gtggggaaat gtggtgacac ccatttcaca     60
aggacagctc acatagattg agtgctcagg aaggaccagc accataccca gtgcctgatg    120
tgtatcatct caattagtcc ttgcctcaga tgcaaaagga aaccatcgcc atcatcatca    180
ccaccatcat catcttcctc ctgtgcagat ggaaaggctg aggcatagag aggtgacgga    240
gtctgcccag gactgcaagc ctgctggtgg cagagccagg ttccaatgga atgaaggctg    300
tcatcctcag atggcagggt aggcaggtgg ctagagctca cttgggagaa ggggaaagga    360
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ctctccttta gacccactgt gccttcccgg cctcccgggc ttctgctggg ggcagaagaa   2280
atgcctcccc aggtctgtct ctggaggctc tgagggagat gggcttgggg gctgtaggag   2340
gaggcaggga ttccagggtg tcaggaaggc aggggtgcca ggtcccacct agtgaagtaa   2400
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<212>DNA
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<212>DNA
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aagtttaacc caaagctggg cattgataat cctgtcctct ccctggccga agaccacgac    120
ccctatgatc cctggagcct ggagcggcct cgcttctgtt tactgagcaa agaggagggc    180
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gtggacccag gcacctctgc ccagcgccag ggtcttcagg aaggagacag gatcctggcg    300
gtgaacaatg atgttgtgga acacgaagac tatgcggtgg tggtacgccg catccgggcc    360
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cagctgggag aagatgccca cctctgtccc accctaggcc caggggtccg gccccggctg    480
tgccacatag tgaaagatga gggtggtttt ggcttcagtg tcacccatgg caatcagggt    540
cctttctggt tggtgctaag tactggagga gcagctgagc gggcaggggt gccccccggg    600
gcccggctgc tggaagtgaa tgggctttgg cagagtggac agcaggtgac cttgctggtg    660
gcagggccag aggtggaaga acagtgtcgc cagctgggat tgcccctggc tgcacccctg    720
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa                                        2246
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<212>DNA
<213>人
<400>60
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caggcctttc atggggggaa ccgcattgga ggcattcggc tgcgccatca gcactggagt    660
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa                                          1944
<210>62
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<212>DNA
<213>人
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tttttttttt tttaaaatca atacaaatct tttattaaag atctactcat accatggctg     60
aaatcatcta ttattgttgc tagttagcct ctcttctata gttgggtaat gttgtcttgc    120
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aaagggtgat cttgtggata aattcatcat acttcacttt gccattgggt tcgatatctg    300
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tatcttcccc ctctgctgct gtcatacaag gagaagcatt tcttgtctca ttaatttggt    660
c                                                                    661
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<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<222>(519)..(519)
<223>N EQUALS ANY KIND OF BASE
<400>63
taactatgga aaaccatgtt tatttttaat aaaggatgac atttccaatc agtaaaatat     60
cataaaagta taaaaatgta ctaagtacaa tcattagcat tatgttatag gggaatagtg    120
gttataactt ttccctgtaa gatggcacat tggatggtca cagttggctt gatttacaga    180
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tgtaaaatga gaaagtccca ggcaaactgg gacggttggt cctacaagaa aaagagcagc    300
atcagagtgt tggctatagt ttggaactta ggaacaggat cagacattat tttttaactt    360
ctccacctat tttcccttta gctgtgaaat aaaaatccct tttgttatta ctgagggtgt    420
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<210>64
<211>1013
<212>DNA
<213>人
<400>64
atcattccta gaactgaagt tgaaaaggcc atcaggatgt cccggagccg tatcaatgat     60
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gcaagaagtg gagaaaatcc ttatgcctcc atcgatatta gcaaaggaga aaataatcca    300
