JP2008538284A - 乳房の腫瘍のレーザーマイクロダイセクションおよびマイクロアレイ解析が、エストロゲン受容体に関係する遺伝子および経路を明らかにする - Google Patents

乳房の腫瘍のレーザーマイクロダイセクションおよびマイクロアレイ解析が、エストロゲン受容体に関係する遺伝子および経路を明らかにする Download PDF

Info

Publication number
JP2008538284A
JP2008538284A JP2008505567A JP2008505567A JP2008538284A JP 2008538284 A JP2008538284 A JP 2008538284A JP 2008505567 A JP2008505567 A JP 2008505567A JP 2008505567 A JP2008505567 A JP 2008505567A JP 2008538284 A JP2008538284 A JP 2008538284A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
gene
seq
sample
expression
genes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2008505567A
Other languages
English (en)
Inventor
ワン・イーシン
ユー・ジャック
ジャン・ユチウ
ヤン・フェイ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LEHNHARDT SUSAN
Janssen Diagnostics LLC
Original Assignee
LEHNHARDT SUSAN
Janssen Diagnostics LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LEHNHARDT SUSAN, Janssen Diagnostics LLC filed Critical LEHNHARDT SUSAN
Publication of JP2008538284A publication Critical patent/JP2008538284A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02Immunomodulators
    • A61P37/04Immunostimulants
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112Disease subtyping, staging or classification
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154Methylation markers
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

【課題】エストロゲン受容体の発現状態を決定する方法を提供する。
【解決手段】ER+の腫瘍とER−腫瘍間で有意差のある発現をする、有意なp値の147の遺伝子および112の遺伝子が、LCMデータセットおよび組織塊データセットそれぞれから同定された。61の遺伝子は共通のデータセットで見出され、さらに85の遺伝子がLCMデータセットに特有であり、51の遺伝子が腫瘍塊データセットにのみ存在した。85の遺伝子についての遺伝子オントロジーを用いた経路分析により、エンドサイトーシス、セラミド産生、Ras/ERK/Arkカスケード、およびJAT−STAT経路に関与した遺伝子がERに関係する役割を果たしていることが示唆された。LCMによって採取した腫瘍細胞の遺伝子プロファイリングは、上皮腫瘍細胞の研究および特徴付け、ならびにERに関連するシグナル伝達経路の知見を得る上で特有のアプローチを提供する。
【選択図】図1

