JPH0856699A - 腫瘍診断及び予後 - Google Patents
腫瘍診断及び予後Info
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- JPH0856699A JPH0856699A JP22420794A JP22420794A JPH0856699A JP H0856699 A JPH0856699 A JP H0856699A JP 22420794 A JP22420794 A JP 22420794A JP 22420794 A JP22420794 A JP 22420794A JP H0856699 A JPH0856699 A JP H0856699A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 生物サンプル中でタンパク質チロシンホスフ
ァターゼα（ＰＴＰα）又はＰＴＰα核酸を検出するこ
とからなる結腸直腸癌のような癌の診断又は予後方法及
びキットを提供する。 【構成】 新生物又は潜在的に新生物の疑いのある組織
から採取した第１の生物サンプル中のＰＴＰα又はＰＴ
Ｐα核酸レベルを正常組織から採取した第２の生物サン
プル中のレベルに比較することからなる。
ァターゼα（ＰＴＰα）又はＰＴＰα核酸を検出するこ
とからなる結腸直腸癌のような癌の診断又は予後方法及
びキットを提供する。 【構成】 新生物又は潜在的に新生物の疑いのある組織
から採取した第１の生物サンプル中のＰＴＰα又はＰＴ
Ｐα核酸レベルを正常組織から採取した第２の生物サン
プル中のレベルに比較することからなる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は癌、特に結腸直腸癌の診
断及び予後に係る。
断及び予後に係る。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】結腸直
腸癌形成に至る腫瘍形成プロセスは多重遺伝子改変を伴
う（Ｆｅａｒｏｎら（１９９０） Ｃｅｌｌ ６１，
７５９−７６７）。ｐ５３、ＤＣＣ及びＡＰＣのような
腫瘍サプレッサー遺伝子は、典型的には１つの対立遺伝
子の遺伝子欠失と第２の対立遺伝子の点突然変異との組
み合わせにより結腸直腸癌で不活性化されることが多い
（Ｂａｋｅｒら（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
４，２１７−２２１； Ｆｅａｒｏｎら（１９９０）
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７，４９−５６； Ｎｉｓｈｉｓ
ｈｏら（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３，６６５
−６６９；及びＧｒｏｄｅｎら（１９９１） Ｃｅｌｌ
６６， ５８９−６００）。最近では、遺伝子安定性
を調節する２つのミスマッチ修復遺伝子の突然変異が家
族性結腸癌に関連付けられた（Ｆｉｓｈｅｌら（１９９
３） Ｃｅｌｌ ７５， １０２７−１０３８； Ｌｅ
ａｃｈら（１９９３） Ｃｅｌｌ７５， １２１５−１
２２５； Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓら（１９９４）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２６３， １６２５−１６２９；及びＢ
ｒｏｎｎｅｒら（１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３６８，
２５８−２６１）。結腸直腸癌ではｍｙｃ及びｒａｓ
のような原腫瘍遺伝子が改変され、癌の６５％でｃ−ｍ
ｙｃ ＲＮＡが過剰発現され（Ｅｒｉｓｍａｎら（１９
８５） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５， １９６９
−１９７０）、癌の５０％では点突然変異によるｒａｓ
活性化が生じる（Ｂｏｓら（１９８７） Ｎａｔｕｒｅ
３２７， ２９３−２９７；及びＦｏｒｒｅｓｔｅｒ
ら（１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２７， ２９８−３
０３）。ｍｙｂ及びｎｅｕのような他の原腫瘍遺伝子は
著しく低頻度でしか活性化されない（Ａｌｉｔａｌｏら
（１９８４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ８１， ４５３４−４５３８；及びＤ’
Ｅｍｉｌｉａら（１９８９） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ４，
１２３３−１２３９）。すべての結腸直腸腫瘍に共通
の遺伝子改変が見いだされる訳ではないので、このよう
な種々の組み合わせがこれらの腫瘍を引き起こし得ると
予想される。
腸癌形成に至る腫瘍形成プロセスは多重遺伝子改変を伴
う（Ｆｅａｒｏｎら（１９９０） Ｃｅｌｌ ６１，
７５９−７６７）。ｐ５３、ＤＣＣ及びＡＰＣのような
腫瘍サプレッサー遺伝子は、典型的には１つの対立遺伝
子の遺伝子欠失と第２の対立遺伝子の点突然変異との組
み合わせにより結腸直腸癌で不活性化されることが多い
（Ｂａｋｅｒら（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
４，２１７−２２１； Ｆｅａｒｏｎら（１９９０）
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７，４９−５６； Ｎｉｓｈｉｓ
ｈｏら（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３，６６５
−６６９；及びＧｒｏｄｅｎら（１９９１） Ｃｅｌｌ
６６， ５８９−６００）。最近では、遺伝子安定性
を調節する２つのミスマッチ修復遺伝子の突然変異が家
族性結腸癌に関連付けられた（Ｆｉｓｈｅｌら（１９９
３） Ｃｅｌｌ ７５， １０２７−１０３８； Ｌｅ
ａｃｈら（１９９３） Ｃｅｌｌ７５， １２１５−１
２２５； Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓら（１９９４）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２６３， １６２５−１６２９；及びＢ
ｒｏｎｎｅｒら（１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３６８，
２５８−２６１）。結腸直腸癌ではｍｙｃ及びｒａｓ
のような原腫瘍遺伝子が改変され、癌の６５％でｃ−ｍ
ｙｃ ＲＮＡが過剰発現され（Ｅｒｉｓｍａｎら（１９
８５） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５， １９６９
−１９７０）、癌の５０％では点突然変異によるｒａｓ
活性化が生じる（Ｂｏｓら（１９８７） Ｎａｔｕｒｅ
３２７， ２９３−２９７；及びＦｏｒｒｅｓｔｅｒ
ら（１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２７， ２９８−３
０３）。ｍｙｂ及びｎｅｕのような他の原腫瘍遺伝子は
著しく低頻度でしか活性化されない（Ａｌｉｔａｌｏら
（１９８４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ８１， ４５３４−４５３８；及びＤ’
Ｅｍｉｌｉａら（１９８９） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ４，
１２３３−１２３９）。すべての結腸直腸腫瘍に共通
の遺伝子改変が見いだされる訳ではないので、このよう
な種々の組み合わせがこれらの腫瘍を引き起こし得ると
予想される。
【０００３】チロシンリン酸化の増大は細胞増殖を制御
するシグナリング経路における共通要素である。過剰発
現又は突然変異を介するタンパク質チロシンキナーゼ
（ＰＴＫ）の脱調節は、細胞形質転換及び腫瘍形成に重
要な段階として認められており、多数の腫瘍遺伝子がＰ
ＫＴをコードする（Ｈｕｎｔｅｒ（１９８９） Ｏｎｃ
ｏｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆＣａｎｃｅｒ， Ｗｅｉｎｂｅｒ
ｇ編 （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）， ｐｐ．１４７−１７
３）。多数の研究がヒト腫瘍形成におけるＰＴＫの関与
を論じている。結腸直腸癌に関連する活性化ＰＴＫはｃ
−ｎｅｕ（増幅）、ｔｒｋ（転位）並びにｃ−ｓｒｃ及
びｃ−ｙｅｓ（機序未知）を含む（Ｄ’Ｅｍｉｌｉａら
（１９８９）， 上掲； Ｍａｒｔｉｎ−Ｚａｎｃａら
（１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３１９， ７４３−７４
８； Ｂｏｌｅｎら（１９８７） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４， ２２５１−
２２５５； Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔら（１９８９）
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ８３， ２０２５−２
０３３； Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔら（１９９０）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７，
５５８−５６２； Ｔａｌａｍｏｎｔｉら（１９９３）
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ９１， ５３−６
０；及びＰａｒｋら（１９９３） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
８， ２６２７−２６３５）。
するシグナリング経路における共通要素である。過剰発
現又は突然変異を介するタンパク質チロシンキナーゼ
（ＰＴＫ）の脱調節は、細胞形質転換及び腫瘍形成に重
要な段階として認められており、多数の腫瘍遺伝子がＰ
ＫＴをコードする（Ｈｕｎｔｅｒ（１９８９） Ｏｎｃ
ｏｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆＣａｎｃｅｒ， Ｗｅｉｎｂｅｒ
