JP2006101701A - 結腸直腸のガンの予後予測 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】遺伝子プロファイルからなる遺伝子群を含む遺伝子ポートフォリオを作成し、遺伝子群の発現を分析することによって結腸直腸ガンの予後予測をする。様々な媒体、例えばマイクロアレイ、から得られる遺伝子発現プロファイル、及びそれらを含む結腸直腸ガンの予後予測を決定するキットを提供する。
【選択図】なし
Description
本出願は、2003年8月28日に出願された米国特許第号特許出願第10/651,237号の一部の続きである。
本発明は、結腸直腸ガンと診断されるか又は結腸直腸ガンを治療された患者において、結腸直腸ガンの再発可能性を評価する方法である。本方法は、遺伝子発現プロファイルの分析を含む。
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新鮮な凍結組織試料は、結腸直腸ガンの外科手術を受けた患者から集められた。使われた試料は、通常の治療診断及び病態に従いデュークBのステージとされる63人の患者由来であった。患者の治療結果は周知であった。36人の患者は、3年以上疾患を患わないままであり、一方27人の患者は、3年以内に腫瘍の再発を有した。
Zymo-Spin Column(Zymo Research, Orange, CA 92867)を使用してLCMがキャプチャーした試料から全RNAを抽出した。約2ngの全RNAを10μlの水中に懸濁し、そして2回のT7RNAポリメラーゼに基づく増幅を行ない、約50ugの増幅されたRNAを生成した。
約23,000個のヒトDNAクローンからなるDNAマイクロアレイのセットを使用し、Affymetrix, Incから商業的に利用でき、獲得されるヒトU133aチップの使用により試料を試験した。全RNAを上で要約したように獲得及び調製し、そしてチップに使用し、製品プロトコルに従ってAgilent BioAnalyzerにより分析した。全ての63試料は、品質管理基準を通過し、そしてデータをマーカー選別に使用した。
二つの遺伝子、MHC II-DR-B及び免疫グロブリン様転写物5タンパク質は、線形判別分析を用いて、予測指数を作るために使われた。投票スコアは、後の再発可能性として定義された。もし、患者スコアが0.5より大きかったなら、患者は生存者として分類された。予測指数は、訓練セット上で試験された。
予測指数の性能は、独立のデータセットを基に判定するべきである。というのは、多くの分類方法は、その確立において使われる例の上でうまく働くからである。16人の患者試験セットは、予測の正確性を評価するために使われた。分類の区分は、ROCカーブをもちいて決定された。選ばれた区分を伴い、試験セットにおける再発及び生存患者の正しい予想の数が決定された。
63人のデュークB大腸ガン患者の遺伝子発現プロファイリングは、これらの患者において発現差(発現減少又は遮断)を有する4の遺伝子の同定された。これらの遺伝子は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、及び配列番号4である。36人の患者は、3年以上疾患を患わないままであったが、一方27人の患者は、3年内に腫瘍再発を患った。配列番号2、配列番号3、及び配列番号4の3つの遺伝子マーカー・ポートフォリオを用いて、27人の再発患者のうち22人、及び36人の疾患を患わない患者のうち27人は、正しく同定される。この結果は82%の感受性,及び75%の特異性を示す。陽性予想値は71%であり、陰性予測値は84%である。
74人のコード化されたB大腸ガン患者からの凍結腫瘍試料が研究された。主な腫瘍及び隣接する非腫瘍性大腸組織は、外科手術のときに採取された。各試料の組織病理学は、診断及び腫瘍を一様に含むかを確定するために再調査された。分析のために選ばれた場所は、混合されていない組織学を有する50%を超える腫瘍細胞割合を含んだ。統一追跡情報は、利用できた。
全RNAは、実施例1〜3に記載される方法に従って実施例4の試料から抽出された。アレイは、基本のアフィメトリックス・プロトコル及びスキャナーを用いて調べられた。続く分析では、各プローブセットは、分離遺伝子として考慮された。各遺伝子の発現値は、アフィメトリックスGeneCHip分析ソフトウェアMAS5.0をもちいて計算された。後の分析のために使われたすべてのデータは、品質管理基準を通過した。
