JP5943315B2 - メラノーマ癌の予後予測 - Google Patents
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Description
本出願は、2007年5月24日に出願されたニュージーランド仮特許出願第555363号の利益を主張し、それは全体において参照によって組み込まれる。
ある態様では、予後の良好なメラノーマおよび予後の悪い(poor)メラノーマにおいてディファレンシャルに発現されることが同定されたマーカー遺伝子のセットが提供される。この遺伝子のセットは、患者におけるメラノーマの進行速度を予測することができる2つ以上のマーカーを含む予後シグネチャーを発生させるのに使用することができる。
(i)患者からのメラノーマ腫瘍サンプルにおいてメラノーマ予後マーカー(MPM)の発現レベルまたは2つ以上のMPMを含む予後シグネチャーの発現レベルを決定し、
(ii)予後が良好な腫瘍サンプルおよび予後が悪い腫瘍サンプルにおけるMPMの発現レベルまたは予測シグネチャー(predictive signature)の発現レベルに予測方法をアプリケーションすることにより確立された予測モデルをアプリケーションし、
(iii)予後を確立する
工程を含む方法を提供する。
(i)患者からのメラノーマ腫瘍サンプルにおいてMPMの発現レベルまたは2つ以上のMPMを含む予後シグネチャーの発現レベルを決定し、
(ii)予後が良好な腫瘍サンプルおよび予後が悪い腫瘍サンプルにおけるMPMの発現レベルまたは予測シグネチャーの発現レベルに予測方法をアプリケーションすることにより確立された予測モデルをアプリケーションし、
(iii)試験に対する患者の適性を確立する、
工程を含む方法も提供する。
本発明の具体的態様及び図に関して記載する。
定義
本発明の態様を詳細に説明する前に、本明細書で使用される用語のいくらかの定義を与えることは有用であろう。
「感受性」は、ボジティブであることが(モデルにより)予測もされる真にポジティブなサンプルの割合を意味する。メラノーマの予後の検定においては、それは、良好であることがモデルにより予測された良好な予後を有する腫瘍の割合であろう。「特異性」または「選択性」は、ネガティブであることが(モデルによって)予測もされる真にネガティブなサンプルの割合を意味する。メラノーマの予後の検定においては、これは、モデルにより悪いことが予測される悪い予後を有するサンプルの割合に等しい。「分類率」は、予測モデルにより正確に分類されるすべてのサンプルの割合である(ポジティブまたはネガティブとしてのそれである)。
「0000」
用語「癌」および「癌性」(cancerous)は、典型的には異常なまたは調節されていない細胞増殖により特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指すかまたは説明する。癌および癌病理学は、例えば、転移、隣接細胞の正常な機能を果たすことの妨害、異常なレベルでのサイトカインまたは他の分泌産物の放出、炎症性または免疫学的応答の抑制または悪化、新形成、前悪性疾患、悪性疾患、周囲のまたは離れている組織または器官、たとえばリンパ節等の浸潤と関連していることができる。特にメラノーマが含まれる。
下記のアプローチは、MPMファミリーメンバーを含む増殖マーカーを検出するのに使用することができる非限定的方法である:MPMについて選択的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するマイクロアレイアプローチ;MPM特異的プライマーおよびプローブを使用する腫瘍サンプルに関するリアルタイムqPCR;MPM特異的プライマーおよびプローブを使用するリンパ節、血液、血清、糞便または尿サンプルに関するリアルタイムqPCR;酵素結合免疫学的アッセイ(ELISA);抗マーカー抗体を使用する免疫組織化学;およびコンピュータを使用するアレイまたはqPCRデータの分析。
上記した技術のなかで、最も感受性のそして最も柔軟性の定量的方法は、RT−PCRであり、これは、薬物処理してもしくは薬物処理しないで、正常な組織および腫瘍組織における異なるサンプル母集団においてRNAレベルを比較し、発現のパターンを特徴付け、密接に関連したRNAs間で識別しそしてRNA構造を分析するのに使用されうる。