ｇ編 （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）， ｐｐ．１４７−１７
３）。多数の研究がヒト腫瘍形成におけるＰＴＫの関与
を論じている。結腸直腸癌に関連する活性化ＰＴＫはｃ
−ｎｅｕ（増幅）、ｔｒｋ（転位）並びにｃ−ｓｒｃ及
びｃ−ｙｅｓ（機序未知）を含む（Ｄ’Ｅｍｉｌｉａら
（１９８９）， 上掲； Ｍａｒｔｉｎ−Ｚａｎｃａら
（１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３１９， ７４３−７４
８； Ｂｏｌｅｎら（１９８７） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４， ２２５１−
２２５５； Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔら（１９８９）
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ８３， ２０２５−２
０３３； Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔら（１９９０）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７，
５５８−５６２； Ｔａｌａｍｏｎｔｉら（１９９３）
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ９１， ５３−６
０；及びＰａｒｋら（１９９３） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
８， ２６２７−２６３５）。
【０００４】自明の通り、タンパク質チロシンホスファ
ターゼ（ＰＴＰ）も細胞ホスホチロシンレベルの調節に
深く関与する。ＰＴＰの成長群は非レセプター及びレセ
プター様酵素から構成される（Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕ
ら（１９９２） Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．８， ４６３−４９３； 及びＰｏｔら（１９９
２） Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １
１３６， ３５−４３参照）。全ＰＴＰは共通の保存触
媒ドメインを有しており、このようなドメインは非レセ
プターＰＴＰではタンパク質−タンパク質相互作用、細
胞内局在又はＰＴＰ安定性を支配する調節エレメントを
含む近位又は遠位配列にしばしば関連付けられる。レセ
プター様ＰＴＰは通常、細胞内領域に２つの触媒ドメイ
ンを含み、更にトランスメンブラン領域及び不均一細胞
外領域を有する。これらの酵素の比較的保存された細胞
内部分に比較すると、細胞外領域は著しく不均一である
ので、これらのＰＴＰは特定の細胞外因子により調節さ
れると予想されるが、このような因子は未だほとんど同
定されていない。ＰＴＰのうちにはＰＴＫに対抗して作
用し得るものがある。例えば、非レセプターＰＴＰ １
Ｂ及びＴＣ−ＰＴＰは腫瘍遺伝子チロシンキナーゼｎｅ
ｕ又はｖ−ｆｍｓにより誘発される細胞形質転換を逆転
又は阻止し得るが、別の非レセプターＰＴＰ（３ＨＣ１
３４、ＣＬ１００、ＨＶＨ１、ＰＡＣ−１、ｅｒｐ又は
ＭＫＰ−１として知られている）は中心シグナリング酵
素ＭＡＰキナーゼのＰＴＫ媒介活性化を逆転し得る（Ｂ
ｒｏｗｎ−Ｓｈｉｍｅｒら（１９９２） Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ． ５２， ４７８−４８２； Ｚａｎｄｅｒ
ら（１９９３） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８， １１７５−
１１８２； Ｓｕｎら（１９９３） Ｃｅｌｌ ７５，
４８７−４９３； 及びＷａｒｄら（１９９４） Ｎ
ａｔｕｒｅ ３６７， ６５１−６５４）。逆に、ＰＴ
Ｋと共同して作用し得るＰＴＰもある。２種のレセプタ
ー様ＰＴＰとしてＰＴＰα及びＣＤ４５はチロシンキナ
ーゼｃ−ｓｒｃ又はｌｃｋ及びｆｙｎを夫々活性化し、
非レセプターＳＨ−ＰＴＰ２（ＰＴＰ １Ｄ、ＰＴＰ−
２Ｃ、Ｓｙｐ）はＰＤＧＦレセプターチロシンキナーゼ
からのマイトジェンシグナルをｒａｓにポジティブに形
質導入する（ＷＰ９４／０１１１９； Ｚｈｅｎｇら
（１９９２） Ｎａｔｕｒｅ ３５９， ３３６−３３
９； ｄｅｎ Ｈｅｒｔｏｇら（１９９３） ＥＭＢＯ
Ｊ． １２， ３７８９−３７９８； Ｍｕｓｔｅｌ
ｉｎら（１９８９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６，６３０２−６３０６； Ｏｓ
ｔｅｒｇａａｒｄら（１９８９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６， ８９５９−８
９６３； Ｃａｈｉｒ ＭｃＦａｒｌａｎｄら（１９８
９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ ９０， １４０２−１４０６； 及びＬｉら（１９
９４） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４， ５０９
−５１７）。
ターゼ（ＰＴＰ）も細胞ホスホチロシンレベルの調節に
深く関与する。ＰＴＰの成長群は非レセプター及びレセ
プター様酵素から構成される（Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕ
ら（１９９２） Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．８， ４６３−４９３； 及びＰｏｔら（１９９
２） Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １
１３６， ３５−４３参照）。全ＰＴＰは共通の保存触
媒ドメインを有しており、このようなドメインは非レセ
プターＰＴＰではタンパク質−タンパク質相互作用、細
胞内局在又はＰＴＰ安定性を支配する調節エレメントを
含む近位又は遠位配列にしばしば関連付けられる。レセ
プター様ＰＴＰは通常、細胞内領域に２つの触媒ドメイ
ンを含み、更にトランスメンブラン領域及び不均一細胞
外領域を有する。これらの酵素の比較的保存された細胞
内部分に比較すると、細胞外領域は著しく不均一である
ので、これらのＰＴＰは特定の細胞外因子により調節さ
れると予想されるが、このような因子は未だほとんど同
定されていない。ＰＴＰのうちにはＰＴＫに対抗して作
用し得るものがある。例えば、非レセプターＰＴＰ １
Ｂ及びＴＣ−ＰＴＰは腫瘍遺伝子チロシンキナーゼｎｅ
ｕ又はｖ−ｆｍｓにより誘発される細胞形質転換を逆転
又は阻止し得るが、別の非レセプターＰＴＰ（３ＨＣ１
３４、ＣＬ１００、ＨＶＨ１、ＰＡＣ−１、ｅｒｐ又は
ＭＫＰ−１として知られている）は中心シグナリング酵
素ＭＡＰキナーゼのＰＴＫ媒介活性化を逆転し得る（Ｂ
ｒｏｗｎ−Ｓｈｉｍｅｒら（１９９２） Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ． ５２， ４７８−４８２； Ｚａｎｄｅｒ
ら（１９９３） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８， １１７５−
１１８２； Ｓｕｎら（１９９３） Ｃｅｌｌ ７５，
４８７−４９３； 及びＷａｒｄら（１９９４） Ｎ
ａｔｕｒｅ ３６７， ６５１−６５４）。逆に、ＰＴ
Ｋと共同して作用し得るＰＴＰもある。２種のレセプタ
ー様ＰＴＰとしてＰＴＰα及びＣＤ４５はチロシンキナ
ーゼｃ−ｓｒｃ又はｌｃｋ及びｆｙｎを夫々活性化し、
非レセプターＳＨ−ＰＴＰ２（ＰＴＰ １Ｄ、ＰＴＰ−
２Ｃ、Ｓｙｐ）はＰＤＧＦレセプターチロシンキナーゼ
からのマイトジェンシグナルをｒａｓにポジティブに形
質導入する（ＷＰ９４／０１１１９； Ｚｈｅｎｇら
（１９９２） Ｎａｔｕｒｅ ３５９， ３３６−３３
９； ｄｅｎ Ｈｅｒｔｏｇら（１９９３） ＥＭＢＯ
Ｊ． １２， ３７８９−３７９８； Ｍｕｓｔｅｌ
ｉｎら（１９８９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６，６３０２−６３０６； Ｏｓ
ｔｅｒｇａａｒｄら（１９８９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６， ８９５９−８
９６３； Ｃａｈｉｒ ＭｃＦａｒｌａｎｄら（１９８
９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ ９０， １４０２−１４０６； 及びＬｉら（１９
９４） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４， ５０９
−５１７）。
【０００５】腫瘍形成に関連し得るＰＴＰ発現又は活性
の改変については極めて少数の研究しか報告されていな
い。上述のように、２つのＰＴＰ関連機序であるＰＴＰ
の不活性化又は過剰活性化は細胞ホスホチロシンレベル
を増加させ、ひいては無制御な細胞増殖及び腫瘍形成を
招く。ＰＴＰ不活性化に関連して重要な点は、レセプタ
ー様ＰＴＰγをコードする遺伝子が直腸及び肺癌ではし
ばしば欠失している染色体３領域に位置し、ある種の直
腸癌及び肺癌細胞系ではＰＴＰγ対立遺伝子が欠失して
いるという点である（ＬａＦｏｒｇｉａら（１９９１）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ
８８， ５０３６−５０４０）。ＰＴＰ過剰活性化に関
しては、ＰＴＰαがラット胚繊維芽細胞で過剰発現され
ると、細胞形質転換が生じ、細胞は腫瘍形成することが
ヌードマウスで示されている（ＷＯ９４／０１１１９及
びＺｈｅｎｇら（１９９２）上掲）。ＰＴＰαは短い単
一細胞外ドメインと２つのタンデム触媒ドメインを有す
るレセプター様酵素である（ＷＯ９２／０１０５０；
Ｍａｔｔｈｅｗｓら（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７， ４４４４−４
４４８； Ｓａｐら（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７， ６１１２−６
１１６； 及びＫｒｕｅｇｅｒら（１９９０） ＥＭＢ
Ｏ Ｊ．９， ３２４１−３２５２）。制限された血統
特異的発現を有する多数の他のレセプター様ＰＴＰに比
較すると、ＰＴＰαは広範に発現される（Ｓａｐら（１
９９０），上掲及びＫｒｕｅｇｅｒら（１９９０），上