ggattccaaa acactgatga tgttcagacc tccttttaga aaaatctatg tttttcctct    360
tgaggtgatt ttgttgtatg taaatgttaa tttcatggta tagaaaatat aagatgataa    420
agatatcatt aaatgtcaaa actatgactc tgttcagaaa aaaaattgtc caaagacaac    480
atggccaagg agagagcatc ttcattgaca ttgctttcag tatttatttc tgtctctgga    540
tttgacttct gttctgtttc ttaataagga ttttgtatta gagtatatta gggaaagtgt    600
gtatttggtc tcacaggctg ttcagggata atctaaatgt aaatgtctgt tgaatttctg    660
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<212>DNA
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gccaagaggt tcatcctgga catgtacacg aggatgtaca ccgggtgcgt ggacggcccc   1200
gagggcagca agaagggcgc acgatcccga cgccttttca gccactacac atgtgccaca   1260
gacacacaga acatccgcaa ggtcttcaag gacgtgcggg actcggtgct cgcccgctac   1320
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gcccacacgc aagggagtcg ggggacggcc cgctgctggc cgctctcttc tctgcctctc   1500
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aaagggaagg agcaaaacgg ccatttggga tgccagggtg gatgaaaagg tgaagaaatc   1620
aggggattga gacttgggtg ggtgggcatc tctcaggagc cccatctccg ggcgtgtcac   1680
ctcctgggca gggttctggg accctctgtg ggtgacgcac accctgggat ggggctagta   1740
gagccttcag gcgccttcgg gcgtggactc tggcgcactc tagtggacag gagaaggaac   1800
gccttccagg aacctgtgga ctaggggtgc agggacttcc ctttgcaagg ggtaacagac   1860
cgctggaaaa cactgtcact ttcagagctc ggtggctcac agagtgtcct gccccggttt   1920
gcggacgaga gaaatcgcgg cccacaagca tcccccatcc cttgcaggct gggggctggg   1980
catgctgcat cttaaccttt tgtatttatt ccctcacctt ctgcagggct ccgtgcgggc   2040
tgaaattaaa gatttcttag                                               2060
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<212>DNA
<213>人
<400>66
catagagcca gcgggcgcgg gcgggacggg cgccccgcgg ccggacccag ccagggcacc     60
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gaagtcaacc tctgctgctt ctccttggcc tgcgttggac cttccttttt ttgttgtttt    180
tttttgtttt tcccctttct tccttttgaa ttaactggct tcttggctgg atgttttcaa    240
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aatatcccct gtgaagaagg agataagctc cagcttttct gctttcgact tagaaaaaag   1380
aaccagatgt caaaactgat ttcagaaatg catagtttta tccagataaa gaaaaaaaca   1440
aacccgagaa acaatgaccc caagagcatg aagctacccc aggaacagcg tcagcttcca   1500
tatccttcag aggccagcac aaccttccct gagagccatc ttcggactcc tcagatgcca   1560
ccaacaactc catccagcag tttcttcacc aagaaaagtg aagacacaat ctccaaaatg   1620
aatgacttca tgaggatgca gatactgaag gaagggagtc attttccagg accgttcatg   1680
accagcatag gcccagctga gagccatccc cacactcctc agatgcctcc atcaacacca   1740
agcagcagtt tcttaaccac gttgaaacca agactgaaga ctgaacctga agaagtttcc   1800
atagaagaca gtgcccagag tgacctcaaa gaagtgatgg tgctgaacgc aacagaatca   1860
tttgtatatg agcccaaaga gcagaagaaa atgtttcatg ccacagtggc aactgagaat   1920
gaagtcttcc gagtgaaggt ttttaatatt gacctaaagg agaagttcac cccaaagaag   1980
atcattgcca tagcaaatta tgtttgccgc aatgggttcc tggaggtata tcctttcaca   2040
cttgtggctg atgtgaatgc tgaccgaaac atggagatcc caaaaggatt gattagaagt   2100
gccagcgtaa ctcctaaaat caatcagctt tgctcacaaa ctaaaggaag ttttgtgaat   2160
ggggtgtttg aggtacataa ggtaagccca caccattgtt ttataaaatt tctcctgcaa   2220
cctccaattt ttaaagtctt aacttgtcaa ctggagtttg gtcaacttac tcaacacaga   2280
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atatggggta cgttatattg taacattcct cttcttaagg tatcatcatg caagttattt   2400
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gttcttctcc atctgtatca atgacaactt aatttaattg tgaataaaag agttgctctc   2580
ccaagcctga atcctgattg tgacaaccag agtaagaaat aaaatagact actctgcttt   2640