Description

開示の内容
〔連邦政府による資金提供を受けた研究または開発の記載〕
本発明のためにいかなる政府資金も使用されていない。
〔配列表、またはコンピュータプログラムリストのコンパクトディスクによる付表の参照〕
「配列表(Sequence Listing)」の付表が明記される。
〔発明の背景〕
乳癌の約70〜80%でエストロゲン受容体α(ERα)が発現しており、エストロゲンはホルモン依存性腫瘍の発症と成長において重要な役割を果たしている。リンパ節転移、腫瘍サイズ、および組織学的悪性度と共に、ERの状態は、乳癌の予後診断因子の1つであり、かつホルモン療法の指標として考えられている。乳癌は、米国の女性において最もよく診断される癌であり、癌による死亡の主な原因の第2位となっている。エストロゲンは、正常乳腺の成長と分化において重要な役割を果たすが、乳腺癌(breast carcinoma)の発症と進行にも同様の役割を果たしている。エストロゲンは、ERαを通して遺伝子の発現を調節し、ERαは全乳癌の約70〜80%で発現している(パール(Parl)、2000)。現在の臨床診療での、ERの存在は、原発性もしくは再発性の乳癌患者に対して、ホルモン療法もしくはアロマターゼ阻害薬療法を選択する際のマーカーとなっている(モクベル(Mokbel) 2003)。ERは、リガンドが活性化する転写因子であり、複数の標的組織の成長、発達、および維持対するステロイドホルモンであるエストロゲンの多面発現効果を媒介することが、広範囲な研究によって説明された(モッグズ(Moggs)ら、2001)。エストロゲン受容体が遺伝子発現の転写促進を媒介する機構は、複雑である。ホール(Hall)ら(2001)は、以下の4つの経路をまとめた。すなわち、1)EREコンセンサスDNA配列との相互作用を通してER複合体(ER complex)が遺伝子の転写を調節する、古典的なリガンド依存性経路、2)成長因子とそのチロシンキナーゼ受容体がERを活性化し、エストロゲン非存在下でER標的遺伝子の発現量を増加させると思われる、リガンド非依存性経路、3)AP1、SP1、およびCREなどの非ERE様プロモーター要素との相互作用を通してER複合体による遺伝子調節の誘導がなされる、DNA結合非依存性経路、4)急速な組織反応を引き起こす推定上の膜関連結合部位(putative membrane-associated binding site)をエストロゲンが活性化する、細胞表面(非遺伝子的)シグナル伝達、の4つの経路である。しかしながら、下流の標的遺伝子に対するエストロゲンの効果の詳細、補因子の役割、および他のシグナル伝達経路の間のクロストークについては、依然として大部分は不明である。
遺伝子発現プロファイル技術は、研究者が腫瘍生物学の複雑な問題を扱うことを可能にしている。多くの研究によって、乳癌におけるERの状態と関連する遺伝子発現の明瞭なパターンが示され、ERシグナル伝達に関連する遺伝子群が同定された(国際公開WO2004/079014号;ウェスト(West)ら、2001;グラブバーガー(Gruvberger)ら、および2001;ソティリオ(Sotiriou)ら、2003)。しかしながら、ほとんどのデータは、癌細胞に加えて間質細胞、繊維芽細胞、およびリンパ球などの様々な細胞集団で構成される腫瘤から単離されたmRNAの発現に基づいていた。そのうえ、臨床標本に含まれる腫瘍細胞の割合は、それぞれ大きく異なっている。これらの問題は、上皮細胞上で特異的に発現するERに関する遺伝子発現データを危ういものにする可能性がある。近年、組織学的に均質な細胞群を調達する技術であるレーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)(エメルト‐バック(Emmert-Buck)ら、1996)は、DNAマイクロアレイ技術と組み合わせて様々な種類の腫瘍の研究に用いられて成功を収めており(ルオ(Luo)ら、1999;マツイ(Matsui)ら、2003;イム(Yim)ら、2003;およびナカムラ(Nakamura)ら、2004)、この様々な種類の腫瘍は、腫瘍の進行と転移に関連して遺伝子が同定される乳癌を含む(マ(Ma)ら、2002;セス(Seth)ら、2003;およびニシダテ(Nishidate)ら、2004)。
〔発明の概要〕
本発明は、乳癌患者から腫瘍組織塊試料(bulk tissue tumor sample)を得ることと、i.表2もしくは表3に記載の配列番号と一致するmRNA、またはii.表2もしくは表3に記載の配列番号と一致するpsidのプローブセット(probe sets psids)で認識されるmRNAをコードする遺伝子の試料中の発現レベルを測定することと、によって、エストロゲン受容体の発現状態を決定する方法を提供し、所定のカットオフレベルより高いまたは低い上記遺伝子発現レベルがエストロゲン受容体の発現状態を示唆している。
本発明は、乳癌患者から顕微鏡下で単離した腫瘍試料を得ることと、i.表2もしくは表4に記載の配列番号と一致するmRNA、またはii.表2もしくは表4に記載の配列番号と一致するpsidのプローブセットで認識されるmRNAをコードしている遺伝子の試料中の発現レベルを測定することと、によって、エストロゲン受容体の発現状態を決定する方法を提供し、所定のカットオフレベルより高いまたは低い上記遺伝子発現レベルがエストロゲン受容体の発現状態を示唆している。
本発明は、乳癌患者から腫瘍組織塊試料を得ることと、i.表2もしくは表3に記載の配列番号と一致するmRNA、またはii.表2もしくは表3に記載の配列番号と一致するpsidsのプローブセットで認識されるmRNAをコードしている遺伝子の試料中の発現レベルを測定することと、によって、乳癌患者の治療プロトコルを決定する方法を提供し、所定のカットオフレベルより高いまたは低い上記遺伝子発現レベルが、再発を防止するために推奨された療法の程度および種類を医師が決定できるように、再発のリスクを十分に示唆している。
本発明は、乳癌患者から顕微鏡下で単離した腫瘍試料を得ることと、i.表2もしくは表4に記載の配列番号と一致するmRNA、またはii.表2もしくは表4に記載の配列番号と一致するpsidのプローブセットで認識されるmRNAをコードしている遺伝子の試料中の発現レベルを測定することと、によって乳癌患者の治療プロトコルを決定する方法を提供し、所定のカットオフレベルより高いまたは低い上記遺伝子発現レベルが、再発を防止するために推奨された療法の程度および種類を医師が決定できるように、再発のリスクを十分に示唆している。
本発明は、乳癌患者から腫瘍組織塊試料を得ることと、i.表2もしくは表3に記載の配列番号と一致するmRNA、またはii.表2もしくは表3に記載の配列番号と一致するpsidのプローブセットで認識されるmRNAをコードしている遺伝子の試料中の発現レベルを測定することと、患者がハイリスク患者である場合、アジュバント療法で患者を処置することと、によって乳癌患者を処置する方法を提供する。
本発明は、乳癌患者から顕微鏡下で単離した腫瘍試料を得ることと、i.表2もしくは表4に記載の配列番号と一致するmRNA、またはii.表2もしくは表4に記載の配列番号と一致するpsidのプローブセットで認識されるmRNAをコードしている遺伝子の試料中の発現レベルを測定することと、患者がハイリスク患者である場合、アジュバント療法で患者を処置することと、によって乳癌患者を処置する方法を提供する。
本発明は、表2、表3、および/または表4に記載の配列番号の少なくとも1つのプローブセットを含む構成物を提供する。
本発明は、表2、表3、および/または表4に記載の配列番号に一致するmRNAをコードする遺伝子の組み合わせの、単離した核酸配列、それらの相補体、またはその一部を検出するための物質を含む、生体試料のエストロゲン受容体の発現状態を決定するためにアッセイを行うためのキットを提供する。
本発明は、表2、表3、および/または表4に記載の配列番号と一致するmRNAをコードする遺伝子の組み合わせの、単離した核酸配列、それらの相補体、またはその一部を検出するための物質を含む、乳癌の状態を評価するための物品を提供する。
本発明は、本明細書に記載した方法のいずれか1つの方法を実行するためのマイクロアレイまたは遺伝子チップを提供する。
本発明は、表2、表3、および/または表4に記載の配列番号と一致するmRNAをコードする遺伝子の組み合わせの、単離した核酸配列、それらの相補体、またはその一部を含む、診断/予後診断のポートフォリオを提供する。
〔図面の簡潔な説明〕
図1は、腫瘍塊データセット(bulk tomor data set)とLCMで得た試料データセットとの間で、21の連続して発現したハウスキーピング遺伝子の発現強度を比較した図である。
図2は、ジーン・スプリング・ソフトウェア(Gene Spring software)を使用した、包括的遺伝子発現データの教師なし二次元階層型クラスタリング解析(unsupervised two-dimensional hierarchical clustering analysis)を示す図である。少なくとも2つの試料で「存在(present)」判定を有する遺伝子を含むように、フィルターがかけられた。横の各列は遺伝子を示し、縦の行は試料に相当する。赤色または緑色は、全試料にわたる遺伝子の平均的な発現より高いもしくはより低い転写レベルを示している。青色のバーはLCM試料のデータを示し、黄色のバーは腫瘍塊のデータを示す。リガンド結合アッセイで確認された患者のERの状態を、ER+の患者を濃い緑色のブロックとして、ER−の患者をライトグリーンのブロックとして示した。A,B,C,およびDのバーは、LCMと組織塊クラスターの主要なサブグループを示す。
図3は、ER+サブグループとER−サブグループとの間で差動的に発現した遺伝子の遺伝子経路分析の図である。チップ上に少なくとも10の遺伝子を有したカテゴリーを、次の経路分析に使用した。データ解析から選択された遺伝子リストを、GO生物学的過程(GO Biological Process)カテゴリーにマッピングした。その後、遺伝子の超幾何分布の確率をカテゴリー毎に計算した。0.05未満のp値と、少なくとも2つの遺伝子とを有したカテゴリーを、選択した遺伝子リストにおける過剰表示(over-represented)とみなした。図3Aは、以下の3つのカテゴリー、すなわち、LCMデータセットと腫瘍塊データセット両方に共通、LCM試料データセットに特有、腫瘍塊データセットに特有、と命名した遺伝子数の円グラフを表す。図3Bは、共通の遺伝子リストで同定した経路を記載した図である。図3Cは、LCMデータセットに特有な遺伝子の有意な経路を示す。図3Dは、腫瘍塊データセットに特有の経路を表す。p値は、バーの脇に示した。
〔詳細な説明〕
乳房の腫瘍におけるERの状態と上皮細胞に関連する遺伝子と経路とを調べるために、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)技術を応用して28人のリンパ節無症状の乳房腫瘍試料から上皮腫瘍細胞を採取した。このうち17人の患者はER+の腫瘍を有し、11人の患者はER−の腫瘍を有していた。Affymetrix Hu133A Gene Chipを用いて遺伝子発現プロファイルを分析した。一方で、同じ28人の患者の腫瘍塊から単離した全RNAを用いて、同様に遺伝子プロファイルも作成した。ER+の腫瘍とER−の腫瘍との間で有意差のある発現を有する、有意なP値の146の遺伝子と112の遺伝子が、LCMデータセットと組織塊データセットそれぞれから確認された。61の遺伝子は両方のデータセットに共通であることが分かったが、一方で85の遺伝子はLCMデータセットに特有であり、51の遺伝子は腫瘍塊データセットにのみ存在した。85の遺伝子についての遺伝子オントロジー(Gene Ontology)を用いた経路分析により、エンドサイトーシス、セラミド産生、Ras/ERK/Arkカスケード、およびJAT−STAT経路に関与する遺伝子がERと関連する役割を果たしている場合があることが示唆された。LCMによって採取された腫瘍細胞の遺伝子プロファイリングは、上皮腫瘍細胞を研究し、かつERに関連するシグナル伝達経路の知見を得るために特有のアプローチを提供する。
本発明は、乳癌患者から腫瘍組織塊試料を得ることと、i.表2もしくは表3に記載の配列番号に一致するmRNA、またはii.表2もしくは表3に記載の配列番号に一致するpsidのプローブセットによって認識されるmRNAをコードする遺伝子試料中の発現レベルを測定することと、によってエストロゲン受容体の発現状態を決定する方法を提供し、所定のカットオフレベルより高いもしくは低い遺伝子発現レベルが、エストロゲン受容体の発現状態を示している。
試料は生検もしくは外科標本などの原発腫瘍から得ることができる。この方法は、試料で構造的に発現している少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを測定することをさらに含むこともできる。一実施形態では、この方法は、特異性が少なくとも約40%であり、感度が少なくとも約90%であるという結果をもたらす。他の実施形態では、遺伝子の発現パターンは、再発患者を示す発現パターンと比較される。発現パターンの比較は、コックス(Cox)の比例ハザード解析のようなパターン認識法によって行うことができる。
一実施形態では、所定のカットオフレベルは、良性細胞もしくは正常組織と比較して、試料では少なくとも1.5倍の過剰もしくは過小な発現である。他の実施形態では、所定のカットオフレベルは、良性細胞もしくは正常組織と比較して、転移性の細胞を有する試料では少なくとも統計的に有意なp値の過剰もしくは過小な発現を有する。p値は0.05未満であることが望ましい。
一実施形態では、遺伝子発現は、cDNAアレイもしくはオリゴヌクレオチドアレイなどのマイクロアレイもしくは遺伝子チップで測定される。マイクロアレイもしくは遺伝子チップは、1つもしくはそれ以上の内部コントロール試薬をさらに含むこともできる。一実施形態では、遺伝子発現は、試料から抽出されたRNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって行われる核酸増幅によって決定される。PCRは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によることもでき、1つもしくはそれ以上の内部コントロール試薬を含むこともできる。一実施形態では、蛋白質に特異的な抗体などの遺伝子がコードする蛋白質を測定もしくは検出することによって、遺伝子発現が検出される。一実施形態では、遺伝子発現は、DNA増幅、メチル化、突然変異、および対立遺伝子変異(allelic variation)などの遺伝子の特徴を測定することによって検出される。
本発明は、乳癌患者から顕微鏡的に単離された腫瘍試料を得ることと、i.表2もしくは表4に記載の配列番号に一致するmRNA、またはii.表2もしくは表4に記載の配列番号に一致するpsidのプローブセットによって認識されるmRNAをコードする遺伝子の試料の発現レベルを測定することと、によって、エストロゲン受容体の発現状態を決定する方法を提供し、所定のカットオフレベルより高いもしくは低い遺伝子発現レベルが、エストロゲン受容体の発現状態を示す。
試料は原発腫瘍から得ることができる。顕微鏡的な単離は、例えば、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによって行うこともできる。この方法は試料で構造的に(constitutively)発現している少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを測定することをさらに含むこともできる。一実施形態では、この方法は、特異性が少なくとも約40%であり、感度が少なくとも約90%であるという結果をもたらす。他の実施形態では、遺伝子の発現パターンは、再発患者を示す発現パターンと比較される。発現パターンの比較は、Coxの比例ハザード解析などのパターン認識法によって行うことができる。
一実施形態では、所定のカットオフレベルは、試料において良性細胞もしくは正常組織と比較して少なくとも1.5倍の過剰もしくは過小な発現である。他の実施形態では、所定のカットオフレベルは、良性細胞もしくは正常組織と比較して、転移性の細胞を有する試料では少なくとも統計的に有意なp値の過剰もしくは過小な発現を有する。p値は0.05未満であることが望ましい。
一実施形態では、遺伝子発現は、cDNAアレイもしくはオリゴヌクレオチドアレイなどのマイクロアレイもしくは遺伝子チップで測定される。マイクロアレイもしくは遺伝子チップは、1つもしくはそれ以上の内部コントロール試薬をさらに含むこともできる。一実施形態では、遺伝子発現は、試料から抽出されたRNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって行われる核酸増幅によって決定される。PCRは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によることもでき、1つもしくはそれ以上の内部コントロール試薬を含むこともできる。一実施形態では、蛋白質に特異的な抗体などの遺伝子がコードする蛋白質を測定もしくは検出することによって、遺伝子発現が検出される。一実施形態では、DNA増幅、メチル化、突然変異、および対立遺伝子変異などの遺伝子の特徴を測定することによって、遺伝子発現が検出される。
本発明は、乳癌患者から腫瘍組織塊試料を得ることと、i.表2もしくは表3に記載の配列番号に一致するmRNA、またはii.表2もしくは表3に記載の配列番号に一致するpsidのプローブセットによって認識されるmRNAをコードする遺伝子の試料の発現レベルを測定することと、によって乳癌患者の治療プロトコルを決定する方法を提供し、所定のカットオフレベルより高いもしくは低い遺伝子発現レベルが、再発の危険性を十分に示し、医師が再発を予防するために推奨される治療法の程度および種類を決定できるようにする。