掲）。
の改変については極めて少数の研究しか報告されていな
い。上述のように、２つのＰＴＰ関連機序であるＰＴＰ
の不活性化又は過剰活性化は細胞ホスホチロシンレベル
を増加させ、ひいては無制御な細胞増殖及び腫瘍形成を
招く。ＰＴＰ不活性化に関連して重要な点は、レセプタ
ー様ＰＴＰγをコードする遺伝子が直腸及び肺癌ではし
ばしば欠失している染色体３領域に位置し、ある種の直
腸癌及び肺癌細胞系ではＰＴＰγ対立遺伝子が欠失して
いるという点である（ＬａＦｏｒｇｉａら（１９９１）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ
８８， ５０３６−５０４０）。ＰＴＰ過剰活性化に関
しては、ＰＴＰαがラット胚繊維芽細胞で過剰発現され
ると、細胞形質転換が生じ、細胞は腫瘍形成することが
ヌードマウスで示されている（ＷＯ９４／０１１１９及
びＺｈｅｎｇら（１９９２）上掲）。ＰＴＰαは短い単
一細胞外ドメインと２つのタンデム触媒ドメインを有す
るレセプター様酵素である（ＷＯ９２／０１０５０；
Ｍａｔｔｈｅｗｓら（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７， ４４４４−４
４４８； Ｓａｐら（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７， ６１１２−６
１１６； 及びＫｒｕｅｇｅｒら（１９９０） ＥＭＢ
Ｏ Ｊ．９， ３２４１−３２５２）。制限された血統
特異的発現を有する多数の他のレセプター様ＰＴＰに比
較すると、ＰＴＰαは広範に発現される（Ｓａｐら（１
９９０），上掲及びＫｒｕｅｇｅｒら（１９９０），上
掲）。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、かなり多
くの腫瘍ではＰＴＰα発現レベルが高く、従ってＰＴＰ
αを癌の診断又は予後用マーカーとして使用できること
をここに知見した。従って、本発明は生物サンプル中で
ＰＴＰα又はＰＴＰα核酸を検出することからなる癌の
診断又は予後方法を提供する。
くの腫瘍ではＰＴＰα発現レベルが高く、従ってＰＴＰ
αを癌の診断又は予後用マーカーとして使用できること
をここに知見した。従って、本発明は生物サンプル中で
ＰＴＰα又はＰＴＰα核酸を検出することからなる癌の
診断又は予後方法を提供する。
【０００７】一般に、新生物又は潜在的に新生物の疑い
のある組織から採取した第１の生物サンプル中のＰＴＰ
α又はＰＴＰα核酸のレベルを正常組織から採取した第
２の（対照）生物サンプル中のレベルと比較する。第１
及び第２の生物サンプルは同一被験体から採取してもよ
いし、異なる被験体から採取してもよい。第２の（対
照）生物サンプルは正常組織のプールから取分けてもよ
く、こうすると、個体被験体間のＰＴＰα発現のばらつ
きをなくすか又は限定するのに役立つ。結腸直腸癌の場
合、第２の生物サンプルは新生物又は潜在的に新生物の
疑いのある組織から少なくとも５ｃｍの距離の正常結腸
粘膜から採取すると適切である。
のある組織から採取した第１の生物サンプル中のＰＴＰ
α又はＰＴＰα核酸のレベルを正常組織から採取した第
２の（対照）生物サンプル中のレベルと比較する。第１
及び第２の生物サンプルは同一被験体から採取してもよ
いし、異なる被験体から採取してもよい。第２の（対
照）生物サンプルは正常組織のプールから取分けてもよ
く、こうすると、個体被験体間のＰＴＰα発現のばらつ
きをなくすか又は限定するのに役立つ。結腸直腸癌の場
合、第２の生物サンプルは新生物又は潜在的に新生物の
疑いのある組織から少なくとも５ｃｍの距離の正常結腸
粘膜から採取すると適切である。
【０００８】第１のサンプルにおけるＰＴＰα又はＰＴ
Ｐα核酸レベルが第２のサンプルよりも高いならば、第
１のサンプルは確かに新生物又は潜在的に新生物の組織
に由来するとみなされる。典型的には、１．５〜２０
倍、より典型的には２〜１０倍又は６〜１０倍であるな
らば、組織は新生物又は潜在的に新生物であるとみなさ
れる。ＰＴＰα又はＰＴＰα核酸レベルは一般に、正常
組織、新生物組織及び潜在的に新生物の組織中で同一レ
ベルで発現されるタンパク質又は核酸のレベルに関して
標準化される。例えば、ＰＴＰα ｍＲＮＡのレベルは
１８ＳリボソームＲＮＡ又はβ−アクチンｍＲＮＡのレ
ベルに関して標準化され得る。
Ｐα核酸レベルが第２のサンプルよりも高いならば、第
１のサンプルは確かに新生物又は潜在的に新生物の組織
に由来するとみなされる。典型的には、１．５〜２０
倍、より典型的には２〜１０倍又は６〜１０倍であるな
らば、組織は新生物又は潜在的に新生物であるとみなさ
れる。ＰＴＰα又はＰＴＰα核酸レベルは一般に、正常
組織、新生物組織及び潜在的に新生物の組織中で同一レ
ベルで発現されるタンパク質又は核酸のレベルに関して
標準化される。例えば、ＰＴＰα ｍＲＮＡのレベルは
１８ＳリボソームＲＮＡ又はβ−アクチンｍＲＮＡのレ
ベルに関して標準化され得る。
【０００９】「潜在的に新生物の組織」なる用語は、組
織が新生物になる確率を増加する遺伝子改変を含む組織
を意味する。「正常組織」なる用語は、新生物でも潜在
的に新生物でもない組織を意味する。
織が新生物になる確率を増加する遺伝子改変を含む組織
を意味する。「正常組織」なる用語は、新生物でも潜在
的に新生物でもない組織を意味する。
【００１０】本発明の方法は多数の異なる型の癌の診断
又は予後に使用することができる。癌は一般に、腫瘍が
高レベルのｓｒｃ群キナーゼ活性（例えば高レベルのｐ
ｐ６０c-srcキナーゼ活性）を示す癌である。癌は例え
ば結腸直腸癌、神経芽腫又は乳癌であり得る。本発明は
特に結腸直腸癌の検出に有用である。本発明は転移を検
出するために使用することができ、結腸直腸転移ではｃ
−ｓｒｃレベルが非常に高く、ＰＴＰαもこれに対応し
て高いと報告されている。本発明は患者生存及び転移発
生の良好な指標／予後指標となり得る。
又は予後に使用することができる。癌は一般に、腫瘍が
高レベルのｓｒｃ群キナーゼ活性（例えば高レベルのｐ
ｐ６０c-srcキナーゼ活性）を示す癌である。癌は例え
ば結腸直腸癌、神経芽腫又は乳癌であり得る。本発明は
特に結腸直腸癌の検出に有用である。本発明は転移を検
出するために使用することができ、結腸直腸転移ではｃ
−ｓｒｃレベルが非常に高く、ＰＴＰαもこれに対応し
て高いと報告されている。本発明は患者生存及び転移発
生の良好な指標／予後指標となり得る。
【００１１】高レベルの信頼性に達するために、ＰＴＰ
αを癌の他の診断及び予後マーカーと併用してもよい。
本発明者らは、試験した１４個の進行結腸直腸癌のうち
の１０個（７０％）が高レベルのＰＴＰα ｍＲＮＡを
示すことを知見した。結腸直腸癌の他の適切なマーカー
としては癌の６５％で過剰発現されるｃ−ｍｙｃ ＲＮ
Ａ及び癌の５０％で生じる点突然変異によるｒａｓ活性
化が挙げられる。ｍｙｂ及びｎｅｕのような他の原腫瘍
遺伝子は著しく低頻度でしか活性化されない。
αを癌の他の診断及び予後マーカーと併用してもよい。
本発明者らは、試験した１４個の進行結腸直腸癌のうち
の１０個（７０％）が高レベルのＰＴＰα ｍＲＮＡを
示すことを知見した。結腸直腸癌の他の適切なマーカー
としては癌の６５％で過剰発現されるｃ−ｍｙｃ ＲＮ
Ａ及び癌の５０％で生じる点突然変異によるｒａｓ活性
化が挙げられる。ｍｙｂ及びｎｅｕのような他の原腫瘍
遺伝子は著しく低頻度でしか活性化されない。
【００１２】本発明に従って検出されるＰＴＰα又はＰ
ＴＰα核酸は正常（非突然変異）ＰＴＰαもしくはＰＴ
Ｐα核酸、又は突然変異ＰＴＰαもしくはＰＴＰα核酸
であり得る。突然変異ＰＴＰα又はＰＴＰα核酸の検出
は、ＰＴＰαの過剰発現がＰＴＰα遺伝子中の突然変異
に起因する場合に重要である。ＰＴＰα核酸はＰＴＰα
をコードする任意の核酸であり得、通常はＰＴＰα ｍ
ＲＮＡ又はＰＴＰαＤＮＡである。
ＴＰα核酸は正常（非突然変異）ＰＴＰαもしくはＰＴ
Ｐα核酸、又は突然変異ＰＴＰαもしくはＰＴＰα核酸
であり得る。突然変異ＰＴＰα又はＰＴＰα核酸の検出
は、ＰＴＰαの過剰発現がＰＴＰα遺伝子中の突然変異
に起因する場合に重要である。ＰＴＰα核酸はＰＴＰα
をコードする任意の核酸であり得、通常はＰＴＰα ｍ
ＲＮＡ又はＰＴＰαＤＮＡである。
【００１３】種々のアッセイを使用して本発明の方法で
ＰＴＰα又はＰＴＰα核酸を検出することができる。ア
ッセイは好ましくは定量的である。ＰＴＰα又はＰＴＰ
α核酸は組織サンプル中でｉｎ ｓｉｔｕ検出してもよ
いし、分離細胞材料（例えば細胞核酸又は細胞タンパク
質）のサンプル中で検出してもよい。
ＰＴＰα又はＰＴＰα核酸を検出することができる。ア
ッセイは好ましくは定量的である。ＰＴＰα又はＰＴＰ
α核酸は組織サンプル中でｉｎ ｓｉｔｕ検出してもよ
いし、分離細胞材料（例えば細胞核酸又は細胞タンパク
質）のサンプル中で検出してもよい。
【００１４】ｉｎ ｓｉｔｕ検出は、組織学的サンプル
を患者から採取し、標識化結合タンパク質（例えば標識
化抗体）又は標識化核酸プローブをＰＴＰα又はＰＴＰ
α核酸に夫々結合又はハイブリダイズさせることにより
実施される。このような手順を使用することにより、Ｐ
ＴＰα又はＰＴＰα核酸を検出できるのみならず、その
空間分布を決定することも可能である。分離細胞材料の
サンプル中での検出は、サザン／ノーザン／ウェスタン
ブロッティング、ＥＬＩＳＡ（酵素に基づくイムノアッ
セイ）、ＲＮＡ保護アッセイ及びドットブロットハイブ
リダイゼーションのような方法を使用して実施され得
る。
を患者から採取し、標識化結合タンパク質（例えば標識
化抗体）又は標識化核酸プローブをＰＴＰα又はＰＴＰ
α核酸に夫々結合又はハイブリダイズさせることにより
実施される。このような手順を使用することにより、Ｐ
ＴＰα又はＰＴＰα核酸を検出できるのみならず、その
空間分布を決定することも可能である。分離細胞材料の
サンプル中での検出は、サザン／ノーザン／ウェスタン
ブロッティング、ＥＬＩＳＡ（酵素に基づくイムノアッ
セイ）、ＲＮＡ保護アッセイ及びドットブロットハイブ
リダイゼーションのような方法を使用して実施され得
る。
【００１５】本発明に従って使用される生物サンプルは
組織サンプル、生物流体（例えば血液又は唾液）、糞便
材料又は分離細胞材料（例えば細胞核酸又は細胞タンパ
ク質）のサンプルであり得る。組織サンプルは慣用組織
学的方法により調製してもよいし、分離細胞材料のサン
プルは慣用精製方法により調製してもよい。糞便中には
脱落した結腸細胞が存在するので、糞便材料は結腸癌の
検出に特に有用である。生物サンプルは通常、癌をもつ