RT−PCR技術のより最近の変化は、リアルタイム定量的PCRであり、これは、二重標識された蛍光発生プローブ(fluorigenic probe)(即ち、TaqManプローブ)によるPCR産物蓄積を測定する。リアルタイムPCRは定量的競合PCRおよび定量的比較PCRの両方と適合性である。前者は正規化のために各ターゲット配列のための内部競合体を使用し、後者は、サンプル内に含有される正規化遺伝子またはRT−PCRのためのハウスキーピング遺伝子を使用する。更なる詳細は、例えば、Held et al., Genome Research 6: 986-994(1996)により与えられる。
ディファレンシャルな発現は、マイクロアレイ技術によって同定または確認することもできる。したがって、MPMの発現プロフィルは、マイクロアレイ技術を使用して新しい腫瘍組織またはパラフィン包埋された腫瘍組織のいずれかにおいて測定することができる。この方法では、関心のあるポリヌクレオチド配列(cDNAsおよびオリゴヌクレオチドを含む)をマイクロチップ基材上にプレートまたはアレイする。次いでアレイされた配列(即ち捕捉プローブ)を関心のある細胞または組織からの特異的ポリヌクレオチド(即ち、ターゲット)とハイブリダイゼーションさせる。丁度RT−PCR法におけると同じく、RNAのソースは、ヒト腫瘍もしくは腫瘍細胞系および対応する正常な組織もしくは細胞系から単離されたトータルRNAである。したがって、RNAは、種々の原発性腫瘍または腫瘍細胞系から単離することができる。RNAのソースが原発性腫瘍であるならば、RNAは、例えば、毎日の臨床実施においてルーチンに調製されそして保存されている、凍結されまたは保管された、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された(FFPE)組織サンプルおよび固定された(例えば、ホルマリン固定された)組織サンプルから抽出されうる。
mRNA抽出のための一般的方法は、当技術分野で周知でありそしてAusubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons(1997)を含む分子生物学の標準方法に開示されている。パラフィン包埋された組織からのRNA抽出のための方法は、例えば、Rupp and Locker, Lab Invest. 56: A67(1987)およびDe Sanders et al., BioTechniques 18: 42044(1995)に開示されている。特に、RNA単離は、Quiagenなどの商業的製造者からの精製キット、バッファーセットおよびプロテアーゼを使用して、製造者のインストラクションに従って行うことができる。例えば、培養物中の細胞からのトータルRNAは、Quiage RNeasyミニカラムを使用して単離されうる。他の市販のRNA単離キットは、MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit(EPICENTRE(D, Madison, WI)およびParaffin Block RNA Isolation Kit(Ambion, Inc)を含む。組織サンプルからのトータルRNAは、RNA Stat-60(Tel-Test)を使用して単離されうる。腫瘍から調製されたRNAは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心により単離されうる。
免疫組織化学法は、本発明の増殖マーカーの発現レベルを検出するのにも適当である。したがって、各マーカーに対して特異的な抗体もしくは抗血清、好ましくはポリクローナル抗血清、最も好ましくはモノクローナル抗体が発現を検出するのに使用される。抗体は、例えば、放射性標識、蛍光標識、ハプテン標識、例えばビオチンまたは酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼによる、抗体自体の直接標識化により検出されうる。あるいは、標識されていない第一抗体を、第1抗体に対して特異的な、抗血清、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を含む標識された第二抗体と共に使用する。免疫組織化学プロトコールおよびキットは、当技術分野で周知でありそして市販されている。