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ataaatgggg caataaaatg caaaaaaaaa gaaaaaaagc ttggtgaatt cttaggctta   2880
cagtgtgcct ttcagtctct acacatcatg taaatattat gcttagctga tttaacttct   2940
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tgtgctgttt tctctacact cagtttaaat gactgtacat atatatgtgg ttggagagtt   3060
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gccataaaaa gcctctattc tctgctcttg ggcaggtgtg aaagaaacct accaaattaa   3300
tcagattttt ctgtatccag gctccttaaa aaatcccagc tgtgctgatg tggaaacagg   3360
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tccagaaaca ccctgtattt ctcatagatt tgaaaattat tgatccagtt tcagaagata   3600
agtgttaatt ttcttttgca gaaaaatgta aggggtgaat tcacttatta tgaaatacaa   3660
gataatacag ggaagatgga agtggtggtg catggacgac tgaccacaat caactgtgag   3720
gaaggagata aactgaaact cacctgcttt gaattggcac cgaaaagtgg gaataccggg   3780
gagttgagat ctgtaattca tagtcacatc aaggtcatca agaccaggaa aaacaagaaa   3840
gacatactca atcctgattc caagtatgga aacttcacca gactttttct tctaaaatct   3900
ggatgtcatt gacgataatg tttatggaga taaggtctaa gtgcctaaaa aaatgtacat   3960
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tatggaatgg ggtattggga gtgctttttt aatttttcat agtttttttt taataaaatg   4080
gcatattttg catctacaac ttctataatt tgaaaaaata aataaacatt atcttttttg   4140
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tttgcttttg tttcttctgg tcccatcact gggacctaaa agaagctcac atgtggtctc     60
tggaaatgct gaagctgtgg actgtagaca ttattttcag tccttgtcct ggtggctgca    120
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ccgcggcaca ggcggtgatg ggaactcctc cccgggccag cctctcaggc tgcagcccca    240
cggcaccctg aggccctcat ctctgctcgg cagctaaaac atctccttct tcgatgctct    300
gcaactgcag cctctggctc acaagagttc tgctgcctcg gcggcccccg aagccgcccc    360
ccgggacagt ccgtgctgta accaagaccc ctggcaaagc ctcctcccca aataagttga    420
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tggtagtgaa tactttattt tgttgtaaac aagttagttt tgagggtatt tcctcgtggt     60
cctcctgccg tcactcgtcc ccatgttcca atgatgctga tcaactgctt tattcagttt    120
cccatctttc ttcttgccca ggcatcgtag cctttctttt tttaaacaca tgatccctag    180
tactcatctt tggaggacaa aaggctttcc atatgttaga aaaatttgaa tctcatagta    240
ctcacaacaa tgagcagcat tgtaagttgt gatgcattca tttggattgg aacattctca    300
atcagtcctt ccactctaag taaatatttg tttctcacag aacacaaggc agttcaaaag    360
gcctcttggt taaggaatta tagggtgttg aatgggaaac atcatacaag cagtgaaaac    420
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tctctaattt aaaaaataca tgcacatata tacaatagtg attggaatgt attcttatcc    540
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aaaagaagtt actaaatttt aacactgaca tccttgtgaa gagccagtct ttacaggcgt    720
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aggactcggg ccggagcgtg gccggacccc cacccgccga ggggcccagg gaggacgcgg     60
cagagtcacg gtggcagcat tgagagttgg acacccgggt ccttgaagtg atctctaggc    120
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gctggagggg aggccttagg gggcagtttc tgggaggctg gcaactacag gcgcacggta    240
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gcccgcatcg agaaggctta tgcccagcag ttggctgact gggcccgaaa gtggaggggg    360
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agtgagcggg tgcgcgcctg gcagcggggg gctttccacc ggcctgtgct gggcggcttc    540
cgcgagagcc gggcggccga ggacggcttc cgcaaggccc agaagccctg gctgaagagg    600
ctgaaggagg ttgaggcttc caagaaaagc taccacgcag cccggaagga tgagaagacc    660
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aaactgcagg aacgggtgga acgctgtgcc aaggaggccg agaagacaaa agctcagtat    780
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ctcaccttac accagcacct ggacctttcc agcagtgaga agttccatga actccaccgt    960
