JP2002541826A

JP2002541826A - 悪性黒色腫由来のメラニン細胞母斑を区別するための染色体コピー数の変化の検出

Info

Publication number: JP2002541826A
Application number: JP2000611736A
Authority: JP
Inventors: ボリスバスチャン，; ダニエルピンケル，
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1999-04-09
Filing date: 2000-04-10
Publication date: 2002-12-10
Also published as: EP1181392A4; WO2000061814A8; WO2000061814A9; WO2000061814A1; CA2368903A1; EP1181392A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、悪性黒色腫由来のメラニン細胞母斑（例えば、スピッツ母斑）を識別するための方法を提供する。この方法は、患者由来の核酸サンプルを、染色体領域（例えば、１１ｐ（通常、スピッツ母斑において増幅される））上の標的ポリヌクレオチド配列と選択的に結合するプローブと接触させる工程を包含する。この核酸サンプルは、代表的に患者の皮膚上の腫瘍病巣内に位置する皮膚腫瘍細胞に由来する。染色体領域（例えば、１ｑ、６ｐ、７ｐ、９ｐ、または１０ｑ（これらは、通常、黒色腫において変更されたコピー数を示す））と選択的に結合する別のプローブを使用して、この方法は、１ｑ、６ｐ、７ｐ、９ｐ、または１０ｑのコピー数における変化を伴わないそれらの腫瘍細胞は、黒色腫細胞ではないむしろスピッツ母斑細胞であるということを決定し得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）メラニン細胞は、形態学的に異なる多数の腫瘍を生じ得る。そのほとんどは、
生物学的に良性であり、そしてメラニン細胞母斑と呼ばれる。メラニン細胞母斑
の例は、先天性母斑、スピッツ母斑（スピッツ母斑の亜類型と見なされる、色素
性紡錘細胞母斑を含む）、形成異常母斑またはクラーク母斑、青色母斑、単純黒
子および深部穿通性母斑（ｄｅｅｐｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇｎｅｖｕｓ）で
ある。

【０００２】スピッツ母斑は、黒色腫に対してかなりの組織学的類似点を有し得る、良性メ
ラニン細胞新生物である。これは最初に、１９４８年にＳｏｐｈｉｅＳｐｉｔ
ｚによって「若年性黒色腫」と記載され、そして最初は、良性な経過が続く、小
児期黒色腫の部分集合と見なされた（Ｓｐｉｔｚ，Ｓ．、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏ
ｌ．２４、５９１〜６０９（１９４８））。スピッツ母斑は、一般的であり、そ
して外科的に除去される母斑の約１％の原因である（Ｃａｓｓｏら、Ｊ．Ａｍ
ＡｃａｄＤｅｒｍａｔｏｌ．２７、９０１〜１３（１９９２））。一般的に、
スピッツ母斑の病理学的診断は簡単であるが、スピッツ母斑を黒色腫と組織学的
に識別することが困難〜不可能である症例の部分集合が存在し、これは、重複す
る組織学的特徴（例えば、豊富な細胞質を有するメラニン細胞および／または大
きな多形性核を有するメラニン細胞の存在）が原因である。さらに、有糸分裂像
は、時には多数が、両方の新生物にて生じる。

【０００３】黒色腫とは、メラニン細胞の悪性新生物をいう。正確な診断および早期の処置
は、非常に重要である。なぜなら、進行した黒色腫は、わずかな予後しか有さず
、ほとんどの黒色腫は、その早期段階で切除される場合に治癒可能であるからで
ある。一般に、黒色腫の病理学的診断は簡単であるが、黒色腫をメラニン細胞の
良性新生物と識別することが困難〜不可能である症例の部分集合が存在する（Ｌ
ｅＢｏｉｔ，Ｐ．Ｅ．、ＳＩＭＵＬＡＮＴＳＯＦＭＡＬＩＧＡＮＡＮＴＭ
ＥＬＡＮＯＭＡ：ＡＲＯＧＵＥ’ＳＧＡＬＬＥＲＹＯＦＭＥＬＡＮＯＣ
ＹＴＩＣＡＮＤＮＯＮ−ＭＥＬＡＮＯＣＹＴＩＣＩＭＰＯＳＴＥＲＳ、Ｍ
ａｌｉｇｎａｎｔＭｅｌａｎｏｍａａｎｄＭｅｌａｎｏｃｙｔｉｃＮｅ
ｏｐｌａｓｍｓ、Ｐ．Ｅ．Ｌｅｂｏｉｔ編（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｈａｎ
ｌｅｙおよびＢｅｌｆｕｓ）１９５〜２５８頁（１９９４））。黒色腫の多くの
刺激因子を分類する診断基準は絶えず洗練されているけれども、明白な診断に到
達し得ない症例の部分が残る（Ｆａｒｍｅｒら、ＤＩＳＣＯＲＤＡＮＣＥＩＮ
ＴＨＥＨＩＳＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＤＩＡＧＮＯＳＩＳＯＦＭＥ
ＬＡＮＯＭＡＡＮＤＭＥＬＡＮＯＣＹＴＩＣＮＥＶＩＢＥＴＷＥＥＮ
ＥＸＰＥＲＴＰＡＴＨＯＬＯＧＩＳＴＳ、ＨｕｍａｎＰａｔｈｏｌ．２７：
５２８〜３１（１９９６））。最も頻繁かつ重要な診断ジレンマは、スピッツ母
斑と黒色腫との間の差次的診断である。

【０００４】スピッツ母斑を黒色種とする誤診およびその逆は、文献に繰り返し報告されて
いる（Ｇｏｌｄｅｓら、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１：２９５〜８（
１９８４）；Ｏｋｕｎ，Ｍ．Ｒ．、Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１５：１４
１６〜１４２０（１９７９）；Ｐｅｔｅｒｓら、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ
、１０、１２８９〜１３０２（１９８６））。１０２例の小児期の黒色腫の回想
研究によって、６０症例のみが、一群の専門家によって黒色腫として分類され、
残りの大多数はスピッツ母斑として分類されていることが、見出された（Ｓｐａ
ｔｚ，Ｓ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ６８、３１７〜２４（１９９６））。
この診断のグレーゾーンの存在は、ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉ
ｃａｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙの「Ｃｏｎｔ
ｉｎｕｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＥｄｕｃａｔｉｏｎ」の節における総説論文の
著者が、スピッツ母斑および黒色腫が「実際には一連の疾患に存在」し得ると結
論付ける（Ｃａｓｓｏら、Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２７．９０
１〜１３（１９９２））ことさえもたらした。この著者は、「処置は、すべての
スピッツ母斑の完全な切除、続いて存在する場合は陽性の縁の再切除を含む」こ
とを薦めた。メラニン細胞新生物について改善された診断法の必要性が、免疫組
織化学により検出され得るマーカーの使用によって、診断の正確性を改善しよう
とする多数の試みを生じた。この問題を解決しようとする先の努力が存在したが
、どれも十分ではなかった。例えば、Ｓ１００、ＨＭＢ４５のようなマーカーを
使用する試験は、ほとんど分化していない腫瘍がメラニン細胞の株であることを
確立する際には有用であるが、付属する技術は、良性のメラニン細胞病変を悪性
のメラニン細胞病変から分類するのをほとんど補助しなかった。

【０００５】従って、スピッツ母斑を悪性黒色腫から区別するための改善されかつ正確な診
断法について、大きな必要性が存在する。さらに、スピッツ母斑と悪性との間に
あり分類するのが困難である、メラニン細胞新生物を区別する必要性が存在する
。本発明は、これらの必要性および他の必要性に取り組み、この取り組みは、１
１ｐ染色体アームのコピー数における増加の存在を腫瘍サンプルにて検出するこ
と、特に、スピッツ母斑の存在を示す、１１ｐ同腕染色体の存在を検出すること
によって、メラニン細胞新生物を分類する方法を提供することによる。分類はま
た、染色体１１ｐ１５．５の増幅の存在を腫瘍サンプルにおいて決定すること、
および特に、Ｈ−ＲＡＳの増幅を検出することによって、実施され得る。分類の
さらなる局面は、腫瘍サンプル中に存在する変異型Ｈ−ＲＡＳ遺伝子の検出であ
り、この変異型Ｈ−ＲＡＳ遺伝子はまた、スピッツ母斑に関連するかまたはスピ
ッツ母斑の存在を示す。

【０００６】（発明の要旨）本発明は、メラニン細胞母斑（例えば、スピッツ母斑）を悪性黒色腫から区別
する方法を提供する。この方法は、染色体領域（例えば、１１ｐ、特に１１ｐ１
５．５）上の標的ポリヌクレオチド配列（例えば、Ｈ−ＲＡＳ）を検出する工程
を包含し、この配列は、スピッツ母斑にて頻繁に増幅される。この核酸サンプル
は、代表的には、患者に皮膚上の腫瘍病変中に位置する皮膚腫瘍組織から採取さ
れる。この方法はまた、その腫瘍細胞が、黒色腫と関係する染色体領域（例えば
、１ｑ、６ｐ、７ｐ、または１０ｑ）中に変化を欠くか否かを決定するために使
用され得る。通常は、その標的領域のコピー数が測定される。

【０００７】本発明の方法は、さらに、患者由来のメラニン細胞新生物を分類する方法であ
って、１１ｐ染色体アームのコピー数における増加の存在を検出し、それにより
メラニン細胞新生物をスピッツ母斑と分類することによる方法を包含する。代表
的には、この方法は、患者由来の腫瘍サンプル中の１１ｐ同腕染色体の存在を検
出する工程を包含する。

【０００８】その核酸サンプルは、間期の核から抽出され得る。代表的には、そのプローブ
は、例えば、蛍光標識で標識される。その標識は、直接標識であり得る。通常は
、第２の染色体領域への参照プローブが、内部コントロールとしてこの方法にお
いて使用される。これらの実施形態において、この第２のプローブは、その標的
ポリヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズするプローブ上の標識と区別可
能な蛍光標識で標識される。

【０００９】いくつかの実施形態において、そのプローブは、反復配列を含み得る。この場
合において、この方法はさらに、そのプローブへの反復配列のハイブリダイゼー
ション能力をブロックする工程を包含し得る。反復配列を含む非標識ブロック核
酸（例えば、Ｃｏｔ−１ＤＮＡ）が、この目的のためにサンプルと接触させら
れ得る。

【００１０】この核酸ハイブリダイゼーションは、多くの形式にて実行され得る。例えば、
このハイブリダイゼーションは、インサイチュハイブリダイゼーションであり得
る。いくつかの実施形態において、そのプローブは、固体基材に、例えば、核酸
アレイのメンバーとして、結合される。

【００１１】本発明の１つの実施形態において、メラニン細胞新生物は、Ｈ−ＲＡＳ遺伝子
中の変異の存在を検出することによって、スピッツ母斑として分類され得る。そ
の変異は、Ｈ−ＲＡＳをコードする核酸またはフラグメントを増幅し、そしてそ
の増幅した産物を配列決定して、その配列が正常なＨ−ＲＡＳ配列に対して変異
を含むか否かを決定することによって、検出され得る。増幅は、代表的には、Ｐ
ＣＲを使用して実施される。ＰＣＲ反応のためのプライマーは、配列番号１およ
び２ならびに配列番号３および４に記載されるものを含む。増幅される核酸は、
ゲノムＤＮＡであっても、ＲＮＡであってもよい。

【００１２】本発明の別の局面において、Ｈ−ＲＡＳ遺伝子における変異の存在は、皮膚腫
瘍サンプル由来の核酸を、Ｈ−ＲＡＳ遺伝子を含む標的核酸に選択的にハイブリ
ダイズするプローブと接触させて、安定なハイブリダイゼーション複合体を形成
することによって、検出される。このプローブは、そのプローブがＨ−ＲＡＳ遺
伝子を含む標的核酸に選択的に結合する条件下で接触される。１つの実施形態に
おいて、そのプローブは、変異型Ｈ−ＲＡＳ遺伝子に選択的にハイブリダイズす
る。この方法はさらに、そのサンプルから核酸を増幅する工程を包含し得る。好
ましくは、この増幅工程は、ＰＣＲ反応であり、この反応は、例えば、配列番号
１および２、ならびに３および４に記載されるようなオリゴヌクレオチドを使用
して、実施され得る。このサンプル由来の核酸は、好ましくは、ゲノムＤＮＡま
たはＲＮＡである。

【００１３】本発明はまた、Ｈ−ＲＡＳ遺伝子によりコードされるポリペプチドを検出する
ことによって、増幅されたＨ−ＲＡＳ遺伝子の存在を検出する方法を包含する。
好ましくは、ポリペプチドの量は、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使
用して定量される。１つの実施形態において、このポリペプチドは、変異体Ｈ−
ＲＡＳ遺伝子によりコードされるポリペプチドに選択的に結合する抗体を使用し
て、検出される。

【００１４】（定義）本発明の理解を容易にするために、多数の用語が以下に規定される。

【００１５】用語「黒色腫」または「皮膚黒色腫」とは、メラニン細胞の悪性新生物をいい
、これは、通常は表皮中に、時には真皮中に存在する、色素細胞である。以下の
４つの型の皮膚黒色腫が存在する：悪性黒子黒色腫、表在拡大型黒色腫（ＳＳＭ
）、結節性黒色腫、および末端部黒子黒色腫（ＡＭ）。黒色腫は通常、表皮と真
皮との接合部の、単一のメラニン細胞の増殖として開始する。この細胞はまず、
水平様式で成長し、そして数ミリメートル〜数センチメートルに変化し得る皮膚
の領域に落ち着く。上記のように、ほとんどの場合、形質転換したメラニン細胞
は、関与する領域が臨床医により容易に観察され得るように、増加した量の色素
を生成する。

【００１６】用語「メラニン細胞新生物」とは、良性の経過、局所的に侵襲性（ａｇｇｒｅ
ｓｓｉｖｅ）の経過、または悪性の経過を経験し得る、メラニン細胞の蓄積をい
う。「メラニン細胞新生物」は、良性のメラニン細胞新生物「母斑」および悪性
のメラニン細胞新生物「黒色腫」の両方を包含する。

【００１７】用語「スピッツ母斑（単数または複数）」とは、黒色腫に対してかなりの組織
学的類似点を有し得る、メラニン細胞新生物をいう。これらは一般的に、良性で
あるが、局所的に再発し得、またはまれにリンパ節に広がり得る。これらはまず
、「若年性黒色腫」と記載され、そして最初は、良性の経過が続く、小児期黒色
腫の亜類型と考えられた。スピッツ母斑は、一般的であり、そして外科的に除去
される母斑の約１％の原因である。

【００１８】動物における用語「腫瘍」または「癌」とは、不定型の増殖または形態のよう
な特徴（制御されない増殖、不朽性、転移能、迅速な成長および増殖の速度、な
らびに特定の特有の形態学的特徴を含む）を有する細胞の存在をいう。しばしば
、癌細胞が、腫瘍の形態であるが、このような細胞は、動物中にて単独で存在し
得る。「腫瘍」は、良性および悪性の両方の新生物を包含する。