有意と思われる遺伝子の選択への早期のアプローチは、関心のある2つのグループ間での所与の遺伝子の「倍率変化」(fold change)を単に調べることを含んでいた。このアプローチは、最も劇的に変化すると思われる遺伝子に関して効果があるが、基本的統計学の考察は、分散(またはノイズレベル)が極めて高い(しばしばマイクロアレイ実験でみられるとおり)ならば、みかけは大きい倍率変化がただ偶然によるだけでしばしば起こりうることを認識させる。
検定(t検定などの)は十分ではない。何故ならば、これは、数千の実験(この状況では、各遺伝子は「実験」を構成する)の群において、少なくとも1つの実験が偶然によるだけで通常の判断基準を通過する確率は本質的に一つ(unity)であるからである。有意についての検定において、典型的には、「帰無仮説」が正しいという確率を計算する。2つのグループを比較する場合に、帰無仮説は、2つのグループ間に差はないということである。統計的な検定がある閾値(通常0.05または0.01)以下で帰無仮説について確率を生じるならば、我々は帰無仮説を拒絶することができそして2つのグループは有意に異なるという仮説を受け入れることができるといわれる。明らかに、このような検定では、偶然のみによる帰無仮説の拒絶が20回に1回(または100回に1回)期待されうる。有意についてのt検定のまたは他の同様な統計的検定の使用は、マイクロアレイに関しては、あまりにも多くの偽陽性(または第1種の過誤)を生じることになる。
データマイニングは、「知識」の抽出、換言すれば(通常)大容量のデータ(データセット)からの「ノーハウ」または予測能力を説明するために使用される用語である。これは、予後シグネチャーを発生させるのにこの研究で使用されたアプローチである。この研究の場合に、「ノーハウ」は、遺伝子発現測定またはシグネチャー(この節で一般的に述べられそして実施例の節で更に詳細に述べられた)の所与のセットから予後を正確に予測する能力である。
●データ表示
これは、選ばれたーデータマイニング技術で最も成功的に働きそうな形態にデータを変換することを含む。調査されるべきデータが遺伝子発現の相対的レベルを表すこの研究におけるように、データが数値である場合には、これは非常に簡単である。データが大きなダイナミックレンジを含むならば(即ち、多くの桁の大きさ)、しばしばデータの対数が採用される。別々の研究者による、別々の日の別々のサンプルの多くの測定値を含むならば、系統誤差が最小になることを確実にするよう、特に注意しなければならない。系統誤差(即ち、プロトコール差、機械差、オペレーター差および他の定量可能な因子から生じる誤差)の最小化は、ここでは「正規化」と呼ばれるプロセスである。
典型的には、データセットは、日々の基準で測定するのに実際的であるよりも多くのデータエレメントを含有し、そして更に予測モデルを作成するのに必要な情報を与えない多くのエレメントを含有する。予測モデルのデータセットを説明する実際の能力は、データセットの全次元(full dimensionality)のいくらかのサブセットから誘導される。これらの次元はデータセットの最も重要な成分(または特徴)である。マイクロアレイデータに関しては、データセットの次元は個々の遺伝子であることに留意されたい。ここで述べた文脈において、特徴選択は、最も「ディファレンシャルに発現される」これらの遺伝子を発見することを含む。より一般的な意味においては、それは、有意についてのいくらかの統計的検定に通るこれらのグループを含む、即ち、調査されているグループの一方もしくは他方において一貫してより高いかまたはより低い特定の変数のレベルである。時には、特徴は、最も大きい分散を示すこれらの変数(または次元)である。
一旦クラス例えば、良好な予後/悪い予後)および選択の特徴が確立されそしてデータがデータマイニングのためのインプットとして受け入れ可能な形態で表示されると、縮小したデータセット(特徴で述べられたとおりの)を選択された予測モデルにアプリケーションする。このモデルのためのインプットは、関連したアウトプット(クラス標識または応答)とともに、通常多次元数値インプット(ベクトルとして知られた)の形態にある。トレーニングプロセスにおいては、選択されたデータは、順次に(ニューラルネットワークなどの技術において)またはまとめて(線形モデル、線形判別分析、サポートベクターマシンなどのいくつかの回帰を適用する技術において)予測モデルにインプットされる。ある場合には(例えばk最近傍)、データセット(または特徴選択の後に得られたデータセットのサブセット)は、それ自体モデルである。論議されたとおり、有効なモデルは、成功的結果を最ももたらしそうであるとエキスパートアナリストによりモデルのパラメーターが 予め決定されている種々のソフトウエアパッケージの使用により、詳細な数学の最小の理解で確立されうる。