gacttgcacc agggcattga ggcagccagt gacgaagagg atctgcgctg gtggcgcagc   1020
acccacgggc caggcatggc catgaactgg ccacagttcg aggagtggtc cttggacaca   1080
cagaggacaa tcagccggaa agagaagggt ggccggagcc ctgatgaggt taccctgacc   1140
agcattgtgc ctacaagaga tggcaccgca cccccacccc agtccccggg gtccccaggc   1200
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tcctgacagc ccttctgcaa cgtttaccca ccctggttca gagcccagct tctcctggag   1500
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa                               1894
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tggaacagct ggaagctctg gtgcaaacca aggaccagga gattcagacc ctgaagagtc    1020
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a                                                                    1561
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tcgagatcca ttgtgctcta aaggctcgcc ctcctgtgca tcgcggctaa tttggggtat     60
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gactgagtga cagtactcag tatatctgag ataaactcta taatgttttg gataaaaata   1140
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aggcttttag aaaatttatt atgaattccg agaagtctgc tcatcatata cctcccccag     60
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gttcgaataa atccgcggac gacttccatg agaaagtgac agaagcactg cagctgtttg   1860
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ccatgtggcc catcacacag aagattctgc gggatttcta caggcccttc aacgctaggc   2220
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catgtgaata acatgtggtg taattctgct tcttacagaa gtattactga aggtattatt   4320
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<212>DNA
<213>人
<400>93
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gatcagaaga ctttaattat atattttcat cctataagct taaataggaa agtttcttca   1200
acaggattac agtgtagcta cctacatgct gaaaaatata gcctttaaat catttttata    1260
ttataactct gtataataga gataagtcca ttttttaaaa atgttttccc caaaccataa    1320
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<212>DNA
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Claims (33)

1、评估结肠直肠癌状态的方法，该方法包括对选自Seq.ID.No.7-13的基因组合进行差异调控鉴定。
2、权利要求1的方法，其中将所述基因的表达模式与指示复发患者的表达模式进行比较。
3、权利要求2的方法，其中所述表达模式的比较是通过模式识别方法进行的。
4、权利要求3的方法，其中所述模式识别方法包括使用Cox比例风险分析。
5、权利要求1的方法，其中所述方法是在原发肿瘤样本上进行的。
6、权利要求1的方法，其中所述组合包括相应于Seq.ID.No.7-13的所有基因。
7、权利要求1的方法，其进一步包括选自Seq.ID.No.14-28的基因。
8、权利要求7的方法，其中所述组合包括相应于Seq.ID.No.14-28的所有基因。
9、权利要求6的方法，其进一步包括包含Seq.ID.No.14-28的基因组合。
10、权利要求1的方法，其中被调控基因的表达至少有2倍的差异。
11、权利要求1的方法，其中指示差异调控的p值小于.05。
12、权利要求1的方法，其进一步包括非基于遗传学的结肠直肠诊断。
13、预后组合，其包含一种基因组合的分离的核酸序列、其互补序列、或其部分，其中所述基因组合包括Seq.ID.No.6和选自Seq.ID.No.7-13的基因。
14、权利要求13的方法，其中所述的组合包括相应于Seq.ID.No.14-28的所有基因。
15、权利要求13的方法，其进一步包括选自Seq.ID.No.14-28的基因。
16、权利要求15的方法，其中所述组合包括权利要求15的所有基因。
17、权利要求13的组合，其处于适于对其中所含基因进行差异表达鉴定的基质中。
18、权利要求17的组合，其中所述基质是微阵列。
19、权利要求18的组合，其中所述微阵列是cDNA微阵列。
20、权利要求18的组合，其中所述微阵列是寡核苷酸微阵列。
21、对结肠直肠癌患者的预后进行评价的试剂盒，其包括用于检测一种基因组合的分离的核酸序列、其互补序列、或其部分的材料，其中所述基因组合包含Seq.ID.No.6和选自Seq.ID.No.7-13的基因。
22、权利要求21的试剂盒，其中所述基因是相应于Seq.ID.No.7-13的所有基因。
23、权利要求21的试剂盒，其进一步包括选自Seq.ID.No.14-28的基因。
24、权利要求23的试剂盒，其中所述基因是相应于Seq.ID.No.14-28的所有基因。
25、权利要求23的试剂盒，其进一步包括进行微阵列分析的试剂。
26、权利要求23的试剂盒，其进一步包括用以检测所述核酸序列、其互补序列、或其部分的介质。
27、评估结肠直肠癌状态的制品，其包括用于鉴定一种基因组合的分离的核酸序列、其互补序列、或其部分的材料，其中所述基因组合包含Seq.ID.No.6和选自Seq.ID.No.7-13的基因。
28、权利要求27的制品，其中所述基因是相应于Seq.ID.No.7-13的所有基因。
29、权利要求28的制品，其进一步包括选自Seq.ID.No.14-28的基因。
30、权利要求29的制品，其中所述基因是相应于Seq.ID.No.14-28的所有基因。
31、评估结肠直肠癌的试剂盒，其包括检测Seq.ID.No.7-13表达的试剂。
32、权利要求31的试剂盒，其进一步包括检测Seq.ID.No.14-28表达的试剂。
33、治疗结肠直肠癌患者的方法，其包括基于Seq.ID.No.7-28的基因的表达来判断患者是否具有高复发风险，以及对于有高复发风险的患者进行辅助治疗。
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