【００１９】句、新生物を「分類する」または「検出する」とは、その新生物が、新生物の
特定の種類であるか、または新生物の特定の種類である高い可能性を有するかの
決定をいう。分類は、その新生物が、良性であるかまたは悪性であるか、あるい
は母斑の型（例えば、スピッツ母斑）に基づき得る。「分類する」または「検出
する」とはまた、患者におけるスピッツ母斑または黒色腫の存在の可能性に関す
る、間接的証拠を得ることもいい得る。黒色腫に対するスピッツ母斑の検出は、
本発明の方法単独を使用してか、または他の方法と組み合わせてか、または患者
の健康状態に関する他の情報を考慮して、達成され得る。

【００２０】用語「特異的にハイブリダイズする」、「特異的ハイブリダイゼーション」お
よび「選択的にハイブリダイズする」とは、本明細書中で使用される場合、スト
リンジェントな条件下での、優先的に特定のヌクレオチド配列への、核酸分子の
結合、二重鎖形成、またはハイブリダイゼーションをいう。用語「ストリンジェ
ントな条件」とは、プローブがその標的部分配列に優先的にハイブリダイズし、
そしてより弱い程度で他の配列にハイブリダイズするかもしくは全く他の配列に
ハイブリダイズしない、条件をいう。核酸ハイブリダイゼーションの文脈におい
て（例えば、アレイにおいて、サザンハイブリダイゼーションにおいて、または
ノーザンハイブリダイゼーションにおいて）、「ストリンジェントなハイブリダ
イゼーション」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」
は、配列依存性であり、そして異なる環境パラメーターの下で異なる。核酸への
ハイブリダイゼーションの広範な指針が、例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎｗｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓｐａｒｔＩ，Ｃ
ｈ．２、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｈｙｂｒｉ
ｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｓｔｒａｔｅｇｙｏｆｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄｐｒｏｂｅａｓｓａｙｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ＮＹ（「Ｔｉｊ
ｓｓｅｎ」）に見出される。一般的に、非常にストリンジェントなハイブリダイ
ゼーションおよび洗浄の条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにて、特定の
配列に関する熱融解点（Ｔ_m）より約５℃低いように選択される。このＴ_mは、（
規定されたイオン強度およびｐＨの下で）標的配列の５０％が、完全に一致した
プローブにハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、
特定のプローブについてのＴ_mと等しいように選択される。サザンブロットまた
はノーザンブロットにおけるアレイもしくはフィルター上での、１００個を超え
る相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件の例は、標準的ハイブリダイゼーション溶
液（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版）第１〜３巻、Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、ＮＹおよび以下の詳細な説明を参照のこと）を
使用して４２℃であり、このハイブリダイゼーションは、一晩実行される。非常
にストリンジェントな洗浄条件の例は、７２℃で約１５分間の０．１５ＭＮａ
Ｃｌである。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃にて１５分間の０．２
×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら（前出）を参照のこと）。しばしば、高ストリンジェンシー洗浄が、バック
グラウンドのプローブシグナルを除去するために、低ストリンジェンシー条件の
前に行われる。例えば、１００ヌクレオチドを超える二重鎖についての中ストリ
ンジェンシー洗浄の例は、４５℃で１５分間の１×ＳＳＣである。例えば、１０
０ヌクレオチドを超える二重鎖についての低ストリンジェンシー洗浄の例は、４
０℃で１５分間の４×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣである。

【００２１】用語「検出可能な標識で標識される（された）」とは、本明細書中で使用され
る場合、核酸が検出可能な組成物（すなわち、標識）に付着されることをいう。
その検出は、例えば、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的
手段、物理学的手段または化学的手段により得る。例えば、有用な標識としては
、³²Ｐ、³⁵Ｓ、³Ｈ、¹⁴Ｃ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ；蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、ロー
ダミン、ランタニドリン光体、Ｔｅｘａｓｒｅｄ）、電子が密な試薬（例えば
、金）、例えば、ＥＬＩＳＡにて一般的に使用されるような、酵素（例えば、ホ
ースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、
アルカリホスファターゼ）、比色標識（例えば、コロイド状金）、磁性標識（例
えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ^TM）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、
ならびに抗血清もしくはモノクローナル抗体が利用可能であるタンパク質が、挙
げられる。この標識は、核酸、ペプチド、または検出される他の標識化合物に直
接組み込まれ得るし、またはこの標識は、標的にハイブリダイズまたは結合する
、プローブまたは抗体に付着され得る。標識は、潜在的立体障害を減少するため
または他の有用な特性もしくは所望の特性を付与するために、種々の長さのスペ
ーサーアームにより付着され得る。例えば、Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ、ＭｏｌＣｅ
ｌｌＰｒｏｂｅｓ９：１４５〜１５６（１９９５）を参照のこと。さらに、
標的ＤＮＡ配列は、プライムドインサイチュラベリング技術（ＰＲＩＮＳ）によ
って検出され得る（Ｋｏｃｈら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．
８：１７１〜８（１９９１））。検出の感度は、化学的増幅手順を使用すること
、例えば、チラミド（ｔｙｒａｍｉｄｅ）を使用することによって、増加され得
る（Ｓｐｅｅｌら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４５：１４３
９〜４６（１９９７））。

【００２２】用語「対形成したハイブリダイゼーションシグナル」または「ハイブリダイゼ
ーションシグナルペア」は、ハイブリダイゼーションシグナルの空間パターンを
いい、ここで、２つのシグナルは、一貫して、極めて接近して同定される。同腕
染色体は、代表的に、単一のプローブ由来の「対形成したハイブリダイゼーショ
ンシグナル」の存在によって特徴付けられる。例えば、多くの細胞を含むサンプ
ルにおいて、「ハイブリダイゼーションシグナルペア」は、人工産物またはラン
ダムな事象に明らかに起因しない、極めて接近した２つのシグナルの一貫した発
生である。

【００２３】本明細書中で使用されるように、用語「核酸」は、一本鎖形態または二本鎖形
態のいずれかにおけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドをいう
。この用語は、参照核酸のように、所望される目的のために、類似の結合性質ま
たは改良された結合性質を有する、天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む
核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド）を包含する。この用語はまた、天然に存
在するヌクレオチドに類似の様式で代謝されるか、または所望の目的のために改
良された速度で代謝される核酸を含む。この用語はまた、合成骨格を有する核酸
様構造を包含する。本発明によって提供されるＤＮＡ骨格アナログとしては、ホ
スホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネ
ート、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、アルキルホス
ホトリエステル、スルファメート（ｓｕｌｆａｍａｔｅ）、３’−チオアセター
ル、メチレン（メチルイミノ）、３’−Ｎ−カルバメート（ｃａｒｂａｍａｔｅ
）、モルホリノカルバメート、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる；Ｏ
ｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＡｎａｌｏｇｕｅｓ，ａＰｒａｃ
ｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、ＩＲＬＰｒｅｓｓ
ａｔＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（１９９１）；Ａｎ
ｔｉｓｅｎｓｅＳｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ＡｎｎａｌｓｏｆｔｈｅＮｅｗ
ＹｏｒｋＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，第６００巻、Ｂａｓｅ
ｒｇａおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編（ＮＹＡＳ１９９２）；Ｍｉｌｌｉｇａｎ（
１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１９２３−１９３７；Ａｎｔｉｓｅｎ
ｓｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３，ＣＲ
ＣＰｒｅｓｓ）を参照のこと。ＰＮＡは、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン
単位のような非イオン性骨格を含む。ホスホロチオエート連結は、ＷＯ９７／
０３２１１；ＷＯ９６／３９１５４；Ｍａｔａ（１９９７）Ｔｏｘｉｃｏｌ．
Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４４：１８９−１９７に記載される。この用
語によって包含される他の合成骨格としては、メチルホスホネート連結または交
互のメチルホスホネートおよびホスホジエステル連結（Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕ
ｋｕｐ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３６：８６９２−８６９８）、
ならびにベンジルホスホネート連結（Ｓａｍｓｔａｇ（１９９６）Ａｎｔｉｓｅ
ｎｓｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＤｒｕｇＤｅｖ６：１５３−１５６）
が挙げられる。用語、核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチ
ドプライマー、プローブおよび増幅産物と交換可能に使用される。

【００２４】本明細書中で使用されるように、用語「核酸アレイ」は、複数の標的エレメン
トであり、各々の標的エレメントは、サンプル核酸がハイブリダイズされ得る１
つ以上の固体表面上に固定化された１つ以上の核酸分子（プローブ）を含む。標
的エレメントの核酸は、特定の遺伝子またはクローン（例えば、本明細書中で同
定された領域）由来の配列を含み得る。他の標的エレメントは、例えば、参照配
列を含む。種々の大きさの標的エレメントが、本発明のアレイにおいて使用され
得る。一般的には、より小さい標的エレメントが好ましい。代表的には、標的エ
レメントは、直径約１ｃｍ未満である。一般的に、エレメントの大きさは、１μ
ｍ〜約３ｍｍであり、好ましくは、約５μｍと約１ｍｍとの間である。アレイの
標的エレメントは、異なる密度で固体表面上に配列され得る。標的エレメントの
密度は、多くの因子（例えば、標識、固体支持体などの性質）に依存する。当業
者は、各々の標的エレメントが、異なる長さおよび配列の核酸の混合物を含み得
ることを認識する。従って、例えば、標的エレメントは、ＤＮＡのクローン化さ
れた断片の１を超えるコピーを含み得、そして各々のコピーは、異なる長さのフ
ラグメントに切断され得る。標的エレメント上に固定された核酸の長さおよび複
雑性は、本発明に重大ではない。当業者は、これらの因子を調節して、最適のハ
イブリダイゼーションおよび所定のハイブリダイゼーション手順のためのシグナ
ル生成を提供し得、そして異なる遺伝子またはゲノム位置の間に必要とされる解
決を提供し得る。種々の実施形態において、標的エレメント配列は、約１ｋｂと
約１Ｍｂとの間、約１０ｋｂと約５００ｋｂとの間、約２００ｋｂと約５００ｋ
ｂとの間、そして約５０ｋｂ〜約１５０ｋｂの複雑性を有する。

【００２５】本明細書中で使用されるように、用語「核酸サンプル」または「ヒト核酸のサ
ンプル」は、ハイブリダイゼーションまたは増幅による検出に適切な形態で、ヒ
トＤＮＡまたはＲＮＡを含むサンプルをいう。代表的には、これは、分類が困難
であり得るメラニン細胞腫瘍を有するか、またはこの腫瘍を有する疑いのある患
者由来の皮膚組織サンプルから調製される。このサンプルは、最も通常、腫瘍か
ら採取された組織から調製される。

【００２６】多くの場合において、核酸サンプルは、以下に記載される標準的なインサイチ
ュハイブリダイゼーション方法のために準備される組織または細胞サンプルであ
る。このサンプルが調製されて、その結果、標準的な技術に従って調製された個
々の染色体は、実質的にインタクトなままである。あるいは、核酸は、単離され
得るか、クローニングされ得るか、または増幅され得る。これは、例えば、特定
の染色体由来の、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであり得るか、あるい
は本明細書中で開示される特定のアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）または欠失
の内部の選択された配列（例えば、特定のプロモーター、遺伝子、増幅または制
限フラグメント、ｃＤＮＡなど）であり得る。

【００２７】核酸サンプルは、特定の細胞または組織（例えば、メラニン細胞）から抽出さ
れ得る。細胞および組織サンプルを単離する方法は、当業者に周知であり、そし
て吸引、組織切片、針バイオプシーなどを含むが、これらに限定されない。頻繁
に、サンプルは、患者に由来するサンプルである「臨床サンプル」であり、これ
は、組織学的目的のために採取された、凍結切片またはパラフィン切片のような
組織切片を含む。サンプルはまた、細胞培養物由来の（細胞の）上清または細胞
自身、組織培養物由来の細胞、および染色体異常の検出、またはアンプリコンの
コピー数の決定に望ましいものであり得る他の培地由来であり得る。いくつかの
場合において、核酸は、ハイブリダイゼーションの前に、ＰＣＲのような標準的
技術を使用して増幅され得る。サンプルは、固体上に固定化された、単離された
核酸であり得る。

【００２８】本明細書中で使用されるように、用語「プローブ」または「核酸プローブ」は
、サンプルに対するハイブリダイゼーションが検出され得る、１つ以上の核酸フ
ラグメントの蓄積物（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）であるように規定される。プロー
ブは、以下に記載されるように、非標識であり得るか、または標識され得る。そ
の結果、標的またはサンプルへの結合が検出され得る。プローブは、ゲノムの１
つ以上の特定の（あらかじめ選択された）部分（例えば、１つ以上のクローン）
、単離された全体の染色体または染色体フラグメント、あるいはポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）増幅産物の蓄積物由来の核酸の供給源から生成される。本発明
のプローブは、本明細書中で記載される領域において見出される核酸から生成さ
れる。

【００２９】「動原体に隣接する」プローブは、動原体に隣接する領域にハイブリダイズし
、そして１１ｐ１１．１〜１１ｐ１１．２または１１ｑ１１．１〜１１ｑ１１．
２で配列に結合するプローブをいう。

【００３０】「１１ｐ染色体アーム」は、細胞遺伝学的に、バンド１１ｐ１１〜１１ｐｔｅ
ｒの染色体を包含するように規定される。

【００３１】プローブまたはゲノム核酸サンプルは、いくつかの様式で（例えば、反復核酸
のブロックまたは除去、あるいは独特の核酸での濃縮によって）プロセスされ得
る。用語「サンプル」は、本明細書中で使用されて、検出された核酸だけでなく
、標的に適用された形態（例えば、ブロッキング核酸などを有する形態）におい
て検出可能な核酸をもいい得る。ブロッキング核酸はまた、別々にいわれ得る。
「プローブ」が具体的に言及するものは、用語が使用される文脈から明らかであ
る。プローブはまた、アレイにおけるように、固体表面（例えば、ニトロセルロ
ース、ガラス、石英、融合シリカスライド）上に固定化された、単離された核酸
であり得る。いくつかの実施形態において、プローブは、例えば、ＷＯ９６／
１７９５８に記載されるような多くの核酸のアレイであり得る。高密度アレイを
生成し得る技術はまた、この目的のために使用され得る（例えば、Ｆｏｄｏｒ（
１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ７６７−７７３；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（１９９８）Ｃ
ｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：Ｒ１７１−Ｒ１７４；Ｓｃｈｕｍｍｅｒ（１９９７）Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２３：１０８７−１０９２；Ｋｅｒｎ（１９９７）
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２３：１２０−１２４；米国特許第５，１４３，
８５４号を参照のこと）。当業者は、本明細書中で記載される特定のプローブの
正確な配列が、開示されたプローブに「実質的に同一」であるが、由来するプロ
ーブと同じ標的またはサンプルに特異的に結合する（すなわち、特異的にハイブ
リダイズする）能力を保持するプローブを生成するように、ある程度まで改変さ
れ得ることを認識する（上記の議論を参照のこと）。このような改変は、本明細
書中で記載される個々のプローブを参照することによって特異的に網羅される。