これは、データマイニングプロトコールのキー成分であり、そしてこれの誤ったアプリケーションは、しばしば誤りに導く。データセットの一部は、予測モデルの成功を検定するために、特徴選択およびトレーニングとは別に、取っておくべきである。更に、パリデーションの結果がモデルの特徴選択およびトレーニングを行うのに使用されるならば、モデルが実生活の状況にアプリケーションされる前に、モデルを検定するための更なるバリデーションセットが得られる。このプロセスが厳密にモデルに忠実でない(not adhered)ならば、モデルは、実世界の状況において失敗する可能性が高い。バリデーションの方法は以下に更に詳細に述べられる。
モデルが構築されそしてバリデーションされると、それはエンドユーザーに受け入れられうるような方法でパッケージされなければならない。これは、しばしば、モデルが埋め込まれているスプレッドシートアプリケーションのある形態の実装、統計的ソフトウエアパッケージのスクリプティング、または情報技術スタッフによるハードコーデッドアプリケーション(hard-corded application)へのモデルのリファクタリングを含む。
多数のベンダーから得られるスプレッドシートプラグイン(spreadsheat plugins)、
統計的環境R(R statistical environment)、
市販のパッケージMatlab、 S-Plus、 SAS、 SPSS、 STATA、
フリーオープンソースソフトウエア(free open-source software)、例えばOctave(MatLabクローン)
市販のクローズドソースセッティング(closed-source setting)における予測モデルを実装するのに使用されうる多くのおよび多様なC++ライブラリー。
本発明の方法は、最初にデータマイニング(上記)の工程を引き受け、次いで適切な既知のソフトウエアパッケージをアプリケーションすることにより行うことができる。データマイニングのプロセスの更なる説明は多くの極めてよく書かれているテキストに詳細に記載されている19。
データは、線形回帰モデルのインプットとして処理され、そのクラス標識または応答変数はアウトプットである。クラス標識または他のカテゴリーデータは、数値(通常整数)に変換されなければならない。一般化された線形モデルにおいては、クラス標識または応答変数は、それ自体はインプットデータに線形で関係していないが、「連結関数」の使用により変換される。ロジスティック回帰は、一般化された線形モデルの最も普通の形態である。
データが線形に分離可能である(即ち、データのグループまたはクラスが、閾値のn次元拡張である超平面により分離されうる)との条件下で、この技術は適用されうる。変数の組み合わせは、グループ間分散が最大化されそしてグループ内分散が最小になるように、クラスを分離するのに使用される。この副産物は、分類ルールの形成である。未知のクラスのサンプルへのこのルールの適用は、クラス所属関係の予測または分類がそのサンプルについてなされることを可能とする。マイクロアレイ分析のために普通に使用されるニアレストシュランケンセントロイド(nearest shrunken centroids)などの線形判別分析の変形もある。
変数のコレクションを重量のコレクションとともに使用してこれらの重り付き変数によってクラス間の分離を最大化するモデルを決定する。次いでこのモデルのサンプルへの適用は、そのサンプルの分類またはクラス所属関係の予測を生じさせる。
データは、ノードのネットワークへのインプットとして処理され、ノードのネットワークは、表面的には生物学的ニューロンに似ており、インプットをすべてのノードからそれらが連結されているノードにアプリケーションし、そしてインプットをアウトプットに変換する。普通は、ニューラルネットワークは、「乗算および和算アルゴリズム」(multiply and sum algorithm)を使用して、多数の接続されたインプットノードからのインプットをシングルアウトプットに変換する。ノードは、そのノードへのインプットがある閾値を超えないならば、必ずしもアウトプットを生成しなくてもよい。各ノードは、そのインプットとしていくつかの他のノードからのアウトプットを有し、最終アウトプットノードは通常カテゴリー変数に連結されている。ノードの数およびノードのトポロジーは、殆ど無限に変わることができ、他の方法では分類することができないことがある非常にノイズのあるデータを分類する能力を与える。ニューラルネットワークの最も普通の実装は、多層パーセプトロンである。