試料は、生検もしくは外科標本などの原発腫瘍から得ることができる。この方法は、試料で構造的に発現している少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを測定することをさらに含むこともできる。一実施形態では、この方法は、特異性が少なくとも約40%であり、感度が少なくとも約90%であるという結果をもたらす。他の実施形態では、遺伝子の発現パターンは再発患者を示す発現パターンと比較される。発現パターンの比較は、Coxの比例ハザード解析などのパターン認識法によって行うことができる。
一実施形態では、所定のカットオフレベルは、良性細胞あるいは正常組織と比較して、試料では少なくとも1.5倍の過剰もしくは過小な発現である。他の実施形態では、所定のカットオフレベルは、良性細胞もしくは正常組織と比較して、転移性の細胞を有する試料では少なくとも統計的に有意なp値の過剰もしくは過小な発現を有する。p値は0.05未満であることが望ましい。
一実施形態では、遺伝子発現は、cDNAアレイもしくはオリゴヌクレオチドアレイなどのマイクロアレイもしくは遺伝子チップで測定される。マイクロアレイもしくは遺伝子チップは、1つもしくはそれ以上の内部コントロール試薬をさらに含むこともできる。一実施形態では、遺伝子発現は、試料から抽出されたRNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって行われる核酸増幅によって決定される。PCRは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によることもでき、1つもしくはそれ以上の内部コントロール試薬を含むこともできる。一実施形態では、蛋白質に特異的な抗体などの遺伝子がコードする蛋白質を測定もしくは検出することによって、遺伝子発現が検出される。一実施形態では、遺伝子発現は、DNA増幅、メチル化、突然変異、および対立遺伝子変異のような遺伝子の特徴を測定することによって検出される。
本発明は、乳癌患者から顕微鏡的に単離された腫瘍試料を得ることと、i.表2もしくは表4に記載の配列番号に一致するmRNA、またはii.表2もしくは表4に記載の配列番号に一致するpsidのプローブセットによって認識されるmRNAをコードする遺伝子試料中の発現レベルを測定することとによって乳癌患者の治療プロトコルを決定する方法を提供し、所定のカットオフレベルより高いもしくは低い遺伝子発現レベルが、再発の危険性を十分に示し、医師が再発を予防するために推奨される治療法の程度および種類を決定できるようにする。
標本は原発腫瘍から得ることができる。顕微鏡的な単離は、例えば、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによって行うこともできる。この方法は、試料で構造的に発現している少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを測定することをさらに含むこともできる。一実施形態では、この方法は、特異性が少なくとも約40%であり、感度が少なくとも約90%であるという結果をもたらす。他の実施形態では、遺伝子の発現パターンは、再発患者を示す発現パターンと比較される。発現パターンの比較は、Coxの比例ハザード解析などのパターン認識法によって行うことができる。
一実施形態では、所定のカットオフレベルは、良性細胞もしくは正常組織と比較して、試料では少なくとも1.5倍の過剰もしくは過小な発現である。他の実施形態では、所定のカットオフレベルは、良性細胞あるいは正常組織と比較して、転移性の細胞を有する試料では少なくとも統計的に有意なp値の過剰もしくは過小な発現を有する。p値は0.05未満であることが望ましい。
一実施形態では、遺伝子発現は、cDNAアレイもしくはオリゴヌクレオチドアレイなどのマイクロアレイもしくは遺伝子チップで測定される。マイクロアレイもしくは遺伝子チップは、1つもしくはそれ以上の内部コントロール試薬をさらに含むこともできる。一実施形態では、試料から抽出されたRNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって行われる核酸増幅によって、遺伝子発現が決定される。PCRは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によることもでき、1つもしくはそれ以上の内部コントロール試薬を含むこともできる。一実施形態では、蛋白質に特異的な抗体などの遺伝子がコードする蛋白質を測定もしくは検出することによって、遺伝子発現が検出される。一実施形態では、遺伝子発現は、DNA増幅、メチル化、突然変異、および対立遺伝子変異などの遺伝子の特徴を測定することによって検出される。
本発明は、乳癌患者から腫瘍組織塊試料を得ることと、i.表2もしくは表3に記載の配列番号に一致するmRNA、またはii.表2もしくは表3に記載の配列番号に一致するpsidのプローブセットによって認識されるmRNAをコードする遺伝子試料中の発現レベルを測定することと、ハイリスク患者の場合にはアジュバント療法によって処置することと、によって、乳癌患者を処置する方法を提供する。
試料は、生検あるいは外科標本などの原発腫瘍から得ることができる。この方法は、試料で構造的に発現している少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを測定することをさらに含むこともできる。一実施形態では、この方法は、特異性が少なくとも約40%であり、感度が少なくとも約90%であるという結果をもたらす。他の実施形態では、遺伝子の発現パターンは、再発患者を示す発現パターンと比較される。発現パターンの比較は、Coxの比例ハザード解析のようなパターン認識法によって行うことができる。
一実施形態では、所定のカットオフレベルは、良性細胞あるいは正常組織と比較して、試料では少なくとも1.5倍の過剰あるいは過小な発現である。他の実施形態では、所定のカットオフレベルは、良性細胞あるいは正常組織と比較して、転移性の細胞を有する試料では少なくとも統計的に有意なp値の過剰あるいは過小な発現を有する。p値は0.05未満であることが望ましい。
一実施形態では、遺伝子発現は、cDNAアレイもしくはオリゴヌクレオチドアレイなどのマイクロアレイもしくは遺伝子チップで測定される。マイクロアレイもしくは遺伝子チップは、1つもしくはそれ以上の内部コントロール試薬をさらに含むこともできる。一実施形態では、試料から抽出されたRNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって行われる核酸増幅によって、遺伝子発現が決定される。PCRは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によることもでき、1つもしくはそれ以上の内部コントロール試薬を含むこともできる。一実施形態では、蛋白質に特異的な抗体などの遺伝子がコードする蛋白質を測定もしくは検出することによって、遺伝子発現が検出される。一実施形態では、DNA増幅、メチル化、突然変異、および対立遺伝子変異などの遺伝子の特徴を測定することによって、遺伝子発現が検出される。
本発明は、乳癌患者から顕微鏡的に単離された試料を得ることと、i.表2もしくは表4に記載の配列番号に一致するmRNA、またはii.表もしくは表4に記載の配列番号に一致するpsidのプローブセットによって認識されるmRNAをコードする遺伝子の試料中の発現レベルを測定することと、ハイリスク患者の場合にはアジュバント療法によって処置を行うことと、によって、乳癌患者を処置する方法を提供する。
試料は原発腫瘍から得ることができる。顕微鏡的な単離は、例えば、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによって行うこともできる。この方法は、試料で構造的に発現している少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを測定することをさらに含むこともできる。一実施形態では、この方法は、特異性が少なくとも約40%であり、また感度が少なくとも90%であるという結果をもたらす。他の実施形態では、遺伝子の発現パターンは、再発患者を示す発現パターンと比較される。発現パターンの比較は、Coxの比例ハザード解析のようなパターン認識法によって行うこともできる。
一実施形態では、所定のカットオフレベルは、良性細胞もしくは正常組織と比較して、試料では少なくとも1.5倍の過剰あるいは過小な発現である。他の実施形態では、所定のカットオフレベルは、良性細胞もしくは正常組織と比較して、転移性の細胞を有する試料では少なくとも統計的に有意なp値の過剰もしくは過小な発現を有する。p値は0.05未満であることが望ましい。
一実施形態では、遺伝子発現は、cDNAアレイもしくはオリゴヌクレオチドアレイなどのマイクロアレイもしくは遺伝子チップで測定される。マイクロアレイもしくは遺伝子チップは、1つもしくはそれ以上の内部コントロール試薬をさらに含むこともできる。一実施形態では、遺伝子発現は、試料から抽出されたRNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって行われる核酸増幅によって決定される。PCRは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によることもでき、1つもしくはそれ以上の内部コントロール試薬を含むこともできる。一実施形態では、蛋白質に特異的な抗体などの遺伝子がコードする蛋白質を測定あるいは検出することによって、遺伝子発現が検出される。一実施形態では、遺伝子発現は、DNA増幅、メチル化、突然変異、および対立遺伝子変異などの遺伝子の特徴を測定することによって検出される。
本発明は、キット、物品、マイクロアレイなど、表2、表3、および/もしくは表4に記載の配列番号の少なくとも1つのプローブセットを具備する構成物を提供する。
本発明は、表2、表3、および/もしくは表4に記載の配列番号に一致するmRNAをコードする遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、それらの相補体、もしくはその一部分を検出するための物質を含む、生体試料のエストロゲン受容体の発現状態を決定するためにアッセイを行うキットを提供する。一実施形態では、配列番号は表2、および/もしくは表3の配列番号である。他の実施形態では、配列番号は表2、および/もしくは表4に記載されている。上記キットは、媒体であって、該核酸配列、それらの相補体、もしくはその一部がアッセイされる媒体など、マイクロアレイ解析を行うための試薬をさらに含むこともできる。
本発明は、表2、表3、および/もしくは表4に記載の配列番号に一致するmRNAをコードする遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、それらの相補体、もしくはその一部を検出するための物質を含む、乳癌の状態を評価する物品を提供する。一実施形態では、配列番号は表2および/もしくは表3の配列番号である。他の実施形態では、配列番号は表2および/もしくは表4に記載されている。この物品は、媒体であって、上記の核酸配列、それらの相補体、もしくはその一部がアッセイされる媒体など、マイクロアレイ解析を行うための試薬をさらに含むこともできる。
本発明は、本明細書に記載された方法のうち任意の1つの方法を実施するためのマイクロアレイもしくは遺伝子チップを提供する。マイクロアレイは、表2、表3、および/もしくは表4に記載の配列番号に一致するmRNAをコードする遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、それらの相補体、もしくはその一部を含むことができる。マイクロアレイは、cDNAアレイもしくはオリゴヌクレオチドアレイをさらに含むこともできる。マイクロアレイは、1つあるいはそれ以上の内部コントロール試薬をさらに含むこともできる。
本発明は、表2、表3、および/もしくは表4に記載された配列番号に一致するmRNAをコードする遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、それらの相補体、もしくはその一部を含む、診断/予後判断のポートフォリオを提供する。
顕微鏡的に単離された乳房腫瘍細胞を使用した遺伝子発現プロファイリングは、異なって発現したERの状態に関連する遺伝子を同定するのみではなく、エストロゲンシグナル伝達と関連する経路に関する新たな情報も提供する。これらの遺伝子の機能的および臨床的重要性を解明することは、腫瘍の進行もしくはステージと、同定された遺伝子の発現レベルを相互に関係させることによって乳房腫瘍の発症を確定することにも有用である。乳房の上皮細胞特異的な遺伝子を同定することは、組織中あるいは生体内の発現システムの中で、薬剤あるいは他の物質の存在に応答する同定された遺伝子の発現レベルを監視することによって、乳癌に対する創薬(drug discovery)においてさらに利点を提供する。
単に、組織試料での特定の核酸配列のささいな存在(mere presence)もしくは非存在が、臨床的もしくは予後診断的な価値を有することがきわめてまれに認められている。一方では、各種蛋白質、ペプチドもしくはmRNAの発現についての情報は、ますます重要なものと見られている。ゲノム内の、蛋白質、ペプチド、あるいはmRNAを発現する可能性を有する核酸配列(「遺伝子(genes)」と呼ばれるような配列)の単なる存在は単独で、所定の細胞内で蛋白質、ペプチド、もしくはmRNAが発現するかどうかの確定要素とはならない。所定の遺伝子が蛋白質、ペプチド、もしくはmRNAを発現する能力があるか否かも同様であるし、たとえ発現したとしても、どの程度発現するかは様々な複合因子によって決定される。これらの要因の理解および評価の困難とは関係なく、遺伝子発現を解析することは、腫瘍形成、転移、アポトーシスおよび他の臨床的に関連のある現象のような重要な事象の発生に関して有用な情報を提供することができる。遺伝子がどの程度活性もしくは不活性であるかの相対的な指標は、遺伝子発現プロファイルで見出すことができる。本発明における遺伝子発現プロファイルは、乳癌患者の予後診断を行い、かつ乳癌患者を治療するために使用される。
試料の準備として、患者の試料を収集する必要がある。本発明の方法に使用する患者試料は、乳房の試料の原発腫瘍から採取された上皮細胞など、病変した細胞を含むことが疑わしいものである。切除縁(surgical margins)から採取された試料も好ましい。しかしながら、最も好ましくは、試料は、乳癌の外科手術から得られたリンパ節から採取される。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)技術は、研究されるべき細胞を選別するための1つの方法であり、細胞種の不均一性に起因する変動を最小化する。この結果、正常細胞と癌細胞との間の遺伝子発現の緩慢もしくは小さな違いを、容易に検出することができる。試料は末梢血から取り出された、循環している上皮細胞(circulating epithelial cells)を含むこともできる。上記の試料は多くの方法によって得ることができるが、最も好ましい方法は、米国特許第6,136,182号に開示された磁気的分離技術である。目的の細胞を含む試料が得られれば、RNAを抽出し、増幅し、適切なポートフォリオの遺伝子について、好ましくはマイクロアレイにより、遺伝子発現プロファイルを得る。
遺伝子発現プロファイルを確立するための好適な方法には、蛋白質もしくはペプチドをコードできる遺伝子によって産生されたRNAの量を決定することが含まれる。これは、RT−PCR法、競合RT−PCR法、リアルタイムRT−PCR法、ディファレンシャルディスプレイRT−PCR法、ノーザンブロット解析、および他の関連する試験法により達成される。それぞれのPCR反応を使用してこれらの技術を実施することが可能である一方で、mRNAから産生された相補的DNA(cDNA)もしくは相補的RNA(cRNA)を増幅して、マイクロアレイによって解析することが最良である。多数の各種アレイの構成、およびそれらを製造する方法は、当業者には既知であり、米国特許第5,445,934号; 第5,532,128号; 第5,556,752号; 第5,242,974号; 第5,384,261号; 第5,405,783号; 第5,412,087号; 第5,424,186号; 第5,429,807号; 第5,436,327号; 第5,472,672号; 第5,527,681号; 第5,529,756号; 第5,545,531号; 第5,554,501号; 第5,561,071号; 第5,571,639号; 第5,593,839号; 第5,599,695号; 第5,624,711号; 第5,658,734号; および第5,700,637号などの米国特許に記載されている。
マイクロアレイ技術は、何千もの遺伝子の定常状態のmRNAレベルを同時に測定することを可能にし、それによって、制御されていない細胞増殖の開始、停止、もしくは調整などの作用を同定するための強力なツールを提供する。2種類のマイクロアレイ技術が現在広く使用されている。第1の技術はcDNAアレイであり、第2の技術はオリゴヌクレオチドアレイである。これらのアレイのチップ構成には相異が存在するが、本質的には下流のデータ解析と出力は全て同じである。これらの解析から得られる物は、通常ではマイクロアレイの既知の位置に核酸配列をハイブリダイズする試料中の、cDNA配列を検出するために使用される、標識されたプローブから受け取る信号強度の測定である。通常は、シグナルの強度は、試料細胞で発現されたcDNAの量、したがってmRNAの量に比例する。このような多くの技術は入手可能であり有用である。遺伝子発現を確認するための好適な方法は、米国特許第6,004,755号; 第6,218,114号; 第6,218,122号;および第6,271,002号に記載されている。