【００３２】用語「イムノアッセイ」は、抗原を特異的に結合するような抗体を使用するア
ッセイである。イムノアッセイは、特定の抗体の特異的結合性質の使用によって
特徴付けられ、抗原を単離し、標的化し、そして／または定量する。

【００３３】タンパク質またはペプチドをいう場合、句、抗体への「特異的（または選択的
）結合」あるいは「特異的に（または選択的に）〜と免疫反応性」は、タンパク
質および他の生物製剤の異種集団におけるタンパク質の存在の決定因である結合
反応をいう。従って、指定されたイムノアッセイ条件下において、特定化された
抗体は、少なくとも２倍のバックグラウンドで、より代表的には、１０〜１００
倍を超えるバックグラウンドで特定のタンパク質に結合し、そしてサンプル中に
存在する他のタンパク質に有意な量で実質的に結合しない。用語「イムノアッセ
イ」は、抗原を特異的に結合する抗体を使用するアッセイである。イムノアッセ
イは、特定の抗体の特異的結合性質の使用によって特徴付けられ、抗原を単離し
、標的化し、そして／または定量する。

【００３４】タンパク質またはペプチドをいう場合、句、抗体への「特異的（または選択的
）結合」あるいは「特異的に（または選択的に）〜と免疫反応性」は、タンパク
質および他の生物製剤の異種集団におけるタンパク質の存在の決定因である結合
反応をいう。従って、指定されたイムノアッセイ条件下において、特定化された
抗体は、少なくとも２倍のバックグラウンドで、より代表的には、１０〜１００
倍を超えるバックグラウンドで特定のタンパク質に結合し、そしてサンプル中に
存在する他のタンパク質に有意な量で実質的に結合しない。いくつかの条件下で
の抗体への特異的結合は、特定のＨ−ＲＡＳタンパク質についての特異性のため
に選択される抗体を必要とし得る。例えば、変異Ｈ−ＲＡＳ遺伝子によってコー
ドされるポリペプチドに選択的に結合する抗体は、変異であるが正常なＨ−ＲＡ
Ｓに結合する。

【００３５】「核酸サンプルの提供」は、本発明において記載される方法における使用のた
めの生物学的サンプルを得ることを意味する。最もしばしば、これは、動物由来
の細胞のサンプルを取り除くことによって行われるが、また、以前に単離された
細胞（例えば、別人によって単離された細胞）を使用することによって達成され
得るか、または、インビボで本発明の方法を行うことによって達成され得る。

【００３６】「組織バイオプシー」は、診断分析のための生物学的サンプルの除去をいう。
癌を有する患者において、組織は、腫瘍から取り出され得、腫瘍内部の細胞の分
析を可能にする。

【００３７】（特定の実施形態の説明）（序論）本発明は、スピッツ母斑と悪性黒色腫とを区別するための、独特かつ正確な方
法を提供する。本発明は、黒色腫において頻繁に変更されたコピー数を有する染
色体領域（例えば、１ｑ、６ｐ、７ｐ、９ｐまたは１０ｑ）が、スピッツ母斑に
おいてほとんど変化しないという知見に基づく。さらに、スピッツ母斑細胞は、
コピー数の増加によって示されるように、染色体領域１１ｐ、特に、１１ｐ１５
．５、より特にＨ−ＲＡＳ遺伝子（１１ｐ１５．５に局在する）の単一の増幅、
すなわち黒色腫においては極めて珍しい現象を示す。染色体１１ｐの増幅は、代
表的には、１１ｐ染色体アームの増幅を介して発生し、そして１１ｐ同腕染色体
の存在によって特徴付けられる。スピッツ母斑と黒色腫との間の染色体異常の型
におけるこの差異は、スピッツ母斑と黒色腫とのより正確な診断区別を導き得る
。

【００３８】本発明はさらに、皮膚腫瘍サンプルにおけるスピッツ母斑の診断に関連する変
異Ｈ−ＲＡＳ遺伝子の存在を検出することによって、メラニン細胞新生物を分類
する方法を提供する。

【００３９】原発性黒色腫および転移性黒色腫を含む黒色腫細胞の間の染色体異常の頻度は
、ＣＧＨを使用して研究された（Ｂａｓｔｉａｎら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５
８，２１７０−５（１９９８））。この実験の発見のうちの一つは、それぞれ、
８１％および６３％の腫瘍において発生する、染色体９および染色体１０の頻繁
な喪失であった。薄い腫瘍および厚い腫瘍における発生の頻度を比較することに
よって、ならびに腫瘍進行の異なる段階にある腫瘍の部分を比較することによっ
て、染色体９および１０の喪失が、腫瘍形成の初期に発生したことが発見された
。

【００４０】７０個の腫瘍までデータセットを拡張する別のセットの実験が行われた。第二
のセットの実験からの結果は、染色体９および１０の喪失が、皮膚の原発性黒色
腫における最も頻繁な変化であることを確認した。これらの７０個の黒色腫にお
いて、４つのみがＣＧＨによる変化を示さなかった。黒色腫細胞を用いて行われ
たこれらの実験の結果を、図１に示す。

【００４１】イメージサイトメトリーまたはフローサイトメトリーによる核ＤＮＡ含量の測
定を使用した、スピッツ母斑における倍数性のいくつかの研究が存在する（Ｈｏ
ｗａｔら、Ｃａｎｃｅｒ６３，４７４−８（１９８９）；ＬｅＢｏｉｔら、Ｊ
ＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ８８，７５３−７（１９８７）；Ｏｔｓｕ
ｋａら、ＣｌｉｎＥｘｐＤｅｒｍａｔｏｌ１８，４２１−４（１９９３）
；Ｖｏｇｔら、ＡｍＪＤｅｒｍａｔｏｐａｔｈｏｌ１８，１４２−５０（
１９９６））。しかし、これらの技術の慣用的な適用は、手順の複雑性および感
受性の欠失によって妨げられる。最近、分子細胞遺伝学的分析が、スピッツ母斑
（特に、スピッツ母斑のサブセット）が、１１ｐ１５．５領域を含む染色体１１
ｐの増幅を示すことを示した（例えば、Ｂａｓｔｉａｎら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．
Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１３：１０６５−１０６９，１９９９；およびＢａｓｔｉ
ａｎら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５８：２１７０−２１７５，１９９８を参照の
こと）。本明細書中で開示されるように、Ｈ−ＲＡＳ遺伝子（１１ｐ１５．５に
局在する）の変異を伴うかまたは伴わない増幅がまた、スピッツ母斑に存在する
。Ｈ−ＲＡＳが、黒色腫においてほとんど変異しない（例えば、Ｊｉｖｅｓｋｏ
ｇら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１１：７５７−７６１，１９９
８；ｖａｎＥｌｓａｓら、ＡｍＪ．Ｐａｔｈｏｌ．１４９：８８３−８９３
，１９９６を参照のこと）が、スピッツ母斑において変異するので、Ｈ−ＲＡＳ
における変異は、スピッツ母斑と黒色腫とをさらに区別するために使用され得る
。従って、本発明は、新生物が、スピッツ母斑であるか否かを決定するために、
増幅されたＨ−ＲＡＳ遺伝子の存在および／またはメラニン細胞新生物における
Ｈ−ＲＡＳ遺伝子の変異を決定するための方法を提供する。

【００４２】スピッツ母斑のサブセットが、切除の後に再発することが決定された。このサ
ブセットは、代表的には、完全な１１ｐ染色体アームの増幅によって、特に、１
１ｐ同腕染色体の存在によって特徴付けられる。染色体１１ｐの完全なアームの
増幅は、黒色腫において観察されていない。従って、本発明はまた、１１ｐの完
全なアームのコピー数の増加の存在を検出することによって（特に、１１ｐ同腕
染色体の存在を検出することによって）、メラニン細胞新生物をスピッツ母斑と
して分類または類別する方法を提供する。

【００４３】（染色体異常を測定するための一般的方法）ゲノムの不安定性は、固体腫瘍の顕著な特徴であり、そして実際に、ゲノムの
主要な変更を示さない固体腫瘍は存在しない。大多数の腫瘍に関して、この不安
定性は、染色体相補体のレベルにおいて表現され、従って細胞遺伝アプローチに
より検出可能である（Ｍｉｔｅｌｍａｎ，Ｆ．、Ｃａｔａｌｏｇｏｆｃｈｒ
ｏｍｏｓｏｍｅａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓｉｎｃａｎｃｅｒ、第５版（Ｎｅ
ｗＹｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ）（１９９４））。しかし、異数性は、そ
れ自体では悪性度を示さず、そして多くの良性腫瘍は、異常な核型を有し得る（
Ｍｉｔｅｌｍａｎ、１９９４）。異数性をマーカーとして効率的に利用するため
に、分化されるべき腫瘍の特徴の異常を知ることは、必須である。

【００４４】固定後の組織における染色体相補体の研究を可能にするいくつかの技術が、開
発された。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して、
細胞分裂間期の核における個々の遺伝子座のコピー数を、研究し得（Ｐｉｎｋｅ
ｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５、９１３８−
４２（１９８８））、そして比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）（Ｋ
ａｌｌｉｏｎｉｅｍｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８、８１８−２１（１９９２）
）は、染色体領域のコピー数の変化に関してゲノム全体をプローブするために有
用な技術であることが、示された（Ｈｏｕｌｄｓｗｏｕｔｈら、ＡｍＪＰａ
ｔｈｏｌ１４５、１２５３−６０（１９９４））。

【００４５】ＦＩＳＨの、黒色腫からのスピッツ母斑の分化についての付加的な診断技術と
しての適用は、以前に示唆された（ＤｅＷｉｔら、ＪＰａｔｈｏｌ．１７３
、２２７−３３（１９９４））。調査者は、染色体１のための動原体プローブを
使用し、そして１５の黒色腫と１５のスピッツ母斑との間で、異常数のシグナル
を有する細胞の数に有意な差異を見出した。この時点において、皮膚の原発性黒
色腫の染色体変化に関する詳細な知識は利用可能ではなく、そして染色体１は、
黒色腫転移の頻繁な数値的な変化に基づいて、選択された（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら
、ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅｔＣｙｔｏｇｅｎｅｔ８３、９３−１０４（１９
９５））。原発性黒色腫に頻繁に関与する領域の染色体マーカーのパネルの選択
は、感度および特異性を、ＦＩＳＨを慣用的な方法として応用することを可能に
するレベルまで上昇させ得ることが、予測されるべきである。この目的を達成す
るために、黒色腫およびその良性の対応物における異常のパターンを知ることが
、必須である。

【００４６】（コピー数の検出）特定の遺伝子または染色体領域のコピー数を推定する方法は、当業者に周知で
ある。本発明において、染色体の増加または損失の存在または非存在は、ここで
同定される領域のコピー数の決定により、簡単に推定され得る。代表的に、推定
される領域は、１ｑ、６ｐ、７ｐ、９ｐ、１０ｑ、および１１ｐである。

【００４７】（ハイブリダイゼーションに基づくアッセイ）好ましいハイブリダイゼーションに基づくアッセイとしては、サザンブロット
またはインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）のような伝統
的な「直接プローブ」法、および比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）
のような「比較プローブ」法が挙げられるが、これらに限定されない。これらの
方法を、基質（例えば、膜またはガラス）結合法、または以下に記載されるよう
なアレイに基づくアプローチが挙げられるがこれらに限定されない、広範な種々
の形式において使用し得る。

【００４８】インサイチュハイブリダイゼーションアッセイは、周知である（例えば、Ａｎ
ｇｅｒｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ１５２：６４９）。一般に
、インサイチュハイブリダイゼーションは、以下の主要な工程を包含する：（１
）分析されるべき組織または生物学的構造の固定化；（２）標的ＤＮＡのアクセ
ス可能性を増加させ、そして非特異的結合を減少させるための、生物学的構造の
ハイブリダイゼーション前の処理；（３）核酸の混合物の、生物学的構造または
組織の核酸へのハイブリダイゼーション；（４）ハイブリダイゼーションにおい
て結合しなかった核酸フラグメントを除去するための、ハイブリダイゼーション
後の洗浄；および（５）ハイブリダイズした核酸フラグメントの検出。これらの
工程の各々において使用される試薬および使用条件は、特定の適用に依存して、
変動する。

【００４９】代表的なインサイチュハイブリダイゼーションアッセイにおいて、細胞は、固
体支持体（代表的には、スライドガラス）に固定される。核酸がプローブされる
べきである場合には、これらの細胞は、代表的に、加熱またはアルカリにより変
性される。次いで、これらの細胞は、中程度の温度でハイブリダイゼーション溶
液に接触されて、タンパク質をコードする核酸配列に特異的な標識プローブのア
ニーリングを可能にする。次いで、標的（例えば、細胞）は、代表的に、予め決
定されたストリンジェンシーでか、または適切なシグナル対ノイズ比が得られる
まで増加されるストリンジェンシーで、洗浄される。

【００５０】これらのプローブは、代表的に、例えば、放射性同位体または蛍光レポーター
により、標識される。二本鎖のニックトランスレーションされた核酸について好
ましいサイズ範囲は、約２００ｂｐ〜約１０００ｂｐであり、より好ましくは、
約４００〜約８００ｂｐの間である。

【００５１】いくつかの適用において、反復配列のハイブリダイゼーション能力をブロック
することが、必要である。従って、いくつかの実施形態において、ヒトゲノムＤ
ＮＡまたはＣｏｔ−１ＤＮＡを使用して、非特異的なハイブリダイゼーション
をブロックする。

【００５２】比較ゲノムハイブリダイゼーション法において、第一の収集（サンプル）の核
酸（例えば、可能な腫瘍由来）を、第一の標識で標識し、一方で、第二の収集（
コントロール）の核酸（例えば、健康な細胞／組織由来）を、第二の標識で標識
する。これらの核酸のハイブリダイゼーションの比を、アレイにおける各ファイ
バーに結合するこれら２つ（第一および第二）の標識の比により、決定する。染
色体の欠失または増殖が存在する場合には、これら２つの標識からのシグナルの
比の差異が検出され、そしてこの比は、コピー数の測定を提供する。

【００５３】本発明の方法と共に使用するために適したハイブリダイゼーションプロトコル
は、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ（１９８４）ＥＭＢＯＪ．３：１２２７−１
２３４；Ｐｉｎｋｅｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ８５：９１３８−９１４２；ＥＰＯ公開番号４３０，４０２；Ｍｅｔｈｏ
ｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第３３巻：ＩｎＳｉｔｕ
ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＰｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｃｈｏｏ編、Ｈｕｍａｎ
ａＰｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ（１９９４）などに記載される。１つの特
に好ましい実施形態において、Ｐｉｎｋｅｌら（１９８８）ＮａｔｕｒｅＧｅ
ｎｅｔｉｃｓ２０：２０７−２１１またはＫａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ（１９９２
）Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８９：５３２１−５３２５
（１９９２）のハイブリダイゼーションプロトコルが、使用される。

