JP2002538838A

JP2002538838A - 黒色腫の検出

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Publication number: JP2002538838A
Application number: JP2000605783A
Authority: JP
Inventors: ボリスバスチャン，; ダニエルピンクル，
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1999-03-17
Filing date: 2000-02-24
Publication date: 2002-11-19
Also published as: EP1169476A4; WO2000055367A1; CA2368109A1; US7470508B2; US20030073119A1; EP1169476A1; US6465180B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、患者由来のサンプルにおける、前悪性のメラノサイトの存在をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、黒色腫細胞において増幅される染色体領域におけるｔｏａ標的ポリヌクレオチド配列を選択的に結合するプローブを用いて、患者由来の生物学的サンプルからの核酸サンプルを接触する工程を包含する。またこのとき、プローブは、標的ポリヌクレオチド配列と選択的に結合し、安定なハイブリダイゼーション複合体を形成する。このハイブリダイゼーション複合体の形成を検出する工程もまた、包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）黒色腫とは、メラノサイトの悪性新生物をいう。その適切な診断および完全切
除による早期の処置が非常に重要である。なぜなら、進行した黒色腫は、不幸な
予後を有し、そしてほとんどの黒色腫は、早期に切除される場合、治癒可能であ
る。ほとんどの場合において、形質転換されたメラノサイトは、増加した量の色
素を産生し、その結果、関与するその領域は、臨床医によって容易に分かり得る
。黒色腫の切除縁は、この肉眼的な外観に基づいて同定されて、そして関与して
いないと思われる皮膚の縁が切除されない場合、黒色腫は、局所的再発の危険を
有する。

【０００２】このことは、一次腫瘍の厚さに依存して０．５ｃｍ〜３ｃｍで変動する正常皮
膚の安全縁を除去する勧めに導く（Ｗｉｎｇｏ，Ｐ．Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ８
２：１１９７−２０７（１９９８）；Ｒｉｇｅｌ，Ｄ．Ｓ．ら、ＪＡｍＡｃ
ａｄＤｅｒｍａｔｏｌ３４：８３９−４７（１９９６）；ＭｃＧｏｖｅｒｎ
，Ｖ．Ｊ．ら、Ｃａｎｃｅｒ３２：１４４６−５７（１９７３））。切除によ
って悩まされる、生じた欠損がかなり重要であることが明らかである。４ｍｍよ
りも大きな厚さを有する、直径で大きさが２ｃｍある黒色腫が現在のガイドライ
ンの下で切除されるべきである場合、生じる欠損は、直径で８ｃｍ（２＋３＋３
ｃｍ）である。２−３ｃｍの縁を有する切除の閉鎖は、通常、皮膚移植を必要と
し、そして悪い結果の可能性（例えば不満の残る美容的結果、増加する罹患率お
よび費用ならびにしばしば永久的な機能障害）を有する。「適切」な安全縁をも
ってしても、黒色腫は局所的に再発し得る。

【０００３】明らかに、縁が、個々の患者の腫瘍の必要に合わせられ得る場合が所望される
。不幸なことに、今のところ、腫瘍の程度を正確に検出し得る技術が存在しない
。いくつかの型の黒色腫において、腫瘍の水平方向に増殖した部分は、表皮の基
底層に沿う単一のメラノサイトを主に構成する。これらの黒色腫型は、黒子症（
ｌｅｎｔｉｇｉｎｏｕｓ）黒色腫といわれる。これらにおいて、異常な細胞の量
は、縁に向かってしばしば徐々に減少し、その結果、病理学者が黒色腫の境界を
決定することが困難または不可能となり得る。しかし、現在の意見は、ほとんど
の場合において、黒色腫の範囲は、病理学によって評価され得るということを暗
示する。しかし、「健康」な皮膚の縁の除去が、再発率を減少させるという事実
は、この皮膚は実際、健康ではなく、現在の方法によって検出不可能である黒色
腫の残りを含むということを示唆する。

【０００４】黒色腫を形成する能力を有する形態学的に正常な悪性になる前の細胞が同定さ
れ得る有用な手段の同定。本発明は、これらおよび他の必要性に取り組む。

【０００５】（発明の要旨）本発明は、患者に由来するサンプルにおける、悪性になる前のメラノサイトの
存在についてスクリーニングする方法を提供する。その方法は、患者からの生物
学的サンプルに由来する核酸サンプルを、黒色腫細胞において増幅される染色体
領域上の標的ポリヌクレオチド配列に選択的に結合するプローブに接触させる工
程を包含する。通常、標的配列のコピー数が決定される。その核酸サンプルは、
代表的に、患者における黒色腫病巣に隣接する形態学的に正常な細胞に由来する
。

【０００６】その方法において、プローブが安定なハイブリダイゼーション複合体を形成す
るように選択的に標的ポリヌクレオチド配列と結合する条件下で、プローブがサ
ンプルと接触されて、そしてハイブリダイゼーション複合体の情報が検出される
。その標的配列は、１１ｐ１５、１１ｑ１３、２２ｑ１２、７ｐ、６ｐ、１ｑ、
１２ｑ１４、および５ｐからなる群から選択される。

【０００７】その核酸サンプルの性質は、本発明に対して重要ではない。いくつかの実施形
態において、核酸サンプルは、中期スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）または静止期核
である。代表的に、そのプローブは、例えば蛍光標識を用いて標識される。その
標識は直接標識であり得る。通常、第２染色体領域（例えば、セントロメア）に
対する参照プローブが、内部コントロールとしてこの方法において使用される。
これらの実施形態において、第２のプローブは、標的ポリヌクレオチド配列に選
択的にハイブリダイズするプローブ上の標識と区別可能な蛍光標識で標識される
。

【０００８】いくつかの実施形態において、そのプローブは、反復配列を含み得る。この場
合において、その方法は、反復配列のハイブリダイゼーション能力をブロッキン
グする工程をさらに包含し得、反復配列（例えば、Ｃｏｔ−１ＤＮＡ）を含む
核酸をブロッキングする非標識化プローブが、この目的のためにサンプルと接触
され得る。

【０００９】核酸ハイブリダイゼーションが、多数の形式において実行され得る。例えば、
そのハイブリダイゼーションは、インサイチュハイブリダイゼーションであり得
る。いくつかの実施形態において、そのプローブは、固体基板（ｓｕｂｓｔｒａ
ｔｅ）（例えば、核酸アレイのメンバーとして）に結合される。

【００１０】（定義）本発明の理解を容易にするために、多数の用語が以下に定義される。

【００１１】本明細書中で使用される用語「アンプリコン」とは、ゲノム核酸のある領域を
いい、これは、変更されたコピー数で存在する場合、癌に関連する。例えば、本
発明は、核酸配列を提供し、異常なコピー数で存在する場合には、黒色腫と関連
する。

【００１２】「動物」とは、動物界のメンバーをいい、多細胞性、神経系の所有、随意運動
、体内消化などによって特徴付けられる。「動物」は、ヒトまたは他の動物であ
り得る。好ましい動物としては、ヒト、非ヒト霊長類、および他の哺乳動物が挙
げられる。従って、本発明の方法は、獣医学的適用ならびにヒトに指向された医
学的適用を意図するということが認識される。

【００１３】動物における「癌」とは、癌原因細胞の代表的な特徴（例えば、非制御化増殖
、不死、転移可能性、急激な増殖および増殖速度ならびに特定の特有の形態学的
特徴）を所有する細胞の存在をいう。しばしば、癌細胞は、腫瘍の形態であるが
、そのような細胞は、動物内に単独で存在するか、または非腫瘍化癌細胞（例え
ば、白血病細胞）であり得る。癌としては、黒色腫、乳癌、肺癌、気管支癌、結
腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳もしくは中枢神経系癌
、末梢神経系癌、食道癌、頸部癌、子宮または子宮内膜癌、口腔もしくは咽頭の
癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸もしくは虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺
癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫などが挙げられるが、これらに限定されない。

【００１４】語句「癌を検出する」とは、動物（この場合、黒色腫細胞、または前悪性のメ
ラノサイト）における癌の存在または非存在下での確認をいう。「癌を検出する
」とはまた、動物における癌細胞の存在の可能性に関する、または可能性または
癌の発症への偏好に対する間接的な証拠をいう。癌を検出することは、本発明の
方法のみを使用して、あるいは他の方法と組み合わせて、または動物の健康状態
に関する他の情報の観点において、達成され得る。

【００１５】用語「特異的にハイブリダイズする」および「特異的ハイブリダイゼイション
」は、本明細書中で使用される場合、ストリンジェントな条件下で、特定のヌク
レオチド配列に、優先的に、核酸分子を結合するか、二重鎖形成するか、または
ハイブリダイズすることをいう。用語「ストリンジェントな条件」とは、プロー
ブが、その標的サブ配列に優先的にハイブリダイズし、そして他の配列により低
い程度か、または全くハイブリダイズしないことをいう。核酸ハイブリダイゼイ
ション（例えば、アレイ、サザン、またはノーザンハイブリダイゼーションにお
けるように）の観点で「ストリンジェントなハイブリダイゼイション」および「
ストリンジェントなハイブリダイゼイション洗浄条件」は、配列依存性であり、
そして異なる環境パラメータ下で異なる。核酸のハイブリダイゼイションに対す
る広範なガイドは、例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ--ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈＮｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓＰａｒｔ１、第２章、「Ｏｖｅｒｖｉｅ
ｗｏｆｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄ
ｔｈｅｓｔｒａｔｅｇｙｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｐｒｏｂｅ
ａｓｓａｙｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ＮＹ（「Ｔｉｊｓｓｅｎ」）に見出される
。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼイションおよび洗浄条件は
、所定のイオン強度およびｐＨにおいて、特異的な配列に対して、熱融点（Ｔ_m
）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔ_mは、標的配列の５０％が完全に
一致した配列にハイブリダイズする温度（所定のイオン強度およびｐＨ下で）で
ある。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブに対してＴ_mと等しく
なるように選択される。サザンまたはノーザンブロットにおいて、アレイまたは
、フィルター上の１００より多い相補残基を有する相補核酸のハイブリダイザイ
ションのためのストリンジェントなハイブリダイザイション条件の例は、４２℃
であり、標準的なハイブリダイゼイション溶液を使用し（例えば、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＭａｎｕａｌ（第２版）１−３巻、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓ
ｓ、ＮＹ、および以下の詳細な議論を参照のこと）、ハイブリダイゼイションは
、一晩実施される。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、７２℃で約１５
分間の０．１５ＭＮａＣｌである。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５
℃で１５分間の０．２×ＳＳＣ洗浄である（例えば、ＳＳＣ緩衝液の記載につい
てのＳａｍｂｒｏｏｋ（前出）を参照のこと）。しばしば、高度なストリンジェ
ンシー洗浄が、バックグラウンドプローブシグナルを除去するために低度のスト
レンジェンシー洗浄の後に行われる。例えば、１００より多いヌクレオチドの二
重鎖形成のための、例示的な中程度のストリンジェンシー洗浄は、４５℃で１５
分間の１×ＳＳＣである。例えば、１００より多いヌクレオチドの二重鎖形成の
ための低度のストリンジェンシー洗浄の例は、４０℃で１５分間の４×ＳＳＣ〜
６×ＳＳＣである。

【００１６】本明細書中で使用される場合、用語「検出可能な組成物で標識された」とは、
検出可能な組成物（すなわち、標識）に付着された核酸をいう。検出は、例えば
、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、物理的手段ま
たは化学的手段によってであり得る。例えば、有用なラベルには、³²Ｐ、³⁵Ｓ、 ³ Ｈ、¹⁴Ｃ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ；蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタ
ニドリン（ｌａｎｔｈａｎｉｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒ）、Ｔｅｘａｓｒｅｄ）
、電子高密度試薬（例えば、金）、例えば、ＥＬＩＳＡにおいて通常使用される
ような酵素（ホースラディシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシ
フェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、比色分析用標識（例えば、コロイド状
金）、磁気標識（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ^TM）、ビオチン、ジゴキシゲニン
（ｄｉｏｘｉｇｅｎｉｎ）、あるいは抗血清またはモノクローナル抗体が利用で
きるハプテンまたはタンパク質が挙げられる。この標識は、検出される核酸、ペ
プチド、または他の標的に直接組み込まれるか、または標的にハイブリザイズす
るか、または結合するプローブまたは抗体に付着され得る。ペプチドは、第２の
レポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、第２の抗体のための結合部位、
転写アクティベータポリペプチド、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によっ
て認識される所定のポリペプチドエピトープを組み込むことによって検出可能と
なり得る。標識は、潜在的な立体障害、あるいは他の有用または所望の特性の対
する影響を減少するために種々の長さのスペーサーアームによって付着される。
例えば、Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ（１９９５）ＭｏｌＣｅｌｌＰｒｏｂｅｓ９
：１４５−１５６。