発現レベルの解析は、シグナル強度の比較によってなされる。これは、試験試料の遺伝子発現強度の、対照試料の発現強度に対する、マトリクスの比を求めることによって最良に行われる。例えば、病変組織から得られた遺伝子発現強度を、同種の正常組織から得られた発現強度と比較することができる(例:病変乳房組織試料 対 正常乳房組織試料)。これらの発現強度の比は、試験試料と対照試料との間の遺伝子発現の倍率変化(fold-change)を示している。
遺伝子発現プロファイルも多くの方法で表示することができる。最も一般的な方法は、未加工の蛍光強度もしくはマトリクスの比を、縦の列が試験試料を示し、横の行が遺伝子を示す、グラフの樹状図(graphical Dendogram)に配列する方法である。データは、類似した発現プロファイルを有する遺伝子がお互いに近位になるように配列される。個々の遺伝子の発現比は、カラーで視覚化される。例えば、1未満の比(ダウンレギュレーションを示す)はスペクトルの青の部分に現れてよく、1より大きい比(アップレギュレーションを示す)はスペクトルの赤の部分の色として現れてよい。アジレント・テクノロジーズ社(Agilent Technologies)のGeneSpring、ならびにパーテック社(Partek)(登録商標)のPartek Discover(商標)、およびPartek Infer(商標)を含む、市販のコンピュータソフトウェアプログラムは、このようなデータを表示するために使用できる。
本発明の方法で使用された変調された遺伝子は、実施例の中に記載する。異なって発現した遺伝子は、再発していない患者に対し、乳癌の再発のある患者ではダウンレギュレートもしくはアップレギュレートされている。アップレギュレーションおよびダウンレギュレーションは、ある基準と比較して発現量に検出可能な差異がみられる(測定に使用した系のノイズの寄与を超える)ということを意味する相対的な用語である。この場合には、基準は再発していない患者の測定された遺伝子発現である。病変した細胞(再発患者の)の目的の遺伝子は、次に、同様の測定方法を使用して、基準値に対してアップレギュレートもしくはダウンレギュレートされる。この文脈において病変(diseased)とは、身体機能の適切な性能を、妨害するもしくは支障をきたす、または支障をきたす可能性がある、身体状態の変化のことを言い、それは制御されていない細胞増殖によって生じる。ある人について、その人の遺伝子型もしくは表現型が疾患の存在と矛盾しない場合に、病気であると診断される。しかしながら、診断や予後診断を行うという行為は、再発の可能性の決定や治療観察といった病気と状態の問題の決定を含んでいる。治療観察においては、遺伝子発現プロファイルが正常組織とより一致するパターンに変化したのかどうか、もしくは変化しつつあるのかどうかということを決定するために、何度も遺伝子発現の比較をして、所定の一連の治療の効果についての臨床的判断が行われる。
アップレギュレーションおよびダウンレギュレーションのレベルは、ハイブリダイズしたマイクロアレイプローブの強度測定の倍率変化に基づいて区別されることが望ましい。2.0倍の違いは、このような区別を行うのに望ましい(あるいはp値が0.05未満)。すなわち、遺伝子が正常/非再発細胞に対して病変/再発細胞において異なって発現していると結論する前に、病変細胞は正常細胞と比較して少なくとも2倍より多い、もしくは2倍少ない強度をもたらすことが分かっている。より大きい倍率の差があるほど、診断もしくは予後判断の道具として遺伝子を使用することが好ましい。本発明の遺伝子発現プロファイルのために選択された遺伝子は、臨床用実験器具を使用してバックグラウンドノイズを超える量だけ、正常な遺伝子もしくは非変調遺伝子のシグナルと区別可能なシグナルを結果として発生する発現レベルを有している。
変調された遺伝子を、非変調遺伝子およびノイズと確信を持って区別するために統計的値を使用することもできる。統計的検定により、試料の様々な群の間で最も優位差のある遺伝子を検出する。スチューデントのt−検定は、ロバストな統計的検定の1例であり、2群間の有意差を検出するために使用することができる。p値が低いほど、その遺伝子が異なる群の間の差を示している証拠がより説得力を持つ。とはいえ、マイクロアレイは、1回に2つ以上の遺伝子を測定するので、数万もの統計的検定を一度に行うことがあるかもしれない。このため、全くの偶然によって低いp値を見出す可能性は低く、シダックの補正のみでなくランダム化/置換を用いることでこの調整を行うことができる。t−検定による0.05未満のp値は、遺伝子に有意差があるという証拠となる。シダックの補正を計算に入れた後の0.05未満のp値は、より強力な証拠となる。各群の多数の試料に対して、ランダム化/置換検定を行った後の0.05未満のp値は、有意差を示す最も強力な証拠となる。
非変調遺伝子もしくはノイズのシグナルよりも強いシグナルを発する遺伝子を選択するために使用可能なもう1つのパラメータは、シグナルの絶対的な差の測定を利用することである。好ましくは、変調した遺伝子の発現によって発生するシグナルは、(絶対値で)正常もしくは非変調の遺伝子によるシグナルと少なくとも20%差がある。さらに好ましくは、このような遺伝子が正常もしくは非変調の遺伝子の発現パターンと、少なくとも30%異なった発現パターンを示す。
遺伝子は、グループ化して、グループ内の遺伝子のセットについて得られる情報が、診断、予後診断、もしくは処置法の選択などの臨床的に適切な判断を行う際の妥当な根拠を提供するようにすることもできる。これらの遺伝子のセットは、本発明のポートフォリオを作っている。この場合、このポートフォリオによってサポートされた判断は、乳癌およびその再発の可能性が含まれる。ほとんどの診断用マーカーと同様に、正確な医療的判断を行うのに十分な最小数のマーカーを使用することがしばしば望まれる。このことは、時間と資源の不適切な使用を防止するとともに、さらなる解析を待つ間の処置の遅延を防止する。
好ましくは、ポートフォリオは、そのポートフォリオ中の遺伝子の組み合わせによって、個々の遺伝子もしくはランダムに選択された遺伝子の組み合わせと比べて、向上した感度と特異性を示すように構築される。本明細書中では、ポートフォリオの感度は、正常状態と比較して病変状態での遺伝子の発現によって示される倍率の差に反映されうる。特異性は、遺伝子発現のシグナル伝達の、目的とする状態との相関の統計的測定に反映されうる。例えば、標準偏差はこのような測定として使用することができる。ポートフォリオに包含する遺伝子群を考えたとき、発現の測定値における小さな標準偏差は、より大きな特異性と相互に関係している。相関係数など変化の他の測定値も使用することが可能である。
遺伝子発現ポートフォリオを構築する1方法は、株式ポートフォリオを構築する際に広く使用されている平均分散アルゴリズムなど最適化アルゴリズムの使用によるものである。本方法は米国特許広報番号20030194734に詳細に記載されている。本質的には、この方法は返り値(return)(例:発生した信号)の変動を最小化し、使用するために、受け取る返り値を最適化する入力のセット(金融応用では株であるが、ここでは強度によって測定される発現である)の構築を必要とする。このような作業を行うための多くの市販のソフトウェアプログラムが入手可能である。好ましくは、本明細書では「ワグナーソフトウェア(Wagner Software)」と言われる「ワグナーアソシエイツ平均分散最適化アプリケーション(Wagner Associates Mean-Variance Optimization Application)」が好ましい。このソフトウェアは、「ワグナーアソシエイツ平均分散最適化ライブラリー(Wagner Associates Mean-Variance Optimization Library)」からの機能を用いて有効フロンティアを決定し、マーコウィッツの観念(Markowitz sense)における最適ポートフォリオが好ましい。この形式のソフトウェアを使用する際には、このソフトウェアが、意図された経済分析の目的で使用される際に株の収益とリスクの大きさ(stock return and risk measurements)が使用されるような形で、マイクロアレイのデータを入力として扱うことのできるように変形することが要求される。
ポートフォリオを選択する過程はまた、発見的規則の適用を含んでもよい。好ましくは、このような規則は、臨床的な結果を生み出すために使用される技術の理解および生物学に基づいて構築される。さらに好ましくは、このような規則が、最適化法から得られた出力に適用される。例えば、ポートフォリオ選択の平均分散法は、乳癌の被験者で異なって発現した多数の遺伝子に対するマイクロアレイデータに適用することができる。本方法の出力は、病変組織、ならびに末梢血に発現したいくつかの遺伝子を含むことができる、最適化された遺伝子のセットと推測される。もしこの検定法で使用される試料が末梢血から得られたものであり、乳癌の事例で異なって発現している特定の遺伝子が、末梢血中で異なって発現していた場合、ポートフォリオが、末梢血中で異なって発現しているものを排除する有効フロンティアから選択される、発見的規則を適用することが可能である。もちろん、例えばデータの事前選択の段階で規則を適用することにより、規則は有効フロンティアを形成する前に適用することもできる。
問題としている生物学とは必ずしも関連の無い他の発見的規則を適用することも可能である。例えば、ポートフォリオの所定のパーセンテージだけを、特定の遺伝子もしくは遺伝子群によって表わすことができる規則を適用することが可能である。ワグナーソフトウェアなどの市販ソフトウェアは、これらのタイプの発見的方法に容易に対応する。例えば、正確度と精密度以外の要素(例:予想されるライセンス料)が、1つ以上の遺伝子を含める好ましさに影響を与えるときにこれは有用でありうる。
本発明の1方法では、予後判断に帰する様々な遺伝子(あるいはポートフォリオ)に対して遺伝子発現プロファイルと比較することを含む。ポートフォリオを含むそれぞれの遺伝子の遺伝子発現プロファイルは、コンピュータで読み込み可能な媒体などの媒体に記録される。これは様々な形態を取ってもよい。例えば、疾病を表わすシグナルの範囲(例:強度測定)を入力する表を確立してもよい。次に、患者の試料が正常か病変かを決定するために、実際の患者のデータを上記表の値と比較してもよい。より高度な実施形態においては、発現シグナル(例:蛍光強度)のパターンはデジタル的にあるいは図示的に記録される。
次に患者の試料と組み合わせて使用される遺伝子ポートフォリオからの遺伝子発現パターンを、発現パターンと比較する。次に患者の試料が疾病の再発を示すパターンを有するかどうかを決定するために、パターン比較ソフトウェアを使用することができる。もちろん、これらの比較は、患者が病気を再発する可能性が無いかどうか決定するためにも使用することができる。次に試料の発現プロファイルを対照細胞のポートフォリオと比較する。もし試料の発現パターンが乳癌の再発の発現パターンと一致すれば、(対抗するような医学的考察が無い場合には)患者は再発患者が受けるであろう処置と同様の治療を受ける。もし試料の発現パターンが正常/対照細胞の発現パターンと一致すれば、患者は乳癌に関して陰性と診断される。
本発明では、乳癌の予後診断を決定するために患者の遺伝子発現パターンを解析する最も好ましい方法は、Coxのハザード解析プログラムを使用して行われる。最も好ましくは、解析はS−プラスソフトウェア(S-Plus software)(インサイトフル・コーポレーション(Insightful Corporation)から市販されている)を用いて行われる。このような方法を使用して、遺伝子発現プロファイルが確実に再発を示すプロファイルと比較される(つまりプロファイル中の遺伝子の組み合わせの発現レベルが再発を示している)。すでに閾値の決定されたCoxのハザードモデルを、2つのプロファイル(既知の再発 対 患者)の類似性の比較に使用し、その後患者のプロファイルが閾値を超えているかどうか決定される。もし超えていれば、患者は将来再発するであろう患者として分類され、アジュバント療法などの治療を認められる。もし患者のプロファイルが閾値を超えていなければ、非再発性の患者として分類される。線形判別分析・ロジスティック回帰およびニューラルネットワークアプローチなどの他の解析ツールも、同様の疑問に答えるために使用することができる。
様々な他の周知のパターン認識方法も利用可能である。以下の参考文献ではいくつかの例を提供する。加重投票(Weighted Voting)(ゴルブ(Golub)ら、1999)、サポートベクターマシン(Support Vector Machines)(スー(Su)ら、2001、およびラマズワミー(Ramaswamy)ら、2001)、k最近傍法(K-nearest Neighbors)(ラマズワミー(Ramaswamy)ら、2001)、ならびに相関係数(ヴァンヴィール(van’t Veer)ら、2002)。
本発明における遺伝子発現プロファイルは、癌の診断、予後判断、もしくは処置の観察に有用な、他の非遺伝子的な診断方法と組み合わせて使用することもできる。例えば、ある状況においては、上記に記載した遺伝子発現に基づく方法の診断力と、血清タンパクマーカー(例:癌抗原、27.29(「CA27.29」))などの従来のマーカーのデータとを組み合わせることは有益である。CA27.29のような分析物を含む、このような一連のマーカーが存在する。このような一方法では、治療中の患者から定期的に血液を採取し、その血液は、上記に記載した血清マーカーのうち1つについて酵素免疫測定を受ける。マーカー濃度が腫瘍の再発あるいは治療の失敗を示唆したときには、遺伝子発現解析に従う試料源が採取される。疑わしい塊(mass)が存在する場所に、穿刺吸引(FNA)を行い、その塊から採取された細胞の遺伝子発現プロファイルを上記に記載したように解析する。代わりに、以前に腫瘍が切除された組織に隣接する部位から組織試料を採取してもよい。このアプローチは、他の試験があいまいな結果を示すときに特に有効でありうる。
本発明の物品は、病気の処置、診断、予後判断、およびその他には病気の評価に有用な遺伝子発現プロファイルの表現を含む。これらのプロファイルの表現は、コンピュータで読み込むことのできる媒体(磁気的、光学的、および同等のもの)のような装置によって自動的に読むことのできる媒体に記録される。物品は、そのような媒体の遺伝子発現プロファイルを評価する取扱説明書も含むことができる。例えば、物品は、上記に記載された遺伝子のポートフォリオの遺伝子発現プロファイルを比較するためのコンピュータ取扱説明書を有するCD ROMを含んでもよい。物品はまた、患者試料から得られた遺伝子発現データと比較できるように、デジタル的に記録された遺伝子発現プロファイルを有してもよい。代わりに、上記プロファイルは、異なった表示形式で記録することもできる。図表記録は1つのそのような形式である。上記に記載した、パーテック社(Partek)(登録商標)のPartek Discover(商標)およびPartek Infer(商標)ソフトウェアに組み込まれたアルゴリズムなどのクラスタリングアルゴリズムは、そのようなデータの視覚化の際に最も役に立つであろう。
本発明に従った、異なったタイプの製造品は、遺伝子発現プロファイルを明らかにするために使用される媒体もしくはフォーマットされたアッセイ(formatted assay)である。これらは例えば、目的とする遺伝子を示す配列が結合し、それらの存在の読み出し可能な決定因子を作成するマトリクスに、配列相補体あるいはプローブが固定されたマイクロアレイを含むことができる。代替として、本発明に基づく物品は、乳癌を検出するために、ハイブリダイゼーション、増幅、および目的とする遺伝子の発現レベルを示すシグナル発生を行うための試薬キットに作り上げられることができる。
本発明に従って作製されたキットは、遺伝子発現プロファイルを決定するためのフォーマットされたアッセイを含む。上記キットには、試薬や取扱説明書など、アッセイを行うために必要な物質の全てもしくは一部を含むこともできる。
配列番号1〜197を表5に集約した。配列番号1〜197のそれぞれにおいて、マーカーは、所定の配列番号に対応する、任意の変異体、対立遺伝子等をコードする遺伝子を表わすpsidもしくはアフィメトリクスプロセットID(Affymetrix Proset ID)によって同定される。またマーカーは、所定のpsidに対応したプローブによって認識されるmRNAをコードする遺伝子として定められている。
以下の実施例は説明のために提供するものであり、主張する発明を制限するものではない。本明細書に言及する全ての文献は、参照することを以って本明細書に組み込まれる。本発明に従って分析された遺伝子は、通常は、タンパク質もしくはペプチドの生産をコードする完全長の核酸配列に関連する。当業者であれば、完全長の配列の同定が、解析の観点から必ずしも必要でないことを理解できよう。すなわち、配列の一部もしくはESTは、対応する遺伝子の遺伝子発現を評価する目的でプローブをデザインできる、周知の原理にしたがって選択することができる。
〔実施例1〕
腫瘍塊データセットとLCMにより得られた試料データセットとの間の、21個の継続的に発現しているハウスキーピング遺伝子の発現強度の比較
乳房の上皮細胞におけるエストロゲンによって誘発される機構について知見を得るために、本発明者らは、17のER+の腫瘍と11のER−の腫瘍とからなる28の早期の原発性乳房腫瘍のセットにLCM技術を応用した。次に、Affymetrix Gene Chip Hu133Aを用いてそれらの遺伝子発現プロファイルを解析した。
本研究で用いられた乳房腫瘍は、エラスムス・メディカル・センター(Erasmus Medical Center)(オランダロッテルダム(Rotterdam, Netherlands))の腫瘍バンクから選択された。これらの試料は、ステロイドホルモン受容体の状態の通常の評価のために実験室に提出され、それ以降液体窒素中で保管された。コードを付与された腫瘍組織を使用する本研究は、オランダの医科学協会連合の行動規範(Code of Conduct of the Federation of Medical Scientific Societies in the Netherlands)に準拠して行われた。本研究はエラスムス・メディカル・センター(Erasmus Medical Center)の機関の医療倫理委員会(institutional Medical Ethical Committee)により承認された。患者は、1983年から1994年までの間にステージIおよびステージIIaと診断され、平均年齢は49歳(範囲:29歳〜74歳)であった。これらの乳房腫瘍はほとんどが浸潤性乳管癌(IDC)であり、腫瘍の一部では非浸潤性乳管癌(DCIS)も存在していた。表1にこれらの患者の臨床的特徴が明記されている。25人の患者は乳房温存手術を、3人は乳房切除術を受けた。