【００５４】（同腕染色体の検出）特定の遺伝子または染色体領域のコピー数の変化は、同腕染色体（ここで、染
色体のアームの一方が重複しており、従ってこの重複したアームに位置する配列
のコピー数が増加する）の存在を含む、多数の機構に起因し得る。特定の遺伝子
または染色体領域のコピー数を推定する方法、および特に、同腕染色体の存在を
分析する方法は、当業者に周知である。染色体１１のアーム全体のコピー数の増
加は、例えば、同時係属中の出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２８８，９４０に記載
される手順を使用して、検出され得る。コピー数（および特に、同腕染色体）の
変化は、代表的に、ＦＩＳＨのようなハイブリダイゼーションに基づくアッセイ
を使用して、検出される。

【００５５】同腕染色体の存在は、重複した染色体アームに領域とハイブリダイズするもの
に対する単一のプローブを使用して、検出され得る。代表的に、このプローブは
、染色体アームの、動原体に隣接する領域に局在化される。正常な細胞は、２つ
の無作為に位置するシグナルを、その核に有する。同腕染色体を有する細胞は、
その核に、１対〜数対のシグナルが存在する。

【００５６】好ましくは、同腕染色体は、２つのプローブを使用して検出され、各々のプロ
ーブは、別の化合物（例えば、区別可能な色を有する異なる蛍光標識）で標識さ
れる。通常、この分析は、原動体に近い核酸配列にハイブリダイズする２つのプ
ローブを使用する。これらのプローブの一方は、動原体に隣接するｐアーム上の
標的配列（例えば、１１ｐ１１．１または１１ｐ１１．２に局在化する配列）と
ハイブリダイズする。第二のプローブは、原動体に隣接するｑアーム上の標的配
列（すなわち、１１ｑ１１．１または１１ｑ１１．２）とハイブリダイズする。
同腕染色体は、可視化された対が２つの色を含む正常な状況と比較して、同じ色
の対として生じるハイブリダイゼーション領域の存在を決定することにより、検
出される。

【００５７】（Ｈ−ＲＡＳにおける変異の検出）Ｈ−ＲＡＳ遺伝子は、スピッツ母斑のサブセットに増幅されることが示された
領域である、１１ｐ１５．５に位置する（Ｂａｓｔｉａｎら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ
．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１３，１０６５−１０６９、１９９９および同時係属中
のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２８８，９４０）。型別されるべきメラニン細胞新生
物が、記載されるように、増幅されたＨ−ＲＡＳ遺伝子の存在について分析され
得、そしてさらに、Ｈ−ＲＡＳ遺伝子におけるさらなる変異の存在について、分
析され得る。Ｈ−ＲＡＳのオンコジーン変異は、代表的に、コドン１２、１３、
および６１を含む。しかし、他の変異（例えば、構造遺伝子内の任意の領域また
はＨ−ＲＡＳの調節領域で生じる点変異、挿入、および欠失）もまた、本発明の
方法を使用して、検出され得る。

【００５８】所定の遺伝子において変異を検出するための多くの方法が、当該分野において
公知である。有用な技術としては、ＦＩＳＨ、直接ＤＮＡ配列決定、サザンブロ
ット分析、一本鎖コンホメーション分析（ＳＳＣＰ）、変性勾配ゲル電気泳動、
ＲＮＡｓｅ保護アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ド
ットブロット分析、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ、および対立遺伝子特異的ＰＣＲが挙げら
れるが、これらに限定されない。

【００５９】当該分野において公知の別の方法は、ＣＦＬＰ−切断フラグメント長多型性で
ある。この方法は、目的の遺伝子（ここではＨ−ＲＡＳ）を増幅する工程、続い
て切断酵素Ｉ（ｃｌｅａｖａｓｅＩ）（これは、ＤＮＡを、二次構造に依存し
た部位で切断する）での消化を包含する。得られたものを、アガロースゲル上で
分離し、そして切断消化産物の異なるパターンを、野生型サンプルおよび変異サ
ンプルに関して得る。

【００６０】当該分野において公知のさらなる方法は、温度調節ヘテロ二本鎖クロマトグラ
フィー（ＴＭＨＣ）である。この方法は、Ｈ−ＲＡＳ遺伝子の増幅、続いてＰＣ
Ｒ産物を変性し、次いでサンプルの組成に基づいて予め決定された温度までゆっ
くりと冷却する工程を包含する。冷却の間に、ＰＣＲ産物は再生されて、ヘテロ
二本鎖およびホモ二本鎖を形成し、これらを、ＴＭＣＨを使用して互いから分離
する。この分離は、ＷＡＶＥ（登録商標）ＤＮＡフラグメント分析システム（Ｔ
ｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｉｎｃ．、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）を使用して実施
され得る。

【００６１】遺伝子における変異は、生物学的サンプル（例えば、皮膚腫瘍サンプル）中の
この遺伝子を、例えばＰＣＲを使用して増幅し、そして増幅産物を配列決定する
ことにより、直接的に見出され得る。あるいは、Ｈ−ＲＡＳ遺伝子と特異的にハ
イブリダイズするプローブを使用して、変異の存在を検出し得る。さらに、変異
Ｈ−ＲＡＳ遺伝子と特異的にハイブリダイズするが正常な遺伝子とはハイブリダ
イズしないプローブ（例えば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド）を使用し
て、特定の変異の存在を決定し得る。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのよ
うなプローブを、プローブとして直接使用してもよく、または変異が存在する場
合にのみ産物が得られる増幅反応におけるプライマーとして使用してもよい。

【００６２】Ｈ−ＲＡＳ遺伝子における変異は、種々のハイブリダイゼーション分析により
、検出され得る。単一の塩基の変異の検出は、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレ
オチドを使用する、差別的ハイブリダイゼーション技術により、好都合に達成さ
れ得る（例えば、Ｓｕｇｇｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８
：６６１３−６６１７（１９８１）；Ｃｏｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２７８−２８２（１９８３）；Ｓａｉｋｉら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：６２３０−６２３４（１９８９）を参照
のこと）。変異は、ミスマッチしたプローブと比較して、完全にマッチしたプロ
ーブのより高い熱安定性に基づいて、診断され得る。ハイブリダイゼーション反
応は、例えば、フィルターに基づく形式において実施され得、ここで、標的核酸
は、ニトロセルロースまたはナイロンの膜に固定され、そしてオリゴヌクレオチ
ドプローブを用いてプローブされる。任意の公知のハイブリダイゼーション形式
が使用され得、サザンブロット、スロットブロット、「逆」ドットブロット、溶
液ハイブリダイゼーション、固体支持体に基づくサンドイッチハイブリダイゼー
ション、ビーズに基づくハイブリダイゼーション形式、シリコンチップに基づく
ハイブリダイゼーション形式、およびマイクロタイターウェルに基づくハイブリ
ダイゼーション形式が挙げられる。

【００６３】代替のストラテジーは、サンドイッチハイブリダイゼーション法による、Ｈ−
ＲＡＳ遺伝子における変異の検出を包含する。このストラテジーにおいて、変異
標的核酸および正常な標的核酸が、非相同性のＤＮＡ／ＲＮＡから、固体支持体
に固定された共通の捕捉オリゴヌクレオチドを用いて分離され、そしてレポータ
ー標識でタグ化された特異的なオリゴヌクレオチドプローブにより検出される。
捕捉オリゴヌクレオチドは、マイクロタイタープレートウェル上またはビーズ上
に、固定され得る（Ｇｉｎｇｅｒａｓら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６４、
１０６６−１０７４（１９９１）；Ｒｉｃｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１１２４１−１１２４５（１９９１））。

【００６４】（核酸アレイ）本発明の方法は、アレイに基づくハイブリダイゼーション形式に特によく適す
る。１つの好ましいアレイに基づくハイブリダイゼーション系の記載については
、Ｐｉｎｋｅｌら（１９９８）ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ、２０：２０７
−２１１を参照のこと。

【００６５】アレイとは、１つ以上の表面（例えば、固体、膜、またはゲル）に付着した複
数の異なる「プローブ」核酸または「標的」核酸（あるいは他の化合物）である
。好ましい実施形態において、複数の核酸（または他の部分）は、単一の連続的
な表面か、または互いに隣接する複数の表面に、付着される。

【００６６】アレイ形式において、多数の異なるハイブリダイゼーション反応が、本質的に
「平行して」起こり得る。これは、単一の「実験」において、多数のハイブリダ
イゼーションの、迅速な、本質的に同時の評価を提供する。アレイに基づく形式
でハイブリダイゼーション反応を実施する方法は、当業者に周知である（例えば
、Ｐａｓｔｉｎｅｎ（１９９７）ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．７：６０６−６１４；
Ｊａｃｋｓｏｎ（１９９６）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４
：１６８５；Ｃｈｅｅ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４：６１０；ＷＯ９６
／１７９５８を参照のこと）。

【００６７】アレイ（特に、核酸アレイ）は、当業者に周知の広範な種々の方法に従って、
作製され得る。例えば、簡単な実施形態においては、「低密度」アレイが、異な
る核酸を固体支持体（例えば、ガラス表面、膜など）上の異なる位置にスポット
すること（例えば、ピペットを使用して手で）により、簡単に作製され得る。

【００６８】この簡単なスポットアプローチは、高密度スポットアレイを作製するために、
自動化された（例えば、米国特許第５，８０７，５２２号を参照のこと）。この
特許は、ミクロ毛細管を表面に叩き付けて、小容量の生物学的サンプルを堆積さ
せる、自動化システムの使用を記載する。このプロセスを繰り返して、高密度ア
レイを作製する。アレイはまた、オリゴヌクレオチド合成技術を使用して、作製
され得る。従って、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号ならびにＰＣＴ公
開番号ＷＯ９０／１５０７０および同９２／１００９２は、高密度オリゴヌクレ
オチドアレイの、光により指向されるコンビナトリアル合成の使用を教示する。

【００６９】別の実施形態において、アレイ（特に、スポットアレイ）は、ゲノムＤＮＡ（
例えば、目的の領域に対応するアンプリコンの高分解能走査を提供するオーバー
ラップクローン）を含み得る。アンプリコン核酸は、例えば、ＭＡＣ、ＹＡＣ、
ＢＡＣ、ＰＡＣ、Ｐ１、コスミド、プラスミド、ゲノムクローンの内部Ａｌｕ
ＰＣＲ産物、ゲノムクローンの制限消化物、ｃＤＮＡクローン、増幅（例えば、
ＰＣＲ）産物などから得られ得る。

【００７０】種々の実施形態において、アレイ核酸は、下記のように、本発明の標的配列を
貫くかまたはそれを含むクローン、およびゲノムの他の領域からのクローンの、
以前にマッピングされたライブラリーに由来する。このアレイは、サンプル核酸
の単一の集団とハイブリダイズし得るか、または２つの示差的に標識された収集
物とともに使用され得る（試験サンプルおよび参照サンプルとともに）。

【００７１】種々の固体表面において核酸を固定するための多くの方法が当該分野において
公知である。広汎な種々の有機ポリマーおよび無機ポリマー、ならびに他の材料
（天然および合成の両方）は、その固体表面のための材料として使用され得る。
例示的な固体表面としては、例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、推
奨、ジアゾ化膜（紙またはナイロン）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セ
ルロース、およびセルロースアセテートが挙げられる。さらに、プラスチック（
例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなど）が使用され得る。
使用され得る他の材料としては、紙、セラミクス、金属、メタロイド、半導体材
料、サーメットなどが挙げられる。さらに、ゲルを形成する物質が使用され得る
。そのような材料としては、例えば、タンパク質（例えば、ゼラチン）、リポポ
リサッカリド、シリケート、アガロースおよびポリアクリルアミドが挙げられる
。その固体表面が多孔性である場合、種々の孔サイズが、その系の性質に依存し
て使用され得る。

【００７２】表面を調製するにおいて、複数の異なる材料（特に、積層板）を使用して種々
の特性を得ることができる。例えば、タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン
）または高分子の混合物（例えば、デンハルト溶液）を使用して、非特異的な結
合を回避し得、共有結合を単純化し得、シグナル検出を増強などをし得る。化合
物と表面との間の共有結合が所望される場合、その表面は、通常多官能性である
か、または多官能性化され得る。その表面上の存在し得、そして連結に使用され
得る官能基としては、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン
基、ヒドロキシル基、メルカプト基などが挙げられる。広汎な種々の化合物を種
々の表面へと連結する様式は周知であり、そして文献において充分例示されてい
る。

【００７３】例えば、その分子に対して種々の官能基を導入することによって核酸を固定す
るための方法は公知である（例えば、以下を参照のこと：Ｂｉｓｃｈｏｆｆ（１
９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６４：３３６−３４４；Ｋｒｅｍｓｋ
ｙ（１９８７）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：２８９１−２９１０）。
改変されたヌクレオチドは、改変されたヌクレオチドを含むＰＣＲプライマーを
用いるか、または改変されたヌクレオチドでの酵素末端標識によってその標的に
配置され得る。ガラス膜支持体（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ポリプ
ロピレン）を本発明の核酸アレイのために使用することは有利である。なぜなら
、十分に開発された技術は、比較的高い要素密度で標的を配列する手動およびロ
ボットの方法を使用するからである。そのような膜は、一般に利用可能であり、
そして膜へのハイブリダイゼーションのためのプロトコルおよび装置は周知であ
る。

【００７４】種々のサイズ（１ｍｍ直径から１μｍまで及ぶ）の標的エレメントが使用され
得る。濃縮され固定された低量のプローブＤＮＡを含むより小さな標的エレメン
トは高い複合度比較ハイブリダイゼーションのために使用される。なぜなら、各
標的エレメントに結合するために利用可能なサンプルの量の合計が限定されてい
るからである。従って、濃縮されたプローブ少量のＤＮＡを含む小さなアレイ標
的エレメントを有することが好ましい。その結果、得られるシグナルは高度に局
所化されそして明るい。そのような小さなアレイ標的エレメントは、代表的には
、１０⁴／ｃｍ²より高い密度でアレイ中で使用される。単純な画像における多数
の標的エレメントの取得を可能にする、１ｃｍ²の面積の定量的蛍光を画像化し
得る比較的単純なアプローチが記載されている（例えば、以下を参照のこと：Ｗ
ｉｔｔｒｕｐ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ１６：２０６−２１３，１９９４）。

【００７５】膜（例えば、ガラス、石英または小さなビーズ）よりもはるかにより少ない蛍
光を有する固体表面基板におけるアレイがはるかにより高感度で達成され得る。
ガラスまたは溶融シリカのような基板が以下の点で有利である：それらが、非常
に低い蛍光基板および高度に効率的なハイブリダイゼーション環境を提供するこ
と。この標的核酸のガラスもしくは合成溶融シリカへの共有結合的付着は、多数
の公知の技術（以下に記載）に従って達成され得る。例えば、多数の官能基を有
するシラン処理されたガラスの調製のための材料は、市販されるか、または標準
的な技術を用いて調製され得る（例えば以下を参照のこと：Ｇａｉｔ（１９８４
）ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃ
ａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．）。石英
カバーガラス（これは、ガラスよりも多くても１０分の１の自己蛍光を有する）
もまたシラン処理され得る。