疑いのあるヒト又は動物被験体から採取するが、健康な
被験体から採取してもよい。
組織サンプル、生物流体（例えば血液又は唾液）、糞便
材料又は分離細胞材料（例えば細胞核酸又は細胞タンパ
ク質）のサンプルであり得る。組織サンプルは慣用組織
学的方法により調製してもよいし、分離細胞材料のサン
プルは慣用精製方法により調製してもよい。糞便中には
脱落した結腸細胞が存在するので、糞便材料は結腸癌の
検出に特に有用である。生物サンプルは通常、癌をもつ
疑いのあるヒト又は動物被験体から採取するが、健康な
被験体から採取してもよい。
【００１６】ＰＴＰα核酸は核酸にハイブリダイズする
オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出され得る。プ
ローブは、ＰＴＰα核酸の一部又は全体にハイブリダイ
ズする標識化オリゴヌクレオチド（通常ＤＮＡ又はＲＮ
Ａ）である。プローブは一般に少なくとも１０ヌクレオ
チド長、例えば１２〜１００ヌクレオチド長である。プ
ローブは好ましくは他の核酸にはハイブリダイズせず、
ＰＴＰα核酸のみに特異的にハイブリダイズすべきであ
る。例えばタンパク質の細胞外ドメインは単一であるの
で、タンパク質の細胞外ドメインに対応するＰＴＰα核
酸の一部とハイブリダイズするようにプローブの配列を
選択することができる。適切なプローブはヒトＰＴＰα
コーディング配列のヌクレオチド３６９〜４２６にハイ
ブリダイズするプローブである。
オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出され得る。プ
ローブは、ＰＴＰα核酸の一部又は全体にハイブリダイ
ズする標識化オリゴヌクレオチド（通常ＤＮＡ又はＲＮ
Ａ）である。プローブは一般に少なくとも１０ヌクレオ
チド長、例えば１２〜１００ヌクレオチド長である。プ
ローブは好ましくは他の核酸にはハイブリダイズせず、
ＰＴＰα核酸のみに特異的にハイブリダイズすべきであ
る。例えばタンパク質の細胞外ドメインは単一であるの
で、タンパク質の細胞外ドメインに対応するＰＴＰα核
酸の一部とハイブリダイズするようにプローブの配列を
選択することができる。適切なプローブはヒトＰＴＰα
コーディング配列のヌクレオチド３６９〜４２６にハイ
ブリダイズするプローブである。
【００１７】プローブは多数の型のＰＴＰα核酸検出ア
ッセイ、例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーショ
ン、ＲＮＡ保護、サザン又はウェスタンブロッティング
及びドットブロットハイブリダイゼーションで使用する
ことができる。このようなアッセイは一般に、（ａ）プ
ローブを生物サンプルと接触させる段階と、（ｂ）サン
プル中に存在するＰＴＰα核酸にハイブリダイズしたプ
ローブを検出する段階とを含む。
ッセイ、例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーショ
ン、ＲＮＡ保護、サザン又はウェスタンブロッティング
及びドットブロットハイブリダイゼーションで使用する
ことができる。このようなアッセイは一般に、（ａ）プ
ローブを生物サンプルと接触させる段階と、（ｂ）サン
プル中に存在するＰＴＰα核酸にハイブリダイズしたプ
ローブを検出する段階とを含む。
【００１８】ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは
典型的には、プローブを組織サンプルと接触させ、ハイ
ブリダイズしなかったプローブを洗い流し、ハイブリダ
イズしたプローブを検出することからなる。
典型的には、プローブを組織サンプルと接触させ、ハイ
ブリダイズしなかったプローブを洗い流し、ハイブリダ
イズしたプローブを検出することからなる。
【００１９】ＲＮＡ保護アッセイは典型的には、ＲＮＡ
プローブを分離細胞材料に接触させ、ハイブリダイズし
なかった一重鎖プローブを消化し、残りのプローブを検
出することからなる。
プローブを分離細胞材料に接触させ、ハイブリダイズし
なかった一重鎖プローブを消化し、残りのプローブを検
出することからなる。
【００２０】ブロッティングは典型的には、分離細胞材
料をゲル電気泳動にかけて材料中の核酸を分離し、分離
した核酸をブロッティングにより固体支持体（例えばニ
トロセルロース支持体）に移し、支持体上の分離した核
酸にプローブを接触させ、プローブを検出することから
なる。
料をゲル電気泳動にかけて材料中の核酸を分離し、分離
した核酸をブロッティングにより固体支持体（例えばニ
トロセルロース支持体）に移し、支持体上の分離した核
酸にプローブを接触させ、プローブを検出することから
なる。
【００２１】ＰＴＰα核酸は検出前に増幅され得る。増
幅は組織サンプル中でｉｎ ｓｉｔｕで実施してもよい
し、分離細胞材料のサンプル中で実施してもよい。標識
化プライマー、標識化デオキシリボヌクレオシド三リン
酸（ｄＮＴＰ）又は標識化リボヌクレオシド三リン酸
（ＮＴＰ）を増幅反応で使用することにより増幅核酸を
直接検出することが可能である。核酸配列を増幅するた
めに多数の方法が公知である。これらの方法にはポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写−ポリメラーゼ連鎖
反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、自己持続配列複製反応（３Ｓ
Ｒ）及びリガーゼ連鎖反応がある。ＲＴ−ＰＣＲはＫａ
ｗａｓａｋｉ（１９９０） Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ ｏｆ ＲＮＡ， Ｉｎｎｉｓら編， ＰＣＲ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； ２１−
２７に記載されている。熱安定組換えＴｈｅｒｍｕｓ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ｒＴｔｈ）ＤＮＡポリメラ
ーゼを使用するＲＴ−ＰＣＲはＷａｎｇら（１９８９）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８
６：９７１９−９７２１及びＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃ
ａｔａｌｏｇｕｅ， Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ， Ｎｅｗ
Ｊｅｒｓｅｙ， ＵＳＡ （１９９３） ｐ．２５に
記載されている。３ＳＲはＧｉｎｇｅｒａｓら（１９９
１） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
Ｄｉｓｅａｓｅｓ １６４， １０６６−１０７４及び
Ｇｉｎｇｅｒａｓら（１９９３）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ
１７， ３４４−３４６に記載されている。リガーゼ
連鎖反応はＢａｒａｎｙ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａ
ｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ （１９９１） １， ５−１６に記載されている。
定量的ＲＴ−ＰＣＲはＰＴＰα ｍＲＮＡの過剰発現を
検出するために特に有用な方法であり得る。
幅は組織サンプル中でｉｎ ｓｉｔｕで実施してもよい
し、分離細胞材料のサンプル中で実施してもよい。標識
化プライマー、標識化デオキシリボヌクレオシド三リン
酸（ｄＮＴＰ）又は標識化リボヌクレオシド三リン酸
（ＮＴＰ）を増幅反応で使用することにより増幅核酸を
直接検出することが可能である。核酸配列を増幅するた
めに多数の方法が公知である。これらの方法にはポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写−ポリメラーゼ連鎖
反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、自己持続配列複製反応（３Ｓ
Ｒ）及びリガーゼ連鎖反応がある。ＲＴ−ＰＣＲはＫａ
ｗａｓａｋｉ（１９９０） Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ ｏｆ ＲＮＡ， Ｉｎｎｉｓら編， ＰＣＲ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； ２１−
２７に記載されている。熱安定組換えＴｈｅｒｍｕｓ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ｒＴｔｈ）ＤＮＡポリメラ
ーゼを使用するＲＴ−ＰＣＲはＷａｎｇら（１９８９）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８
６：９７１９−９７２１及びＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃ
ａｔａｌｏｇｕｅ， Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ， Ｎｅｗ
Ｊｅｒｓｅｙ， ＵＳＡ （１９９３） ｐ．２５に
記載されている。３ＳＲはＧｉｎｇｅｒａｓら（１９９
１） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
Ｄｉｓｅａｓｅｓ １６４， １０６６−１０７４及び
Ｇｉｎｇｅｒａｓら（１９９３）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ
１７， ３４４−３４６に記載されている。リガーゼ
連鎖反応はＢａｒａｎｙ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａ
ｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ （１９９１） １， ５−１６に記載されている。
定量的ＲＴ−ＰＣＲはＰＴＰα ｍＲＮＡの過剰発現を
検出するために特に有用な方法であり得る。
【００２２】ＰＴＰαはＰＴＰαに特異的な化学的又は
生物学的リガンド（例えば結合タンパク質又はペプチ
ド）を用いて検出することができる。結合タンパク質は
イムノグロブリンが適切であるが、細胞外基質タンパク
質又は細胞表面タンパク質のような天然に存在するタン
パク質でもよい。イムノグロブリンは完全抗体又は少な
くとも１個のＰＴＰα結合部位を有する抗体フラグメン