Figure 2008538284
全ての患者は腋窩リンパ節の切開を受け、示唆された場合には続けて放射線治療を受けた。ネオアジュバント療法を施されたものはいなかった。腫瘍は直径5cm未満の大きさの原発性の浸潤性乳管癌(pT1もしくはpT2)と特徴付けられた。手術の時点ではリンパ節転移は見られなかった。ERの状態は、前述のようにリガンド結合アッセイもしくは酵素免疫測定によって決定した(フォーケンス(Foekens)ら、1989)。腫瘍をER+とER−に区別するために、細胞質ゾルタンパク質10fmol/mgのカットオフ値を用いた。遺伝子発現プロファイルを作成するために、平均1000個の腫瘍細胞を腫瘍塊の新鮮凍結切片から得た。マイクロアレイ解析のために十分な量のビオチン標識されたaRNAを得るため、T7-based RNAリニア増幅が行われた(カメ(Kamme)ら、2004)。TargetAmp RNA増幅キット(ウィスコンシン州のエピセンター社(Epicenter, WI))を使用し、2回目の増幅のラウンドビオチン標識のステップをAffymetrix Enzoキット(カリフォルニア州のアフィメトリクス社(Affymetrix, CA))と入れ替えて使用することによって、2回の増幅ラウンドの後、平均サイズ分布がおよそ2000ヌクレオチド長のaRNAが、平均して60μg産生された。増幅力は初期全RNAからおよそ106倍であった。増幅されたRNAの複製から得られた遺伝子発現データの直線回帰分析は0.96のR2値を示した。2ラウンドのT7-based RNAリニア増幅の良好な忠実度と再現性がいくつかの報告の中で示されており(ルッツィ(Luzzi)ら、2003;マ(Ma)ら、2003)、Affymetrix GeneChip(登録商標)では、アレイのプローブのセットが3’末端配列を使用するように設計されているために、転写産物の3’末端側での増幅は全体の転写プロファイルに大きな影響を与えなかった(ルッツィ(Luzzi)ら、2003)。さらに、増幅方法は、増幅しない方法と比較して、異なって発現している遺伝子を同定する感度を増加させることを示した(ポラセック(Polacek)ら、2003)。本研究の増幅方法がLCMによって得られたRNA試料中でmRNA存在量を正確に保持していることを確認するために、LCMによって得られた試料と腫瘍塊の試料との間で、21の構造的に発現しているハウスキーピング遺伝子の発現レベルを比較した(図1)。これらの21の遺伝子は、異なった組織のタイプにわたる正常、良性および腫瘍の試料からの遺伝子発現プロファイルの大きなコレクションに基づいて選択された。2ラウンドで増幅されたLCM試料から得られた21の遺伝子の発現レベルと、対応する腫瘍塊の試料からのそれとの間には、統計的に有意な差は見られなかった。ゆえに、本発明者らの結果は、2ラウンドのT7-based RNA増幅がRNA試料中でmRNAの存在量を正確に保持していると公表された研究と合致しており、LCMとRNA増幅の組み合わせは遺伝子発現プロファイルに対する信頼に足るアプローチである。
腫瘍塊の遺伝子発現データを生成するために、トリゾール法(Trizol method)(カリフォルニア州のインビトロジェン社(Invitrogen, CA))を使用して全RNA試料を抽出した。次に目的物はビオチン標識され、製造会社のマニュアルにしたがってGeneChip Hu133A(カリフォルニア州アフィメトリクス社(Affymetrix, CA))とハイブリダイズされた。LCMによって得られた試料のデータセットに対しては、PALM(登録商標)マイクロレーザーシステムとZEISS Axiovert 135(ドイツP.A.L.M.マイクロレーザーテクノロジーズ社(P.A.L.M. Microlaser Technologies, Germany))、および確立されたプロトコルを使用して腫瘍細胞を得た(カメ(Kamme)ら、2004)。要するに、埋め込まれた凍結腫瘍標本をCryocut 1800 Reichert-Jung cryotome(ドイツのケンブリッジ・インストルメンツ社(Cambridge Instruments, Germany))を用いて、−17℃〜−25℃の温度で、10μmの厚さの連続切片に切り、PEN(ポリエチレンナフタレート)膜スライド(ドイツP.A.L.M.マイクロレーザーテクノロジーズ社(P.A.L.M. Microlaser Technologies, Germany))に載せた。
H&E染色のために、スライドを徐々に濃度の低くなる一連のエタノール溶液に連続的に5回浸し、ハリス−ヘマトキシリン溶液(ミズーリ州セントルイスのシグマ社(Sigma, St.Louis, MO))に30秒間浸し、脱イオン化水で軽く洗い、エオシンY(Eosin Y)(ミズーリ州セントルイスのシグマ社(Sigma, St.Louis, MO))に5回浸し、95%エタノールと100%エタノールで洗浄した。10分間空気乾燥した後、スライドはLCM処置に使えるようになる。それぞれの腫瘍試料について、最初と最後の組織切片はガラススライドに載せ、H&E染色の後にキシレンに埋め込まれ、これは診断の際の基準および確認として役に立つ。次に腫瘍細胞を含んでいる部位は、独立してスライドから単離され、100%エタノール中で保管される。レーザーで採取した細胞の全RNAは、RNeasy緩衝液(ドイツ、キアゲン社(Qiagen, Germany))で抽出され、Zymo spin-column(カリフォルニア州、ザイモ・リサーチ社(Zymo Research, CA))を使用して回収された。次に、RNA試料は本文で述べているような変更を加えたTargetAmp(商標)キットで増幅された。最終のビオチン標識されたaRNA産物は、GeneChip Hu133Aとハイブリダイズされた。データ解析のために、スキャンされたチップの画像はMicroarray Analysis suite5.0(カリフォルニア州アフィメトリクス・インコーポレイティッド(Affymetrix Inc., CA))を使用して処理された。個々のマイクロアレイの画像データは、平均強度が600になるように個別に増減された。品質管理基準は以下のとおりである:RawQは4未満、バックグラウンドは100未満、スケーリングファクターは4未満、「存在(Present)」の判定が35%より大きい、であった。青と黄色のバーはそれぞれ腫瘍塊とLCM試料の発現レベルを表わしている。エラーバーはそれぞれのデータセットの28の実験の標準偏差を表わしている。t−検定を用いてp値を得た。0.01未満のp値は、2つのデータセットの間で有意差があると考えられた。結果は図1に図示した。
〔実施例2〕
ジーン・スプリング・ソフトウェア(Gene Spring software)を使用した、包括的遺伝子発現データの教師なし2次元階層的クラスタリング分析
Affymetrix U133Aチップの約23000のプローブセットの遺伝子発現強度を、まず分位点正規化法(quantile normalization method)によって正規化し、次にAffymetrix MAS 5.0ソフトウェアによって決定された「存在(Present)」判定を用いてフィルターした。発現パターンの類似性に基づいて遺伝子をグループ化するため、および包括的遺伝子発現プロファイルの類似性に基づいて試料をクラスター化するために、教師なし二次元階層的クラスタリングアルゴリズムがマイクロアレイデータに適用された。図2に示したように、56の試料(28のLCM、および28の組織塊)はRNA抽出のソース(LCMによって得られた腫瘍細胞と、腫瘍塊から得られた、混合された細胞集団)に応じて大きな2つのグループにクラスター化された。それぞれのグループ内で、試料はさらに2つのサブグループ(LCM試料内のグループAとB、組織塊試料のグループCとD)にクラスター化された。これらのサブグループが臨床的なパラメータと関連がある可能性を調べたところ、ERの状態がこの分類と最も大きな相関を持っていた。LCMデータセットでは、ER+と診断された17の腫瘍のうち、15個が同じサブグループ(サブグループA)に分類され、1つはそれ自身でサブグループを形成し、1つはER−のグループに分類された。11のER−の腫瘍のうち10個はサブグループBに分類され、カイ二乗検定の推定P値は0.0006であった。1つのER−の腫瘍はER+の腫瘍にクラスター化された。腫瘍塊のデータセットに関しては、同じ15のER+の試料が正しいカテゴリ(サブグループC)に分類され、同じ1つのER−の試料がER+のグループにクラスター化された。ER−のサブグループに分類された2つのER+の腫瘍は、チップのデータ上でエストロゲン受容体の発現が非常に低かった一方で、ER+のサブグループに分類された1つのER−の腫瘍は、チップ上で高い発現を示していた。通常の評価によるERの状態と遺伝子発現データとの間の不一致は、おそらく腫瘍の不均一性もしくはこれらの腫瘍でのER発現の転写後制御によるものであろう。
〔実施例3〕
ER+のサブグループとER−のサブグループの間の、異なって発現している遺伝子の経路分析
ERの状態に関連する遺伝子およびその関連する経路を同定するために、ER+のサブグループとER−のサブグループとの間のt−検定を、2つのデータセットのそれぞれにおいて行った。ボンフェローニ補正されたP値<0.05をカットオフに用いて、LCMによって得られた試料のデータセットで146の特有の遺伝子を表す175のプローブセットが見出され、腫瘍塊データセットで112の特有の遺伝子を表す130のプローブセットが同定された。これら2つの遺伝子リストを比較することによって、61の遺伝子が共通であることが見出され、85の遺伝子がLCMによって得られた試料に特有であり、51の遺伝子が腫瘍塊の試料の中にのみ存在した(図3A;表2、表3、表4)。61の共通な遺伝子のうち、ER+のサブグループの中で36個は比較的過剰に発現しており、25はダウンレギュレートされていた(表2)。エストロゲン受容体は、トレフォイル因子1と3、GATA3、X−ボックス結合タンパク質1(XBP1)、およびケラチン18のようなERの活性化に関連していることが知られている他の遺伝子と供に、アップレギュレートされている遺伝子に含まれる(ソティリオ(Sotiriou)ら、2003;グラブバーガー(Gruvberger)ら、2001;ソン(Sun)ら、2005)。一方で、P−カドヘリン(CDH3)、GABRP、およびFrizzled関連分泌タンパク質1(secreted frizzled-related protein 1)(SFRP1)はダウンレギュレートされた遺伝子のリストに現れている。
Figure 2008538284
Figure 2008538284
Figure 2008538284
Figure 2008538284
Figure 2008538284
Figure 2008538284
遺伝子オントロジーの注釈を使用して、3つの遺伝子リスト(図3B、図3C、および図3D)について特徴ある経路がP値<0.05で同定された。61の遺伝子について、最も重要な経路は、微小管細胞骨格構成経路(microtubule cytoskeleton organization pathway)であることが判明した。この経路には防御応答、細胞増殖の負の調節、解糖、消化、視覚、ナトリウムイオン輸送、イオン輸送、および形態形成経路が続く。細胞増殖の負の調節経路には、その中でER+腫瘍でレチノイン酸受容体応答細胞(retinoic acid receptor responder)(タザロテンにより誘導)1、およびBTGファミリーのメンバー3遺伝子がダウンレギュレートされていることが見出されたが、共通の遺伝子リストの関連するほとんどの遺伝子を有する。興味深い発見としては、微小管細胞骨格の構成と生物発生(biogenesis)の経路の微小管関連タンパク質タウ(MAPT)の、ER+乳房腫瘍内でのアップレギュレーションである。この遺伝子は神経系で異なって発現しており(バインダー(Binder)ら、1985)、その変異はいくつかの神経変性疾患を引き起こす(スピランティーニ(Spillantini)ら、1998)。この遺伝子が植物性エストロゲンイソフラボンの経口摂取と相互に関連して、霊長類の脳内で抑制されることは報告されていたが(キム(Kim)ら、2001)、乳房腫瘍細胞中のERの状態と関連したアップレギュレーションはこれまで示されたことがない。
LCM試料に特有な遺伝子リストの中で同定された重要な経路は、以下の、スフィンゴ糖脂質生合成、エンドサイトーシス、RAS蛋白質シグナル伝達、中枢神経系発達、代謝、および同種親和性細胞接着(homophilic cell adhesion)である。UDP−グルコースセラミドグルコシルトランスフェラーゼ、およびUDPグリコシルトランスフェラーゼ8は、セラミド(分化、老化、増殖、およびアポトーシスを促進するシグナル伝達カスケードへの二次メッセンジャーとして機能する)などのスフィンゴ糖脂質生合成に関係する(シメステイン(Simstein)ら、2003)。ER経路内部での相互作用の基礎となる機構は未知であるにもかかわらず、セラミド生成はタモキシフェン誘発アポトーシスに付随し(マンドレカー(Mandlekar)ら、2001)、おそらくは細胞外シグナル制御キナーゼ(ERK)を通してエストロゲンの反アポトーシスシグナル伝達経路を阻害する(チェン(Chen)ら、2005)とされた。さらに、別の同定された経路であるエンドサイトーシスは、乳癌内で、Eph/エフリンシグナル伝達経路(JAT−STAT経路を交差活性化する)を通して細胞の接着と遊走に関連していた(フォックス(Fox)ら、2004;ポリアコフ(Poliakov)ら、2004)。RAS癌遺伝子ファミリーのメンバー(RAB17およびRAB26)は、RASタンパク質シグナル伝達に関わる遺伝子(SOSIおよびPLD1)とともに同定された。活動亢進したRasは、乳癌の成長および発症を促進する可能性があり、ERK/AKTシグナル伝達経路の上流に影響を与える(エッカート(Eckert)ら、2004)。MCF7細胞中で、Rasの活動は、エストラジオールに反応したp27の核外輸送と分解に必要であり、培地内での乳癌細胞の生存を促進する際の新たな非遺伝子的な経路を仲介したということが示されている(フェルナンド(Fernando)ら、2004)。
形質転換成長因子β(TGF−β)は腫瘍形成の初期と終期の段階で腫瘍抑制効果と促進効果の両方を持つことが示されている(アクハースト(Akhurst)ら、2001)。DNA依存性もしくは非依存性の様式で、TGF−βシグナル伝達とエストロゲンシグナル伝達との間のクロストークが示されている(マツダ(Matsuda)ら、2001;ウー(Wu)ら、2003;アマナマンシ(Ammanamanchi)ら、2004)。TGF−βシグナル伝達に影響すると示唆されていたいくつかの遺伝子が、共通の遺伝子リストとLCMに特有の遺伝子リストで同定された。WWドメイン含有蛋白質1(WWP1)は、上皮で発現するE3ユビキチンリガーゼであるが、TGF−βI型受容体のユビキチン化を誘導しTGF−βI型受容体を劣化させることを通して、TGF−βシグナル伝達を阻害することが見出された(マルベルト‐コーラス(Malbert-Colas)ら、2003;コムロ(Komuro)ら、2004)。ソティリオ(Sotiriou)ら(2003)も、彼らのERの状態に関連する遺伝子のリストの中にこの遺伝子を見出しているが、そのER経路との相互作用については依然として未知である。DACH1は、乳癌細胞株においてSmad4への結合を通してTGF−βが誘発するアポトーシスを阻害することが示されており、このSmad4は、ER−αのAF1ドメインとの相互作用によるER−αの転写抑制補体である(ウー(Wu)ら、2003)。FOXC1は、DACH1のレギュレーターであるが(タミミ(Tamimi)ら、2004)、これもLCM試料に特有な遺伝子のリストに存在していた。WWP1およびDACH1のアップレギュレーションは、TGF−βシグナル伝達がER+の腫瘍内で抑制されていることを示唆した。さらにLCMに特有な遺伝子のリストには、DNA依存性転写制御、細胞表面受容体とリンクしたシグナル伝達、細胞の接着/運動性、代謝酵素、およびアポトーシスなどの、ER経路に関連する機能に関与する遺伝子がある。それらの中で、いくつかの遺伝子はERと相互作用することが知られており、それは例えばHDAC2、ANXA1、およびCCNB1である。これらの遺伝子の潜在的な役割と、それらのERとの関係をさらに詳しく調べることは、これらの経路間の相互関係およびエストロゲンシグナル伝達についての知見を提供するだろう。
一方で、腫瘍塊の試料に特有な遺伝子については、走化性と抗菌体液性応答に関連する経路が上位に挙げられた。システインリッチ蛋白質1(CRIP1)は、ヒトの末梢血単核細胞中で産生されており、宿主防衛に関連している(クー(Khoo)ら、1997)。ラジニン1(LAD1)は、基底膜蛋白質であり、おそらく上皮層と下層の間葉との結合の安定化に寄与している(マリンコヴィッチ(Marinkovich)ら、1996)。
上述の発明は、理解し易いように例示および例を用いて、詳細に説明してきたが、この説明および例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
Figure 2008538284
Figure 2008538284
Figure 2008538284
Figure 2008538284
Figure 2008538284
Figure 2008538284
〔参照文献〕
Figure 2008538284