【００７６】あるいは、プローブはまた、市販のコーティングされたビーズまたは他の表面
の上に固定され得る。例えば、ビオチン末端標識核酸は、市販のＡＢＩ人コーテ
ィングビーズに結合され得る。ストレプトアビジンまたは抗ジゴキシゲニン抗体
はまた、例えば、以下の標準的なプロトコルに従ってプロテインＡを用いたタン
パク質媒介結合によってシラン処理されたガラススライドに付着され得る（例え
ば、以下を参照のこと：Ｓｍｉｔｈ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８：１１
２２１１２６）。ビオチンまたはジゴキシゲニンで末端標識された核酸は、標
準的な技術に従って調製され得る。ビーズに付着した核酸へのハイブリダイゼー
ションは、ハイブリダイゼーション混合物においてそれらを懸濁させること、お
よび次いで洗浄後に分析のためのガラス基板上でそれらを沈着させることによっ
て達成される。あるいは、アビジンコーティングありなしの常磁性粒子（例えば
、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子）が使用され得る。

【００７７】１つの特に好ましい実施形態において、プローブ核酸は、表面（例えば、ガラ
スまたは石英表面）においてスポットされる。その核酸は、ジメチルスルホキシ
ド（ＤＭＳＯ）およびニトロセルロースの混合物中に溶解され、そしてアミノシ
ランコーティングされたガラススライドへとスポットされる。小さなキャピラリ
ーチューブは、プローブ混合物を「スポット」するために使用され得る。

【００７８】種々の他の核酸ハイブリダイゼーション形式は、当業者に公知である。例えば
、一般的な形式としては、サンドイッチアッセイおよび競合アッセイまたは脱離
アッセイが挙げられる。ハイブリダイゼーション技術は、一般的には、以下に記
載される：ＨａｍｅｓａｎｄＨｉｇｇｉｎｓ（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏ
ａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；ＧａｌｌおよびＰａｒｄｕｅ（１９６９）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６３：３７８−３８３；ならびにＪ
ｏｈｎら（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ２２３：５８２−５８７。

【００７９】サンドイッチアッセイは、核酸を検出または単離するための商業的に有用なハ
イブリダイゼーションアッセイである。そのようなアッセイは、固体基板に共有
結合的に固定された「捕捉」核酸および溶液中の、標識された「シグナル」核酸
を利用する。そのサンプルは、標的核酸を提供する。「捕捉」核酸および「シグ
ナル」核酸プローブは、標的核酸とハイブリダイズして、「サンドイッチ」ハイ
ブリダイゼーション複合体を形成する。最も効率よくあるために、そのシグナル
核酸は、その捕捉核酸とはハイブリダイズしないべきである。

【００８０】ハイブリダイゼーション複合体の検出は、標的およびプローブポリヌクレオチ
ドもしくは核酸の二重鎖へのシグナル生成複合体の結合を必要とし得る。代表的
に、そのような結合は、リガンド結合体化プローブとシグナルと結合体化された
抗リガンドとの間のようなリガンドと抗リガンドとの相互作用を通じて生じる。

【００８１】ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、検出される標的核酸を増幅する核
酸増幅系の使用を通じて増強され得る。そのような系の例としては、ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）系およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）系が挙げられる。最
近当該分野において記載される他の方法は、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ
Ｏ、Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）およびＱβ
Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ系である。

【００８２】核酸ハイブリダイゼーションは、単に、変性されたプローブおよび標的核酸を
、そのプローブおよびその相補的標的が安定なハイブリッド二重鎖を相補的塩基
対合を通じて形成し得る条件下で提供する工程を包含する。次いで、ハイブリッ
ド二重鎖を形成しない核酸は、洗浄されて除かれ、代表的には付着された検出可
能な標識の検出を通じて検出されるべきハイブリダイズされた核酸が残る。一般
に、核酸は、その核酸を含む緩衝液の温度の上昇、その核酸を含む緩衝液の塩濃
度の減少によるか、または化学的薬剤の添加、もしくはｐＨの上昇によって変性
され得る。低いストリンジェンシー条件下（例えば、低い温度および／または高
い塩および／または高い標的濃度）で、ハイブリッド二重鎖（例えば、ＤＮＡ：
ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、またはＲＮＡ：ＤＮＡ）は、そのアニールされた配列
が完全に相補的ではないときに均一に形成する。従って、ハイブリダイゼーショ
ンの特異性は、より低いストリンジェンシーにおいて減少する。逆に、より高い
ストリンジェンシーにおいて（例えば、より高い温度またはより低い塩）におい
て、首尾良いハイブリダイゼーションは、より少ないミスマッチを必要とする。

【００８３】当業者は、ハイブリダイゼーション条件を選択して、任意の程度のストリンジ
ェンシーを提供し得ることを理解する。好ましい実施形態において、ハイブリダ
イゼーションは、低いストリンジェンシーで実行して、ハイブリダイゼーション
を確実にし、次いで続いての洗浄をより高いストリンジェンシーで実行してミス
マッチしたハイブリッド二重鎖を除去する。連続洗浄を所望のレベルのハイブリ
ダイゼーション特異性が得られるまで、漸増するより高いストリンジェンシーで
行い得る（例えば、３７℃から７０℃まででの０．２５×ＳＳＰＥＴの低さま
で）。ストリンジェンシーはまた、ホルムアミドのような薬剤の添加により増加
させ得る。ハイブリダイゼーション特異性は、試験プローブに対するハイブリダ
イゼーションと、存在し得る種々のコントロールに対するハイブリダイゼーショ
ンの比較によって評価され得る。

【００８４】一般に、ハイブリダイゼーション特異性（ストリンジェンシー）とシグナルの
強度との間には、トレードオフが存在する。従って、好ましい実施形態において
、洗浄は、一致する結果を生成し、そしてバックグラウンド強度の約１０％を超
えるシグナル強度を提供する、最も高いストリンジェンシーで行われる。従って
、好ましい実施形態において、ハイブリダイズしたアレイは、連続するより高度
のストリンジェンシー溶液で洗浄し得、そして各洗浄の間で読みとられ得る。こ
のように生成したデータセットの分析によって、それを超えれば、ハイブリダイ
ゼーションパターンが認識可能には変化せず、そして目的の特定のプローブにつ
いて適切なシグナルを提供する、洗浄ストリンジェンシーが明らかになる。

【００８５】好ましい実施形態において、バックグラウンドシグナルは、ハイブリダイゼー
ションの間の界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）またはブロック試薬（例えば、
精子ＤＮＡ、ｃｏｔ１ＤＮＡなど）の使用によって減少させて、非特異的な
結合を減少させる。特に好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションを
、約０，１から約０．５ｍｇ／ｍｌＤＮＡ（例えば、ｃｏｔ１ＤＮＡ）の
存在において行われる。ブロック試薬のハイブリダイゼーションにおける使用は
、当業者に周知である（例えば、以下を参照のこと：Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ、前出
、第８節）。

【００８６】ハイブリダイゼーション条件を最適化する方法は、当業者に周知である（例え
ば、以下を参照のこと：Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第２４巻：ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＷｉｔｈ
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．）。

【００８７】最適な条件はまた、基質型、蛍光色素、励起バンドおよび発色バンド、スポッ
トサイズなどの異なる組合せについて標識（例えば、蛍光）検出の感度の関数で
ある。低い蛍光バックグラウンド膜が使用され得る（例えば、以下を参照のこと
：Ｃｈｕ（１９９２）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ１３：１０５−１１４
）。候補膜の上の種々の直径のスポット（「標的エレメント」）の検出のための
感度は、例えば、蛍光末端標識されたＤＮＡフラグメントの希釈系列をスポット
することによって容易に決定され得る。次いで、これらのスポットを従来の蛍光
顕微鏡を用いて画像化する。蛍光色素および固体基板（例えば、膜、ガラス、溶
融シリカ）の種々の組合せから達成され得る感度、線形性および動力学の範囲は
、このように判定され得る。公知の相対比率の系列希釈の対の蛍光色素もまた、
分析され得る。これは、蛍光比率測定が、検出器およびそのプローブが固定され
る基板の蛍光によって可能にされる動力学範囲にわたって実際の蛍光色素比率を
反映する正確性を決定する。

【００８８】本明細書において記載される方法において有用なプローブは、多数の供給源か
ら利用可能である。例えば、ＰＩクローンは、ＤｕＰｏｎｔＰＩライブラリー
から入手可能であり（Ｓｈｅｐａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，９２：２６２９（１９９４））、そしてＧｅｎｏｍｅＳｙｓｔｅ
ｍｓから市販される。染色体全体にわたる種々のライブラリーもまた市販されて
いる（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，ＳｏｕｔｈＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）
か、またはＬｏｓＡｌａｍｏｓＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙか
ら入手可能である。

【００８９】（核酸の標識および検出）好ましい実施形態において、ハイブリダイズした核酸は、サンプルまたはプロ
ーブの核酸に付着した、１つ以上の標識を検出することによって検出される。そ
の標識は、当業者に周知の多数の手段のいずれかによって取り込まれ得る。核酸
への標識の付着手段としては、例えば、以下が挙げられる：その核酸のキナーゼ
処理および続いてサンプル核酸と標識（例えば、発蛍光団）を連結する核酸リン
カーの付着（連結）によるニック翻訳または末端標識（例えば、標識されたＲＮ
Ａを用いる）。標識の核酸への付着のための広汎な種々のリンカーは公知である
。さらに、インターカレート色素および蛍光ヌクレオチドもまた使用され得る。

【００９０】本発明における使用のための検出可能な標識としては以下が挙げられる：分光
光度手段、光化学手段、生化学手段、免疫化学手段、電気手段、光学手段、また
は化学手段により検出可能な任意の組成物。本発明において有用な標識としては
、以下が挙げられる：標識されたストレプトアビジン結合体での染色のためのビ
オチン、磁性ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ^TM）、蛍光色素（例えば、フ
ルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など、例えば
、以下を参照のこと：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒ
ｅｇｏｎ，ＵＳＡ）、放射標識（例えば、³Ｈ、¹²⁵Ｉ、³⁵Ｓ、¹⁴Ｃまたは³²Ｐ）
、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび
他のＥＬＩＳＡにおいて一般に使用されるもの）、ならびに呈色標識（例えば、
コロイド金（例えば、高度の効率を有する４０から８０ｎｍ直径サイズ範囲の散
乱緑色中の金粒子）、または着色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリス
チレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズ。そのような標識の使用を教
示する特許としては以下が挙げられる：米国特許第３，８１７，８３７号；同第
３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号
；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６
，２４１号。

【００９１】蛍光標識が好ましい。なぜなら、蛍光標識は、低いバックグラウンドを伴う非
常に強力なシグナルを提供するからである。必要に応じて、蛍光標識はまた、迅
速な走査手順を通じて高解像度および高感度で検出可能であり得る。この核酸サ
ンプルはすべて、単一の標識（例えば、単一の蛍光標識）を用いて標識され得る
。あるいは、別の実施形態において、異なる拡散サンプルが同時にハイブリ大豆
され得、ここで、各核酸は、異なる標識を有する。例えば、１つの標的は、緑色
蛍光標識を有し得、第二の標的は、赤色蛍光標識を有し得る。この走査工程は、
赤色標識の結合部位を緑色蛍光標識を結合するものから識別する。各核酸サンプ
ル（標的核酸）が互いに独立して分析され得る。

【００９２】使用され得る適切なクロモゲンとしては、異なる範囲の波長における光を吸収
し、その結果色が観察され得るか、あるいは、特定の波長または波長範囲（例え
ば、蛍光剤）の放射で照射されるときに光を放射する分子または化合物が挙げら
れる。

【００９３】望ましくは、蛍光剤は、約３００ｎｍを超える、好ましくは約３５０ｎｍを超
える、そしてより好ましくは約４００ｎｍを超える、光を吸収すべきであり、通
常、吸収される光の波長よりも約１０ｎｍ高い波長で放射する。結合した色素の
吸着および放射の特性は結合していない色素とは異なり得ることに留意すべきで
ある。したがって、色素の種々の波長範囲および特徴に言及する場合、使用され
る色素をいい、そして任意の溶媒において結合せずに特徴付けられた色素はいわ
ない。

【００９４】蛍光剤が一般に好ましい。なぜなら、蛍光剤に光が照射されることにより、複
数の放射を得ることができるからである。したがって、単一の標識が複数の測定
可能な事象を提供し得る。

【００９５】検出可能なシグナルはまた、化学発光および生物発光の供給源によって提供さ
れ得る。化学発光の供給源としては、化学反応によって電気的に励起され、次い
で検出可能なシグナルとして機能するかまたは蛍光アクセプターに対してエネル
ギーを供与する光を放射し得る化合物が挙げられる。あるいは、ルシフェリンが
、ルシフェラーゼまたはルシゲニンとともに用いられて生物発光を提供し得る。
スピン標識は、不対電子スピンを有するレポーター分子によって提供される。こ
のスピンは、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）分光法によって検出され得る。例示的な
スピン標識としては、有機遊離ラジカル、遷移金属錯体（特にバナジウム、銅、
鉄、およびマンガン）などが挙げられる。例示的なスピン標識としては、ニトロ
キシド遊離ラジカルが挙げられる。

【００９６】その標識は、ハイブリダイゼーションの前または後に、標的（サンプル）核酸
に付加され得る。いわゆる「直接標識」は、ハイブリダイゼーションの前に標的
（サンプル）核酸に直接付着されるかまたは取り込まれる。対照的に、いわゆる
「間接標識」は、ハイブリダイゼーションの後にハイブリッド二重鎖へと結合さ
れる。しばしば、間接標識は、ハイブリダイゼーションの前に標的核酸に付着さ
れた結合部分に付着される。したがって、例えば、標的核酸は、ハイブリダイゼ
ーションの前にビオチン化され得る。ハイブリダイゼーション後、アビジン結合
体発蛍光団がハイブリッド二重鎖を有するビオチンを結合し、容易に検出される
標識を提供する。この核酸プローブはまた、ジゴキシゲニンで標識され得、次い
で蛍光色素で標識された抗体で検出され得るか、または西洋ワサビペルオキシダ
ーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素で検出され得る。核酸を標識す
る方法およびハイブリダイズされた標識核酸を検出する方法の詳細な概説につい
て、以下を参照のこと：ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎ
ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖ
ｏｌ．２４：ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＷｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉ
ｄＰｒｏｂｅｓ，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，
（１９９３））。

【００９７】蛍光標識は、インビトロ転写反応の間に容易に添加される。したがって、例え
ば、フルオレセイン標識ＵＴＰおよびＣＴＰがインビトロ転写において生成され
るＲＮＡに取り込まれ得る。