【００１７】用語「黒色腫」または「皮膚黒色腫」は、メラノサイトの悪性新生物をいい、
これらは、通常表皮に、そして時折真皮に存在する色素細胞である。４つの型の
皮膚黒色腫が存在する：悪性黒子黒色腫、皮相拡張黒色腫（ＳＳＭ）、結節性黒
色腫、および末端部黒子黒色腫（ＡＭ）。黒色腫は通常、表皮と真皮の接合部に
おいて、単一のメラノサイトの増殖として開始する。細胞は、最初に、水平方向
に増殖し、そして数ミリメートル〜数センチメートルで変化し得る皮膚の領域に
落ち着く。上記のように、ほとんどの場合において、トランスフォームされたメ
ラノサイトは、色素量の増加を生じ、その結果、関係する領域が臨床医によって
容易に理解され得る。

【００１８】本明細書中で使用される場合、用語「核酸」は、１本鎖形態または２本鎖形態
のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドをいう。この用
語は、核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド）を包含し、この核酸は、参照核酸
として、所望の目的のために、類似または改良された結合特性を有する天然のヌ
クレオチドの公知のアナログを含む。この用語はまた、天然のヌクレオチドに類
似した様式で、または所望の目的のために改良された速度で代謝される核酸を含
む。この用語はまた、合成骨格を有する核酸様構造体を包含する。本発明によっ
て提供されるＤＮＡ骨格アナログは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、
ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホラミデート、アルキルホス
ホトリエステル、サルファメート、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイ
ミノ）、３’−Ｎ−カルバメート、モルホリノカルバメート、およびペプチド核
酸（ＰＮＡ）；例えば、ＯｌｉｇｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＡｎａｌｏ
ｇｕｅｓ，ａＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ
編、ＩＲＬＰｒｅｓｓａｔＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅ
ｓｓ（１９９１）；ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＳｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ａｎｎａｌｓ
ｏｆｔｈｅＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ
，６００巻、ＢａｓｅｒｇａおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編（ＮＹＡＳ１９９２）
；Ｍｉｌｌｉｇａｎ（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１９２３−１９
７３；ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎｓ（１９９３、ＣＲＣＰｒｅｓｓ）を参照のこと。ＰＮＡは、非イオン性骨
格を含む（例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位）。ホスホロチオエ
ート結合は、ＷＯ９７／０３２１１；ＷＯ９６／３９１５４、；Ｍａｔａ（
１９９７）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４４：１８９−
１９７に記載される。この用語によって包含される他の合成骨格には、メチルホ
スホネート結合またはメチルホスホネートおよびホスホジエステルの交互結合（
Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３６：
８６９２−８６９８）、ならびにベンジルホスホネート結合（Ｓｍａｓｔａｇ（
１９９６）ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＤｒｕｇＤｅｖ
６：１５３−１５６）が挙げられる。用語核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮ
Ａ、オリゴヌクレオチドプライマー、プローブ、および増幅産物と交換可能に使
用される。

【００１９】本明細書中で使用される場合、用語「核酸アレイ」とは、複数の標的エレメン
トであり、各標的エレメントは、サンプルの核酸がハイブリダイズされ得る１つ
以上の固体表面上に固定された１つ以上の核酸分子（プローブ）を含む。標的エ
レメントの核酸は、特定の遺伝子またはクローン由来（例えば、ここで同定され
る領域から）の配列を含み得る。例えば、他の標的エレメントは、参照配列を含
み得る。種々の寸法の標的エレメントは、本発明のアレイにおいて使用され得る
。一般に、より小さな標的エレメントが好ましい。代表的に、標的エレメントは
、直径約１ｃｍ未満である。一般に、エレメントのサイズは、１μｍ〜約３ｍｍ
、好ましくは、約５μｍと約１μｍとの間である。このアレイの標的エレメント
は、異なる密度で固体表面上に整列され得る。この標的エレメント密度は、因子
（例えば、標識、固体支持体などの性質）の数に依存する。当業者は、各標的エ
レメントが、異なる長さおよび配列の核酸の混合物を含み得ることを認識する。
従って、例えば、標的エレメントは、１を超えるＤＮＡのクローン断片のコピー
を含み得、そして各コピーは、異なる長さのフラグメントへ切断され得る。標的
エレメント上に固定された核酸の長さおよび複雑性は、本発明にとって重要では
ない。当業者は、これらの因子を調整して、所定のハイブリダイゼーション手順
に、最適なハイブリダイゼーションおよびシグナル生成を提供し、そして異なる
遺伝子またはゲノムの座位の間での必要とされる分離を提供し得る。種々の実施
形態において、標的エレメント配列は、約１ｋｂと約１Ｍｂとの間、約１０ｋｂ
と約５００ｋｂとの間、約２００と約５００ｋｂとの間および約５０ｋｂと約１
５０ｋｂとの間の複雑性を有する。

【００２０】本明細書中で使用される場合、用語「核酸サンプル」または「ヒト核酸のサン
プル」とは、ハイブリダイゼーションまたは増幅による検出に適切な形態のヒト
ＤＮＡまたはＲＮＡを含むサンプルをいう。代表的には、このサンプルは、黒色
腫を有するかその恐れのある患者由来の組織サンプルから調製される。このサン
プルは、大抵、黒色腫瘍周辺の組織から調製される。

【００２１】多くの場合、核酸サンプルは、以下に記載される標準のインサイチュハイブリ
ダイゼーション方法のために調製される組織または細胞のサンプルである。この
サンプルは、個々の染色体が実質的にインタクトのままであり、そして標準の技
術に従って調製される分裂中期の展開または静止期の核を代表的に含む。あるい
は、この核酸は、単離されるか、クローン化されるかまたは増幅され得る。この
核酸は、例えば、特定の染色体由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡ
、または選択配列（例えば、特定のプロモーター、遺伝子、増幅フラグメントも
しくは制限フラグメント、ｃＤＮＡなど）（本明細書に特定の単位複製配列また
は欠失が開示される）であり得る。

【００２２】この核酸サンプルは、特定の細胞または組織（例えば、黒色腫）から抽出され
得る。細胞および組織サンプルを単離する方法は、当業者に周知であり、そして
吸引生検、組織切片化生検、針生検などが挙げられるが、これらに限定されない
。このサンプルは、しばしば、「臨床的サンプル」であり、これは、組織学的目的
のために取り出された凍結切片またはパラフィン切片のような組織の切片を含む
、患者からのサンプルである。このサンプルはまた、組織培養物由来の（細胞の
）上清またそれらの細胞、組織培養物由来の細胞自体、および染色体異常性を検
出するかまたは単位複製配列コピー数を決定することが望ましくあり得る他の培
地に由来し得る。いくつかの場合、核酸は、ハイブリダイゼーションの前に、Ｐ
ＣＲのような標準の技術を使用して増幅され得る。このサンプルは、固体上に固
定される単離された核酸であり得る。

【００２３】「前悪性のメラノサイト」は、悪性黒色腫瘍を形成する能力を有する形態学的
に正常な細胞である。このような細胞は、代表的に黒色腫瘍に近接して見出され
る。本明細書で使用する場合、「近接」は、腫瘍における最も近い異型細胞から
５ｃｍ未満、通常３ｃｍ未満を意味する。

【００２４】本明細書中で使用する場合、用語「プローブ」または「核酸プローブ」は、サ
ンプルへのハイブリダイゼーションが検出可能な１つ以上の核酸フラグメントの
コレクションであると規定される。このプローブは、以下に記載するように非標
識または標識され得、その結果、標的またはサンプルへのその結合は、検出され
得る。このプローブは、ゲノムの１つ以上の特定の（予め選択された）部分から
の核酸の供給源（例えば、１つ以上のクローン、単離された全染色体もしくは染
色体フラグメント、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅生成物のコレク
ション）から生成される。本発明のプローブは、本明細書中に記載される領域に
おいて見出される核酸から生成される。プローブまたはゲノム核酸サンプルは、
いくつかの様式で（例えば、反復核酸のブロッキングもしくは除去、または固有
の核酸での富化により）加工され得る。語「サンプル」は、検出された核酸のみ
ではなく、これらが標的に適用される（例えば、ブロッキング核酸などを有する
）形式における検出可能な核酸をいうために本明細書中で使用され得る。ブロッ
キング核酸とはまた、別々にいわれる。特に「プローブ」がいうことは、この語
が使用される文脈から明らかである。プローブはまた、アレイにおける場合、固
体表面（例えば、ニトロセルロース、ガラス、水晶、石英スライド）上に固定さ
れた単離された核酸であり得る。いくつかの実施形態において、プローブは、例
えば、ＷＯ９６／１７９５８に記載されるように核酸にアレイのメンバーであ
り得る。高密度なアレイを生成し得る技術はまた、この目的のために使用され得
る（例えば、Ｆｏｄｏｒ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ７６７−７７３；Ｊｏｈ
ｎｓｔｏｎ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：Ｒ１７１−Ｒ１７４；Ｓｃｈ
ｕｍｍｅｒ（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２３：１０８７−１０９
２；Ｋｅｒｎ（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２３：１２０−１２４
；米国特許第５，１４３，８５４号を参照のこと）当業者は、本明細書中に記載
される特定のプローブの正確な配列が、開示されるプローブに対して「実質的に
同一」であるプローブを産生するためにある程度まで改変し得ることを認識する
が、これらが誘導されたプローブから（上記の議論を参照のこと）プローブとし
て同じ標的またはサンプルに特異的に結合する（すなわち、特異的にハイブリダ
イズする）能力は保持する。このような改変は、本明細書中に記載される個々の
プローブを参照することにより特異的にカバーされる。

【００２５】「核酸サンプルを提供する（こと）」は、本発明に記載される方法における使
用のために生物学的サンプルを得ることを意味する。最も頻繁には、動物由来の
細胞のサンプルを取り出すことにより行われるが、事前に単離された（例えば別
の人により単離された）細胞を使用するかまたはインビボでの本発明の方法の実
施により達成され得る。

【００２６】「組織生検」とは、診断分析のために生物学的サンプルを取り出すことをいう
。癌を有する患者において、組織が癌から取り出され得、腫瘍中の細胞の分析を
可能にする。

【００２７】（特定の実施形態の説明）黒色腫の発症率は、最近の５０年にわたり有意に増加している。（Ｗｉｎｇｏ
，Ｐ．Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ８２：１１９７−１２０７（１９９８）；Ｒｉｇ
ｅｌ，Ｄ．Ｓ．ら、ＪＡｍＡｃａｄＤｅｒｍａｔｏｌ３４：８３９−８
４７（１９９６））。黒色腫の臨床的および組織学的な提示が全体的に同種では
ないが、解剖学的位置、太陽曝露のタイプ、年齢ならびに民族性の間の関連のパ
ターンを示すことが長い間注目されてきた。これらのパターンは、原発性皮膚黒
色腫の異なるタイプの分類の提唱に至った：悪性黒子、表在性展開（ｓｕｐｅｒ
ｆｉｃｉａｌｓｐｒｅａｄｉｎｇ）、結節性黒色腫および肢端黒色腫（ＭｃＧ
ｏｖｅｒｎ，Ｖ．Ｊ．ら、Ｃａｎｃｅｒ３２：１４４６−１４５７（１９７３
））。しかし、これらの黒色腫のタイプの特定の組織学的特色が重複し、そして
これらのタイプの間の独立した予知的な差異が記載されていないので（Ｋｒｅｍ
ｅｎｔｚ，Ｅ．Ｔ．ら、ＡｎｎＳｕｒｇ１９５：６３２−６４５（１９８２
）；Ｐａｎｉｚｚｏｎ，Ｒ．ら、ＳｃｈｗｅｉｚＭｅｄＷｏｃｈｅｎｓｃｈ
ｒ１１２：６１２−６１８（１９８２）；Ｂｒａｕｎｉｎｇｅｒ，Ｈ．ら、Ｈ
ａｕｔａｒｚｔ４５：５２９−５３１（１９９４））、このような分類につい
ての正当化は、議論されるようになった（Ａｃｋｅｒｍａｎ，Ａ．Ｂ．ら、Ｈｕ
ｍＰａｔｈｏｌ１７：４３８−４４０（１９８６）；Ｆｌｏｔｔｅ，Ｔ．Ｊ
．ら、ＨｕｍＰａｔｈｏｌ１７：４４１−４４２（１９８６））。従って、
これらは、黒色腫を扱う臨床家および病理学者の間で傾向が増大しているようで
あり、原発性皮膚黒色腫が単一の疾患要素としてみなされる。さらに、基礎研究
において使用されるヒト黒色腫細胞株は、通常これらが由来する黒色腫に基づい
て同定されない。従って、黒色腫のタイプの間の潜在的な差異を考慮しない黒色
腫についての基礎研究は、特定のタイプにのみに関する関連を見過ごす素因にな
り得、そしてそれにより研究の前進を妨害する。