これらにおいては、変数は、段階的方式でたどられる(followed)ことができるルールの階層制(hierarchy of rules)を規定して、サンプルのクラスを決定するのに使用される。典型的なプロセスは、特定のクラスアウトプットまたは識別できないことの特定の説明をもたらすルールのセットを創り出す。例としての分類木は、下記のようなアルゴリズムの実装である。
if gene A> x and gene Y> x and gene Z=z
then
class A
else if gene A=q
then
class B
予測または分類は、サンプル(未知のクラスの)をその周囲のサンプル(既知のクラスの)と比較することによりなされ、近さ(closeness)は距離関数により定義される。多くの異なる距離関数を定義することが可能である。普通に使用される距離関数は、ユークリッド距離(三角測量におけるようにピタゴラスの距離のn次元への拡張、種々の形態の相関(ピアソン相関係数を含む)である。普通は意味のある距離メトリック(meaningful distance metric)により相互連結されないデータ点を、ユークリッド距離が適用されうるように、ユークリッド空間に変換する変換関数もある(例えばマハラノビス距離)。距離メトリックは極めて複雑でありうるけれども、k最近傍の基本的前提は極めて単純であり、本質的に未知のインプットに最も類似したkデータベクトルを「発見することの」言い換えであり、それらがどのクラスに対応するかを発見し、そして未知のインプットがどのクラスであるかに関して票決する(vote)。
ベイジアンネットワーク
有向非環式グラフ(directed cyclic graph)を使用して変数のコレクションをそれらの同時確率分布(joint probability distribution)と共に表示し、次いでこれを使用してサンプルのクラス所属関係の確率を決定する。
独立したシグナル(例えばクラス所属関係)が変数のコレクシヨンから分離される(成分に)独立成分分析。次いでこれらの成分を使用して、サンプルのクラス所属関係の分類または予測を作成することができる。
予測方法のコレクションを組み合わせてサンプルのクラス所属関係の同時分類または予測(joint classification or prediction) を作成するアンサンブル学習法。
説明した予測方法のいずれかのアプリケーションは、この方法を新しいデータセット(例えば臨床試験からのデータ)にアプリケーションすることができる前に、トレーニングとクロスバリデーション12,26の両方を伴う。トレーニングは、関心のあるデータセット(この場合にメラノーマからの遺伝子発現測定値)のサブセットを、それが検定されるべきクラス(この場合に急速な進行の良好な尤度または悪い尤度を有する腫瘍)を横切って階層化されるように、採用することを含む。このトレーニングセットを使用して予測モデル(上記した)を発生させ、これはデータの残り検定セット)に関して検定される。
これらのマーカーの1つ以上を含む予後シグネチャーを使用して、シグネチャー由来の1つ以上の予測モデルのアプリケーシヨンにより患者のアウトカムを決定することができる。特に、臨床医または研究者は、シグネチャーにおける1つ以上のマーカーのディファレンシャルな発現(例えば、増加した発現または減少した発現)を決定し、予測モデルをアプリケーションし、それによりネガティブな予後、例えば患者の疾患再発の尤度、またはポジティブな予後(連続した寛解)の尤度を決定することができる。
本発明は、特定の薬物試験のための個体を選択するのに使用することもできる。メラノーマを有する個体の予後を確立することにより、患者が応答しそうな慣用の処置を受けるべきかどうか、または患者が特定の薬物試験に参加するべきかどうか、即ち、特定の腫瘍タイプもしくは腫瘍段階を目標とするべきかどうかに関してより良い決定をすることができる。