【００９８】この標識は、直接またはリンカー部分を介して付着され得る。一般に、標識ま
たはリンカー標識付着の部位は、任意の特異的な位置に限定はされない。例えば
、標識は、所望の検出またはハイブリダイゼーションに影響しない任意の位置で
のヌクレオシド、ヌクレオチド、またはそれらのアナログであり得る。例えば、
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）からの特定の標識−ＯＮ試薬は
、オリゴヌクレオチドのリン酸骨格中に遍在する標識ならびに３’末端および５
’末端での末端標識を提供する。本明細書において示されるように、例えば、標
識は、リボース環における位置に付着され得るか、またはそのリボースが改変さ
れ得、そしてさらに所望に応じて除去され得る。有用な標識試薬の塩基部分とし
ては以下が挙げられ得る：天然に存在するかまたはそれらが置かれる目的には影
響を与えない様式で改変されるもの。改変された塩基としては以下が挙げられる
がそれらに限定されない：７−デアザＡおよびＧ、７−デアザ−８−デアザＡお
よびＧ、ならびにヘテロ環式部分。

【００９９】蛍光標識は、単一の種の有機分子に限定されないが、無機分子、有機分子およ
び／または無機分子の多重分子の混合物、結晶、ヘテロポリマーなどが含まれる
。従って、例えば、シリカシェルに囲まれるＣｄＳｅ−ＣｄＳコアシェルナノ結
晶は、生物学的分子への結合のために容易に誘導体化され得る（Ｂｒｕｃｈｅｚ
ら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：２０１３−２０１６）。同様に、高度
な蛍光量子ドット（硫化亜鉛捕捉されるセレン化カドミウム）は、超高感度の生
物学的検出における使用のための生体分子へ共有結合されている（Ｗａｒｒｅｎ
ａｎｄＮｉｅ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：２０１６−２０１８）
。

【０１００】（増幅ベースのアッセイ）別の実施形態において、増幅ベースのアッセイを用いてコピー数を測定し得る
。そのような増幅ベースのアッセイにおいて、拡散配列は、増幅反応におけるテ
ンプレートとして作用する（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））。定量
的増幅において、増幅産物の量は、もとのサンプルにおけるテンプレートの量に
比例する。適切な（例えば、健常組織）のコントロールとの比較は、所望の標的
核酸配列のコピー数の尺度を提供する。「定量的」増幅の方法は、当業者には周
知である。例えば、定量的ＰＣＲは、コントロール配列の公知量を同じプライマ
ーを用いて同時に増幅することを包含する。これは、内部標準を提供する。この
内部標準を用いて、そのＰＣＲ反応を較正し得る。定量的ＰＣＲについての詳細
プロトコルは、以下に提供される：Ｉｎｎｉｓら（１９９０）ＰＣＲＰｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ，ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．）。

【０１０１】他の適切な増幅方法としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：リ
ガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（以下を参照のこと：ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（１
９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４：５６０，Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、（１９８８）
Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：１０７７，ならびにＢａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９
０）Ｇｅｎｅ８９：１１７、転写増幅（Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１１７３）、および自己支持性配
列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ８７：１８７４）。

【０１０２】（遺伝子発現の検出）以下に示すように、多数のオンコジーン、特にＨ−ＲＡＳが本明細書に開示さ
れる増幅の領域において見出される。従って、オンコジーン活性は、例えば、遺
伝子転写（例えば、ｍＲＮＡ）のレベルを測定することによって、または翻訳さ
れたタンパク質の量を測定することによって検出され得る。

【０１０３】（遺伝子転写物の検出）遺伝子転写物の核酸ハイブリダイゼーションを用いた検出および／または定量
の方法は当業者に公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）。例え
ば、ノーザン転写は、所望のｍＲＮＡを直接検出するために使用され得る。手短
には、ｍＲＮＡは、所定の細胞サンプルから、例えば、酸グアニジウム−フェノ
ール−クロロホルム抽出法を用いて単離される。次いで、ｍＲＮＡを電気泳動し
て、そのｍＲＮＡ種を分離し、そしてそのｍＲＮＡをゲルからニトロセルロース
膜に転写する。サザンブロットと同様に、標識プローブを用いてその標的ｍＲＮ
Ａを同定および／または定量する。

【０１０４】別の実施形態において、遺伝子転写物は、増幅（例えば、ＰＣＲ）ベースの方
法を用いて上記のようにその標的配列のコピー数の直接の評価のために測定され
得る。

【０１０５】（発現されたタンパク質の検出）増幅される染色体の領域によってコードされるポリペプチド（例えば、Ｈ−Ｒ
ＡＳ）の存在もまた、発現されたポリペプチドを検出または定量することによっ
て検出および／または定量され得る。このポリペプチドは、当業者に周知の多数
の手段のいずれかによって検出および定量され得る。これらは、電気泳動、キャ
ピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグ
ラフィー（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィーなど、あるいは種々の免疫学的
方法（例えば、液体またはゲルのプレシピチン反応）、免疫拡散（単一または二
重）、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、ウェスタ
ンブロットなどを含み得る。一般的なイムノアッセイの概説について、以下もま
た参照のこと：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，第３７巻（Ａｓａｉ，ｅｄ．
１９９３）；ＢａｓｉｃａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（
Ｓｔｉｔｅｓ＆Ｔｅｒｒ，ｅｄｓ．，７ｔｈｅｄ．１９９１）。

【０１０６】イムノアッセイは、いくつかの構成のいずれかにおいて行われ得る。これらは
、以下において徹底的に概説されている：ＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａ
ｙ（Ｍａｇｇｉｏ，ｅｄ．，１９８０）；ａｎｄＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ
、前出。次いで、イムノアッセイはまた、抗体および抗原によって形成される複
合体に特異的に結合し、そして標識する標識薬剤を使用する。この標識薬剤は、
それ自身が抗体／抗原複合体を含む部分の一つであり得る。例えば、Ｈ−ＲＡＳ
を検出するにおいて、その標識薬剤は、標識されたＨ−ＲＡＳポリペプチドまた
は標識された抗Ｈ−ＲＡＳ抗体であり得る。あるいは、その標識薬剤は、第三部
分（例えば、二次抗体）であり、これは、抗体／Ｈ−ＲＡＳ複合体に特異的に結
合する（二次抗体は、代表的には、その第一抗体が由来する種の抗体に特異的で
ある）。

【０１０７】免疫グロブリン定量領域（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）を特異
的に結合し得る他のタンパク質もまた、標識薬剤として使用され得る。これらの
タンパク質は、種々の種由来の免疫グロブリン定常領域と強力な非免疫原正反応
性を示す（例えば、以下を参照のこと：Ｋｒｏｎｖａｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１１１：１４０１−１４０６（１９７３）；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍら，Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１３５：２５８９−２５４２（１９８５））。その標識薬剤は、検
出可能な部分（例えば、ビオチン）で改変され得る。これに対しては、別の分子
が、例えば、ストレプトアビジンが特異的に結合し得る。種々の検出可能な部分
は、当業者に周知である。

【０１０８】このアッセイを通じて、インキュベーションおよび／または洗浄の工程が各試
薬を合わせた後に必要とされ得る。インキュベーション工程は、５秒から数時間
までで、必要に応じて、約５分から約２４時間の間変動し得る。しかし、インキ
ュベーション時間は、アッセイ形式、抗原、溶液の容量、濃度などに依存する。
通常、そのアッセイは、雰囲気温度で行われるが、それらは、ある範囲の温度に
わたって（例えば、１０〜４０℃）行われ得る。

【０１０９】サンプル中でポリペプチドを検出するためのイムノアッセイは、競合的または
非競合的のいずれかであり得る。非競合的イムノアッセイは、抗原量が直接測定
されるアッセイである。例えば、Ｈ−ＲＡＳの検出のための１つの好ましい「サ
ンドイッチ」アッセイにおいて、抗Ｈ−ＲＡＳ抗体は、それらが固定される固体
支持体に直接結合され得る。次いで、これらの固定された抗体は、その試験サン
プルにおいて存在するＨ−ＲＡＳタンパク質を捕捉する。次いで、このように固
定されたＨ−ＲＡＳは、標識薬剤（例えば、標識を有する第二抗体）によって結
合される。あるいは、その第二抗体は、標識を欠如し得るが、それは、次いで、
その第二抗体が由来する種の抗体に対して特異的な、標識された第三抗体に結合
され得る。第二抗体または第三抗体は、代表的には、検出可能な部分（例えば、
ビオチン）によって改変される。これに対して、別の分子、例えば、ストレプト
アビジンが結合して、検出可能な部分を提供する。

【０１１０】競合アッセイにおいて、サンプルにおいてポリペプチドの量は、サンプル中に
存在する未知のポリペプチドによって抗ポリペプチド抗体から置き換えられた（
競合されて除去された）公知の添加された（外来の）タンパク質の量を測定する
ことによって間接的に測定される。１つの競合アッセイにおいて、例えば、公知
の量のＨ−ＲＡＳタンパク質がサンプルに添加され、次いでそのサンプルが抗体
と接触され、この抗体は、Ｈ−ＲＡＳタンパク質に特異的に結合する。その抗体
に結合した外来性Ｈ−ＲＡＳタンパク質の量は、サンプルに存在するＨ−ＲＡＳ
タンパク質の濃度に逆に比例する。特定の好ましい実施形態において、その抗体
は、固体支持体に固定される。抗体に結合したＨ−ＲＡＳの量は、固体支持体上
に固定される。その抗体に結合したＨ−ＲＡＳの量は、Ｈ−ＲＡＳ／抗体複合体
に存在するＨ−ＲＡＳの量を測定すること、または代替的に、結合していない残
りのタンパク質の量を測定することによって決定され得る。Ｈ−ＲＡＳの量は、
標識されたＨ−ＲＡＳ分子を提供することによって検出され得る。

【０１１１】ハプテン阻害アッセイは、別の競合アッセイである。このアッセイにおいて、
公知タンパク質は、固体支持体に固定される。タンパク質に対する公知量の抗体
を、そのサンプルに添加する。そして、そのサンプルを、固定されたタンパク質
に接触させる。公知の固定されたタンパク質に結合した抗体の量は、そのサンプ
ルに存在するタンパク質の量に逆に比例する。再び、固定された抗体の量を、抗
体の固定された画分または溶液に残る抗体の画分のいずれかを検出することによ
って検出し得る。検出は、その抗体が標識されている場合直接であり得るか、ま
たは標識部分の続いての付加により間接的であり得る。この標識部分は、上記の
ようにその抗体に特異的に結合する。

【０１１２】ウェスタンブロット（イムノブロット）分析を使用して、サンプル中のぽの存
在を検出および定量する。この技術は、一般的に、ゲル電気泳動によって、分子
量に基づいてサンプルタンパク質を分離すること、適切な固体支持体（例えば、
ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルターまたは誘導体化されたナイロ
ンフィルター）に分離されたタンパク質を移すこと、ならびにそのサンプルを、
そのポリペプチド（例えば、Ｈ−ＲＡＳ）および／またはそのポリペプチドの変
異型に特異的に結合する抗体を特異的に結合する抗体とともにインキュベートす
ることを包含する。このポリペプチド抗体は、その固体支持体におけるポリペプ
チドに特異的に結合する。これらの抗体は、直接標識され得るか、または代替的
に、その抗体に特異的に結合する標識された抗体（例えば、標識されたヤギ抗マ
ウス抗体）を用いて次に検出され得る。

【０１１３】他のアッセイ形式としては、リポソームイムノアッセイ（ＬＩＡ）が挙げられ
る。このアッセイは、特異的分子（例えば、抗体）に結合し、そしてカプセル化
された試薬またはマーカーを放出するように設計されたリポソームを使用する。
次いで、この放出された化学物質は、標準的な技術に従って検出される（≦を参
照のこと：Ｍｏｎｒｏｅら，Ａｍｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｖ．５：３４
−４１（１９８６））。

【０１１４】（診断および／または予後の適用における使用のためのキット）上記で示唆される診断、研究および治療のための適用における使用のために、
本発明によってキットもまた提供される。診断および研究の適用において、その
ようなキットは、以下の任意またはすべてを備え得る：アッセイ試薬、緩衝液、
標的配列の検出のための核酸なたびに他のハイブリダイゼーションプローブイン
キュベートおよび／またはプライマー。治療製品は、滅菌生理食塩水または別の
薬学的に受容可能なエマルジョンおよび懸濁物ベースを含み得る。

【０１１５】さらに、このキットは、本発明の方法の実施のための指示（例えば、プロトコ
ル）を含む指示書を備え得る。その指示書は、代表的には、書面または印刷され
たものを含むが、それらは、それらに限定されない。そのような指示を格納し得
およびそれらをエンドユーザーへ連絡し得る任意の媒体が本発明によって企図さ
れる。そのような媒体としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：電
気格納媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒
体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ）など。そのような媒体は、そのような指示書を提供
するインターネットサイトのアドレスを含み得る。

【０１１６】（実施例）（実施例１：スピッツ母斑細胞のＣＧＨおよびＦＩＳＨの研究）本実施例は、ＣＧＨ研究を用いて、スピッツ母斑細胞が染色体領域１１におい
てゲインを有することが示されることを実証する。１７例のスピッツ母斑を、Ｃ
ＧＨを用いて研究した。ＣＧＨの手順を、以下に記載されるような標準的なプロ
トコルに従って行った。

【０１１７】（材料および方法）（腫瘍材料）１７人の患者からのスピッツ母斑からのホルマリン固定し、パラフィン包埋し
た組織を、ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｗｕｒｚｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＤ
ｅｒｍａｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙＳｅｃｔｉｏｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｓ
ｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙａｎｄＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ）のアーカ
イブから入手した。本発明者らは、広汎かつ密に細胞性の皮膚成分を有した損傷
を選択した。この成分は、おもに黒色腫の収集を可能にし、そしてせいぜい散在
性リンパ球侵襲物を有し、その結果、リンパ球ＤＮＡは、新生物細胞における異
常を不明瞭としない。

【０１１８】（ＤＮＡ調製）パラフィン材料：３０μｍの切片を切断し、Ｈ＆Ｅについて、５切片の５μｍ
切片とした。染色されていない３０μｍの切片を、スライドガラスに置き、そし
て目的の領域を脱パラフィン処理せずに微小切開した。

【０１１９】微小切開を、切開顕微鏡にもとで手動で行った。腫瘍のサイズに応じて、２０
〜６０の染色されていない切片を用い、そして高密度の腫瘍細胞を伴う領域を正
常細胞から分離した。切開された腫瘍部分をチューブに収集し、そしてキシレン
およびエタノールを用いて洗浄することによって脱パラフィン処理した。ＤＮＡ
抽出および標識を、Ｉｓｏｌａら（８）によって公開されたように行った。手短
には、組織を完全な消化が起こるまで、５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．５、１ｍ
ＭＥＤＴＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液中のプロテイナーゼＫ（Ｌｉ
ｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ
）とともにインキュベートした（３日間）。ＤＮＡをフェノール−クロロホルム
−イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｖ／ｖ）を用いて抽出し、７．５Ｍ
酢酸アンモニウムおよび１００％エタノールで沈降させ、そして水中に再懸濁し
た。得られたＤＮＡの量は、２〜１２μｇの範囲であった。