【００２８】本発明は、領域（染色体１１ｐ１５、１１ｑ１３、２２ｑ１２、７ｐ、６ｐ、
１ｑ、１２ｑ１４、５ｐ）のマーカーが黒色腫において増大することが頻繁に見
出されるというこの知見に基づき、これは、従来の方法よりも高度な感受性を伴
って、切除検体の縁の、形態学的に正常であるが遺伝的に異常である細胞（本明
細書では前悪性のメラノサイトという）を検出するために使用され得る。

【００２９】（コピー数の検出）１つの実施形態では、前悪性のメラノサイトの存在は、本明細書で同定される
領域のコピー数の決定により、単純に評価される。代表的に、評価された領域は
、１１ｐ１５、１１ｑ１３、２２ｑ１２、７ｐ、６ｐ、１ｑ、１２ｑ１４および
５ｐである。特定の遺伝子または染色体の領域のコピー数を評価する方法は、当
業者に周知である。

【００３０】（ハイブリダイゼーションに基づくアッセイ）好ましいハイブリダイゼーションに基づくアッセイとしては、伝統的な「直接
的プローブ」方法（例えば、サザンブロットまたはインサイチュハイブリダイゼ
ーション（例えば、ＦＩＳＨ）、および「比較プローブ」方法（例えば、比較ゲ
ノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）））が挙げられるが、これらに限定され
ない。これらの方法は、広範な種々の形式（以下に記載されるような、基板−（
例えば、膜またはガラス）結合方法またはアレイに基づく試みが挙げられるが、
これらの限定されない）で使用され得る。

【００３１】インサイチュハイブリダイゼーションアッセイは、周知である（例えば、Ａｎ
ｇｅｒｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ１５２：６４９）。一般に
、インサイチュハイブリダイゼーションは、以下の主要な工程を包含する：（１
）分析するための組織または生物学的構造体の固定化；（２）標的ＤＮＡの接触
性を増加し、そして非特異的結合を減少するための生物学的構造体の前ハイブリ
ダイゼーション処理；（３）生物学的構造体または組織中の核酸への、核酸の混
合物のハイブリダイゼーション；（４）ハイブリダイゼーションにおいて結合し
なかった核酸フラグメントを除去するためのハイブリダイゼーション後の洗浄、
および（５）ハイブリダイズした核酸フラグメントの検出。これらの工程の各々
において使用される試薬および使用のための条件は、特定の適用に依存して変化
する。

【００３２】代表的なインサイチュハイブリダイゼーションアッセイにおいて、細胞は、固
体支持体（代表的にはガラススライド）に固定される。核酸が検出される場合、
細胞は、代表的に熱またはアルカリで変性される。次いで、この細胞は、温和な
温度でハイブリダイゼーション溶液と接触させられ、タンパク質をコードする核
酸配列に特異的な標識プローブにアニーリングさせる。次いで、標的（例えば、
細胞）は、代表的には、事前に決定されたストリンジェンシーまたは適切なシグ
ナル対ノイズ比が得られるまで増加したストリンジェンシーで洗浄される。

【００３３】このプローブは、代表的には、例えば、放射性同位体または蛍光レポーターで
標識される。二本鎖のニックトランスレーションされた核酸について、好ましい
サイズ範囲は、約２００ｂｐ〜約１０００塩基、より好ましくは、約４００〜約
８００ｂｐの間である。

【００３４】いくつかの適用において、反復配列のハイブリダイゼーション能力をブロック
することが必要である。従って、いくつかの実施形態では、ヒトゲノムＤＮＡま
たはＣｏｔ−１ＤＮＡが非特異的ハイブリダイゼーションをブロックするため
に使用される。

【００３５】比較ゲノムハイブリダイゼーション方法において、（サンプル）核酸（例えば
、生じ得る腫瘍由来）の第１のコレクションは、第１の標識で標識され、一方、
第２の（コントロール）核酸のコレクション（例えば、健康な細胞／組織由来）
は、第２の標識で標識される。核酸のハイブリダイゼーションの比は、アレイ中
の各ファイバーに結合する２つ（第１および第２）の標識の比により決定される
。染色体の欠損または増殖が存在する場合、２つの標識に由来するシグナルの比
における差異が検出され、そしてその比は、コピー数の尺度を提供する。

【００３６】本発明の方法を用いる使用に適切なハイブリダイゼーションプロトコールは、
例えば、Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ（１９８４）ＥＭＢＯＪ．３：１２２７〜１２３
４；Ｐｉｎｋｅｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８５：９１３８〜９１４２；欧州公開番号４３０，４０２号；Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第３３巻：ＩｎＳｉｔｕＨ
ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃｈｏｏ編、Ｈｕｍａｎａ
Ｐｕｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（１９９４）などに記載されている。１つの
特に好ましい実施形態では、Ｐｉｎｋｅｌら（１９９８）ＮａｔｕｒｅＧｅｎ
ｅｔｉｃｓ２０：２０７〜２１１またはＫａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ（１９９２）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：５３２１〜５３２５（
１９９２）のハイブリダイゼーションプロトコールが使用される。

【００３７】本発明の方法は、特に、アレイに基づくハイブリダイゼーション形式に十分に
適している。１つの好ましいアレイに基づくハイブリダイゼーション系の記載に
ついては、Ｐｉｎｋｅｌら（１９９８）ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，２０
：２０７〜２１１を参照のこと。

【００３８】アレイは、１以上の表面（例えば、固体、膜、またはゲル）に付着した、多様
な異なる「プローブ」または「標的」核酸（または他の化合物）である。好まし
い実施形態において、多様な核酸（または他の部分）は、１つの連続する表面ま
たは互いに並列の多用な表面に付着される。

【００３９】アレイ形式において、多数の異なるハイブリダイゼーション反応が、本質的に
「並列」して実行される。これは、１回の「実験」において、多数のハイブリダ
イゼーションの迅速で本質的に同時の評価を提供する。アレイ基づく形式におい
て、ハイブリダイゼーション反応を実行する方法は、当業者に周知である（例え
ば、Ｐａｓｔｉｎｅｎ（１９９７）ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．７：６０６〜６１４
；Ｊａｃｋｓｏｎ（１９９６）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１
４：１６８５；Ｃｈｅｅ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４：６１０；ＷＯ９
６／１７９５８を参照のこと）。

【００４０】アレイ、特に核酸アレイは、当業者に周知の広範な種々の方法に従って生成さ
れ得る。例えば、単純な実施形態において、「低密度」アレイは、単純に、固体
支持体（例えば、ガラス表面、膜など）上の異なる位置に、異なる核酸をスポッ
トすることによって（例えば、ピペットを手動で使用することによって）生成さ
れ得る。

【００４１】この単純なスポッティングアプローチは、高密度にスポットされたアレイを生
成するために自動化されている（例えば、米国特許第５，８０７，５２２号を参
照のこと）。この特許は、低容量の生物学的サンプルを沈着させるために、表面
に対してマイクロキャピラリーをタップ（ｔａｐ）する自動化システムの使用を
記載している。このプロセスは、高密度アレイを作製するために繰り返される。
アレイはまた、オリゴヌクレオチド合成技術を使用して生成され得る。従って、
例えば、米国特許第５，１４３，８５４号ならびにＰＣＴ特許公開番号ＷＯ９０
／１５０７０およびＷＯ９２／１００９２は、高密度オリゴヌクレオチドアレイ
の光指向性コンビナトリアル合成の使用を教示している。

【００４２】別の実施形態において、アレイ、特にスポットされたアレイとしては、ゲノム
ＤＮＡ（例えば、目的の領域に対応するアンプリコンの高解像度スキャンを提供
する重複クローン）が挙げられ得る。アンプリコン核酸は、例えば、ＭＡＣ、Ｙ
ＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、Ｐ１、コスミド、プラスミド、ゲノムクローンのＡｌｕ
間ＰＣＲ産物、ゲノムクローンの制限消化物、ｃＤＮＡクローン、増幅（例えば
、ＰＣＲ）産物などから入手され得る。

【００４３】種々の実施形態において、アレイ核酸は、以下に記載されるように、本発明の
標的配列にわたるかまたはこの標的配列を含むクローンの以前にマッピングされ
たライブラリー、ならびにゲノムの他の領域からのクローンに由来する。アレイ
は、サンプルの核酸の単一集団とハイブリダイズされ得るか、または２つの差示
的に標識されたコレクション（試験サンプルおよび参照サンプルに関する）を用
いて使用され得る。

【００４４】種々の固体表面上に核酸を固定化するための多くの方法は、当該分野で公知で
ある。広範な種々の有機ポリマーおよび無機ポリマー、ならびに他の材料（天然
および合成の両方）が、固体表面の材料として用いられ得る。例示的な固体表面
としては、例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、クォーツ、ジアゾ化
された膜（紙もしくはナイロン）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロ
ース、およびセルロースアセテートが挙げられる。さらに、プラスチック（例え
ば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなど）が使用され得る。用い
られ得る他の材料としては、紙、セラミック、金属、非金属、半導体材料、サー
メットなどが挙げられる。さらに、ゲルを形成する物質が、使用され得る。この
ような材料としては、例えば、タンパク質（例えば、ゼラチン）、リポポリサッ
カリド、ケイ酸塩、アガロースおよびポリアクリルアミドが挙げられる。固体表
面が多孔性である場合には、種々の孔サイズが、系の性質に依存して用いられ得
る。

【００４５】表面の調製において、複数の異なる材料（特に積層物）が、種々の特性を得る
ために用いられ得る。例えば、タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）また
は高分子の混合物（例えば、デンハート溶液）は、非特異的結合を回避し、共有
結合の結合体化を単純化し、シグナル検出を増強するためなどに用いられ得る。
化合物と表面との間の共有結合が所望される場合、この表面は、通常、多重官能
性（ｐｏｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）であるか、または多重官能化され得る。表
面上に存在し、そして連結のために使用され得る官能基としては、カルボン酸、
アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基
などが挙げられる。種々の表面に広範な種々の化合物を連結する様式は、周知で
あり、そして文献に十分に例示されている。

【００４６】例えば、分子に種々の官能基を導入することによって核酸を固定化するための
方法が、公知である（例えば、Ｂｉｓｃｈｏｆｆ（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．，１６４：３３６〜３４４；Ｋｒｅｍｓｋｙ（１９８７）Ｎｕｃｌ．
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：２８９１〜２９１０を参照のこと）。改変された核
酸は、改変された塩基を含むＰＣＲプライマーを使用してか、または改変された
ヌクレオチドを用いる酵素による末端標識によって、標的上に配置される。本発
明の核酸アレイに対するガラス支持体または膜支持体（例えば、ニトロセルロー
ス、ナイロン、ポリプロピレン）の使用は、比較的に高いエレメント密度で標的
を整列する手動方法およびロボットを利用する方法を用いる十分に開発された技
術のために有利である。このような膜は、一般的に入手可能であり、そして膜へ
のハイブリダイゼーションについてのプロトコールおよび装置は、周知である。