ここに述べられた実施例は、本発明の態様を説明する目的のためである。他の態様、方法および分析のタイプは、分子診断技術分野における当業者の範囲内にあり、ここで詳細に述べる必要はない。当技術分野の範囲内の他の態様は、本発明の一部であると考えられる。
マイクロアレイ分析のための標本採集および選択
行われた実験の全体的なスキームを図3に示す。Austin Healthで1997〜2004年の間に臨床的に触診可能な節の外科リンパ節切除を受けた29人の患者からのex vivoメラノーマ組織をマイクロアレイ分析のために選択した。すべての標本は、Austin Healthヒト調査倫理委員会により認可された組織入手プロトコールの下にそして各患者の書面のインフォームドコンセントを伴って採集された。急に凍結した標本を最適切削温度化合物(OCT)中に包埋しそしてLudwig/Austin組織バンク貯蔵室内に−80℃で組織ブロックとして貯蔵した。すべての場合に診断は病理学者により確認された。
cDNA合成および共通の参照デザインとのハイブリダイゼーションを29人の選択された患者について二重に(in duplication)行った。トータルRNAを、OCT包埋した組織から、組織切片をTri試薬(Molecular Research Center, Cincinnati, OH)中に浸漬および均質化することにより抽出し、クロロホルム1.5mLを均質化物に加え、サンプルを遠心しそして上部層を取り出し、そして100%エタノールと混合した。RNeasyカラムを使用する精製を、製造者のインストラクション(Quiagen, Valencia, CA)に従って行った。RNA品質を260:280吸光度の比に基づいて確認し、そしてインテグリティーをrRNA標準マーカーに対してホルムアルデヒド−アガロースゲル上で検査した。オリゴ(dT)およびアミノアリルデオキシヌクレオチドの存在下にRNA20μgからcDNAを合成した。Cy染料(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)を腫瘍cDNAおよび並行して産生された参照cDNAにカップリングさせた。参照cDNAをメラノーマを含む種々の腫瘍および細胞系からのプールされたRNAおよび正常な組織からのプールされたRNAから合成した(図4)。
個々の遺伝子および内部コントロールを表す30,888のオリゴヌクレオチドプローブを、MWG Biotech(Erbesberg, Germany)から入手し、そしてOmnigridロボット(Gene Machines, San Carlos, CA)を使用して高密度アレイとしてスポットした。標識された腫瘍/参照cDNAを共ハイブリダイゼーションし、そしてGenepix 4000Aマイクロアレイスキャナー(Axon Insruments, Union City, CA)を使用してスキャニングした。マトリックスオーバーレイをスキャニングされたイメージにアラインさせ、そして特徴抽出を、Gene Pix v.6.0ソフトウエア(Axon Insruments, Foster City, CA) を使用して行った。生のデータをGeneSpring v7.2(Silicon Genetics, Redwood City, CA)を使用して分析した。データをプリントチップグループ(print-tip group)に対して正規化し、次いでメディアン正規化した(median normalized)。簡単にいえば、lowess曲線を対数密度プロット対対数比プロットに適合させた。データの20%を使用して各点におけるlowess適合を計算した。この曲線を使用して各測定値についてコントロール値を調節した。次いで各遺伝子をすべてのサンプルにおけるその測定値のメデイアンにより除した。
遺伝子発現データを、最初に、すべてのサンプルにおいて存在しなかったプローブを排除するフィルターに供した。考慮された最初の30,888のプローブの内、18,807はこのフィルターに通しそして分散分析、階層的クラスタリング(hierarchical clustering)および主成分分析のために使用された。ディファレンシャルに発現された遺伝子は、0.05のp値カットオフに基づく多重検定補正(multiple testing correction)のために補正するのに使用されるBenjamini and Hochbergの偽発見率制御方法(false discovery rate controlling method)28と共に、ウイルコクソン−マン−ホイットニー検定(Wilcoxon-Man-Whitney test)を行うことにより発見された。サンプルの階層的クラスタリングは、距離関数としてスピアマン相関(Spearman correlation) および平均リンケージ(average link)を使用して行われた。