【０１２０】（比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）およびデジタル画像分析）すべての腫瘍を、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ（ＤｕＰｏｎｔ，Ｉｎｃ．
，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて標識した腫瘍ＤＮＡ、およびＴｅｘａｓｒｅ
ｄ−５ｄＵＴＰ（「標準」標識）を用いた参照ＤＮＡの両方を用いて、ならびに
標識を逆にして用いて測定した。標識を、ニック翻訳により行った。ニック翻訳
条件を調整し、その結果、標識後の平均プローブフラグメントサイズは、８００
ｂｐと１５００ｂｐとの間に及んだ。このハイブリダイゼーション混合物は、２
００〜１００ｎｇの標識腫瘍ＤＮＡからなり、末梢血リンパ球からの２００ｎｇ
の逆に標識された６つの適合する正常ヒト参照ＤＮＡ、ならびに１０μｌのハイ
ブリダイゼーション緩衝液（５０％ホルムアミド，１０％デキストランサスルフ
ェート、および２×ＳＳＣ、ｐＨ７．０）中に溶解した２５μｇのヒトＣｏｔ
１ＤＮＡ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）。ハイブリダイゼーションを、正常の中期かで３７℃で２
〜３日インキュベートした（９）。すべてのサンプルを、中期のスライドの単一
バッチを用いて調べた。スライドを洗浄溶液（２×ＳＳＣ、ｐＨ中の５０％ホル
ムアミド）中で、４５℃で３回洗浄し、１回ＰＮ緩衝液（０．１ＭＮａＨ₂
ＰＯ₄、０．１ＭＮａ₂ＨＰ０₄，および０．１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０
、ｐＨ８．０）中で１回洗浄し、そして蒸留水中で１回洗浄した（両方とも室
温で１０分間）。スライドを４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールで色褪
せ防止溶液中で対比染色した。ハイブリダイゼーションの品質を、以前に公開さ
れたように評価した（７）。デジタル画像を、ＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓＣＣ
Ｄカメラ（Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｅｒ１４００，ＸｉｌｌｉｘＴｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢｒｉｔｉｓｈＣｏｌｕｍｂｉａ，Ｃａｎ
ａｄａ）を用いて、標準的な蛍光顕微鏡の上で収集した。各染色体に沿った平均
の腫瘍／参照蛍光比率を、ＣＧＨ分析のカスタムソフトウェアを用いて算出した
。測定を、各条染色体の少なくとも４コピーについて行った。

【０１２１】（コントロールおよび閾値の規定）正常のＤＮＡおよび公知の異常を伴う腫瘍細胞株からのＤＮＡをコントロール
として用いた。本発明者らは、以下の場合にある領域を異常とみなした：１）標
準的な標識または逆の標識が、腫瘍：参照蛍光比率＜０．８０であるか、または
＞１．２である場合、あるいは２）標準および逆の標識が、腫瘍：参照蛍光比率
＜０．８５または＞１．１５である場合。

【０１２２】この実験の結果は、１３の腫瘍がなんら染色体異常を示さないことを示した。
１つの症例では、染色体７、７ｑ２１−ｑｔｅｒの遠位部分の単離されたゲイン
を有した。３つの症例では、染色体１１の短アーム全体に単一の高いレベルのゲ
インが示された（図２）。スピッツ母斑細胞の染色体１１ｐにおけるゲインのこ
の減少は、図１に示されるように、黒色腫細胞のあいだでは見出されない。

【０１２３】（蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ））二重呈色ＦＩＳＨを、組織がＣＧＨ後に残った症例（１４／１７）の組織切片
において行った。染色体１１の短アーム（ＲＭＣ１１Ｂ０２２およびＲＭＣ１１
Ｐ０４）への、および長アーム（ＲＭＣ１１Ｐ００８）へのプローブマッピング
を、研究室の資源から得た。プローブを、Ｃｙ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉ
ｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）またはＤｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて
ニック翻訳により標識した。６μｍ切片を、正に荷電したスライドガラス（Ｆｉ
ｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）上にマウント
し、脱パラフィン処理し、そして強度エタノールを減少させることによって脱水
した。切片を、２〜４分間、１Ｍチオシアン酸ナトリウム中で、８０℃で、０．
２ＮＨＣｌ中で４ｍｇ／ｍｌペプシン中で３７℃で４〜８分間インキュベート
し、強度エタノールを増加させることによって脱水し、そして風乾した。スライ
ドを、７０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ中で７２℃で５分間変性し、そして特級
エタノールシリーズ中で再度脱水した。２．５〜２５ｎｇのおのおのの標識され
たプローブを、２０μｇのＣｏｔ−１ＤＮＡ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）とともに、１０μｌのハ
イブリダイゼーション緩衝液（５０％ホルムアミド、１０％デキストランスルフ
ェート、および２×ＳＳＣ，ｐＨ７．０）中で溶解し、そして７２℃で１０分
間変性した。ハイブリダイゼーションを、３７℃で４８〜７２時間行った。スラ
イドを、洗浄溶液（２×ＳＳＣ，ｐＨ７．０中の５０％ホルムアミド）で４
５℃で３回洗浄し、２×ＳＳＣ中で４５℃で１回、２×ＳＳＣ中で室温で１回、
および４×ＳＳＣ中の０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００中で１回室温で洗浄した
。続いて、切片を湿潤チャンバー中で３７℃で４×ＳＳＣ中の１０％ＢＳＡとと
もにインキュベートし、次いで、１０％ＢＳＡを有する４×ＳＳＣ中で希釈され
たＦＩＴＣで標識された抗ジゴキシゲニン抗体（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎ
ｎｈｅｉｍ，ＩｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓＩＮ）とインキュベートした。切片を
４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
ＭＳ）で色褪せ防止溶液中で対比染色した。両側検定のスチューデントのｔ検定
を、目的の位置および参照プローブについてＦＩＳＨシグナルの比較のために使
用した。

【０１２４】（結果）表１は、スピッツ母斑患者の臨床情報、ならびにＣＧＨおよびＦＩＳＨによっ
て見出された異常を示す。患者の年齢は、３〜４５歳にわたった（平均１８歳）
。追跡は、殆どの患者から利用可能であった。追跡の時間は、１．２〜９年（平
均４．９年）であった。利用可能な追跡を有するすべての患者は、追跡の間隔の
終わりまでに疾患がなくなった。１つの症例（症例１６）では、研究に入った最
終的な外傷の切除の前に２回の再発が発生した。これはおそらく、その腫瘍が２
回掻爬されたからである。すべての症例の再切断切片は、組織病理学的試験によ
って代表的なスピッツ母斑を表した。１７の腫瘍のうち１３の腫瘍（７６％）は
、ＣＧＨによってはＤＮＡコピー数の変化は示されなかった。３つの症例（１８
％）では、染色体１１の短アーム全体のゲインが唯一の異常として示された（図
３）。１つの症例は、染色体７ｑ２１−ｑｔｅｒのゲインを、唯一の異常として
示した（図３）。

【０１２５】ＦＩＳＨ測定を、染色体１１ｐにおける再発ゲインの組織病理学的分布を研究
し、そして正常なＣＧＨプロファイルを有する症例におけるこの異常を有する細
胞の潜在的なマイナー集団を見出すために、組織切片について行った。染色体１
１ｐの遠位部分に対してマッピングした試験プローブ（１ｌｐｌ５．５，クロ
ーンＲＭＣ１１Ｂ０２２）を選択し、そして染色体１１ｑ２３に対してマッピン
グされた参照プローブ（クローンＲＭＣ１１Ｐ００８）を選択した。すべての実
験において、損傷に隣接する上皮のケラチノサイトを、内部コントロールとして
用いた。ハイブリダイゼーションは、６μｍの厚さの切片で行われることから、
多くの核がその／インキュベートＤにおいて完全には表されなかった。ハイブリ
ダイゼーションシグナルを計数するために、本発明者らは、顕微鏡の焦点がわず
かに変化する場合に最小限に短縮されて見える核を選択した。ｑアームおよびｐ
アームについてのケラチノサイト中のこの核のシグナル数は、それぞれ平均値で
１．６〜１．９および１．７〜１．９の範囲であった（図４ｂ、４ｄおよび４ｆ
）。２．０の平均が、すべての計数された核がインタクトであり、そしてハイブ
リダイゼーション効率が１００％であるときに予測される。ｐアームシグナルの
数値は、ｑアームのものよりもわずかに高い傾向があった。これは、ｐアームプ
ローブのより大きなサイズによって説明され得る。これにより、わずかにより高
いハイブリダイゼーション効率が達成される。

【０１２６】しかし、この相違は、統計学的には有意ではない。正常であると仮定された細
胞のコントロール集団においてシグナル数の分散が非常に低かった（０．１６−
０．２４）ことから、１腫瘍あたり２０細胞を計数することがハイブリダイゼー
ションの成功を確立するに充分であった。新生物細胞を分析する場合に、各形態
学的に異なる亜集団の２０細胞を計数した。ＣＧＨによって染色体１１ｐのゲイ
ンを有した３つの症例は、３．５〜５．３のシグナル平均を示した。ここで、ｐ
アームプローブは、ｑアームプローブについての１．５〜２．１の計数の平均に
対して比較される（図４ｃ）。この相違は、高度に有意であった（ｐ＜０．００
００１）。ｑアーム（コントロール）プローブについての計数は、それぞれの損
傷のケラチノサイト（正常細胞）におけるシグナル計数とは統計学的には異なら
なかった。染色体１１ｐのコピーの増加を伴う症例におけるｑアームシグナルに
対するｐアームシグナルの比率は、１．８〜３．０に及んだ。ｐアームプローブ
のシグナル数の増加は、各母斑の各細胞に実質的に存在した。ＣＧＨによって染
色体１１ｐのゲインがなかった１４腫瘍から、１２をＦＩＳＨによって研究し得
た。他の２症例において、パラフィンブロックは、消失した。これらの１２の症
例のうち、１１が染色体１１のｐアームおよびｑアームについてプローブのシグ
ナル分散において有意な相違を有しなかった（図４ａおよび４ｂ）。１つの症例
（症例５）は、２．４ｐアームシグナルに対して１．９ｑアームシグナルを有し
た。この相違は、統計学的に有意（ｐ＝０．０１）であった。２つの症例（症例
３および１５）では、ｑアームおよびｐアームのシグナルの両方の数を増加した
細胞の亜集団が存在した（図４ｃ）。これらの細胞は、１〜２シグナルを有する
腫瘍細胞よりもかなり大きな核を有した。そして従って倍数体であるようである
。

【０１２７】図３において例示されるように、３症例においてゲインされたＣＧＨによって
見出された染色体１１の領域は、同一であるようである。症例１３および症例１
６のプロファイルは、ｐテロメアに向けてＤＮＡコピー数の最大の増加を示唆す
る。しかし、その標識が逆転したＣＧＨ測定のプロファイルは、テロメアに向け
て赤：緑の蛍光比率の減少を示した。このことは、ｐテロメア比率の増加が人工
的であることを示す。このことを確認するため、ＦＩＳＨ実験を、１１ｐ１４（
ＲＭＣ１１Ｐ０１４）に最も近位にマッピングされたｐアームについての異なる
プローブを用いて行った。このプローブを用いた腫瘍細胞の核におけるシグナル
の数は、１１ｐ１５についてのプローブを用いて見出されたものに類似していた
。

【０１２８】１つのプローブは、染色体のｐアームの遠位部分にマッピングされ、そして第
二のプローブは１１ｑにマッピングされた。染色体１１ｐのゲインを示した３つ
の症例のうち、核１つあたり１１ｐプローブの６〜１０のシグナルが検出された
。他方、ｑアームにマッピングされたプローブは、２つのシグナルのみを与えた
。興味深いことに、このシグナル数は、損傷全体にわたって実質的に定常的であ
り、このことは、新生物のクローン性の性質を示唆する。ＣＧＨにおいて１１ｐ
ゲインの徴候を示さなかった他のスピッツ母斑のうち、１つのみのさらなる症例
が、１１ｐの増幅を示した。すべての他の症例は、両方のマーカーの２つのシグ
ナルを有した。例外は、３つの腫瘍において生じる大きな核を伴う細胞であった
。これらの細胞は、１０までの両方のマーカーを有した。これらの知見は、染色
体１１ｐのゲインがスピッツ母斑における再発性の異常であることを示唆する。
スピッツ母斑の細胞は、二倍体であるが、例外として、倍数体であり得る大きな
核を有する細胞を伴った。スピッツ母斑は、クローン性新生物である。

【０１２９】表１：ＣＧＨおよびＦＩＳＨによって見出されたスピッツ母斑および異常の臨
床的情報（ＰＳＣＴ＝着色紡錘細胞腫瘍、ＦＯＤ＝疾患無し、ＮＡ＝利用可能で
はない）

【０１３０】

【表１】（考察）これらの結果は、大多数のスピッツ母斑は、正常な染色体相補体を有するが、
サブセット（ｓｕｂｓｅｔ）は、異常性を有し得るということを示す。本発明者
らは、４／１７ケース（ｃａｓｅ）における染色体１１ｐのゲイン（ｇａｉｎ）
を検出した。従って、スピッツ母斑は、染色体レベルにおいて遺伝的異常を含む
、多くの良性病巣の１つである。スピッツ母斑における染色体異常のパターンは
、皮膚の原発性黒色腫において観察されるものとは明らかに異なる。後者におい
て、ＣＧＨにより分析される場合、少数のケースだけが異常を示さない。この例
において、ＣＧＨ測定を１０２の黒色腫に対して実施して、そして５つのケース
のみが、変化を示さなかった。検出可能な異常を伴わない５つのケースが、これ
らの知見についての少なくとも一部を説明し得る、腫瘍における正常細胞のかな
りの混入を有した。本研究のスピッツ母斑において、炎症性成分を伴うケースを
除外した。その結果、正常細胞の混入は高頻度の陰性の知見を説明し得なかった
。

【０１３１】１７の病巣のうちの４つの病巣における染色体１１ｐの増加したコピー数の知
見は、この異常がスピッツ母斑における再発性の変化を表すということを示す。
それは、染色体１１ｐの遺伝子の増加した投薬量が、この腫瘍の病原性において
関連性を有するということを示唆する。得られたゲノムフラグメントが大きい場
合、さらなる研究が保証されて、重要な遺伝子を同定するための第１段階として
その領域の範囲を細かに区別する。おそらく、１１ｐのゲインを伴わないスピッ
ツ母斑において、それらの遺伝子、またはそれらが属する経路は、遺伝子コピー
数の増加とは異なる機構によって、活性化される。

【０１３２】染色体１１ｐのゲインを、本発明者らがＣＧＨによって分析した１０２の原発
性黒色腫を観察しなかった。１１ｐを含むゲインが、公表された２３９の核型（
大部分が転移性黒色腫に由来する）のケースのうちわずか２つのケースにおいて
のみ見出された（１１、１２）。しかし、これらの２のケースにおいて、そのゲ
インは、遠くのｑ−アームまで伸長した（１２）。