【００４７】種々のサイズ（１ｍｍの直径から１μｍまでの範囲）の標的エレメントが、使
用され得る。少量の濃縮され固定されたプローブＤＮＡを含むより小さな標的エ
レメントが、高い複雑性の比較ハイブリダイゼーションに使用される。なぜなら
各標的エレメントに結合するために利用可能なサンプル全体量が、制限されるか
らである。従って、入手されるシグナルが高度に局在し、そして輝くように、少
量の濃縮されたプローブＤＮＡを含む小さなアレイの標的エレメントを有するこ
とは、利点である。このような小さなアレイの標的エレメントは、代表的には、
１０⁴／ｃｍ²よりも大きな密度のアレイで使用される。１個の画像において多数
の標的エレメントからのデータの取得を許容する、１ｃｍ²の面積を定量的に蛍
光画像化し得る比較的簡単なアプローチが、記載されている（例えば、Ｗｉｔｔ
ｒｕｐ（１９９４）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ１６：２０６〜２１３を参照のこと）
。

【００４８】膜よりもかなり低い蛍光の固体表面基板（例えば、ガラス、クォーツもしくは
小さなビーズ）上のアレイは、より良好な感度を達成し得る。基板（例えば、ガ
ラスもしくは融合シリカ）は、非常に低い蛍光の基板、および高度に効率的なハ
イブリダイゼーション環境を提供するという点で有利である。ガラスもしくは合
成融合シリカへの標的核酸の共有結合による付着は、多数の公知の技術（上記）
に従って達成され得る。核酸は、市販の試薬を使用してガラスに都合よく結合さ
れ得る。例えば、多数の官能基を有するシラン化されたガラスの調製のための材
料は、市販されているか、または標準的な技術を使用して調製され得る（例えば
、Ｇａｉｔ（１９８４）ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ
：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｕｒｓｓ，Ｗａｓｈ
．，Ｄ．Ｃ．を参照のこと）。ガラスよりも少なくとも１０倍低い自己蛍光を有
するクォーツスライドガラスもまた、シアル化され得る。

【００４９】あるいは、プローブはまた、コーティングされた市販のビーズまたは他の表面
上に固定化され得る。例えば、ビオチン末端標識核酸は、アビジンでコーティン
グされた市販のビーズに結合され得る。ストレプトアビジンまたは抗ジゴキシゲ
ニン抗体もまた、例えば、標準的技術（例えば、Ｓｍｉｔｈ（１９９２）Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ２５８：１１２２〜１１２６を参照のこと）に従ってプロテインＡを
使用する、タンパク質媒介結合技術によって、シアル化されたガラススライドに
付着され得る。ビオチンまたはジゴキシゲニン末端標識核酸は、標準的な技術に
従って調製され得る。ビーズに付着した核酸へのハイブリダイゼーションは、ハ
イブリダイゼーション混合液でこれらを懸濁し、次いで洗浄後の分析のためにガ
ラス基板上にこれらを沈着させることによって達成される。あるいは、アビジン
でコーティングされたか、またはされていない、常磁性粒子（例えば、酸化鉄（
ＩＩＩ）粒子）が、使用され得る。

【００５０】１つの特に好ましい実施形態において、プローブ核酸は、表面（例えば、ガラ
スまたはクォーツ表面）上にスポットされる。この核酸は、ジメチルスルホキシ
ド（ＤＭＳＯ）およびニトロセルロースの混合液中に溶解され、そしてアミノシ
ランでコーティングされたガラススライド上にスポットされる。小さなキャピラ
リーチューブが、プローブ混合液を「スポット」するために使用され得る。

【００５１】種々の他の核酸ハイブリダイゼーション形式が、当業者に周知である。例えば
、一般的な形式としては、サンドイッチアッセイおよび競合または置換アッセイ
が挙げられる。ハイブリダイゼーション技術は、一般に、ＨａｍｅｓおよびＨｉ
ｇｇｉｎｓ（１９８５）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｌ
ｌおよびＰａｒｄｕｅ（１９６９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ６３：３７８〜３８３；ならびにＪｏｈｎら（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ
２２３：５８２〜５８７に記載されている。

【００５２】サンドイッチアッセイは、核酸配列を検出または単離するために一般的に有用
なハイブリダイゼーションアッセイアッセイである。このようなアッセイは、固
体支持体に共有結合により固定化された「捕捉」核酸、および溶液中の「シグナ
ル」核酸を利用する。このサンプルは、標的核酸を提供する。「捕捉」核酸よび
「シグナル」核酸プローブは、標的核酸とハイブリダイズして、「サンドイッチ
」ハイブリダイゼーション複合体を形成する。最も効率的にするために、シグナ
ル核酸は、捕捉核酸とハイブリダイズするべきではない。

【００５３】ハイブリダイゼーション複合体の検出は、標的およびプローブのポリヌクレオ
チドまたは核酸の二重鎖へのシグナル生成複合体の結合を必要とし得る。代表的
には、このような結合は、リガンド結合体化プローブとシグナルに結合体化した
抗リガンドとの間のように、リガンドおよび抗リガンドの相互作用を通じて生じ
る。

【００５４】ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、検出される標的核酸を増加する核
酸増幅系の使用を通じて増強され得る。このような系の例としては、ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）系およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）系が挙げられる。当
該分野で最近記載されている他の方法は、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡＯ
，Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）およびＱβレプ
リカーゼ系である。

【００５５】核酸ハイブリダイゼーションは、単純に、変性プローブおよび標的核酸を、こ
のプローブおよびその相補標的が相補的な塩基対合を通じて安定なハイブリッド
二重鎖を形成し得る条件下で提供することを包含する。次いで、ハイブリッド二
重鎖を形成しない核酸は、代表的には、付着された検出可能な標識の検出を通し
て検出されるハイブリッドされた核酸を残して洗浄によって除去される。核酸が
、温度の増大または核酸を含む緩衝液の塩濃度の減少、あるいは化学的因子の添
加またはｐＨの上昇によって変性されるということは、一般的に認識される。低
いストリンジェンシー条件（例えば、低温ならびに／または高塩濃度下および／
もしくは高標的濃度）下では、ハイブリッド二重鎖（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、
ＲＮＡ：ＲＮＡ、またはＲＮＡ：ＤＮＡ）は、アニールした配列が完全に相補的
でない場合でさえも形成する。従って、ハイブリダイゼーションの特異性は、よ
り低いストリンジェンシーで減少される。反対に、より高いストリンジェンシー
（例えば、より高い温度またはより低い塩）の首尾のよいハイブリダイゼーショ
ンは、より少ないミスマッチを必要とする。

【００５６】当業者は、ハイブリダイゼーション条件が任意の程度のストリンジェンシーを
提供するように選択され得ることを理解する。好ましい実施形態において、ハイ
ブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションを保障するために低いストリン
ジェンシーで行われ、次いでその後の洗浄が、ミスマッチしたハイブリッド二重
鎖を除去するためにより高いストリンジェンシーで行われる。首尾のよい洗浄は
所望のレベルのハイブリダイゼーション特異性が得られるまで、ますますより高
いストリンジェンシー（例えば、３７℃〜７０℃で０．２５ＸＳＳＰＥ−Ｔ
程度の低さまで下げられる）で行われ得る。ストリンジェンシーはまた、因子（
例えば、ホルムアミド）の添加によって増大され得る。ハイブリダイゼーション
特異性は、試験プローブへのハイブリダイゼーションと存在し得る種々のコント
ロールへのハイブリダイゼーションとの比較によって評価され得る。

【００５７】一般的に、ハイブリダイゼーション特異性（ストリンジェンシー）とシグナル
強度の間には交換条件（ｔｒａｄｅｏｆｆ）が存在する。従って、好ましい実施
形態において、洗浄は、整合した結果を生じ、かつバックグランド強度よりもお
よそ１０％高いシグナル強度を提供する最高のストリンジェンシーで行われる。
従って、好ましい実施形態において、ハイブリダイズされたアレイは、首尾のよ
いより高いストリンジェンシー溶液で洗浄され得、そして各洗浄間を読み取る。
従って、生じたデータセットの分析は、ハイブリダイゼーションパターンがかな
り変更されておらず、かつ目的の特定のプローブについて適切なシグナルを提供
する洗浄ストリンジェンシーを示す。

【００５８】好ましい実施形態において、バックグラウンドシグナルは、界面活性剤（例え
ば、Ｃ−ＴＡＢ）またはブロッキング剤（例えば、精子ＤＮＡ、ｃｏｔ−１Ｄ
ＮＡなど）をハイブリダイゼーションの間に使用して、非特異的結合を減少させ
ることにより、減少される。特に好ましい実施形態において、ハイブリダイゼー
ションは、約０．１〜約０．５ｍｇ／ｍｌＤＮＡ（例えば、ｃｏｔ−１ＤＮ
Ａ）の存在下で実施される。ハイブリダイゼーションにおけるブロッキング剤の
使用は、当業者に周知である（例えば、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ、前出の第８章を参
照のこと）。

【００５９】ハイブリダイゼーション条件を最適化する方法は、当業者に周知である（例え
ば、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
ｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏ
ｇｙ、第２４巻：ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＷｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄＰｒｏｂｅｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。

【００６０】最適な条件はまた、物質型、蛍光色素、励起および発光バンド、スポットサイ
ズなどの異なる組み合わせに関して検出される標識（例えば、蛍光）の感度の関
数である。低い蛍光バックグラウンド膜が、使用され得る（例えば、Ｃｈｕ（１
９９２）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ１３：１０５−１１４を参照のこと
）。候補膜上の種々の直径のスポット（「標的エレメント」）の検出のための感
度は、例えば、蛍光的に末端標識したＤＮＡフラグメントの希釈系列をスポッテ
ィングすることにより、容易に決定され得る。次いで、これらのスポットを、従
来の蛍光顕微鏡を使用して、画像化する。従って、蛍光色素および固体表面（例
えば、膜、ガラス、溶融シリカ）の種々の組み合わせから達成可能な感度、線形
性、および動的範囲が、決定され得る。既知の相対割合での蛍光色素の対の系列
希釈物もまた、分析され得る。これは、どの蛍光比測定が、検出器およびプロー
ブが固定された基板の蛍光により許容される動的範囲にわたって、実際の蛍光色
素比を反映するかに関する正確さを決定する。

【００６１】（核酸の標識および検出）好ましい実施形態において、ハイブリダイズした核酸が、サンプルまたはプロ
ーブの核酸に付着した１つ以上の標識を検出することにより、検出される。この
標識は、当業者に周知の多数の手段のいずれかにより、組み込まれ得る。標識を
核酸に付着させる手段としては、例えば、核酸のキナーゼ化（ｋｉｎａｓｉｎｇ
）によるニックトランスレーションまたは末端標識（例えば、標識ＲＮＡを用い
る）および引き続く、サンプル核酸を標識（例えば、蛍光団）に連結させる核酸
リンカーの付着（連結）が挙げられる。標識を核酸に付着させるための広範な種
々のリンカーもまた、公知である。さらに、介在色素および蛍光ヌクレオチドも
また、使用され得る。

【００６２】本発明における使用に適した検出可能な標識としては、分光学的、光化学的、
生化学的、免疫化学的、電気的、光学的および化学的な手段により検出可能な任
意の組成物が挙げられる。本発明において有用な標識としては、標識ストレプト
アビジン結合体での染色のためのビオチン、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅ
ａｄｓ^TM）、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン
、緑色蛍光タンパク質など、例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、Ｅｕ
ｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ、ＵＳＡを参照のこと）、放射線標識（例えば、³Ｈ、¹ ²⁵ Ｉ、³⁵Ｓ、¹⁴Ｃ、または³²Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ
、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡにおいて通常使用される他のもの
）ならびにコロイド金（例えば、４０〜８０ｎｍの直径のサイズ範囲の金粒子は
高効率で緑色光を散乱する）または着色されたガラスもしくはプラスチック（例
えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のビーズのような比色
定量標識が挙げられる。このような標識の使用を教示する特許としては、米国特
許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５
０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５
，１４９号；および同第４，３６６，２４１号が挙げられる。

【００６３】蛍光標識は、低いバックグラウンドを伴う非常に強いシグナルを提供するので
、好ましい。これはまた、迅速な走査手順によって、高い解像度および感度で光
学的に検出可能である。核酸サンプルは、単一の標識（例えば、単一の蛍光標識
）を用いて、全て標識され得る。あるいは、別の実施形態においては、異なる核
酸サンプルが、同時にハイブリダイズされ得、ここで、各核酸サンプルが、異な
る標識を有する。例えば、１つの標識は、緑色蛍光標識を有し得、そして第２の
標的は、赤色蛍光標識を有し得る。走査する工程は、赤色標識の結合部位を、緑
色蛍光標識を結合する部位から区別する。各核酸サンプル（標的核酸）は、互い
に独立して分析され得る。