遺伝子発現データは、全ての試料において「存在しない」と呼ばれる遺伝子を除く変異フィルターを受けた。考慮される22,000の遺伝子のうち17,616が、このフィルターを通過し、そしてクラスタリングに使われた。階層的なクラスタリングに先立って、各遺伝子は、患者における発現レベルの中央値によって分けられた。少なくとも10%の患者において平均発現レベルに対し4倍以上の変化を示す遺伝子は、クラスタリングに含められた。異なる遺伝子プロファイルを有する患者のサブグループを同定するために、GeneSpring5.0(San Jose, CA)及びPartek 5.1ソフトウェア(St. Louis, MO)をそれぞれ用いることによって、平均結合階層クラスタリング及びK-平均値クラスタリングは行われた。ボンフェローニ補正を伴うt-検定は、遺伝子を同定するために使われ、クラスタリング結果によって示唆される2人の患者のサブグループ間における異なる発現レベルを有する遺伝子を同定するために使われた。0.01のボンフェローニの補正されたP値は、遺伝子選別の閾値として選ばれた。区別された発現プロファイルを有するそれぞれのクラスター内の患者は、さらに結果の情報に関してさらに試験された。
患者及びその腫瘍の治療上の及び病態学上の特徴は、表1において要約される。患者は、年齢、性別、TNMステージ、段階、腫瘍の大きさ、及び腫瘍の位置に関する情報を有した。74人の患者のうち73人は、検査されたリンパ節の数に関するデータを有し、74人の患者のうち72人は、推定の腫瘍サイズ評価された情報を有した。患者及び腫瘍の性質は、再発した患者と再発しない患者との間で有意に異ならなかった。患者は、手術前の治療を受けなかった。最小限3年の追跡データは、本研究における全ての患者で利用できた。
監督なし階層クラスタリング分析は、17000個の意味ある遺伝子に渡って計測された遺伝子発現プロファイルの類似性に基く74人の患者のクラスターをもたらす。その間で異なって発現される(P<0.00001)600を超える遺伝子を有する患者の二つのサブグループが同定された。大きいサブグループ及び小さいサブグループは、54人及び20人の患者をそれぞれ含んだ。54人の患者の大きいサブグループにおいて、18人の患者(33%)だけが、3年以内に腫瘍の再発を発症し、一方20人の患者の小さいサブグループにおいては、13人の患者(65%)が、進行性の疾患を有した。カイ2乗分析は、0.028のp値を与えた。
再発及び疾患-を患わない患者を区別できる遺伝子マーカーを同定するために、患者の各サブグループは、別々に分析された。各サブグループ内の患者は、大体同じ数でまず治療セットと試験セットへと分けられた。訓練セットは、遺伝子マーカーを選択し、そして予後予測の特性を確立するために使われた。試験セットは、独立確証として使われた。54人の腫瘍の多いサブグループにおいて、36人の患者が、最初の診断後少なくとも3年間疾患を患わないままであり、18人の患者は、3年以内に腫瘍の再発を発生した。54人の患者は、2つの群に分けられた。訓練セットは、21人の疾患を患わない患者及び6人の再発患者を含んだ。20腫瘍の小さいサブグループにおいては、7人の患者が、少なくとも3年間疾患を患わず、そして13人の患者が3年以内に腫瘍の再発を発生した。20人の患者は、2つの群に分けられた。訓練セットは、4人の疾患を患わない患者と7人の再発患者を含んだ。良性の予後予測の群を悪性の予後予測の群から区別する遺伝子特性を同定するために、監督付き分類方法が各訓練セットに関して使われた。一変量性コックス比例ハザード回帰は、その発現レベルが患者の生存期間に相関する遺伝子を同定するために使われた。遺伝子は、0.02未満のp値を、分類の判定基準として使って選ばれた。次に、t検定は、選ばれた遺伝子上で行われて、再発及び疾患を患わない患者(P<0.01)との発現の有意差を決定した。試験セットに過度に適合する遺伝子の選択を避けるため、100回の再サンプリングは、80%以上の再サンプリング試験における有意なp値を有する遺伝子を検索するため、t検定に関して行われた。7の遺伝子(表2)は、27人の患者の訓練セットから選ばれ、そして15の遺伝子(表3)が11人の患者の訓練セットから選ばれた。22の遺伝子をカドヘリン17と一緒にする事で、患者の再発を予測するコックスモデルは、S‐Plusソフトウェアを用いて確立された。カプラン-マイヤーの生存分析は、良性の予後予測と予想される群と悪性の予後予測と予想される群との間で、患者が疾患を患わないままでいる可能性における明白な差を示した(図3)。