Figure 2008538284
〔実施の態様〕
(1)エストロゲン受容体の発現状態を決定する方法において、
a. 乳癌患者から腫瘍組織塊の試料を得るステップと、
b. mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記試料での発現レベルを測定するステップであって、
前記mRNAが、
i. 表2もしくは表3に記載の配列番号に一致するか、または、
ii. 表2もしくは表3に記載の配列番号に一致するpsidからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルより高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、エストロゲン受容体の発現状態を示唆する、方法。
(2)エストロゲン受容体の発現状態を決定する方法において、
a. 乳癌患者から顕微鏡的に単離された腫瘍試料を得るステップと、
b. mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記試料での発現レベルを測定するステップであって、
前記mRNAが、
i. 表2もしくは表4に記載の配列番号に一致するか、または、
ii. 表2もしくは表4に記載の配列番号に一致するpsidからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルより高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、エストロゲン受容体の発現状態を示唆する、方法。
(3)乳癌患者の治療プロトコルを決定する方法において、
a. 乳癌患者から腫瘍組織塊の試料を得るステップと、
b. mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記試料での発現レベルを測定するステップであって、
前記mRNAが、
i. 表2もしくは表3に記載の配列番号に一致するか、または、
ii. 表2もしくは表3に記載の配列番号に一致するpsidからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルより高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、再発を防止するために推奨された処置の程度および種類を医師が決定できるように再発のリスクを十分に示唆する、方法。
(4)乳癌患者の治療プロトコルを決定する方法において、
a. 乳癌患者から顕微鏡的に単離した腫瘍試料を得るステップと、
b. mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記試料での発現レベルを測定するステップであって、
前記mRNAが、
i. 表2もしくは表4に記載の配列番号に一致するか、または、
ii. 表2もしくは表4に記載の配列番号に一致するpsidからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルより高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、再発を防止するために推奨された処置の程度および種類を医師が決定できるように再発のリスクを十分に示唆する、方法。
(5)乳癌患者を処置する方法において、
a. 乳癌患者から腫瘍組織塊の試料を得るステップと、
b. mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記試料での発現レベルを測定するステップであって、
前記mRNAが、
i. 表2もしくは表3に記載の配列番号に一致するか、または、
ii. 表2もしくは表3に記載の配列番号に一致するpsidからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ステップと、
c. 前記患者がハイリスク患者である場合に、前記患者をアジュバント療法で処置するステップと、
を含む、方法。
(6)乳癌患者を処置する方法において、
a. 乳癌患者から顕微鏡的に単離した腫瘍試料を得るステップと、
b. mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記試料での発現レベルを測定するステップであって、
前記mRNAが、
i. 表2もしくは表4に記載の配列番号に一致するか、または、
ii. 表2もしくは表4に記載の遺伝子配列に一致するpsidからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
ステップと、
c. 前記患者がハイリスク患者である場合に、前記患者をアジュバント療法で処置するステップと、
を含む、方法。
(7)実施態様1〜6のいずれかに記載の方法において、
前記試料が、原発腫瘍から得られる、方法。
(8)実施態様1、3、または5に記載の方法において、
前記組織塊の標本が、生検、または外科標本から得られる、方法。
(9)実施態様2、4、または6に記載の方法において、
前記顕微鏡による単離が、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによるものである、方法。
(10)実施態様1〜6のいずれかに記載の方法において、
前記試料に構造的に発現している少なくとも1つの遺伝子の前記発現レベルを測定するステップ、
をさらに含む、方法。
(11)実施態様1〜6のいずれかに記載の方法において、
特異性が、少なくともほぼ40%である、方法。
(12)実施態様1〜6のいずれかに記載の方法において、
感度が、少なくともほぼ90%である、方法。
(13)実施態様1〜6のいずれかに記載の方法において、
前記遺伝子の発現パターンが、再発患者を示唆する発現パターンと比較される、方法。
(14)実施態様13に記載の方法において、
前記発現パターンの前記比較が、パターン認識法で行われる、方法。
(15)実施態様14に記載の方法において、
前記パターン認識法が、コックスの比例ハザード解析の使用を含む、方法。
(16)実施態様1〜6のいずれかに記載の方法において、
前記所定のカットオフレベルが、正常組織または良性細胞と比較して、前記試料で少なくとも1.5倍の過剰または過小発現である、方法。
(17)実施態様1〜6のいずれかに記載の方法において、
前記所定のカットオフレベルが、正常組織または良性細胞と比較して、転移性の細胞を有する前記試料で、少なくとも統計学的に有意なp値の過剰または過小発現を有する、方法。
(18)実施態様17に記載の方法において、
前記p値が、0.05未満である、方法。
(19)実施態様1〜6のいずれかに記載の方法において、
遺伝子発現が、マイクロアレイ、または遺伝子チップで測定される、方法。
(20)実施態様19に記載の方法において、
前記マイクロアレイが、cDNAアレイ、またはオリゴヌクレオチドアレイである、方法。
(21)実施態様20に記載の方法において、
前記マイクロアレイまたは前記遺伝子チップが、1つ以上の内部コントロール試薬をさらに含む、方法。
(22)実施態様1〜6のいずれかに記載の方法において、
遺伝子発現が、前記試料から抽出したRNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって行われる核酸増幅法で決定される、方法。
(23)実施態様22に記載の方法において、
前記PCRが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法(RT−PCR)である、方法。
(24)実施態様23に記載の方法において、
前記RT−PCRが、1つ以上の内部コントロール試薬をさらに含む、方法。
(25)実施態様1〜6のいずれかに記載の方法において、
遺伝子発現が、前記遺伝子によってコードされる蛋白質を測定または検出することで検出される、方法。
(26)実施態様25に記載の方法において、
前記蛋白質が、前記蛋白質に特異的な抗体で検出される、方法。
(27)実施態様1〜6のいずれかに記載の方法において、
遺伝子発現が、前記遺伝子の特性を測定することでを検出される、方法。
(28)実施態様27に記載の方法において、
測定される前記特性が、DNAの増幅、メチル化、突然変異、および対立遺伝子変異からなる群から選択される、方法。
(29)構成物において、
表2、表3、および/または表4に記載の配列番号からなる群から選択される少なくとも一つのプローブセット、
を含む、構成物。
(30)生体試料のエストロゲン受容体の発現状態を決定するためにアッセイを行うためのキットにおいて、
表2、表3、および/または表4に記載の配列番号に一致するmRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離した核酸配列、それらの相補体、またはその一部を検出するための物質、
を含む、キット。
(31)実施態様30に記載のキットにおいて、
前記配列番号が、表2および/または表3の配列番号である、キット。
(32)実施態様30に記載のキットにおいて、
前記配列番号が、表2および/または表4に記載されている、キット。
(33)実施態様30に記載のキットにおいて、
マイクロアレイ解析を行うための試薬、
をさらに含む、キット。
(34)実施態様30に記載のキットにおいて、
媒体であって、この媒体を通して、前記核酸配列、それらの相補体、またはその一部がアッセイされる、媒体、
をさらに含む、キット。
(35)乳癌の状態を判断するための物品において、
表2、表3、および/または表4に記載の配列番号に一致するmRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離した核酸配列、それらの相補体、またはその一部を検出するための物質、
を含む、物品。
(36)実施態様35に記載の物品において、
前記配列番号が、表2および/または表3の配列番号である、物品。
(37)実施態様35に記載の物品において、
前記配列番号が、表2および/または表4に記載されている、物品。
(38)実施態様35に記載の物品において、
マイクロアレイ解析を行うための試薬、
をさらに含む、物品。
(39)実施態様35に記載の物品において、
媒体であって、この媒体を通して、前記核酸配列、それらの相補体、またはその一部がアッセイされる、媒体、
をさらに含む、物品。
(40)マイクロアレイ、または遺伝子チップにおいて、
実施態様1〜6のいずれかに記載の方法を実施するための、マイクロアレイ、または遺伝子チップ。
(41)実施態様40に記載のマイクロアレイにおいて、
表2、表3、および/または表4に記載の配列番号に一致するmRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離した核酸配列、その相補体、またはその一部、
を含む、マイクロアレイ。
(42)実施態様41に記載のマイクロアレイにおいて、
cDNAアレイ、またはオリゴヌクレオチドアレイ、
を含む、マイクロアレイ。
(43)実施態様41に記載のマイクロアレイにおいて、
1つ以上の内部コントロール試薬、
をさらに含む、マイクロアレイ。
(44)診断/予後診断のポートフォリオにおいて、
表2、表3、および/または表4に記載の配列番号に一致するmRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離した核酸配列、その相補体、またはその一部、
を含む、ポートフォリオ。
腫瘍塊データセットとLCMで得た試料データセットとの間で、21の連続して発現したハウスキーピング遺伝子の発現強度を比較した図である。 ジーン・スプリング・ソフトウェア(Gene Spring software)を使用した、包括的遺伝子発現データの教師なし二次元階層型クラスタリング解析を示す図である。 ER+サブグループとER−サブグループとの間で差動的に発現した遺伝子の遺伝子経路分析の図である。図3Aは、以下の3つのカテゴリー、すなわち、LCMデータセットと腫瘍塊データセット両方に共通、LCM試料データセットに特有、腫瘍塊データセットに特有、と命名した遺伝子数の円グラフを表す。図3Bは、共通の遺伝子リストで同定した経路を記載した図である。図3Cは、LCMデータセットに特有な遺伝子の有意な経路を示す。図3Dは、腫瘍塊データセットに特有の経路を表す。