【００６４】使用され得る適切な色素原としては、区別可能な波長範囲において光を吸収し
、その結果、色が観察され得るか、あるいは、特定の波長もしくは波長範囲の放
射線で照射される場合に光を放出する、分子および化合物（例えば、蛍光剤）が
挙げられる。

【００６５】望ましくは、蛍光剤は、約３００ｎｍ、好ましくは約３５０ｎｍ、より好まし
くは約４００ｎｍより大きな光を吸収し、通常は吸収した光の波長より約１０ｎ
ｍ高い波長より大きな波長で発光するべきである。結合した色素の吸収および発
光の特性は、結合していない色素とは異なり得ることに、注目するべきである。
従って、種々の波長範囲および色素の特性を参照する場合には、使用される場合
の色素を示し、そして任意の溶媒中で共役せず、そして特徴付けされる色素を示
さないことが意図される。

【００６６】蛍光剤は、一般に好ましい。なぜなら、蛍光剤を光で照射することによって、
複数の発光を得られるからである。従って、単一のラベルが、複数の測定可能な
事象に関して提供され得る。

【００６７】検出可能なシグナルはまた、化学発光源および生物発光源により、提供され得
る。化学発光源としては、化学反応により電子的に励起され、そして次いで検出
可能なシグナルとして働く光を放出し得るか、または蛍光アクセプターにエネル
ギーを供与する、化合物が挙げられる。あるいは、ルシフェリンが、ルシフェラ
ーゼまたはルシゲニンと共に使用されて、生物発光を提供し得る。スピン標識が
、不対電子スピンを有するレポーター分子により提供され、これは、電子スピン
共鳴（ＥＳＲ）分光計により検出され得る。例示的なスピン標識としては、有機
フリーラジカル、遷移金属錯体（特に、バナジウム、銅、鉄、およびマンガンな
ど）が挙げられる。例示的なスピン標識としては、窒素酸化物フリーラジカルが
挙げられる。

【００６８】標識は、ハイブリダイゼーションの前または後に、標的（サンプル）核酸に付
加され得る。いわゆる「直接標識」とは、ハイブリダイゼーションの前に標的（
サンプル）核酸に直接付着されるかまたは取り込まれる、検出可能な標識である
。対照的に、いわゆる「間接標識」とは、ハイブリダイゼーション後にハイブリ
ッド二重鎖に連結される。しばしば、間接標識は、ハイブリダイゼーション前に
標的核酸に付着された結合部分に付着される。従って、例えば、標的核酸は、ハ
イブリダイゼーション前にビオチニル化され得る。ハイブリダイゼーション後に
、アビジン結合体化蛍光団が、ハイブリッド二重鎖を保有するビオチンに結合さ
れて、容易に検出される標識を提供する。核酸を標識する方法、および標識され
たハイブリダイズされた核酸を検出する方法の、詳細な概説については、Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａ
ｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第２４巻：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎＷｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓ、Ｐ．Ｔｉｊｓｓ
ｅｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９９３）を参照のこと。

【００６９】蛍光標識は、インビトロ転写反応の間に容易に付加される。従って、例えば、
蛍光標識したＵＴＰおよびＣＴＰは、インビトロ転写において産生されるＲＮＡ
に、組み込まれ得る。

【００７０】その標識は、リンカー部分に直接的に、またはリンカー部分を通して結合され
得る。一般的に、標識またはリンカー−標識結合の部位は、いかなる特定の位置
にも限定されない。例えば、標識は、所望されるような検出またはハイブリダイ
ゼーションを妨害しない任意の位置で、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはそ
れらのアナログに結合され得る。例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔ
ｏ，ＣＡ）からの特定のＬａｂｅｌ−ＯＮＲｅａｇｅｎｔは、オリゴヌクレオ
チドのリン酸骨格を通して分散する標識および３’末端および５’末端での末端
標識を提供する。本明細書中の実施例に示されるように、標識は、リボース環上
の位置で結合され得るか、またはそのリボースは、所望されるように、改変され
そして除去さえされ得る。有用な標識試薬の塩基部分は、天然に存在するか、ま
たはそれらが置かれた目的を妨害しない様式で改変されるものを含み得る。改変
された塩基は、７−デアザＡおよび７−デアザＧ、７−デアザ−８−アザ
Ａおよび７−デアザ−８−アザＧ、ならびに他の複素環式部分を含むがそれら
に限定されない。

【００７１】蛍光標識は、単一種の有機分子に限定されないが、無機分子、有機分子および
／または無機分子の複数の分子の混合物、結晶、ヘテロポリマーなどを含むこと
が認識される。従って、例えば、シリカシェル中に封入されるＣｄＳｅ−ＣｄＳ
コア−シェルナノクリスタルは、生物学的分子に結合されるために容易に誘導体
化され得る（Ｂｒｕｃｈｅｚら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８１：２０１３
−２０１６）。同様に、高度な蛍光量子ドット（硫化亜鉛キャップされたセレン
化カドミウム）は、超高感度生物学的検出における使用のために生物分子に共有
結合的された（ＷａｒｒｅｎおよびＮｉｅ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１
：２０１６−２０１８）。

【００７２】（増幅に基づくアッセイ）別の実施形態において、増幅に基づくアッセイは、コピー数を測定するために
使用され得る。このような増幅に基づくアッセイにおいて、核酸配列は、増幅反
応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））における鋳型として働く。定量
的増幅において、増幅産物の量は、もともとのサンプル中の鋳型の量に比例する
。適切な（例えば、健常組織）コントロールとの比較は、所望の標的核酸配列の
コピー数の測定を提供する。「定量的」増幅の方法は、当業者に公知である。例
えば、定量的ＰＣＲは、同時に、同じプライマーを使用してコントロール配列の
既知の量を同時増幅する工程を包含する。これは、ＰＣＲ反応を較正するために
使用され得る内部標準を提供する。定量的ＰＣＲについての詳細なプロトコルは
、Ｉｎｎｉｓら（１９９０）ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ、ＡＧｕｉｄｅｔ
ｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．において提供される。

【００７３】他の適切な増幅方法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌ
ａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４：５６０、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１
９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：１０７７、およびＢａｒｒｉｎｇｅｒら（１
９９０）Ｇｅｎｅ８９：１１７）、転写増幅（Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１１７３）、および自己保持
配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ８７：１８７４）が含まれるがこれに限定されない。

【００７４】（遺伝子発現の検出）以下に示すように、多数の癌遺伝子が、本明細書に開示される増幅の領域中で
見出される。従って、癌遺伝子活性は、例えば、遺伝子転写物（例えば、ｍＲＮ
Ａ）のレベルを測定することによって、または翻訳されたタンパク質の量を測定
することによって、検出され得る。

【００７５】（遺伝子転写物の検出）核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて、遺伝子転写物を検出および／また
は定量する方法は、当業者に公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこ
と）。例えば、ノーザン転写を使用して、所望のｍＲＮＡの検出のために直接的
に使用され得る。手短に言えば、例えば、酸グアニジウム−フェノール−クロロ
ホルム抽出法を用いて、ｍＲＮＡが所定のタンパク質から単離される。次いで、
このｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ種を分離するために電気泳動され、そしてそのｍＲＮ
Ａは、ゲルからニトロセルロースメンブレンに転写される。サザンブロットを用
いる場合、標識されたプローブは、標的ｍＲＮＡを同定および／または定量する
ために使用される。

【００７６】別の好ましい実施形態において、遺伝子転写物は、標的配列のコピー数を直接
的に評価するために、上記のような増幅（例えば、ＰＣＲ）に基づく方法を用い
て測定され得る。

【００７７】（発現されたタンパク質の検出）標的癌遺伝子（ｏｎｏｃｇｅｎｅ）の「活性」はまた、発現されたポリペプチ
ドを検出または定量することによって検出および／または定量され得る。このポ
リペプチドは、当業者に周知の多数の手段のいずれかによって検出および定量さ
れ得る。これらは、分析的な生化学的方法（例えば、電気泳動、キャピラリー電
気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（
ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィーなど）、または種々の免疫学的方法（例え
ば、液体またはゲルの沈降素反応、免疫拡散（一重または二重）、免疫電気泳動
法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）
、免疫蛍光アッセイ、ウェスタンブロッティングなど）を含み得る。

【００７８】（診断的および予後的適用における使用のためのキット）上記で示された、診断的、研究的、および治療的適用における使用のために、
キットもまた、本発明によって提供される。診断的および研究的適用において、
そのようなキットは、以下のいずれかまたはすべてを含み得る：標的配列ならび
に他のハイブリダイゼーションプローブおよび／またはプライマーを検出するた
めの、アッセイ試薬、緩衝液、核酸。治療的産物は、滅菌生理食塩水または別の
薬学的に受容可能な乳濁液および懸濁ベースを含み得る。

【００７９】さらに、このキットは、本発明の方法の実施についての指針（すなわち、プロ
トコル）を含む使用説明書を含み得る。この使用説明書は、代表的には、書かれ
たものまたは印刷されたものを含み得るが、そのようなものに限定されない。こ
のような使用説明書を保存し得、かつエンドユーザに使用説明書の情報を提供し
得る任意の媒体が、本発明によって意図される。このようなメディアには電子的
保存媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体
（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ）などが含まれるが、これらに限定されない。このよう
な媒体は、このような使用説明書を提供するインターネットサイトへのアドレス
を含み得る。

【００８０】（実施例）本実施例は、末端部黒色腫における染色体異常の領域の検出を記載する。

【００８１】末端部黒色腫（ＡＭ）は、おそらく最も顕著な特徴を示す黒色腫の１つの型で
あり、この特徴は、皮膚黒色腫のより一般的な他の形態から末端部黒色腫を分け
る。これは、手掌、足底および爪下の皮膚において発症する（Ａｒｒｉｎｇｔｏ
ｎ，Ｊ．Ｈ．ｄら、ＡｍＪＳｕｒｇＰａｔｈｏｌ１：１３１−３４３（
１９７７））。発症に好ましい部位は、日光への曝露をほとんど有さず、そして
厚い角質層によって紫外線放射（ＵＶ）から保護されている。このことにより、
（ＵＶ）は、ＡＭの病因において役割を果たしていないようである。興味深いこ
とに、ＡＭは、黒人の中で最も一般的な型の黒色腫である（Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｗ
．Ｐ．ｄ．ら、Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ１１６：７７３−６（１９８０）
；Ｋｕｋｉｔａ，Ａ．ら、ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ９２：２１Ｏ
Ｓ−２１３Ｓ（１９８９））が、その全体の発生数は、すべての人種の群にわた
って同様であるらしい（Ｅｌｗｏｏｄ，Ｊ．Ｍ．ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａ
ｔｏｌ９２：２１４Ｓ−２２１Ｓ（１９８９））。比較的なゲノムハイブリダ
イゼーション（ＣＧＨ）を使用する、無作為に選択した３２の皮膚の初代黒色腫
の研究において（Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ，Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８：
８１８−２１（１９９２））、遺伝子増幅は、黒色腫において低い頻度で発生す
るが、末端部黒色腫は、頻度の高い増幅を有するかもしれないことが注目された
（Ｂａｓｔｉａｎ，Ｂ．Ｃ．ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５８：２１７０−５（
１９９８））。ここで本発明者らは、末端部黒色腫が初代皮膚黒色腫の異なる型
を構成し、この黒色腫は、癌遺伝子を標的化する小さなゲノム領域の高頻度の高
レベルの増幅によって発現されるゲノムの不安定性の独特な型によって特徴付け
られることを実証する。