アレイ結果を確かめるためにディファレンシャルに発現された遺伝子に関してqPCRを行い、次いでバリデーションセットAを使用して予測子をバリデーションするのに行った。第1鎖cDNAを、ランダムヘキサマープライマー(Promega, Madison, WI)を使用して、アレイ実験のために抽出されたトータルRNA2μgから合成した。逆転写を省くことによりネガティブコントロールを得た。Universal Probe Library アッセイデザインセンターhttps://www.roche-applied-science.com(Roche, Mannheim, Germany) を使用して、イントロンスパニングマルチプレックスアッセイをqPCRのためにデサインした(アッセイデザインについては図5参照)。すべての反応は、ABI 7700配列検出器(Applied Biosystems, Foster City,CA)を使用して二重に行った。サーマルサイクラー条件は、下記のとおりであった:50℃2分間、95℃10分間、続いて40サイクルの94℃で20秒および60℃で45秒。すべての結果を18S増幅に対して正規化した(Applied Biosystems, Foster City, CA)。本発明者らは、本発明者らのコンパレーターとして参照のためのターゲット閾値(CT)の値を使用して相対的発現を計算した29。
検定セットおよびバリデーションセットAに含まれた患者の臨床的特徴および病理学的特徴を列挙する(図6)。全ての患者は、最初の診断時の年齢、性およびポジティブなリンパ節転移の数および位置に関する情報を有していた。すべてではない患者が本発明者らの病院で初期診断をされ、それ故いくらかの症例では原発性メラノーマにおいて潰瘍化が存在していたかどうかを確かめることはできなかった。原発性メラノーマにおける潰瘍化は、もし存在するならば疾患をIIIBからIIICに段階を上げる独立した予後因子である30。
教師なしの階層的クラスタリングは、予後とも他の臨床的情報とも相関しないメラノーマのサブグループを示さなかった。これはサンプル間の類似性を考えると予期されたことであった。予後グループを有効に分離することができた遺伝子を調査するために、ディファレンシャルな遺伝子発現を調べた。2,140の遺伝子が2つのグループ間でディファレンシャルに発現されたが、しかしながら、多重検定補正の厳格な適用は、これを高度に有意なディファレンシャルな発現を有する22の遺伝子に減少させた(図1)。22の遺伝子を、qPCRを使用してトレーニングセットにおいて更にバリデーションし、そして2つのプラットフォーム間で最も高い相関係数を有する遺伝子(r>0.5、p<0.05)が更なる分析のために選ばれた(データは示されていない)。最初の22の内、15の遺伝子は高いクロスプラットホーム相関(cross-platform correlation)を示し、そしてこれらは予測スコアの開発のために使用された。主成分分析は、15の遺伝子の予後グループを分離する能力を証明した(図7)。
最初の検定セットを使用して2つの独立したバリデーションセットに関して検定された予測子を開発した。2つの予測アルゴリズムは、アレイデータおよびqPCRデータに基づいて開発された。
qPS=[1328.15-187.42(IDH)+137.10(MFG8)+73.61(PILRA)+211.22(HLA-E)+143.94(TXNDC5)]×-1
aPSに関すると同じく、ポジティブスコアは、この方法を使用して改善されたアウトカムと関連していた。
予期されたとおり、検定セットにアプリケーションされたaPSおよびqPSの両方が、2つの予後グループを識別することができた。個々のスコアの大きさ(aPSによる高いスコアおよびqPSでのネガテイブスコア)がqPSおよびaPSの両方について改善されたアウトカムと相関するような(図8、スピアマン順位相関、r=0.7908、p<0.0001)、個々のスコアとTTPおよび全生存期間との強い相関は明白であった。これは、これらのディファレンシャルに発現された遺伝子の発現レベルが、臨床的アウトカムに直接影響を与える基礎をなす生物学的機序に関係することを示唆しており、それらの予後の妥当性を強調している。