Claims (33)
- 配列番号7〜13からなる群から選ばれる遺伝子の組み合わせにおける調節の差を同定することを含む、結腸直腸ガンの状態の評価方法。
- 前記遺伝子の発現パターンが、再発患者を指し示す発現パターンと比較される、請求項1に記載の方法。
- 前記発現パターンの比較が、パターン認識法で行われる、請求項2に記載の方法。
- 前記パターンの認識法が、コックス比例ハザード分析の使用を含む、請求項3に記載の方法。
- 初期の腫瘍試料上で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記組み合わせが、配列番号7〜13に対応する遺伝子の全てを含む、請求項1に記載の方法。
- 配列番号14〜28からなる群から選ばれる遺伝子をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記組み合わせが、配列番号14〜28に対応する遺伝子の全てを含む、請求項7に記載の方法。
- 配列番号14〜28を含む遺伝子の組み合わせをさらに含む、請求項6に記載の方法。
- 調節された遺伝子の発現において少なくとも2倍の差がある、請求項1に記載の方法。
- 前記調節の差を示すp値が、0.05未満である、請求項1に記載の方法。
- 遺伝子に基づかない結腸直腸診断をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 配列番号6を含む遺伝子と配列番号7〜13からなる群から選ばれる遺伝子との組み合わせの単離された核酸配列、その相補配列、又はその部分を含む、予後予測のポートフォリオ。
- 前記組み合わせが、配列番号14〜28に対応する遺伝子の全てを含む、請求項13に記載の方法。
- 配列番号14〜28からなる群から選ばれる遺伝子をさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 前記組み合わせが、請求項15に記載の遺伝子の全てを含む、請求項15に記載の方法。
- マトリックス中に含まれる遺伝子の発現差を同定するために適切であるマトリックスにおける、請求項13に記載のポートフォリオ。
- 前記マトリックスが、マイクロアレイにおいて使用される、請求項17に記載のポートフォリオ。
- 前記マイクロアレイが、cDNAマイクロアレイである、請求項18に記載のポートフォリオ。
- 前記マイクロアレイが、オリゴヌクレオチド・マイクロアレイである、請求項18に記載のポートフォリオ。
- 配列番号6を含む遺伝子と配列番号7〜13からなる群から選ばれる遺伝子との組み合わせの単離された核酸配列、その相補配列、又はその一部を検出する器具を含む、結腸直腸ガン患者の予後予測を決定するキット。
- 前記遺伝子が、配列番号7〜13に対応する遺伝子の全てである、請求項21に記載のキット。
- 配列番号14〜28からなる群から選ればれる遺伝子をさらに含む、請求項21に記載のキット。
- 前記遺伝子が、配列番号14〜28に対応する遺伝子の全てである、請求項23に記載のキット。
- マイクロアレイ分析を行うための試薬をさらに含む、請求項23に記載のキット。
- 前記核酸配列、その相補配列、又はその部分がアッセイされる媒体をさらに含む、請求項23に記載のキット。
- 配列番号6を含む遺伝子と配列番号7〜13からなる群から選ばれる遺伝子との組み合わせの核酸配列、その相補配列、又はその一部を同定する器具を含む、結腸直腸ガンの状態を評価するための物品。
- 前記遺伝子が、配列番号7〜13に対応する遺伝子の全てである、請求項27に記載の物品。
- 配列番号14〜28からなる群から選ばれる遺伝子をさらに含む、請求項28に記載の物品。
- 前記遺伝子が、配列番号14〜28に対応する遺伝子の全てである、請求項29に記載の物品。
- 配列番号7〜13の発現を検出するための試薬を含む、結腸直腸ガンを評価するためのキット。
- 配列番号14〜28の発現を検出するための試薬をさらに含む、請求項31に記載のキット。
- 配列番号7〜28を有する遺伝子の発現に基づいて、患者を再発の危険性が高いかまたはそうでないか特徴づけ、そしてもし患者が危険性の高い患者なら、免疫賦活剤治療で患者を治療することを含む、結腸直腸ガン患者の治療方法。
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