【００８２】（結果）（ＣＧＨを使用するＡＭおよびＳＳＭの一組み合わせ分析（ｍａｔｃｈｅｄ−
ｐａｉｒａｎａｌｙｓｉｓ））原発性皮膚黒色腫の無作為選択の本発明者らの最初の研究（Ｂａｓｔｉａｎ，
Ｂ．Ｃ．ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５８：２１７０−５（１９９８））は、小
さな染色体部分領域に関与する複数回高レベル増幅の存在による他の場合とは異
なるＡＭの単一の場合を含んだ。ＡＭとＳＳＭ（黒色腫の最も頻繁な型）との間
の染色体異常のパターンにおける潜在的な違いを研究するために、本発明者らは
、全部で１５対のこれらの２つの型の黒色腫を選択した。患者の年齢および腫瘍
の厚さによる任意の偏り（本発明者らは、以前に異常の総数に相関することを見
出した）を排除するために、両群は、年齢および腫瘍の厚さを調和した。ＡＭ群
における平均年齢および腫瘍の厚さは、７２．２歳（４４〜８７歳の範囲）およ
び４．６ｍｍ（１．３〜１４ｍｍの範囲）であり、一方、ＳＳＭ群においては、
７０．８歳（４０〜８４歳の範囲）および５．０ｍｍ（１．２〜２０ｍｍの範囲
）であった。

【００８３】ＣＧＨによって検出された異常は、図１に要約した。２つの群の間の類似性は
、容易に明らかである。両群における最も頻繁な変化は、本発明者らの最新の発
見と一致した（Ｂａｓｔｉａｎ，Ｂ．Ｃ．ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５８：２
１７０−５（１９９８））。第９ｐ染色体および第１０ｑ染色体の欠失は、それ
ぞれＡＭの１０／１５（６７％）および７／１５（４７％）ならびにＳＳＭの９
／１５（６０％）および７／１５（４７％）に存在した。対照的に、第７ｐ染色
体、第５ｐ染色体の獲得および第６ｑ染色体の欠失を、ＡＭ群においてより頻繁
に見出した（それぞれ、５３％対１３％、３３％対０％、および４７％対７％）
。しかし、これらの違いは、総数３９の比較（すなわち、全ての常染色体のアー
ム）を行った統計的に有意に与えられなかった。

【００８４】ＡＭとＳＳＭとの有意な違いを、両群における異常の総数および型を分析した
時に見出した。まず、表１に示したように、異常の総数は、先端部黒色腫におい
て有意により高かった。これは、獲得、欠失の真実であり、そして増幅で最も明
らかであった（定義のための方法を参照のこと）。全ての先端黒色腫は、少なく
とも１つの増幅を有したが、多くが、複数回増幅（平均１．９）であった。ＡＭ
群においては、ＡＭにおける総数２９回の増幅が、少なくとも１４の分離遺伝子
座（ｓｅｐａｒａｔｅｌｏｃｉ）に関与した。最も頻繁に、増幅は第１１ｑ染
色体および第２２ｑ染色体に関与した。しかし、図１に示し得るように、染色体
領域５ｐ１５、５ｐ１３、１２ｑ１３〜２２、および１６ｑ２１〜２２を、１つ
より多くの腫瘍において増幅した。対照的に、２回のみの増幅を、ＳＳＭの完全
なセットにおいて見出した（２つの腫瘍の各々に１つ）。

【００８５】

【表１】（ＦＩＳＨによる増幅のインサイチュ検出）増幅のコピー数および組織分布の情報を得るために、本発明者らは、ＣＧＨに
より増幅を示された腫瘍の組織切片上で二色（ｄｕａｌ−ｃｏｌｏｒ）ＦＩＳＨ
を実行した。腫瘍の倍数性を、ＣＧＨによる正常なコピー数を有した領域のため
の参照プローブを使用することによって評価した。増幅をＣＧＨによって検出し
た１８の異なる遺伝子座を含む総数６１のＦＩＳＨ測定を、１７の状況において
実行した。

【００８６】ＦＩＳＨは、ＣＧＨ比が染色体アームの部分領域について１．３を越える場合
、腫瘍がその遺伝子座では、非常に高いコピー数を含んでいることを示した。例
えば、２つの場合（ＡＭ６１およびＡＭ６３）において、ＣＧＨは、腫瘍を示し
た：それぞれ１．５および１．３の染色体帯１１ｑ１３での参照の比。ＦＩＳＨ
シグナルの対応する平均数は、腫瘍内の位置に依存して、ＡＭ６１においては６
〜２０より多くのシグナルの範囲である１１ｑ１３．２（ＲＭＣ１１ｐ００５）
にマッピングされるプローブで決定し、そしてＡＭ６３の場合において７のシグ
ナルで比較的安定であった。両方の場合において、参照プローブは、二倍体の核
型に近いこと（すなわち、切片の通常のケラチノサイトに類似のシグナルの総数
）を示した。ＦＩＳＨおよびＣＧＨにより見出された明らかなコピー数の違いは
、２つの主要な因子のためである。まず、ＣＧＨは、分析される細胞の群内の配
列の平均コピー数を測定する。従って、正常細胞によるサンプルの汚染および腫
瘍内の増幅レベルの不均一性は、存在する高レベルを過小評価する比を生じる。
しかし、ＣＧＨはまた、増幅された領域が小さい場合、増幅のレベルを過小評価
する（Ｐｉｐｅｒ，Ｊ．ら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ１９：１０−２６（１９９５
））。これは、プローブがハイブリダイズする中期の染色体におけるＤＮＡの複
合的なパッキングのためである。この後者の理由は、これらの測定においておそ
らく支配的な要因である。なぜなら、いくつかの場合においては、ＣＧＨピーク
の明らかな位置に基いて選択されたＦＩＳＨプローブが、増幅された領域のピー
クを失うからである。これは、ＣＧＨによって第５ｐ染色体および第６ｐ染色体
の末端部分の増幅を有するＡＭ１０４の場合によって例証される。核あたり１〜
２のシグナルを示す６ｐ２５−ｐｔｅｒ（ＲＭＣ０６Ｂ００５）にマッピングさ
れるプローブは、このアンプリコンが、第６染色体の完全な末端ｐ−アームに関
与しなかったことを示す。第５ｐ染色体の末端アームをＣＧＨにより同レベルま
で増幅し、そして第５ｐ１５染色体（ＲＭＣ０５Ｂ３３２６Ａ）のプローブを用
いて核あたり平均１０コピーを示した。

【００８７】ほとんどの場合、腫瘍内での増幅のレベルにおける限定的な不均一性があった
。新生物の放射状部分が存在した場合、その細胞は、侵襲な部分の細胞において
見出されるシグナル総数とは有意に異ならないシグナル総数を有した。１つの場
合のみ（ＡＭ５１）、第７ｐ２１染色体（ＲＭＣ０７Ｂ３０７８Ａ）および第１
２ｑ１４染色体（１２Ｂ０１４）のプローブを用いてシグナルの核から核への高
いバリエーションを示した（すなわち、それぞれ、４〜４０より多くおよび６〜
２０より多くのシグナルのバリエーション）。この場合においては、１２ｑ１４
プローブの高いコピー数を有する細胞は、腫瘍のより深い部分でより頻繁であっ
たが、７ｐ２１のシグナル数は、完全な腫瘍にわたって変化する。

【００８８】興味深いことには、単離されたＡＭのうち５つの場合において、高シグナル数
を有する細胞が、腫瘍の侵襲部分から５ｍｍまでの表皮の基底層において検出さ
れ得る。４つの場合において、この発見は、わずかに拡大された高色素性の核を
組織学的に示された散在した単一のメラノサイトの存在に相関した。ＡＭ５９の
場合は、第５ｑ１１．２−ｐｔｅｒ染色体、第１１ｐ１５−ｐｔｅｒ染色体、お
よび第１６ｑ２２−ｑｔｅｒ染色体に関与する増幅を有した。Ｈ−ｒａｓ癌遺伝
子は、１１ｐ１５アンプリコンの標的であるようであり、そして本発明者らは、
Ｈ−ｒａｓ遺伝子（ＲＭＣ１１Ｂ０２２）を含む緑標識プローブを使用してＦＩ
ＳＨを実行した。ＣＧＨによって不変化した第１１ｑ染色体についての赤標識プ
ローブ（ＲＭＣ１１Ｐ０１４）を参照として使用した。１０より多くの緑シグナ
ルおよび２〜３の参照シグナルを有する多くの単一細胞は、現存の腫瘍から５ｍ
ｍの距離にわたって基底層において見られた。野生型および変異体（ｖａｌ−１
２）Ｈ−ｒａｓを検出する抗体での免疫染色は、この領域内でのメラノサイトに
よる強いＨ−ｒａｓ発現を示した。標識した細胞に見られ得るように、異常な核
は有しなかった。この領域（増幅を有する細胞）の外側では、基底のメラノサイ
ト内のＨ−ｒａｓ発現が、検出され得ないことを見出した。

【００８９】（Ｈ−ｒａｓの変異分析）Ｈ−ｒａｓは、おそらくＡＭ５９の場合の第１１ｐ１５染色体の増幅の標的で
ある。この概念を支持するために、本発明者らは、配列分析によりＨ−ｒａｓの
コドン１２、１３および６１の変異について調査した。本発明者らは、Ｇｌｙ１
２Ｃｙｓ変化を引き起こす３４位でコドン１２のＧ→Ｔ変異を見出した。野生型
配列は、検出されなかった。他の場合、情報の配列データは、２２個の腫瘍（１
２ＡＭおよび１０ＳＳＭａ）から得られた。ＡＭ６１の場合は、Ｇｌｎ６１Ａｒ
ｇ変化を引き起こすコドン６１のヘテロ接合性のＡ→Ｇ変異を有した。残りの２
１個の場合は、野生型配列を有した。

【００９０】（ＡＭインサイチュにおける増幅の検出）全てのＡＭにおける増幅の発見およびＦＩＳＨによるいくつかのＡＭのインサ
イチュ部分における増幅の実証は、増幅がＡＭの進行において初期に起ることを
示唆した。この事象において、これは、侵襲段階に進行しなかったＡＭにおける
増幅を見出すことを予期する。従って、本発明者らは、ＡＭインサイチュの５つ
のさらなる場合を選択した。それらの障害は、ＣＧＨによって研究され得なかっ
た。なぜなら、これは、正常の細胞によって有意な汚染なしに十分な腫瘍細胞を
選択することは可能ではないからである。実際には、本発明者らは、侵襲ＡＭ（
すなわち、１１ｑ１３）（ＲＭＣ１１Ｐ００８）および２２ｑ１２（ＲＭＣ２２
Ｐ００４）において最も頻繁に増幅された領域のマーカーでＦＩＳＨを使用した
。５つのＡＭインサイチュのうち３つは、１１ｑ１３の増幅を示し、そして一つ
の場合は、２２ｑ１２のさらなる増幅を有した。この増幅シグナルの平均数は、
１つの場合における６個から２つの他の場合における１０個より多い範囲であっ
た。参照プローブは、上昇したコピー数を示さなかった。

【００９１】（考察）本発明者らのデータは、皮膚黒色腫の他の型においてよりも末端部黒色腫（Ａ
Ｍ）において遺伝子増幅の十分により高い頻度を実証する（１００％対１５％）
。他のヒト癌（例えば、神経膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、および乳癌）は、この
場合の５０％までの増幅を有することを示した（Ｂｒｏｄｅｕｒ，Ｇ．Ｍ．ら（
Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．およびＫｉｎｚｌｅｒ，Ｋ，Ｗ．編）（ＭｃＧｒａ
ｗ−Ｈｉｌｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９８））。他の癌における増幅は、わず
かな予後を示し得るので（Ｓｅｅｇｅｒ，Ｒ．Ｃ．ら、ＮＥｎｇｌＪＭｅ
ｄ３１３：１１１１−６（１９８５））、増幅は、ヒト癌における後期の事象
を示すと現在考えられている（Ｌｅｎｇａｕｅｒ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３９
６：６４３−６４９（１９９８））。対照的に、ＡＭインサイチュにおける増幅
の検出は、この癌型の進行における増幅の初期の発生を実証する。