Claims (44)

  1. エストロゲン受容体の発現状態を決定する方法において、
    a. 乳癌患者から腫瘍組織塊の試料を得るステップと、
    b. mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記試料での発現レベルを測定するステップであって、
    前記mRNAが、
    i. 表2もしくは表3に記載の配列番号に一致するか、または、
    ii. 表2もしくは表3に記載の配列番号に一致するpsidからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
    ステップと、
    を含み、
    所定のカットオフレベルより高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、エストロゲン受容体の発現状態を示唆する、方法。
  2. エストロゲン受容体の発現状態を決定する方法において、
    a. 乳癌患者から顕微鏡的に単離された腫瘍試料を得るステップと、
    b. mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記試料での発現レベルを測定するステップであって、
    前記mRNAが、
    i. 表2もしくは表4に記載の配列番号に一致するか、または、
    ii. 表2もしくは表4に記載の配列番号に一致するpsidからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
    ステップと、
    を含み、
    所定のカットオフレベルより高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、エストロゲン受容体の発現状態を示唆する、方法。
  3. 乳癌患者の治療プロトコルを決定する方法において、
    a. 乳癌患者から腫瘍組織塊の試料を得るステップと、
    b. mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記試料での発現レベルを測定するステップであって、
    前記mRNAが、
    i. 表2もしくは表3に記載の配列番号に一致するか、または、
    ii. 表2もしくは表3に記載の配列番号に一致するpsidからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
    ステップと、
    を含み、
    所定のカットオフレベルより高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、再発を防止するために推奨された処置の程度および種類を医師が決定できるように再発のリスクを十分に示唆する、方法。
  4. 乳癌患者の治療プロトコルを決定する方法において、
    a. 乳癌患者から顕微鏡的に単離した腫瘍試料を得るステップと、
    b. mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記試料での発現レベルを測定するステップであって、
    前記mRNAが、
    i. 表2もしくは表4に記載の配列番号に一致するか、または、
    ii. 表2もしくは表4に記載の配列番号に一致するpsidからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
    ステップと、
    を含み、
    所定のカットオフレベルより高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、再発を防止するために推奨された処置の程度および種類を医師が決定できるように再発のリスクを十分に示唆する、方法。
  5. 乳癌患者を処置する方法において、
    a. 乳癌患者から腫瘍組織塊の試料を得るステップと、
    b. mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記試料での発現レベルを測定するステップであって、
    前記mRNAが、
    i. 表2もしくは表3に記載の配列番号に一致するか、または、
    ii. 表2もしくは表3に記載の配列番号に一致するpsidからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
    ステップと、
    c. 前記患者がハイリスク患者である場合に、前記患者をアジュバント療法で処置するステップと、
    を含む、方法。
  6. 乳癌患者を処置する方法において、
    a. 乳癌患者から顕微鏡的に単離した腫瘍試料を得るステップと、
    b. mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記試料での発現レベルを測定するステップであって、
    前記mRNAが、
    i. 表2もしくは表4に記載の配列番号に一致するか、または、
    ii. 表2もしくは表4に記載の遺伝子配列に一致するpsidからなる群から選択されるプローブセットによって認識される、
    ステップと、
    c. 前記患者がハイリスク患者である場合に、前記患者をアジュバント療法で処置するステップと、
    を含む、方法。
  7. 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法において、
    前記試料が、原発腫瘍から得られる、方法。
  8. 請求項1、3、または5に記載の方法において、
    前記組織塊の標本が、生検、または外科標本から得られる、方法。
  9. 請求項2、4、または6に記載の方法において、
    前記顕微鏡による単離が、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによるものである、方法。
  10. 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法において、
    前記試料に構造的に発現している少なくとも1つの遺伝子の前記発現レベルを測定するステップ、
    をさらに含む、方法。
  11. 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法において、
    特異性が、少なくともほぼ40%である、方法。
  12. 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法において、
    感度が、少なくともほぼ90%である、方法。
  13. 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法において、
    前記遺伝子の発現パターンが、再発患者を示唆する発現パターンと比較される、方法。
  14. 請求項13に記載の方法において、
    前記発現パターンの前記比較が、パターン認識法で行われる、方法。
  15. 請求項14に記載の方法において、
    前記パターン認識法が、コックスの比例ハザード解析の使用を含む、方法。
  16. 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法において、
    前記所定のカットオフレベルが、正常組織または良性細胞と比較して、前記試料で少なくとも1.5倍の過剰または過小発現である、方法。
  17. 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法において、
    前記所定のカットオフレベルが、正常組織または良性細胞と比較して、転移性の細胞を有する前記試料で、少なくとも統計学的に有意なp値の過剰または過小発現を有する、方法。
  18. 請求項17に記載の方法において、
    前記p値が、0.05未満である、方法。
  19. 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法において、
    遺伝子発現が、マイクロアレイ、または遺伝子チップで測定される、方法。
  20. 請求項19に記載の方法において、
    前記マイクロアレイが、cDNAアレイ、またはオリゴヌクレオチドアレイである、方法。
  21. 請求項20に記載の方法において、
    前記マイクロアレイまたは前記遺伝子チップが、1つ以上の内部コントロール試薬をさらに含む、方法。
  22. 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法において、
    遺伝子発現が、前記試料から抽出したRNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって行われる核酸増幅法で決定される、方法。
  23. 請求項22に記載の方法において、
    前記PCRが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法(RT−PCR)である、方法。
  24. 請求項23に記載の方法において、
    前記RT−PCRが、1つ以上の内部コントロール試薬をさらに含む、方法。
  25. 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法において、
    遺伝子発現が、前記遺伝子によってコードされる蛋白質を測定または検出することで検出される、方法。
  26. 請求項25に記載の方法において、
    前記蛋白質が、前記蛋白質に特異的な抗体で検出される、方法。
  27. 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法において、
    遺伝子発現が、前記遺伝子の特性を測定することで検出される、方法。
  28. 請求項27に記載の方法において、
    測定される前記特性が、DNAの増幅、メチル化、突然変異、および対立遺伝子変異からなる群から選択される、方法。
  29. 構成物において、
    表2、表3、および/または表4に記載の配列番号からなる群から選択される少なくとも一つのプローブセット、
    を含む、構成物。
  30. 生体試料のエストロゲン受容体の発現状態を決定するためにアッセイを行うためのキットにおいて、
    表2、表3、および/または表4に記載の配列番号に一致するmRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離した核酸配列、それらの相補体、またはその一部を検出するための物質、
    を含む、キット。
  31. 請求項30に記載のキットにおいて、
    前記配列番号が、表2および/または表3の配列番号である、キット。
  32. 請求項30に記載のキットにおいて、
    前記配列番号が、表2および/または表4に記載されている、キット。
  33. 請求項30に記載のキットにおいて、
    マイクロアレイ解析を行うための試薬、
    をさらに含む、キット。
  34. 請求項30に記載のキットにおいて、
    媒体であって、この媒体を通して、前記核酸配列、それらの相補体、またはその一部がアッセイされる、媒体、
    をさらに含む、キット。
  35. 乳癌の状態を判断するための物品において、
    表2、表3、および/または表4に記載の配列番号に一致するmRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離した核酸配列、それらの相補体、またはその一部を検出するための物質、
    を含む、物品。
  36. 請求項35に記載の物品において、
    前記配列番号が、表2および/または表3の配列番号である、物品。
  37. 請求項35に記載の物品において、
    前記配列番号が、表2および/または表4に記載されている、物品。
  38. 請求項35に記載の物品において、
    マイクロアレイ解析を行うための試薬、
    をさらに含む、物品。
  39. 請求項35に記載の物品において、
    媒体であって、この媒体を通して、前記核酸配列、それらの相補体、またはその一部がアッセイされる、媒体、
    をさらに含む、物品。
  40. マイクロアレイ、または遺伝子チップにおいて、
    請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法を実施するための、マイクロアレイ、または遺伝子チップ。
  41. 請求項40に記載のマイクロアレイにおいて、
    表2、表3、および/または表4に記載の配列番号に一致するmRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離した核酸配列、その相補体、またはその一部、
    を含む、マイクロアレイ。
  42. 請求項41に記載のマイクロアレイにおいて、
    cDNAアレイ、またはオリゴヌクレオチドアレイ、
    を含む、マイクロアレイ。
  43. 請求項41に記載のマイクロアレイにおいて、
    1つ以上の内部コントロール試薬、
    をさらに含む、マイクロアレイ。
  44. 診断/予後診断のポートフォリオにおいて、
    表2、表3、および/または表4に記載の配列番号に一致するmRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離した核酸配列、その相補体、またはその一部、
    を含む、ポートフォリオ。
JP2008505567A 2005-04-04 2006-04-03 乳房の腫瘍のレーザーマイクロダイセクションおよびマイクロアレイ解析が、エストロゲン受容体に関係する遺伝子および経路を明らかにする Pending JP2008538284A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US66800505P 2005-04-04 2005-04-04
PCT/US2006/013004 WO2006108135A2 (en) 2005-04-04 2006-04-03 Laser microdissection and microarray analysis of breast tumors reveal estrogen receptor related genes and pathways