トであり得る。抗体フラグメントはＦａｂ、Ｆ（ａ
ｂ’）2、Ｆｖ又はｓｃＦｖフラグメントであり得る。
イムノグロブリンは例えばＥＰ−Ａ−２３９ ４００
（Ｗｉｎｔｅｒ）に開示されているようにヒト適応化す
ることができる。適切な抗体はＷＯ９２／０１０５０に
開示されている。イムノグロブリンは標識化され得る。
生物学的リガンド（例えば結合タンパク質又はペプチ
ド）を用いて検出することができる。結合タンパク質は
イムノグロブリンが適切であるが、細胞外基質タンパク
質又は細胞表面タンパク質のような天然に存在するタン
パク質でもよい。イムノグロブリンは完全抗体又は少な
くとも１個のＰＴＰα結合部位を有する抗体フラグメン
トであり得る。抗体フラグメントはＦａｂ、Ｆ（ａ
ｂ’）2、Ｆｖ又はｓｃＦｖフラグメントであり得る。
イムノグロブリンは例えばＥＰ−Ａ−２３９ ４００
（Ｗｉｎｔｅｒ）に開示されているようにヒト適応化す
ることができる。適切な抗体はＷＯ９２／０１０５０に
開示されている。イムノグロブリンは標識化され得る。
【００２３】イムノグロブリンは公知方法を使用して製
造することができる。例えば、モノクローナル抗体はＫ
ｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ （１９７５） Ｎａ
ｔｕｒｅ ２５６， ４９５−４９７に最初に記載され
た方法を使用してハイブリドーマ細胞から製造すること
ができる。組換え抗体及び抗体フラグメントはＥＰ−Ａ
−３２４ １６２（Ｓｋｅｒｒａ及びＰｌｕｃｋｔｈｕ
ｎ）に記載の方法を使用して製造することができる。
造することができる。例えば、モノクローナル抗体はＫ
ｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ （１９７５） Ｎａ
ｔｕｒｅ ２５６， ４９５−４９７に最初に記載され
た方法を使用してハイブリドーマ細胞から製造すること
ができる。組換え抗体及び抗体フラグメントはＥＰ−Ａ
−３２４ １６２（Ｓｋｅｒｒａ及びＰｌｕｃｋｔｈｕ
ｎ）に記載の方法を使用して製造することができる。
【００２４】多数の異なるアッセイ法、例えばｉｎ ｓ
ｉｔｕハイブリダイゼーション、ウェスタンブロッティ
ング及びＥＬＩＳＡ（酵素に基づくイムノアッセイ）を
用いてＰＴＰαを検出するために、イムノグロブリンを
使用することができる。このような方法は、一般に
（ａ）生物サンプルをイムノグロブリンと接触させる段
階と、（ｂ）ＰＴＰαに結合したイムノグロブリンを検
出する段階とを含む。
ｉｔｕハイブリダイゼーション、ウェスタンブロッティ
ング及びＥＬＩＳＡ（酵素に基づくイムノアッセイ）を
用いてＰＴＰαを検出するために、イムノグロブリンを
使用することができる。このような方法は、一般に
（ａ）生物サンプルをイムノグロブリンと接触させる段
階と、（ｂ）ＰＴＰαに結合したイムノグロブリンを検
出する段階とを含む。
【００２５】ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは
典型的には、イムノグロブリンを組織サンプルと接触さ
せ、結合しなかったイムノグロブリンを洗い流し、結合
したイムノグロブリンを検出することからなる。
典型的には、イムノグロブリンを組織サンプルと接触さ
せ、結合しなかったイムノグロブリンを洗い流し、結合
したイムノグロブリンを検出することからなる。
【００２６】ウェスタンブロッティングは一般に、分離
細胞材料をゲル電気泳動にかけて材料中のタンパク質を
分離し、分離したタンパク質をブロッティングにより固
体支持体（例えばニトロセルロース支持体）に移し、イ
ムノグロブリンを支持体上の分離したタンパク質と接触
させ、結合したイムノグロブリンを検出することからな
る。
細胞材料をゲル電気泳動にかけて材料中のタンパク質を
分離し、分離したタンパク質をブロッティングにより固
体支持体（例えばニトロセルロース支持体）に移し、イ
ムノグロブリンを支持体上の分離したタンパク質と接触
させ、結合したイムノグロブリンを検出することからな
る。
【００２７】ＥＬＩＳＡは典型的には、ＰＴＰαに特異
的な非標識化抗体を固体支持体上に固定し、サンプル中
に存在するＰＴＰαが非標識化抗体により捕獲されるよ
うに生物サンプルを加え、ＰＴＰαに特異的な酵素標識
化抗体を加え、結合した標識化抗体を検出することから
なる。
的な非標識化抗体を固体支持体上に固定し、サンプル中
に存在するＰＴＰαが非標識化抗体により捕獲されるよ
うに生物サンプルを加え、ＰＴＰαに特異的な酵素標識
化抗体を加え、結合した標識化抗体を検出することから
なる。
【００２８】ＰＴＰαはＰＴＰαのチロシンホスファタ
ーゼ活性の直接酵素アッセイを使用して検出してもよ
い。これは生物サンプルからのＰＴＰαをＰＴＰα抗体
で免疫沈降させ、免疫複合体のチロシンホスファターゼ
活性をアッセイすることにより定量することができる。
このようなアッセイはＺｈｅｎｇら（１９９２） Ｎａ
ｔｕｒｅ ３５９， ３３６−３３９に記載されてい
る。
ーゼ活性の直接酵素アッセイを使用して検出してもよ
い。これは生物サンプルからのＰＴＰαをＰＴＰα抗体
で免疫沈降させ、免疫複合体のチロシンホスファターゼ
活性をアッセイすることにより定量することができる。
このようなアッセイはＺｈｅｎｇら（１９９２） Ｎａ
ｔｕｒｅ ３５９， ３３６−３３９に記載されてい
る。
【００２９】多数の型のラベルを使用してＰＴＰα又は
ＰＴＰα核酸を検出することができる。ラベルはＰＴＰ
α結合タンパク質（例えばイムノグロブリン）、ＰＴＰ
αの化学的リガンド、オリゴヌクレオチドプローブ、プ
ライマー、ｄＮＴＰ又はＮＴＰ上に存在し得る。適切な
ラベルの例としては、放射性ラベル（例えば35Ｓ又は32
Ｐ）、ビオチン（ペルオキシダーゼに結合したアビジン
又はストレプトアビジンで検出可能）、蛍光ラベル（例
えばフルオレセイン）、酵素（例えば西洋ワサビペルオ
キシダーゼ）又はジゴキシゲニンを挙げることができ
る。これらのラベルの検出方法は周知である。
ＰＴＰα核酸を検出することができる。ラベルはＰＴＰ
α結合タンパク質（例えばイムノグロブリン）、ＰＴＰ
αの化学的リガンド、オリゴヌクレオチドプローブ、プ
ライマー、ｄＮＴＰ又はＮＴＰ上に存在し得る。適切な
ラベルの例としては、放射性ラベル（例えば35Ｓ又は32
Ｐ）、ビオチン（ペルオキシダーゼに結合したアビジン
又はストレプトアビジンで検出可能）、蛍光ラベル（例
えばフルオレセイン）、酵素（例えば西洋ワサビペルオ
キシダーゼ）又はジゴキシゲニンを挙げることができ
る。これらのラベルの検出方法は周知である。
【００３０】本発明は更に、ＰＴＰαに特異的なイムノ
グロブリン、又はＰＴＰα核酸に特異的なオリゴヌクレ
オチドプローブもしくはプライマーを含む、癌の診断又
は予後用キットを提供する。イムノグロブリンは固体支
持体上に提供され得る。
グロブリン、又はＰＴＰα核酸に特異的なオリゴヌクレ
オチドプローブもしくはプライマーを含む、癌の診断又
は予後用キットを提供する。イムノグロブリンは固体支
持体上に提供され得る。
【００３１】キットは一般に、イムノグロブリン、プロ
ーブ又はプライマーを検出するための手段を更に含み得
る。検出手段はＰＴＰα又はＰＴＰα核酸に特異的なイ
ムノグロブリン、プローブ又はプライマー上のラベルで
あり得る。あるいはＰＴＰαに特異的なイムノグロブリ
ンを含むキットの場合には、結合の検出手段はＰＴＰα
に特異的なイムノグロブリンに対して反応性の標識化二
次イムノグロブリンであり得る。
ーブ又はプライマーを検出するための手段を更に含み得
る。検出手段はＰＴＰα又はＰＴＰα核酸に特異的なイ
ムノグロブリン、プローブ又はプライマー上のラベルで
あり得る。あるいはＰＴＰαに特異的なイムノグロブリ
ンを含むキットの場合には、結合の検出手段はＰＴＰα
に特異的なイムノグロブリンに対して反応性の標識化二
次イムノグロブリンであり得る。
【００３２】キットはＥＬＩＳＡキット、ブロッティン
グキット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションキッ
ト、ＲＮＡ保護アッセイキット又は核酸増幅キットであ
り得る。従って、キットは上述のようにこれらの方法の
各々によりＰＴＰα又はＰＴＰα核酸を検出するために
必要な試薬を含み得る。キットは更に正又は負の対照を
含み得る。
グキット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションキッ
ト、ＲＮＡ保護アッセイキット又は核酸増幅キットであ
り得る。従って、キットは上述のようにこれらの方法の
各々によりＰＴＰα又はＰＴＰα核酸を検出するために
必要な試薬を含み得る。キットは更に正又は負の対照を
含み得る。
【００３３】
【実施例】以下、実施例により本発明を説明する。
【００３４】材料及び手法 組織サンプル 。正常結腸粘膜組織及び結腸腺癌を鈍的剥
離により下層の筋肉組織から分離した。組織を液体窒素
中で瞬間凍結し、使用時まで−８０℃で保存した。病理
学者により全組織で組織病理試験、染色及び修正デュー
ク分類（Ｔｕｒｎｂｕｌｌら（１９６７） Ａｎｎ．Ｓ
ｕｒｇ．１６６， ４２０−４２７）による病期決定を
実施した。臨床及び組織病理データを表１に示す。
離により下層の筋肉組織から分離した。組織を液体窒素
中で瞬間凍結し、使用時まで−８０℃で保存した。病理
学者により全組織で組織病理試験、染色及び修正デュー
ク分類（Ｔｕｒｎｂｕｌｌら（１９６７） Ａｎｎ．Ｓ
ｕｒｇ．１６６， ４２０−４２７）による病期決定を
実施した。臨床及び組織病理データを表１に示す。
【００３５】全細胞ＲＮＡの分離。Ｃｈｏｍｅｚｙｎｓ
ｋｉ及びＳａｃｃｈｉ（１９８７）Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ １６２， １５６−１５９の酸−イソチオ
シアン酸グアニジウム抽出法に従って凍結外科標本から
全細胞ＲＮＡを分離した。ＲＮＡをアガロースゲル上で
泳動させた後、臭化エチジウムで２８Ｓ及び１８Ｓを可
視化することにより、ＲＮＡの完全性をチェックした。
ｋｉ及びＳａｃｃｈｉ（１９８７）Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ １６２， １５６−１５９の酸−イソチオ
シアン酸グアニジウム抽出法に従って凍結外科標本から
全細胞ＲＮＡを分離した。ＲＮＡをアガロースゲル上で
泳動させた後、臭化エチジウムで２８Ｓ及び１８Ｓを可
視化することにより、ＲＮＡの完全性をチェックした。
【００３６】ＲＮアーゼ保護アッセイ。ＰＴＰαの完全
細胞外ドメイン（ｂｐ１〜４２６）をコードするＢｇｌ