【００９２】これまでに研究した１６の全ての侵襲性ＡＭ（ＡＭの指針症例を含む（Ｂａｓ
ｔｉａｎ，Ｂ．Ｃ．ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５８：２１７０−５（１９９８
）））における染色体部分領域の少なくとも１つ（主にいくつか）ならびに５つ
のインサイチュＡＭの少なくとも３つの増幅の存在は、遺伝子増幅が、この癌に
おける基本的な役割を果たすことを示唆する。腫瘍形成において初期に起る特定
の欠損症が、メラノサイト形質転換において重要な遺伝子の増幅を引き起こすと
いう推測を導いている。頻繁な増幅は、従って、腫瘍の進行を誘導する染色体の
不活性化の新規の型を示し得る（結腸直腸癌における有糸分裂紡錘体チェックポ
イントの不活性化のための異数性に類似する）（Ｌｅｎｇａｕｅｒ，Ｃ．ら、Ｎ
ａｔｕｒｅ３８６：６２３−７（１９９７））。この仮説の支持において、本
発明者らの場合におけるアンプリコンは、一般的にメラノサイトの増殖または細
胞の増殖の制御において確立された経路に属する遺伝子を頻繁に含むことは事実
である。最も頻繁に増幅される領域（１１ｑ１３）は、線維芽細胞増殖因子（Ｆ
ＧＦ）３および４、ならびにサイクリンＤ１を含む。基本的なＦＧＦは、周知で
あり、そしてメラノサイトのマイトジェンに非常に効果的であり（Ｈａｌａｂａ
ｎ，Ｒ．ら、ＩｎＶｉｔｒｏＣｅｌｌＤｅｖＢｉｏｌ２３：４７−５
２（１９８７））、そしてヒト黒色腫におけるオートクライン増殖因子として作
用し得る（Ｈａｌａｂａｎ，Ｒ．ら、ＯｎｃｏｇｅｎｅＲｅｓ３：１７７−
８６（１９８８））。血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、同様にオートクリン
マイトジェン特性を有し（Ｂｅｈｌ，Ｃ．ら、ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｓｈｙｓ
ＲｅｓＣｏｍｍｕｎ１９３：７４４−５１（１９９３））、そしてＰＤＧ
ＦＡおよびＰＤＧＦＢは、本発明者らのＡＭにおいて頻繁に獲得または増幅され
る７ｐ２２および２２ｑ１２−１３の両領域に位置付けられることが示された。
黒色腫の別の強力な増殖因子であるエンドセリン−１（Ｙａｄａ，Ｙら、ＪＢ
ｉｏｌＣｈｅｍ２６６：１８３５２−７（１９９１））は、共通に獲得され
る領域である６ｐ２３−３４に位置付ける。他のアンプリコンは、これらの因子
（例えば、Ｈ−ｒａｓ（１ｐ１３．２）、Ｈ−ｒａｓ（１１ｐ１５）、ならびに
細胞周期の正のレギュレーター（ＣＤＫ４（１２ｑ１４）、ＥＴＦ４（１６ｑ２
２）およびサイクリンＥ（１９ｑ１３））の可能性のある下流標的を保有する。
これらの関連およびアンプリコン内の変異Ｈ−ｒａｓの本発明者らの発見に基い
て、本発明者らは、他の増幅された領域が、無作為ゲノム「ノイズ」を示さない
ことを予測することが適切であると感じるが、黒色腫の発生において重要な遺伝
子を含むことを見出す。アンプリコンの構造のより高い分解図は、ＣＧＨのマッ
ピングされたクローンのマクロアレイへの使用により現在得られている（Ｐｉｎ
ｋｅｌ，Ｄ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０：２０７−２１１（１９９８））。

【００９３】新生物メラノサイトが、表皮の基底層にのみ単一の単位として整列される、ほ
とんどの末端黒色腫は、放射状の増殖層を示す。このパターンは、黒子といわれ
、そしてＳＳＭにおいて真皮表皮接合部（ｄｅｒｍｏｅｐｉｄｒｍａｌｊｕｎ
ｃｔｉｏｎ）上の単一細胞のより頻繁な発見と対照的である。従って、ＡＭはま
た、末端黒子黒色腫といわれる。しかし、全てのＡＭが、黒子増殖パターンを示
さず、そして実際にＳＳＭおよび結節性黒色腫はまた、末端皮膚上に存在すると
いくらか考える（Ｆｅｉｂｌｅｍａｎ，Ｃ．Ｅ．ら、Ｃａｎｃｅｒ４６：２４
９２−５０４（１９８０）；Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ，Ｋ．ら、ＡｃｔａＰａ
ｔｈｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＳｃａｎｄ［Ａ］８８：２７５−８３（１９８
０））。種々の型の黒色腫に関与する表皮内のパターン間の違いは、完全にほど
遠く、そしてＡＭおよび悪性黒子黒色腫は両方、小さな増殖および侵襲性の病巣
（ｆｏｃｃｉ）上の基底層上の細胞の領域をしばしば示す。この発見は、病理学
者は、光学顕微鏡により黒色腫の型を確実に分類することにおいていくつかの違
いを説明し得る。本発明者らのＡＭのうち１２が、黒子放射状増殖期を有し、そ
して２つの場合において、放射状増殖期が、このような分類を可能にしないよう
にブロックに相当していなかった。１つの場合は、主に小さな放射状増殖期を有
した。増幅は、全てのＡＭにおいて見出され、増幅部表現型が、増殖パターンの
非依存性を示すことが示された。本シリーズの全てのＡＭの場合は、末端に位置
された；しかし、３つの増幅を有しなかった徴候の場合（Ｂａｓｔｉａｎ，Ｂ．
Ｃ．ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５８：２１７０−５（１９９８））は、指由来
の爪下黒色腫であった。これは、この増幅部表現型が、足底黒色腫（ｐｌａｎｔ
ａｒｍｅｌａｎｏｍａ）に限定されないことを示す。無毛皮膚上の存在は、Ａ
Ｍの共通の特徴であるようであるが、さらなる研究が、それらのより完全な範囲
を定義する保証とされる。

【００９４】現在まで、明確に認識可能なＡＭの放射状腫瘍部分を越えた、わずかな異型性
を有するかまたは有さないメラニン形成細胞の数のわずかな増加が、インサイチ
ュメラノーマ（ｉｎ−ｓｉｔｕｍｅｌａｎｏｍａ）または「活性化メラニン形
成細胞」を表すか否かについての議論が存在する（Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｙ．ら、Ｐ
ａｔｈｏｌｏｇｙ１７：２５８〜６５（１９８５））。ＦＩＳＨによる侵襲性
の腫瘍部分から５ｍｍまでの単一のメラニン形成細胞の増殖についての本発明者
らの発見は、この現象が反応性の現象よりもむしろインサイチュで黒色腫を表す
ことを明らかに提案する。黒色腫は、正常な皮膚の縁とともに切り取られない場
合、局所的に再発する、十分に記載された傾向を有する（Ｄａｙ，Ｃ．Ｌ．，Ｊ
ｒ．ら、ＪＤｅｒｍａｔｏｌＳｕｒｇＯｎｃｏｌ９：７９７〜８０１（
１９８３））。ＦＩＳＨが、異型性の細胞が組織学的に明かである領域を越えて
異常な細胞をよく検出するので、これらの「衛星」細胞が再発の供給源を表す可
能性がある。この観察が黒色腫における切除縁のサイズについての議論の解決に
役立ち得るか否かを決定するためにさらなる研究が必要とされる（Ｈｅｅｎａｎ
，Ｐ．Ｊ．ＪＡｍＡｃａｄＤｅｒｍａｔｏｌ３５：２８１〜２（１９９
６））。

【００９５】本発明者らのデータは、ＡＭにおける染色体異常性のタイプにおける、他のタ
イプの黒色腫と比較した定性的な差異を示す。対照的に、染色体獲得および損失
の表示の全体のパターンが考慮される場合、ＡＭおよびＳＳＭは、差異よりも類
似性をより示す。５ｐ、６ｑ、および７ｐのような少数のゲノム領域は、異なる
頻度の関与を示した。異常性のパターンのこの類似性は、同じ経路／チェックポ
イントにおいて作動する遺伝子が黒色腫サブタイプにおいて冒されるが、異なる
遺伝子活性化のモードであることを示すとして解釈され得る。遺伝子増幅は、Ａ
Ｍにおけるオンコジーン活性化の優性なモードであり得るが、他のタイプにおい
て、これは変異および再配列であり得る。サブタイプの腫瘍経過は、後に、共通
の最終経路に収束し得、一旦この疾患が転移する場合の黒色腫サブタイプの類似
の臨床的課程を説明する。この課程が正しい場合、ＡＭにおける「増幅表現型」
は、黒色腫経過における生物学的に関連した遺伝子を同定するための独特の機会
を提供し得る。なぜなら、冒されたゲノム領域が、少量の増幅によって強調され
るからである。

【００９６】（材料および方法）（研究個体群）ＡＬＭの診断下で保管された１５のケースを、ｔｈｅＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏｃｙ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｕｒｚｂｕ
ｒｇ、ｔｈｅＤｅｒｍａｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙＳｅｃｔｉｏｎｏｆｔ
ｈｅＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｓｏｆＰａｔｈｏｌｏｃｙａｎｄＤｅｒｍ
ａｔｏｌｏｇｙ、およびｔｈｅＭｅｌａｎｏｍａＣｅｎｔｅｒｏｆｔｈ
ｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＳａｎＦｒａｎ
ｃｉｓｃｏの保管材料からランダムに選択した。２個の末端部黒色腫（ＡＭ）が
足指由来であり、１０個が足の裏由来であり、そして３個がさらなる詳細のない
足由来であった。組織学によって、１２個のＡＭが、末端部黒子タイプであり、
２個のＡＭが腫瘍の放射状部分がサンプルに表されなかったので分類不可能であ
り、１個のＡＭがＳＳＭと重なる特徴を有した。コントロールとして、患者の年
齢（±５才）および腫瘍厚さ（＜１．５ｍｍ、１．５〜４．０ｍｍおよび＞４．
０ｍｍ）について一致させ、そしてＳＳＭとして保管された１５のケースを回収
した。組織学的再評価によって、全ての１５個のコントロールにおいてＳＳＭの
典型的な特徴を示した。重篤な慢性の太陽による損傷を示す有意な日光弾力線維
症を有する腫瘍は無かった。

【００９７】ＡＭインサイチュの分析について、５個の腫瘍をＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ
のｔｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａのｔｈｅＭｅ
ｌａｎｏｍａＣｅｎｔｅｒのデータベースから選択した。

【００９８】（比較ゲノムハイブリダイゼーション）ＤＮＡ抽出。３０μｍのセクションをパラフィンブロックから切り出し、Ｈ＆
Ｅのために５セクションごとに５μｍで切り出した。染色されていない３０μｍ
のセクションをガラススライド上に置き、目的の領域を脱パラフィンすることな
く、顕微解剖した。顕微解剖を解剖顕微鏡下で手動で実施した。腫瘍の大きさに
依存して、３〜２０の染色していないセクションを使用し、そして高密度の腫瘍
細胞を有する領域を正常な細胞から分離した。解剖された腫瘍部分をチューブに
おいて回収し、キシレンおよびエタノールで洗浄することによって脱パラフィン
した。ＤＮＡ抽出および標識化を、Ｉｓｏｌａら、９Ｉｓｏｌａ、Ｊ．ら、Ａｍ
ＪＰａｔｈｏｌ１４５：１３０１〜８（１９９４）によって公開されるよ
うに実施した。手短には、組織を、プロテイナーゼＫ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、５０ｍＭ
ＴｒｉｓｐＨ８．５、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液
中で完全に消化する（３日）までインキュベートした。ＤＮＡをフェノール−ク
ロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｖ／ｖ）で抽出し、７．
５ｍ酢酸アンモニウムおよび１００％エタノールで沈澱させ、そして水中で再
懸濁させた。得られたＤＮＡの量は、２〜１２μｇの範囲であった。