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2008538284A true JP2008538284A (ja) 2008-10-23

Family

ID=37074106

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008505567A Pending JP2008538284A (ja) 2005-04-04 2006-04-03 乳房の腫瘍のレーザーマイクロダイセクションおよびマイクロアレイ解析が、エストロゲン受容体に関係する遺伝子および経路を明らかにする

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20080305959A1 (ja)
EP (1) EP1874960A2 (ja)
JP (1) JP2008538284A (ja)
CN (1) CN101965190A (ja)
BR (1) BRPI0607874A2 (ja)
CA (1) CA2603898A1 (ja)
MX (1) MX2007012395A (ja)
WO (1) WO2006108135A2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019527544A (ja) * 2016-06-30 2019-10-03 キャピタルバイオ コーポレーションCapitalBio Corporation 分子マーカー、参照遺伝子、及びその応用、検出キット、並びに検出モデルの構築方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010088498A1 (en) * 2009-01-30 2010-08-05 Bayer Healthcare Llc Methods for treating estrogen receptor positive cancer by x-box binding protein 1 inhibition
DE102012207240A1 (de) * 2012-05-02 2013-11-07 Leica Microsystems Cms Gmbh Laser-Mikrodissektionsgerät und -verfahren
CN110205322B (zh) * 2017-02-24 2020-12-08 北京致成生物医学科技有限公司 一种乳腺癌致病基因sec63的突变snp位点及其应用
US20180251849A1 (en) * 2017-03-03 2018-09-06 General Electric Company Method for identifying expression distinguishers in biological samples
KR102071491B1 (ko) * 2017-11-10 2020-01-30 주식회사 디시젠 차세대 염기서열분석을 이용한 기계학습 기반 유방암 예후 예측 방법 및 예측 시스템

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002072828A1 (fr) * 2001-03-14 2002-09-19 Dna Chip Research Inc. Procede permettant de prevoir un cancer
WO2002092854A2 (en) * 2001-05-16 2002-11-21 Novartis Ag Genes expressed in breast cancer as prognostic and therapeutic targets
JP2004344171A (ja) * 2003-04-24 2004-12-09 Veridex Llc 乳癌予後予測法

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5700637A (en) * 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
GB8822228D0 (en) * 1988-09-21 1988-10-26 Southern E M Support-bound oligonucleotides
US5527681A (en) * 1989-06-07 1996-06-18 Affymax Technologies N.V. Immobilized molecular synthesis of systematically substituted compounds
US5143854A (en) * 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5242974A (en) * 1991-11-22 1993-09-07 Affymax Technologies N.V. Polymer reversal on solid surfaces
US5384261A (en) * 1991-11-22 1995-01-24 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis using mechanically directed flow paths
US5412087A (en) * 1992-04-24 1995-05-02 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of oligonucleotides and other biological polymers on surfaces
US5554501A (en) * 1992-10-29 1996-09-10 Beckman Instruments, Inc. Biopolymer synthesis using surface activated biaxially oriented polypropylene
US5472672A (en) * 1993-10-22 1995-12-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Apparatus and method for polymer synthesis using arrays
US5429807A (en) * 1993-10-28 1995-07-04 Beckman Instruments, Inc. Method and apparatus for creating biopolymer arrays on a solid support surface
US5571639A (en) * 1994-05-24 1996-11-05 Affymax Technologies N.V. Computer-aided engineering system for design of sequence arrays and lithographic masks
US5556752A (en) * 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US5599695A (en) * 1995-02-27 1997-02-04 Affymetrix, Inc. Printing molecular library arrays using deprotection agents solely in the vapor phase
US5624711A (en) * 1995-04-27 1997-04-29 Affymax Technologies, N.V. Derivatization of solid supports and methods for oligomer synthesis
US5545531A (en) * 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
US5658734A (en) * 1995-10-17 1997-08-19 International Business Machines Corporation Process for synthesizing chemical compounds
US6136182A (en) * 1996-06-07 2000-10-24 Immunivest Corporation Magnetic devices and sample chambers for examination and manipulation of cells
US6218114B1 (en) * 1998-03-27 2001-04-17 Academia Sinica Methods for detecting differentially expressed genes
US6004755A (en) * 1998-04-07 1999-12-21 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Quantitative microarray hybridizaton assays
US6218122B1 (en) * 1998-06-19 2001-04-17 Rosetta Inpharmatics, Inc. Methods of monitoring disease states and therapies using gene expression profiles
US6271002B1 (en) * 1999-10-04 2001-08-07 Rosetta Inpharmatics, Inc. RNA amplification method

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002072828A1 (fr) * 2001-03-14 2002-09-19 Dna Chip Research Inc. Procede permettant de prevoir un cancer
WO2002092854A2 (en) * 2001-05-16 2002-11-21 Novartis Ag Genes expressed in breast cancer as prognostic and therapeutic targets
JP2004344171A (ja) * 2003-04-24 2004-12-09 Veridex Llc 乳癌予後予測法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019527544A (ja) * 2016-06-30 2019-10-03 キャピタルバイオ コーポレーションCapitalBio Corporation 分子マーカー、参照遺伝子、及びその応用、検出キット、並びに検出モデルの構築方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2006108135A2 (en) 2006-10-12
CA2603898A1 (en) 2006-10-12
MX2007012395A (es) 2008-04-14
WO2006108135A9 (en) 2009-10-15
US20080305959A1 (en) 2008-12-11
CN101965190A (zh) 2011-02-02
EP1874960A2 (en) 2008-01-09
WO2006108135A8 (en) 2007-11-15
BRPI0607874A2 (pt) 2009-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5089993B2 (ja) 乳癌の予後診断
US7901881B2 (en) Diagnostic tool for diagnosing benign versus malignant thyroid lesions
JP4938672B2 (ja) p53の状態と遺伝子発現プロファイルとの関連性に基づき、癌を分類し、予後を予測し、そして診断する方法、システム、およびアレイ
Bertucci et al. Gene expression profiling of primary breast carcinomas using arrays of candidate genes
JP5295761B2 (ja) 甲状腺穿刺吸引分子分析
US8349555B2 (en) Methods and compositions for predicting death from cancer and prostate cancer survival using gene expression signatures
US8183353B2 (en) Breast cancer prognostics
JP2008521412A (ja) 肺癌予後判定手段
EP1526186B1 (en) Colorectal cancer prognostics
US20170073758A1 (en) Methods and materials for identifying the origin of a carcinoma of unknown primary origin
WO2007035676A2 (en) Methods and materials for identifying the origin of a carcinoma of unknown primary origin
US20170211155A1 (en) Method for predicting risk of metastasis
JP2007049991A (ja) 乳癌の骨への再発の予測
CA2504403A1 (en) Prognostic for hematological malignancy
CA2781955A1 (en) Multi drug response markers for breast cancer cells
US20050186577A1 (en) Breast cancer prognostics
JP2008538284A (ja) 乳房の腫瘍のレーザーマイクロダイセクションおよびマイクロアレイ解析が、エストロゲン受容体に関係する遺伝子および経路を明らかにする
US20050048494A1 (en) Colorectal cancer prognostics
JP4886976B2 (ja) 結腸直腸のガンの予後予測
Febbo et al. Use of expression analysis to predict outcome after radical prostatectomy
Nguyen et al. Lung cancer staging in the genomics era

Legal Events

Date Code Title Description
RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20081212

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20090129

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20111018

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20120313