ＩＩ−Ｐｓｔ Ｉ ＰＣＲフラグメントをｐＳＰ７３
転写ベクターに挿入することによりＰＴＰαプローブを
構築した。プラスミドを挿入物の３６９位の単一Ｅｃｏ
Ｒ１部位で線状化した。得られたリボプローブは相補
的ＤＮＡ ｎｔ ３６９〜４２６及びこのｃＤＮＡ配列
の不確定のやや短縮した形態に夫々対応する５７ｎｔ及
び５５ｎｔ ＰＴＰα ｍＲＮＡフラグメントを保護す
る。１８Ｓ ＲＮＡ及びヒトβ−アクチンリボプローブ
を内部対照として使用した。ｐＴ７ ＲＮＡ １８Ｓア
ンチセンス対照鋳型はヒト１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝
子の高度に保存された領域の８２ｂｐフラグメントを含
み、該鋳型はＡｍｂｉｏｎから購入した。ヒト繊維芽細
胞ｃＤＮＡから増幅した１６４ｂｐＰｓｔ Ｉ−Ｃｌａ
Ｉ ＰＣＲフラグメントをｐＳＰ７２ベクターに挿入
することによりヒトβ−アクチンプローブを構築した。
リボプローブはβ−アクチンのアミノ酸残基８０〜１２
６に対応する１３８ｎｔの範囲を保護する。
細胞外ドメイン（ｂｐ１〜４２６）をコードするＢｇｌ
ＩＩ−Ｐｓｔ Ｉ ＰＣＲフラグメントをｐＳＰ７３
転写ベクターに挿入することによりＰＴＰαプローブを
構築した。プラスミドを挿入物の３６９位の単一Ｅｃｏ
Ｒ１部位で線状化した。得られたリボプローブは相補
的ＤＮＡ ｎｔ ３６９〜４２６及びこのｃＤＮＡ配列
の不確定のやや短縮した形態に夫々対応する５７ｎｔ及
び５５ｎｔ ＰＴＰα ｍＲＮＡフラグメントを保護す
る。１８Ｓ ＲＮＡ及びヒトβ−アクチンリボプローブ
を内部対照として使用した。ｐＴ７ ＲＮＡ １８Ｓア
ンチセンス対照鋳型はヒト１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝
子の高度に保存された領域の８２ｂｐフラグメントを含
み、該鋳型はＡｍｂｉｏｎから購入した。ヒト繊維芽細
胞ｃＤＮＡから増幅した１６４ｂｐＰｓｔ Ｉ−Ｃｌａ
Ｉ ＰＣＲフラグメントをｐＳＰ７２ベクターに挿入
することによりヒトβ−アクチンプローブを構築した。
リボプローブはβ−アクチンのアミノ酸残基８０〜１２
６に対応する１３８ｎｔの範囲を保護する。
【００３７】Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ Ｇｅｍｉｎｉ転写シ
ステム（商品名、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して［α−32
Ｐ］ｒＵＴＰ又は［α−33Ｐ］ｒＵＴＰの存在下に標識
化アンチセンスリボプローブを転写し、変性用アクリル
アミドゲル上で精製した。ＲＮアーゼ保護アッセイは記
載通りに実施した（Ｇｉｌｍａｎ （１９９４），Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌら編 （Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ＮｅｗＹｏｒｋ，
ＮＹ） ｐｐ ４．７．１−４．７．６）。腫瘍とそ
れに対応する粘膜との各対からの等量の全ＲＮＡ（６〜
２０μｇ）を４５℃で標識化リボプローブと一晩ハイブ
リダイズし、ＲＮアーゼＡ（０．０５μｇ／μｌ）とＲ
ＮアーゼＴ１（８０単位／ｍｌ）の混合物を使用して２
５℃で１時間消化を行った。サンプルを１２％変性用ア
クリルアミドゲル上で電気泳動させ、７０℃でオートラ
ジオグラフィーにかけた。Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ（商
品名）プログラムを使用してリン光イメージャー（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）により定量及び内
部対照に対する標準化を行った。
ステム（商品名、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して［α−32
Ｐ］ｒＵＴＰ又は［α−33Ｐ］ｒＵＴＰの存在下に標識
化アンチセンスリボプローブを転写し、変性用アクリル
アミドゲル上で精製した。ＲＮアーゼ保護アッセイは記
載通りに実施した（Ｇｉｌｍａｎ （１９９４），Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌら編 （Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ＮｅｗＹｏｒｋ，
ＮＹ） ｐｐ ４．７．１−４．７．６）。腫瘍とそ
れに対応する粘膜との各対からの等量の全ＲＮＡ（６〜
２０μｇ）を４５℃で標識化リボプローブと一晩ハイブ
リダイズし、ＲＮアーゼＡ（０．０５μｇ／μｌ）とＲ
ＮアーゼＴ１（８０単位／ｍｌ）の混合物を使用して２
５℃で１時間消化を行った。サンプルを１２％変性用ア
クリルアミドゲル上で電気泳動させ、７０℃でオートラ
ジオグラフィーにかけた。Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ（商
品名）プログラムを使用してリン光イメージャー（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）により定量及び内
部対照に対する標準化を行った。
【００３８】非放射性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼー
ション。ジゴキシゲニン標識化センス及びアンチセンス
ＰＴＰαプローブを使用して非放射性ｉｎ ｓｉｔｕハ
イブリダイゼーションを実施した。転写物はｐＳＰ７３
ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングしたＰＴＰ
αの最初の４２６ヌクレオチドを含む上記構築物のラン
オフ転写物に相当する。他方、プラスミドの線状化はＢ
ｇｌ ＩＩ（アンチセンス）又はＰｓｔ Ｉ（センス）
消化のいずれかで実施した。製造業者の指示に従ってジ
ゴキシゲニン−１１−ウリジン−５’−三リン酸（ＤＩ
Ｇ−ＵＴＰ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ， ｃａｔ．ｎｏ． １２０９２６６）によるランオ
フ手順及びその後の精製を実施した。微量の［α−
32Ｐ］ｒＵＴＰを転写反応物に加えた後、６％ＰＡＧＥ
によるプローブの可視化及びオートラジオグラフィーに
より、プローブの完全性及び濃度を決定した。
ション。ジゴキシゲニン標識化センス及びアンチセンス
ＰＴＰαプローブを使用して非放射性ｉｎ ｓｉｔｕハ
イブリダイゼーションを実施した。転写物はｐＳＰ７３
ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングしたＰＴＰ
αの最初の４２６ヌクレオチドを含む上記構築物のラン
オフ転写物に相当する。他方、プラスミドの線状化はＢ
ｇｌ ＩＩ（アンチセンス）又はＰｓｔ Ｉ（センス）
消化のいずれかで実施した。製造業者の指示に従ってジ
ゴキシゲニン−１１−ウリジン−５’−三リン酸（ＤＩ
Ｇ−ＵＴＰ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ， ｃａｔ．ｎｏ． １２０９２６６）によるランオ
フ手順及びその後の精製を実施した。微量の［α−
32Ｐ］ｒＵＴＰを転写反応物に加えた後、６％ＰＡＧＥ
によるプローブの可視化及びオートラジオグラフィーに
より、プローブの完全性及び濃度を決定した。
【００３９】製造業者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ： Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｉｎ
Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ）により指定された条件を
わずかに修正した条件を使用してサンプル組織の固定、
ジゴキシゲニン標識化プローブのハイブリダイゼーショ
ン及び検出を実施した。要約すると、腫瘍の新鮮な凍結
切片（１０μｍ）及び対応する粘膜組織を新鮮なピクリ
ン酸パラホルムアルデヒド（ＰＡＦ）中に３０分間固定
した後、２μｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋで３
７℃で５分間消化した。切片を０．２％グリシンで濯ぐ
ことにより消化を停止した。クロロホルムでポストフィ
クシング後、切片を再水和し、ＨＢ緩衝液（５０％（ｖ
／ｖ）脱イオンホルムアミド、４×ＳＳＣ、５００μｇ
／ｍｌ 剪断ｓｓＤＮＡ、５ｍｇ／ｍｌ酵母ｔ−ＲＮ
Ａ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液及びＤＥＰＣ処理ｄＨ2
Ｏ中１０％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸）で５５℃で３
時間プレハイブリダイズした。同一緩衝液中で飽和量の
アンチセンス及びセンスＰＴＰαプローブと５５℃で一
晩ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、２
×ＳＳＣで２回、０．２×ＳＳＣで１回及び０．１×Ｓ
ＳＣで２回切片を洗うことにより、非特異的に結合した
ＲＮＡプローブを除去した。全洗浄は４５℃で各１５分
間実施した。ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドをペルオキシ
ダーゼ結合抗ジゴキシゲニン−ＰＯＤＦａｂフラグメン
ト（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， ｃａ
ｔ．ｎｏ． １２０７７３３）で免疫組織化学的に検出
する前に、切片を０．０３％Ｈ2Ｏ2で処理することによ
り内因性ペルオキシダーゼ活性をサンプル組織から除去
した。プレブロックした切片（ＰＢＳ＝１％ＢＳＡ［フ
ラクションＶ］＋０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）をペルオ
キシダーゼ結合抗ジゴキシゲニン−ＰＯＤ Ｆａｂフラ
グメントの１：１００希釈液と共に３７℃で３０分間イ
ンキュベートした。次にジアミノベンジジンを色素源と
して使用してジゴキシゲニン−抗体複合体を可視化し
た。切片をニュートラルレッドで対比染色した。
ｎｈｅｉｍ： Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｉｎ
Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ）により指定された条件を