【００９９】ＣＧＨ。全ての腫瘍をフルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ（ＤｕｐｏｎｔＩｎ
ｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で標識された腫瘍ＤＮＡ、およびＴｅｘａｓｒｅ
ｄ−５−ｄＵＴＰ（「標準」標識）で標識された参照ＤＮＡと、逆にして標識し
たＤＮＡとの両方で測定した。ニックトランスレーションによって標識を実施し
た。ニックトランスレーション条件は、標識後のプローブフラグメントサイズが
８００ｂｐと１５００ｂｐの間の範囲であるように調節した。ハイブリダイゼー
ション混合物は、１０μｌハイブリダイゼーション緩衝液（５０％ホルムアルデ
ヒド、１０％デキストラン硫酸、および２×ＳＳＣ、ｐＨ７．０）中に溶解した
、２００〜１０００ｎｇの標識腫瘍ＤＮＡ、末梢血リンパ球由来の２００ｎｇの
逆標識標準ヒト参照ＤＮＡ、および２５３ｃ、ヒトＣｏｔ−１ＤＮＡ（Ｌ
ｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍ
Ｄ）からなった。ハイブリダイゼーションを２〜３日間３７℃で正常中期まで実
施した（Ｋａｌｌｉｏｎｌｅｍｉ，Ａ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：２１５６〜６０（１９９４））。全てのサンプルを単
一のバッチの中期スライドを用いて調査した。スライドを洗浄溶液（２×ＳＳＣ
中の５０％ホルムアルデヒド、ｐＨ）で３回、ＰＮ緩衝液（０．１ＭＮａＨ₂
ＰＯ₄、０．１ＭＮａ₂ＦＩＰＯ₄、および０．１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０、
ｐＨ８．０）中で１回、そして蒸留水（ともに１０分間室温で）中で１回、洗浄
した。ハイブリダイゼーション後、スライドを抗退色（ａｎｔｉ−ｆａｄｅ）溶
液中の４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールで対比染色した。ハイブリダ
イゼーションの質を、以前に公開された（Ｂａｓｔｉａｎ，Ｂ．Ｃ．ら，Ｃａｎ
ｃｅｒＲｅｓ５８：２１７０〜５（１９９８））のように評価した。デジタ
ル画像を標準蛍光顕微鏡上でＣＣＤカメラ（Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｅｒ１４００
，ＸｉｌｉｉｘＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂｒｉｔｉ
ｓｈＣｏｌｕｍｂｉａ，Ｃａｎａｄａ）を用いて５個の中期から集めた。各染
色体に沿った平均腫瘍／参照蛍光比を、カスタムＣＧＨ分析ソフトウェアを用い
て計算した。各常染色体の少なくとも４個のコピーで測定を行った。

【０１００】コントロールおよび閾値の定義。正常なＤＮＡおよび既知の異常を有する腫瘍
細胞株由来のＤＮＡを、コントロールとして使用した。本発明者は、１）標準標
識または逆標識のいずれかが、＜０．８０または＞１．２の腫瘍／参照蛍光比を
生じた場合、あるいは２）標準標識と逆標識の両方が、＜０．８５または＞１．
１５の腫瘍：参照蛍光比を生じた場合、領域を異常としてみなした。

【０１０１】（蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ））二重色（ｄｕａｌ−ｃｏｌｏｒ）ＦＩＳＨを、ＣＧＨによる増幅を示した腫瘍
の組織セクション上で行った。増幅領域にマッピングするプローブおよびＣＧＨ
分析によって変化しない領域に対する参照プローブを、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓｒｅｓｏｕｒｃｅ（ｈｔｔｐ：／／ｒｍｃ−ｗｗｗ．ｌｂｌ．ｇｏｖ）から
選択した。プローブを、ニックトランスレーションにより、Ｃｙ３（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ，ＡｒｌｉｎｃｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）またはＤｉｇｏｘｉｇｅ
ｎｉｎ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ
ＩＮ）を用いて標識した。６μｍのセクションを正に荷電したガラススライド
（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）上に載
せ、脱パラフィンし、そして減少する濃度のエタノールによって水和させた。セ
クションを、１Ｍチオシアン酸ナトリウム中８０℃で２〜４分間、０．２ＮＨ
Ｃｌ中の４ｍｇ／ｍｌＰｅｐｓｉｎ中３７℃で４〜８分間インキュベートし、
増加する濃度のエタノールで脱水し、そして空気乾燥した。スライドを７０％ホ
ルムアミド、２×ＳＳＣｐＨ７．０中５分間７２℃で変性させ、勾配をつけた
一連のエタノールで脱水した。２．５〜２５ｎｇのそれぞれの標識プローブを、
２０μｇＣｏｔ−１ＤＮＡ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ
．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）とともに、１０μｌのハイブリダイゼー
ション緩衝液（５０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、および２×ＳＳ
Ｃ、ｐＨ７．０）中に溶解させ、１０分間７２℃で変性させた。ハイブリダイゼ
ーションを４８〜７２時間３７℃で行った。スライドを、洗浄溶液（２×ＳＳＣ
中の５０％ホルムアミド、ｐＨ７．０）中４５℃で３回、２×ＳＳＣ中４５℃で
１回、２×ＳＳＣ中室温（ＲＴ）で１回、そして４×ＳＳＣ中の０．１％Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ１００中室温で１回、洗浄した。引き続いて、セクションを３７℃で
湿室中、４×ＳＳＣ中の１０％ＢＳＡでインキュベートし、次いで、１０％ＢＳ
Ａを有する４×ＳＳＣ中で希釈されたＦＩＴＣ標識抗ジゴキシゲニン抗体（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，ＩｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓＩＮ）でイ
ンキュベートした。セクションを抗退色溶液中、４，６−ジアミノ−２−フェニ
ルインドール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＳ）で対比染色した。

【０１０２】全ての実験において、病巣に隣接した表皮のケラチノサイトを、内部コントロ
ールとして使用した。ハイブリダイゼーションを６μｍの厚さのセクション上で
行った場合、多くの核は、スライド中には完全には提示されなかった。ハイブリ
ダイゼーションシグナルをカウントするために、本発明者らは、顕微鏡の焦点が
わずかに変化した場合に最小に切断されたように見える核を選択した。ケラチノ
サイト中の核シグナルカウントは、平均値１．６〜１．９の範囲であった。その
範囲内の平均シグナルカウントを有した腫瘍細胞を、近接二倍体と見なした（増幅の定義）ＣＧＨ測定に基づいて、領域は、染色体アームの別個のセグメントの腫瘍／参
照比が１．５を越えた場合、または比の高さが染色体アームの鋭く区別されたセ
グメントを強調した場合、増幅した呼ばれた。大部分の場合において、両方の基
準は満たされが、いくつかの腫瘍において、増幅された染色体セグメントは、狭
すぎて、＞１．５の比を生じることができなかった。ＡＬＭ群のいくつかの腫瘍
は、全染色体を含む、１．５の腫瘍／参照比を越えるコピー数の増加を有した。
これらの変化は、増幅とみなさなかった。

【０１０３】ＦＩＳＨ実験に基づいて、参照プローブの平均シグナル数の少なくとも三倍を
示す領域を、増幅したと呼んだ。

【０１０４】（免疫組織化学）ヒトｃ−Ｈ−ｒａｓの免疫染色を、色原体としてジアミノベンジジンを使用す
るアビジン−ビオチン免疫ペルオキシダーゼ法を用いる標準的な手順に従って、
組換えｃ−Ｈ−ｒａｓ（ｖａｌ−１２）（ＤａｋｏＣｏｒｐ．，Ｃａｌｐｉｎ
ｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＣｏｄｅＮｏ．Ｍ６３７，希釈１：１００）に対するマウ
スモノクローナル抗体を使用して実施した。

【０１０５】（ＤＮＡ配列分析）Ｈ−ｒａｓコドン１２プライマーは、５’ＡＧＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＡＧＧＡ
ＧＧＡ−３’（順）および５’−ＣＧＣＴＡＧＧＣＴＣＡＣＣＴＣＴＡＴＡＧＴ
Ｇ−３’（逆）であり、そしてコドン６１プライマーは、５’−ＣＴＧＣＡＧＧ
ＡＴＴＣＣＴＡＣＣＧＧＡ−３’および５’−ＡＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＴＴＧＡ
ＴＧＧＣＡ−３’であった。ＰＣＲを、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅ
ｍ９７００ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）
中、２５μｌの反応体積で実施した。各ＰＣＲ反応は、３．５ｍＭのＭｇＣｌ₂
、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、０．６２５ＵＴａｑＧｏｌｄＰｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、１×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒＩＩ、それぞ
れ０．５μＭの順プライマーおよび逆プライマー（ｆｏｒｗａｒｄａｎｄｒ
ｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ）、ならびに５０〜３００ｎｇのゲノムＤＮＡを含
んだ。ＰＣＲサイクル条件は、以下の通りであった：９５℃１５分間、続く３５
サイクルの９５℃１５秒間、５５℃３０秒間、そして７２℃で６０秒間、そして
７２℃で１０分間の最終維持。

【０１０６】配列決定の前に、ＰＣＲ産物をＰＣＲ産物Ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット
（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を使用して
精製し、過剰のプライマーおよびヌクレオチドを除去した。蛍光ＤＮＡ配列決定
を、ＢｉｇＤｙｅｄｙｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し
て実施した。手短には、３０〜５０ｎｇの精製ＰＣＲ産物および３．２ピコモル
の配列決定プライマーを製造業者の指示に従って１５μｌ反応物中で配列決定す
るために使用した。配列決定産物を、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０カラムを使用し
て精製し、減圧濃縮器で乾燥し、３μｌのゲル充填緩衝液（８３％脱イオン化ホ
ルムアミド、１７％ゲル充填色素）（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ）中で再懸濁させた。次いで、０．５μｌのサンプルをＡＢＩ自動ＤＮＡシ
ークエンサーの変性配列ゲルに充填した。データをＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓからのＳｅｑｕｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓ３．０ソフトウェア
を使用して分析し、全てのサンプルを順方向および逆方向の両方で配列決定し、
変異の存在／非存在を確かめた。

【０１０７】本明細書中に記載される実施例および実施形態が例示の目的のみのためであり
、それらを考慮して種々の改変または変化が当業者に提案され、そして本出願お
よび添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれることが理解される。本
明細書中に引用される全ての出版物、特許、および特許出願は、全ての目的につ
いてその全体において参考として本明細書によって援用される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＣＧＨにより検出される１５ＡＭおよび１５ＳＳＭのＤＮＡ配列
コピー数の変化の染色体局在化を示す。染色体イデオグラムの右側のラインはゲ
インを表し、左側のラインは、欠損を表す。太いラインは増幅を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ピンクル，ダニエルアメリカ合衆国カリフォルニア 94595，ウォールナットクリーク，マンザニタコート 31 Ｆターム(参考） 4B024 AA12 BA80 CA01 CA04 CA09 CA11 HA12 4B063 QA01 QA19 QQ08 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR56 QR62 QR82 QS25 QS34 QS36 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】患者由来のサンプルにおける前悪性のメラノサイトの存在を
スクリーニングする方法であって、該方法は、以下：黒色腫細胞において増幅され、そして１１ｐ１５、１１ｑ１３、２２ｑ１２、
７ｐ、６ｐ、１ｑ、１２ｑ１４、および５ｐからなる群から選択される、染色体
領域における標的ポリヌクレオチド配列に対して選択的に結合するプローブと、
患者由来の核酸サンプルを接触する工程であって、ここで該プローブが、該標的
ポリヌクレオチド配列と選択的に結合し、安定なハイブリダイゼーション複合体
を形成する条件下で、サンプルと接触される、工程；およびハイブリダイゼーション複合体の形成を検出する工程、を包含する、方法。
【請求項２】前記核酸サンプルが中期スプレッドまたは間期核である、請
求項１に記載の方法。
【請求項３】前記核酸サンプルが前記患者の黒色腫病巣に隣接する形態学
的に正常な細胞由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記プローブが標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記標識が蛍光標識である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】前記蛍光標識がＦＩＴＣである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】前記プローブがジゴキシゲニンまたはビオチンを用いて標識
される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】前記標識が直接標識である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】第２染色体領域に対する参照プローブと、前記サンプルを接
触する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】前記第２染色体領域がセントロメアである、請求項３に記
載の方法。
【請求項１１】前記第２プローブが、前記標的ポリヌクレオチド配列に対
して選択的にハイブリダイズするプローブ上の前記標識とは区別できる蛍光標識
を用いて標識される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程が、前
記標的ポリヌクレオチド配列のコピー数を決定する工程を包含する、請求項１に
記載の方法。
【請求項１３】核酸の第１および第２コレクションにおいて、反復配列の
ハイブリダイゼーション能力をブロックする工程をさらに包含する、請求項１に
記載の方法。
【請求項１４】反復配列を含む、非標識の、ブロックしている核酸がサン
プルと接触される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】前記非標識の、ブロックしている核酸がＣｏｔ−１ＤＮ
Ａである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】プローブが固体基板に結合される、請求項１に記載の方法
。
【請求項１７】前記プローブがアレイのメンバーである、請求項１６に記
載の方法。