次いで結果を、独立に発生させたデータにアプリケーションした。我々自身に類似した患者のサブグループに関する1つの公表されたデータセットが同定された。この研究27においてプロフィル化された83人の患者の内、14人は長期追跡により段階III疾患を有していた。このサブグループでは、我々の検定セットにおいて適用された同様な基準を使用して、10人の患者は「悪い」として分類され(平均TTP10カ月)、そして4人は「良好」として分類された(平均TTP62カ月)。aPSアルゴリズムをこれらのサンプルにアプリケーションすると、すべての10人の「悪い」患者および4人の「良好な」患者の内2人は正しく予測され、85%の総合的な正しい分類率(overall correct classification rate)を生じる。
この実施例は、マイクロアレイ遺伝子発現データおよびqPCRから誘導された発現プロフィルを使用して段階IIIメラノーマ患者の他の方法では識別できないグループにおける臨床的アウトカムの成功した予測を示す。2つの独立したセットにおいて、15のディファレンシャルに発現された遺伝子に基づく2つの開発された予測スコアアルゴリズムを、マイクロアレイおよびqPCRデータにアプリケーションして、段階IIIB/Cメラノーマを有する患者における臨床的アウトカムを将来的に予測することができることが確立された。
予後癌マーカー、特にメラノーマ予後マーカーに基づく本発明の方法、成分、キットおよび装置は、癌、特にメラノーマの予後および処置のために有用である。
Claims (11)
- 段階IIIB又は段階IIICにある患者におけるメラノーマの予後を決定するために補助する方法であって、下記工程:
(i)患者からのメラノーマ腫瘍サンプルにおいて、乳脂肪球−EGF因子8タンパク質(MFGE8)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ1(NADP+)可溶性(IDH1)、ペアード免疫グロブリン様2型レセプターα(PILRA)、主要組織適合性複合体、クラスI、E(HLA−E)及びチオレドキシンドメイン含有5(TXNDC5)を含むメラノーマ予後マーカー(MPM)の発現レベルを決定する工程、そして
(ii)決定した発現レベルを予測モデルに適用すること
を含み、ここで予測モデルは、式:
qPS=[1328.15-187.42(IDH1)+137.10(MFGE8)+73.61(PILRA)+211.22(HLA-E)+143.94(TXNDC5)]×-1
であり、ゼロより小さいqPSスコアは悪い予後を示し、そしてゼロより大きいqPSスコアは良好な予後を示す、方法。 - MPMの発現レベルを決定する工程が、各遺伝子のmRNAの発現レベルを検出することにより行われる、請求項1に記載の方法。
- MPMの発現レベルを決定する工程が、各遺伝子のcDNAの発現レベルを検出することにより行われる、請求項1に記載の方法。
- MPMの発現レベルを決定する工程が、前記cDNAの少なくとも一部に対して相補的なヌクレオチドを使用して行われる、請求項3に記載の方法。
- MPMの発現レベルを決定する工程が、フォアードプライマーおよびリバースプライマーを使用するqPCR法を使用して行われる、請求項2に記載の方法。
- MPMの発現レベルを決定する工程が、各マーカーのタンパク質の発現レベルを検出することにより行われる、請求項1に記載の方法。
- MPMの発現レベルを決定する工程が、各マーカーのペプチドの発現レベルを検出することにより行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記検出する工程が、各マーカーに向けられた抗体を使用して行われる、請求項6に記載の方法。
- 前記検出する工程が、サンドイッチ型イムノアッセイ法を使用して行われる、請求項6〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項8〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、ポリクローナル抗血清である、請求項8〜9のいずれか一項に記載の方法。
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