わずかに修正した条件を使用してサンプル組織の固定、
ジゴキシゲニン標識化プローブのハイブリダイゼーショ
ン及び検出を実施した。要約すると、腫瘍の新鮮な凍結
切片（１０μｍ）及び対応する粘膜組織を新鮮なピクリ
ン酸パラホルムアルデヒド（ＰＡＦ）中に３０分間固定
した後、２μｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋで３
７℃で５分間消化した。切片を０．２％グリシンで濯ぐ
ことにより消化を停止した。クロロホルムでポストフィ
クシング後、切片を再水和し、ＨＢ緩衝液（５０％（ｖ
／ｖ）脱イオンホルムアミド、４×ＳＳＣ、５００μｇ
／ｍｌ 剪断ｓｓＤＮＡ、５ｍｇ／ｍｌ酵母ｔ−ＲＮ
Ａ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液及びＤＥＰＣ処理ｄＨ2
Ｏ中１０％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸）で５５℃で３
時間プレハイブリダイズした。同一緩衝液中で飽和量の
アンチセンス及びセンスＰＴＰαプローブと５５℃で一
晩ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、２
×ＳＳＣで２回、０．２×ＳＳＣで１回及び０．１×Ｓ
ＳＣで２回切片を洗うことにより、非特異的に結合した
ＲＮＡプローブを除去した。全洗浄は４５℃で各１５分
間実施した。ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドをペルオキシ
ダーゼ結合抗ジゴキシゲニン−ＰＯＤＦａｂフラグメン
ト（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， ｃａ
ｔ．ｎｏ． １２０７７３３）で免疫組織化学的に検出
する前に、切片を０．０３％Ｈ2Ｏ2で処理することによ
り内因性ペルオキシダーゼ活性をサンプル組織から除去
した。プレブロックした切片（ＰＢＳ＝１％ＢＳＡ［フ
ラクションＶ］＋０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）をペルオ
キシダーゼ結合抗ジゴキシゲニン−ＰＯＤ Ｆａｂフラ
グメントの１：１００希釈液と共に３７℃で３０分間イ
ンキュベートした。次にジアミノベンジジンを色素源と
して使用してジゴキシゲニン−抗体複合体を可視化し
た。切片をニュートラルレッドで対比染色した。
【００４０】結果 ヒト結腸癌におけるＰＴＰα ｍＲＮＡレベルの増大 。
ＲＮアーゼ保護アッセイを使用して一次結腸直腸癌にお
けるヒトレセプター様ＰＴＰαの発現をｍＲＮＡレベル
で試験した。デュークの病期決定によりＤ期として分類
される１４個の腫瘍から全ＲＮＡを調製した。定義によ
ると、これらの一次病変は遠位転移を誘発した。本発明
者らはＰＴＰα発現の後発変化をＤ期で検出可能である
という推論に基づき、サンプルの不均一性を最小限にす
るために、Ｄ期の一次腫瘍のみを分析用に選択した。任
意の１個の腫瘍中のＰＴＰα ｍＲＮＡレベルを隣接す
る（少なくとも距離５ｃｍ離れた）正常結腸粘膜サンプ
ル中のレベルと比較した。サンプルＲＮＡをヒトＰＴＰ
α ｃＤＮＡのヌクレオチド３６９〜４２６の範囲の放
射性標識プローブとハイブリダイズした。これはＰＴＰ
αの細胞外領域の一部に対応し、ＰＴＰαに固有である
ことからこの領域を選択し、一方、ＰＴＰαの細胞内領
域をコードする配列の一部はレセプター様ＰＴＰεの同
様の部分をコードする配列と相同である（Ｋｒｕｅｇａ
ｒら（１９９０） ＥＭＢＯ Ｊ．９，３２４１−３２
５２）。１０対のサンプルで実施したＲＮアーゼ保護ア
ッセイの結果を図１に示す。５７及び５５ヌクレオチド
の２つの保護ＰＴＰαフラグメントは腫瘍及び隣接粘膜
中に一様に検出される。２つのシグナルの合計を使用し
てＰＴＰα ｍＲＮＡレベルを定量した。保護アッセイ
に使用されるＲＮＡの量を標準化するために、サンプル
をβ−アクチン（図示せず）又は１８Ｓ ＲＮＡ配列
（図１）で同時にプローブした。ＰＴＰα及び１８Ｓ
ＲＮＡ又はβ−アクチン保護フラグメントの定量及び標
準化によると、１４対のサンプルのうちの１０対（〜７
２％）において腫瘍中で検出可能なＰＴＰα ｍＲＮＡ
は正常粘膜中の２倍以上であった。これらの１０個のサ
ンプルにおける増大は２．２〜１０．３倍であった（図
２）。本発明者らは、この定常状態高レベルのＰＴＰα
ｍＲＮＡが腫瘍組織中の高メッセージ安定性に起因す
るのか又は高転写率に起因するのかを現時点では決定す
ることができない。４人の患者（＃７０７、８４８、１
１２５、８４４）からのサンプルは腫瘍におけるＰＴＰ
α ｍＲＮＡの増大を示さなかった。試験した腫瘍サン
プルに関する臨床データを表１に示す。
ＲＮアーゼ保護アッセイを使用して一次結腸直腸癌にお
けるヒトレセプター様ＰＴＰαの発現をｍＲＮＡレベル
で試験した。デュークの病期決定によりＤ期として分類
される１４個の腫瘍から全ＲＮＡを調製した。定義によ
ると、これらの一次病変は遠位転移を誘発した。本発明
者らはＰＴＰα発現の後発変化をＤ期で検出可能である
という推論に基づき、サンプルの不均一性を最小限にす
るために、Ｄ期の一次腫瘍のみを分析用に選択した。任
意の１個の腫瘍中のＰＴＰα ｍＲＮＡレベルを隣接す
る（少なくとも距離５ｃｍ離れた）正常結腸粘膜サンプ
ル中のレベルと比較した。サンプルＲＮＡをヒトＰＴＰ
α ｃＤＮＡのヌクレオチド３６９〜４２６の範囲の放
射性標識プローブとハイブリダイズした。これはＰＴＰ
αの細胞外領域の一部に対応し、ＰＴＰαに固有である
ことからこの領域を選択し、一方、ＰＴＰαの細胞内領
域をコードする配列の一部はレセプター様ＰＴＰεの同
様の部分をコードする配列と相同である（Ｋｒｕｅｇａ
ｒら（１９９０） ＥＭＢＯ Ｊ．９，３２４１−３２
５２）。１０対のサンプルで実施したＲＮアーゼ保護ア
ッセイの結果を図１に示す。５７及び５５ヌクレオチド
の２つの保護ＰＴＰαフラグメントは腫瘍及び隣接粘膜
中に一様に検出される。２つのシグナルの合計を使用し
てＰＴＰα ｍＲＮＡレベルを定量した。保護アッセイ
に使用されるＲＮＡの量を標準化するために、サンプル
をβ−アクチン（図示せず）又は１８Ｓ ＲＮＡ配列
（図１）で同時にプローブした。ＰＴＰα及び１８Ｓ
ＲＮＡ又はβ−アクチン保護フラグメントの定量及び標
準化によると、１４対のサンプルのうちの１０対（〜７
２％）において腫瘍中で検出可能なＰＴＰα ｍＲＮＡ
は正常粘膜中の２倍以上であった。これらの１０個のサ
ンプルにおける増大は２．２〜１０．３倍であった（図
２）。本発明者らは、この定常状態高レベルのＰＴＰα
ｍＲＮＡが腫瘍組織中の高メッセージ安定性に起因す
るのか又は高転写率に起因するのかを現時点では決定す
ることができない。４人の患者（＃７０７、８４８、１
１２５、８４４）からのサンプルは腫瘍におけるＰＴＰ
α ｍＲＮＡの増大を示さなかった。試験した腫瘍サン
プルに関する臨床データを表１に示す。
【００４１】ＰＴＰαは脳のような高発現組織に比較し
て肺、心臓及び胃のような器官では低度にしか発現され
ないという初期知見に従い、ＰＴＰα ｍＲＮＡは結腸
中に低レベルで存在する（図１のラット結腸及び脳サン
プルを比較されたい）（Ｍａｔｔｈｅｗｓら（１９９
０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ ８７， ４４４４−４４４８； Ｓａｐら（１９９
０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ ８７， ６１１２−６１１６）。
て肺、心臓及び胃のような器官では低度にしか発現され
ないという初期知見に従い、ＰＴＰα ｍＲＮＡは結腸
中に低レベルで存在する（図１のラット結腸及び脳サン
プルを比較されたい）（Ｍａｔｔｈｅｗｓら（１９９
０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ ８７， ４４４４−４４４８； Ｓａｐら（１９９
０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ ８７， ６１１２−６１１６）。
【００４２】結腸癌及び結腸粘膜組織におけるｉｎ ｓ
ｉｔｕ ＰＴＰα ＲＮＡハイブリダイゼーション。
ｉｔｕ ＰＴＰα ＲＮＡハイブリダイゼーション。
【００４３】腫瘍組織の不均一性により、腺癌及び隣接
粘膜の切片で非放射性ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＮＡハイブリ
ダイゼーションを実施し、ＰＴＰα発現の全体の増大に
関与する細胞を決定した。図３ａはヘマトキシリン及び
エオシンで染色したデュークのＤ期腫瘍の代表的な顕微
鏡写真であり、正常粘膜（図３ｂ）に比較すると典型的
な形態学的及び細胞学的異常を示している。ニュートラ
ルレッドで対比染色した腫瘍組織をジゴキシゲニン標識
化アンチセンスＰＴＰα ＲＮＡでプローブした処（図
３ｃ）、悪性変換上皮細胞は強いシグナルを示した。周
囲の間葉組織と新生物から少なくとも５ｃｍの距離の正
常粘膜（図３ｄ）は有効なシグナルを示さず、従って、
ＰＴＰα転写物の増加は実際の新生物と変換上皮細胞に
制限されることが確認された。対照として、同一腫瘍の
切片をＰＴＰαのｍＲＮＡセンス鎖でプローブしたが、
組織のどの部分も染色しなかった（図３ｅ）。結腸粘膜
（図３ｃ及び３ｄ）に比較して腫瘍組織中に観察された
強いシグナルは、腫瘍の一部のＲＮアーゼ保護アッセイ
により検出される高レベルのＰＴＰα ｍＲＮＡに一致
する。
粘膜の切片で非放射性ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＮＡハイブリ
ダイゼーションを実施し、ＰＴＰα発現の全体の増大に
関与する細胞を決定した。図３ａはヘマトキシリン及び
エオシンで染色したデュークのＤ期腫瘍の代表的な顕微
鏡写真であり、正常粘膜（図３ｂ）に比較すると典型的
な形態学的及び細胞学的異常を示している。ニュートラ
ルレッドで対比染色した腫瘍組織をジゴキシゲニン標識
化アンチセンスＰＴＰα ＲＮＡでプローブした処（図
３ｃ）、悪性変換上皮細胞は強いシグナルを示した。周
囲の間葉組織と新生物から少なくとも５ｃｍの距離の正
常粘膜（図３ｄ）は有効なシグナルを示さず、従って、
ＰＴＰα転写物の増加は実際の新生物と変換上皮細胞に
制限されることが確認された。対照として、同一腫瘍の
切片をＰＴＰαのｍＲＮＡセンス鎖でプローブしたが、
組織のどの部分も染色しなかった（図３ｅ）。結腸粘膜
（図３ｃ及び３ｄ）に比較して腫瘍組織中に観察された
強いシグナルは、腫瘍の一部のＲＮアーゼ保護アッセイ
により検出される高レベルのＰＴＰα ｍＲＮＡに一致
する。
【００４４】
【表１】 デュークのＤ期腫瘍及び粘膜におけるＰＴＰα ｍＲＮ
Ａレベルを試験した患者の臨床データ。部位：一次腫瘍
の部位；型：一次腫瘍の型；ＬＮ異常：リンパ節異常；
遠位転移：二次病巣の部位；ＰＴＰα ｍＲＮＡ増大：
腫瘍中のＰＴＰα ｍＲＮＡが粘膜中の少なくとも２
倍。
Ａレベルを試験した患者の臨床データ。部位：一次腫瘍
の部位；型：一次腫瘍の型；ＬＮ異常：リンパ節異常；
遠位転移：二次病巣の部位；ＰＴＰα ｍＲＮＡ増大：
腫瘍中のＰＴＰα ｍＲＮＡが粘膜中の少なくとも２
倍。
【００４５】結論 悪性変換に至る分子事象を解明するべく多数の研究が行
われている。本試験において本発明者らは、ＰＴＰαの
癌関与の可能性を調べた。その結果、まず最初に腫瘍中
の特異的レセプター様ＰＴＰ ｍＲＮＡの定常状態高レ
ベルが判明した。ＰＴＰαの過剰発現はデュークのＤ期
ヒト結腸癌に高頻度で生じる。１４サンプル対（腫瘍と
正常粘膜）のうちの１０対において腫瘍組織中のＰＴＰ
α転写物は隣接する正常粘膜組織の２〜１０倍であっ
た。これらの１０例のうちの４例の結腸腫瘍には正常粘
膜に比較して特に高レベルのＰＴＰα ｍＲＮＡ（＞６
倍）が観察された。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーシ
ョンによると、腫瘍サンプルの新生物細胞には高ＰＴＰ
α ｍＲＮＡが局在することが確認された。
われている。本試験において本発明者らは、ＰＴＰαの
癌関与の可能性を調べた。その結果、まず最初に腫瘍中
の特異的レセプター様ＰＴＰ ｍＲＮＡの定常状態高レ
ベルが判明した。ＰＴＰαの過剰発現はデュークのＤ期
ヒト結腸癌に高頻度で生じる。１４サンプル対（腫瘍と
正常粘膜）のうちの１０対において腫瘍組織中のＰＴＰ
α転写物は隣接する正常粘膜組織の２〜１０倍であっ
た。これらの１０例のうちの４例の結腸腫瘍には正常粘
膜に比較して特に高レベルのＰＴＰα ｍＲＮＡ（＞６
倍）が観察された。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーシ
ョンによると、腫瘍サンプルの新生物細胞には高ＰＴＰ
α ｍＲＮＡが局在することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＲＮアーゼ保護アッセイにより決定された結腸
直腸腫瘍及び結腸粘膜サンプル中のＰＴＰαの発現。デ
ュークのＤ期結腸腫瘍（Ｔ）及び隣接する結腸粘膜
（Ｍ）の対又はラット脳及び結腸からの全細胞ＲＮＡを
材料及び手法の項に記載したように混合し、標識化ＰＴ
Ｐα又は１８Ｓ ＲＮＡリボプローブと共にアニールし
た。ＲＮアーゼによる消化及びゲル電気泳動後、保護さ
れたフラグメントをオートラジオグラフィーにより可視
化した。患者参照番号を腫瘍及び粘膜サンプルの各対の
上に示す。
直腸腫瘍及び結腸粘膜サンプル中のＰＴＰαの発現。デ
ュークのＤ期結腸腫瘍（Ｔ）及び隣接する結腸粘膜
（Ｍ）の対又はラット脳及び結腸からの全細胞ＲＮＡを
材料及び手法の項に記載したように混合し、標識化ＰＴ
Ｐα又は１８Ｓ ＲＮＡリボプローブと共にアニールし
た。ＲＮアーゼによる消化及びゲル電気泳動後、保護さ
れたフラグメントをオートラジオグラフィーにより可視
化した。患者参照番号を腫瘍及び粘膜サンプルの各対の
上に示す。
【図２】結腸粘膜中に対する結腸腫瘍中ＰＴＰα ｍＲ
ＮＡの増大比。ＲＮアーゼ保護分析により検出されたＰ
ＴＰα及び１８Ｓ ＲＮＡ保護フラグメントをリン光イ
メージャーにより定量した。各サンプルにおけるＰＴＰ
α ｍＲＮＡ対１８ＳＲＮＡの比を計算することにより
ＰＴＰαシグナルを標準化した。１人の患者からの各サ
ンプル対毎に標準化腫瘍ＰＴＰα ｍＲＮＡ単位を標準
化粘膜ＰＴＰαｍＲＮＡ単位で除することにより粘膜中
に対する腫瘍中のＰＴＰα ｍＲＮＡの増大比を計算し
た。計算した増大比を各棒グラフの上に数字で示す。ア
ステリスクを付した２つのサンプルは、（１８Ｓ ＲＮ
Ａシグナルでなく）β−アクチンシグナルを標準化に使
用し、Ｖｉｓａｇｅ ２０００ Ｉｍａｇｅ分析システ
ム（商品名ＢｉｏＩｍａｇｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用
いてデンシトメトリー走査により定量を行った。患者参
照番号をグラフの下部に示す。
ＮＡの増大比。ＲＮアーゼ保護分析により検出されたＰ
ＴＰα及び１８Ｓ ＲＮＡ保護フラグメントをリン光イ
メージャーにより定量した。各サンプルにおけるＰＴＰ
α ｍＲＮＡ対１８ＳＲＮＡの比を計算することにより
ＰＴＰαシグナルを標準化した。１人の患者からの各サ
ンプル対毎に標準化腫瘍ＰＴＰα ｍＲＮＡ単位を標準
化粘膜ＰＴＰαｍＲＮＡ単位で除することにより粘膜中
に対する腫瘍中のＰＴＰα ｍＲＮＡの増大比を計算し
た。計算した増大比を各棒グラフの上に数字で示す。ア
ステリスクを付した２つのサンプルは、（１８Ｓ ＲＮ
Ａシグナルでなく）β−アクチンシグナルを標準化に使
用し、Ｖｉｓａｇｅ ２０００ Ｉｍａｇｅ分析システ
ム（商品名ＢｉｏＩｍａｇｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用
いてデンシトメトリー走査により定量を行った。患者参
照番号をグラフの下部に示す。
【図３】ＰＴＰα ｍＲＮＡとのｉｎ ｓｉｔｕハイブ
リダイゼーション。材料及び手法の項に記載したよう
に、結腸腫瘍（ａ，ｃ，ｅ）及び結腸粘膜（腫瘍から少
なくとも５ｃｍの距離）（ｂ，ｄ）から切片を作成し、
ヘマトキシリン及びエオシン（ａ，ｂ）で染色するか、
又はジゴキシゲニン標識化アンチセンスＰＴＰαＲＮＡ
（ｃ，ｄ）もしくはセンスＰＴＰα ＲＮＡ（ｅ）でプ
ローブし、ニュートラルレッドで対比染色した。
リダイゼーション。材料及び手法の項に記載したよう
に、結腸腫瘍（ａ，ｃ，ｅ）及び結腸粘膜（腫瘍から少
なくとも５ｃｍの距離）（ｂ，ｄ）から切片を作成し、
ヘマトキシリン及びエオシン（ａ，ｂ）で染色するか、
又はジゴキシゲニン標識化アンチセンスＰＴＰαＲＮＡ
（ｃ，ｄ）もしくはセンスＰＴＰα ＲＮＡ（ｅ）でプ
ローブし、ニュートラルレッドで対比染色した。
フロントページの続き (72)発明者 キヤサライナ・ジエイ・パルレン シンガポール国、シンガポール・0511、ケ ント・リツジ・クレセント・10
Claims (10)
- 【請求項１】 タンパク質チロシンホスファターゼα
（ＰＴＰα）又はＰＴＰα核酸を生物サンプル中で検出
することを特徴とする癌診断又は予後方法。 - 【請求項２】 新生物又は潜在的に新生物の疑いのある
組織から採取した第１の生物サンプル中のＰＴＰα又は
ＰＴＰα核酸レベルを正常組織から採取した第２の生物
サンプル中のレベルと比較する請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 第２の生物サンプルが正常組織のプール
に由来する請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 癌が結腸直腸癌である請求項１から３の
いずれか一項に記載の方法。 - 【請求項５】 ＰＴＰα又はＰＴＰα核酸を組織サンプ
ル中でｉｎ ｓｉｔｕ検出する請求項１から４のいずれ
か一項に記載の方法。 - 【請求項６】 ＰＴＰα又はＰＴＰα核酸を分離細胞タ
ンパク質又は分離細胞核酸のサンプル中で検出する請求
項１から４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項７】 ＰＴＰαがＰＴＰαに特異的なイムノグ
ロブリンを用いて検出される請求項１から６のいずれか
一項に記載の方法。 - 【請求項８】 ＰＴＰα核酸が核酸にハイブリダイズす
るオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される請求
項１から６のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項９】 ＰＴＰαに特異的なイムノグロブリン又
はＰＴＰα核酸に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ
もしくはプライマーを含むことを特徴とする癌診断又は
予後用キット。 - 【請求項１０】 イムノグロブリン、プローブ又はプラ
イマーを検出するための手段を更に含む請求項９に記載
のキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22420794A JPH0856699A (ja) | 1994-08-25 | 1994-08-25 | 腫瘍診断及び予後 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22420794A JPH0856699A (ja) | 1994-08-25 | 1994-08-25 | 腫瘍診断及び予後 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0856699A true JPH0856699A (ja) | 1996-03-05 |
Family
ID=16810206
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22420794A Pending JPH0856699A (ja) | 1994-08-25 | 1994-08-25 | 腫瘍診断及び予後 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0856699A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006101701A (ja) * | 2003-08-28 | 2006-04-20 | Veridex Llc | 結腸直腸のガンの予後予測 |
-
1994
- 1994-08-25 JP JP22420794A patent/JPH0856699A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006101701A (ja) * | 2003-08-28 | 2006-04-20 | Veridex Llc | 結腸直腸のガンの予後予測 |
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