【０１３３】さらに、原発性黒色腫において最も頻繁な知見（染色体９および１０の喪失）
が、いずれのスピッツ母斑においても見出されなかった。しかし、染色体７を本
発明者らの黒色腫のケース（７）の５０％において獲得し、そしてスピッツ母斑
の１つが、染色体７ｑ２３−ｐｔｅｒのゲインを示した。従って、将来の研究が
スピッツ母斑の異常性の完全なスペクトルおよび頻度を決定することを必要とさ
れるとしても、現在のデータは、黒色腫およびスピッツ母斑における染色体のゲ
インおよび喪失のパターンにおいて明確な差異が存在することを明確に示す。こ
れらの差異は、診断目的のために使用され得る遺伝子マーカーを定義する可能性
を生じる。細胞遺伝学的研究は、軟部組織腫瘍の分類において大いに役に立ち、
そして中枢の診断情報を提供し得る（１３）。スピゾイド（ｓｐｉｚｏｉｄ）メ
ラニン細胞新生物についての診断試験は、染色体１１ｐ、９および１０のコピー
数欠失を含み得る。染色体１１ｐのゲインは、スピッツ母斑に有利なものとして
解釈され得、そして染色体９および／または１０の喪失は、黒色腫に有利なもの
として解釈され得る。

【０１３４】原発性黒色腫に最も頻繁に見い出される染色体変化は、スピッツ母斑に存在し
ないということが実際に顕著である。そして、黒色腫に頻繁に見い出される異常
性のこの非存在が、診断の機会を実際に提供し得る差異となり得る。３２の原発
性黒色腫に対するこれまでのＣＧＨ研究は、そのケースの８２％において染色体
９ｐの喪失、６３％において染色体１０の喪失、および２８％において染色体６
ｐの喪失を示した（Ｂａｓｔｉａｎら、１９８８）。黒色腫において頻繁なゲイ
ンは、染色体７ｐ（５０％）、８ｑ（３４％）および６ｐ（２８％）に関与した
。これらの変化は、本発明者らの一連のスピッツ母斑において見出されなかった
。ある研究が、２７のスピッツ母斑のうちの２つにおいて染色体９ｐの介在性欠
失を見出し、そのことが９ｐの喪失が黒色腫に限られたことではないということ
を示唆することに注目すべきである（ＨｅａｌｙＥら、ＡＬＬＥＬＯＴＹＰＥ
ＳＯＦＰＲＩＭＡＲＹＣＵＴＡＮＥＯＵＳＭＥＬＡＮＯＭＡＡＮＤ
ＢＥＮＩＧＮＭＥＬＡＮＯＣＹＴＩＣＮＥＶＩ，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５
６；５８９，１９９６）。従って、おそらく、他の染色体領域（例えば、１ｑ、
６ｐ、７ｐ、および１０ｑ）のコピー数の決定は、示差的診断においてより有用
であることを証明し得る。そのような試験の有効性は、矛盾する組織病理学的判
定基準を有するが、公知の追跡調査を有するケースの包含を伴う、より大きなセ
ットの腫瘍の分析を介して評価されることを必要とする。このことは、臨床的に
関連する条件下において、感受性および特異性の決定を可能にする。

【０１３５】ＦＩＳＨ測定は、ＣＧＨの知見を確認するだけでなく、スピッツ母斑の倍数性
およびクローン性に関するいくつかの興味深い識見を可能にする。その母斑のほ
とんど全ての細胞は、ＦＩＳＨによって、２コピーの１１ｑ上のコントロール遺
伝子座を有し、そしてＣＧＨが、その遺伝子座について異常なコピー数を示さな
かったので、これらの母斑における大多数の細胞は、二倍体であり、これは以前
のフローサイトメトリー研究と一致する（１０）。２つのケースが、巨大な核を
有する細胞の亜集団を有した。コピー数が増加したそれらの細胞は、試験された
その２つの遺伝子座についてのＦＩＳＨシグナルを増強させた。このことは、増
大した核のサイズは、おそらく倍数性に起因することを示唆する。これらのデー
タはまた、スピッツ母斑がおそらくメラニン細胞のモノクローナル集団から構成
されることを示す。これは、獲得された１１ｐを有する３つのケースから結論さ
れ得る。なぜなら、染色体アームの増加したコピー数が、全ての細胞の病巣に存
在したからである。

【０１３６】要約すれば、本実施例は、スピッツ母斑において、（Ｉ）大多数のケースが、
ＣＧＨ分解能のレベルにおいて正常な染色体相補体を有し、（ＩＩ）染色体１１
ｐのゲインは、病巣のサブセットにおける再発性異常を表わし、（ＩＩＩ）スピ
ッツ母斑は、おそらくクローン性新生物であり、（ＩＶ）スピッツ母斑の大多数
のメラニン細胞は、倍数体であり得る大きな核を有する細胞を除いて二倍体であ
り、そして（Ｖ）原発性皮膚性黒色腫およびスピッツ母斑における細胞遺伝学的
に検出可能な異常性の位置および頻度における明確な差異は、この難しい示差的
診断の診断上の正確さを洗練するためにＣＧＨおよびＦＩＳＨを有望な技術とす
るということを示す。

【０１３７】（実施例２：染色体９プローブを使用するメラニン細胞性腫瘍のＦＩＳＨ研究
）本実施例は、原発性黒色腫細胞を検出する際に染色体９プローブを使用してＦ
ＩＳＨ実験を実証する。

【０１３８】染色体９についてのＰＩクローンを、原発性黒色腫の切片のＦＩＳＨ研究のた
めに同様に使用した。染色体９の喪失は、黒色腫のＣＧＨ研究における最も頻繁
な知見であった。ＦＩＳＨ実験は、ほとんどのケースの黒色腫において、染色体
９ｐに対して１つのプローブを有する核当たり０〜１シグナルを検出したが、同
時にハイブリダイズした参照遺伝子座は、核当たり２シグナルよりの大きなシグ
ナルを示したことを示した。このことは、ＦＩＳＨは、組織切片におけるホモ接
合性欠失およびヘテロ接合性欠失を検出し得ることを示唆する。

【０１３９】従って、ハイブリダイゼーションプローブの選択は、以下の判定基準に基づく
：（ａ）対応する染色体領域は、１つの新生物において頻繁な異常を示すはずで
あり、そして他（例えば、１ｑ、６ｐ、７ｐ、９ｐ、１０ｑおよび１１ｐ）にお
いては示さないはずであり、（ｂ）プローブは、強力かつ再現性のハイブリダイ
ゼーションシグナルを与えるはずである。

【０１４０】（実施例３：組織ハイブリダイゼーションプロトコル）本実施例は、黒色腫細胞とスピッツ母斑細胞との間の染色体遺伝子座当たりの
シグナル比の差異を研究する際の組織ハイブリダイゼーションプロトコルの使用
を実証する。

【０１４１】ハイブリダイゼーションプロトコルは、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ
ＧｅｎｅｔＣｙｔｏｇｅｎｅｔ８３，９３−１０４（１９９５）から適応さ
れる。手短には、組織切片を正に荷電したスライド上に封入する。そのスライド
を５５℃にて約３０分間加熱し、そしてキシレンを用いて脱パラフィン化処理し
、そしてエタノールで脱水処理する。次いで、その組織切片をＮａＳＣＮ中で連
続的にインキュベートし、続いてペプシンによってインキュベートする。ホルム
アミドにおいて変性させた後、その組織切片を標準的な技術を使用してハイブリ
ダイズする。プローブを直接Ｃｙ−３で標識し、そしてＦＩＴＣ標識抗ジゴキシ
ゲニン抗体で後に検出されるジゴキシゲニンで間接的に標識する。代替的標識ア
プローチを、１つのハイブリダイゼーションにおいて、示差的に標識された３つ
のプローブを検出し得るように使用し得る。

【０１４２】これまでの研究に基づいて、合計２５の腫瘍細胞核および２５の正常組織細胞
核において各ハイブリダイゼーションプローブのシグナルを計数することで充分
であるということが予期される。意思決定のための１つのパラメーターは、組織
（例えば、表皮性付属物または上皮性付属物のケラチノサイト）内の正常細胞に
おける遺伝子座当たりのシグナルの平均数と比較した場合の腫瘍細胞当たりの遺
伝子座当たりのシグナルの平均数の比である。予備研究に従うと、その比は、黒
色腫における遺伝子座の頻繁な喪失については１未満であり、そしてスピッツ母
斑において獲得される遺伝子座については１よりも大きいことが予期される。

【０１４３】第２のパラメータは、腫瘍細胞当たりのシグナル数の分散である。これまでの
他の研究および実験に基づくと、その分散は、良性腫瘍よりも悪性腫瘍において
有意により高いことが予期される（ＤｅＷｉｔら、ＪＰａｔｈｏｌ１７３
，２２７〜３３（１９９４））。

【０１４４】（実施例４：Ｈ−ＲＡＳ変異の同定）本実施例は、変異したＨ−ＲＡＳ遺伝子がスピッツ母斑と関連するということ
を実証する。Ｈ−ＲＡＳ変異を同定するこの手順を、以下に記載されるような標
準的なプロトコルに従って実施した。

【０１４５】ケースの選択：スピッツ母斑のパラフィンブロックを、Ｄｅｒｍａｔｏｐａｔ
ｈｏｌｏｇｙｓｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｓｏｆ
ＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙおよびＰａｔｈｏｌｏｇｙａｔｔｈｅＵｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏの保
管所から無作為に検索した。本発明者らは、以下の判定基準を用いてＤｅｒｍａ
ｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙＳｅｃｔｉｏｎのデータベースのコンピュータ検索を
実施した：本発明者らの研究所で使用されるスピッツ母斑の３０の異なる記述的
改変体に１つの主な診断を割り当てられた１／１／９８〜１２／３１／９８の全
てのケースを選択する。立会い診察においてスライドとして送られたケースを、
異常なスピッツ母斑に関するバイアスを避けるために除外した。その要求は、ブ
ロックが入手可能である１４４ケースを得た。

【０１４６】これらのケースに加えて、ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏ
ｇｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｕｚｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙの２２ケ
ースを、その研究に含めた。これらのケースは、初め、比較ゲノムハイブリダイ
ゼーションについて検索され、そして少なくとも１ｍｍ厚のスピッツ母斑のみを
含んだ。

【０１４７】組織アレイのアセンブリ：組織アレイをＫｏｎｏｎｅｎら、に従って構築した
（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：８４４−８４７，１９９８）。手短には、組織配列機器
（ＢｅｅｃｈｅｒＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＳｉｌｖｅｒＳｐｒｉｎｇ，Ｍ
Ｄ）を使用して、母斑のほとんどの細胞性領域の０．８ｍｍバイオプシーコアの
穴を開けた。このバイオプシーコアを、製造業者の指示に従ってレシピエントパ
ラフィンブロック内に整列させた。６μｍ厚の複数の切片を、接着性被膜テープ
セクショニングシステム（ａｄｈｅｓｉｖｅ−ｃｏａｔｅｄｔａｐｅｓｅｃ
ｔｉｏｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍ）（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｄｉｃｓ，Ｈａｃｋｅｎ
ｓａｃｋ，ＮＪ）を使用して、ミクロトームを用いて切断した。Ｈ＆Ｅ切片を、
バイオプシーコアの組織学的試験のために使用した。新生物メラニン細胞の粘着
性集団を伴う少なくとも１つの領域を有するケースのみが、この分析に含まれた
。

【０１４８】ホルマリン固定された組織マイクロアレイ切片に対するＦＩＳＨ：二重色ＦＩ
ＳＨを、以前に記載されたようにアレイの組織切片上で実行した（Ｂａｓｔｉａ
ｎら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１３：１０６５−１０６９、１
９９９）。本発明者らは、染色体１１ｐの増幅の欠失についてＨ−ＲＡＳ、およ
び染色体１１のｑ−アームについて参照Ｐ１クローン（ＲＭＣ１１Ｐ００８）を
含んだＢＡＣクローン（ＲＭＣ１１Ｂ０２２）を使用した。プローブを、ニック
翻訳によって、Ｃｙ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔ
ｓ，ＩＬ）またはジゴキシゲニン（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｉｅｍ，
ＩｎｄｉａｎｏｐｏｌｉｓＩＮ）で標識した。組織切片を脱パラフィン処理し
、水和し、そして１Ｍのチオシアン酸ナトリウム中で８０℃にて２〜４分、０．
２ＮのＨＣｌ中４ｍｇ／ｍｌのペプシンにおいて３７℃にて４〜８分間前処理し
た。脱水処理後、切片を、７０％ホルムアミド、２×ＳＳＣｐＨ７．０中で５
分間７２℃において変性させ、そして１０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液
（５０％ホルムアミド、１０％デキストランサルフェートおよび２×ＳＳＣ、ｐ
Ｈ７．０、２０μｇＣｏｔ−１ＤＮＡ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））中で３７℃において４８〜７２
時間に渡ってハイブリダイズさせた。スライドを、４５℃にて洗浄溶液（２×Ｓ
ＳＣ、ｐＨ７．０中５０％ホルムアミド）中で３回、４５℃において２×ＳＳＣ
中で一度、室温（ＲＴ）において２×ＳＳＣ中で一度、そして室温において４×
ＳＳＣ中０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００中で一度洗浄した。引き続き、切片を
、３７℃にて湿潤チャンバーにおいて４×ＳＳＣ中１０％ＢＳＡと共にインキュ
ベートし、次いで、１０％ＢＳＡを伴う４×ＳＳＣ中に希釈されたＦＩＴＣ標識
抗ジゴキシゲニン抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａ
ｎａｐｏｌｉｓＩＮ）と共にインキュベートした。切片を、抗フェード（ｆａ
ｄｅ）溶液において４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（Ｓｉｇｍａ，
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＳ）を用いて対比染色した。ＦＩＳＨシグナルを、倍率６
３の対物レンズを使用して蛍光顕微鏡Ｚｅｉｓｓ（Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
を用いて得点をつけた。増幅についての判定基準は、少なくとも３０％の腫瘍細
胞において、参照シグナルよりも試験プローブシグナルの方が少なくとも３倍多
いということであった。

【０１４９】ＤＮＡ配列分析：ＤＮＡを、腫瘍保有領域を、解剖顕微鏡下でメスを用いて手
動で解剖した３０μｍ切片から抽出した。２〜３の切片を、０．５ｍｌチューブ
内に収集し、そしてキシレンおよびエタノールを用いて洗浄した後、０．５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０を含むＰＣＲ緩衝液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）中で０．４ｍｇ
／ｍｌのプロティナーゼＫ（ＬｉｆｅＴｅｎｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．
，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）と共に５５℃にて３日間インキュベートし
た。新鮮なプロティナーゼＫを、２４時間毎に０．４ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで
添加した。ＨＲＡＳコドン１２プライマーは、５’−ＡＧＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴ
ＡＧＧＡＧＧＡ−３’（配列番号１）（正方向）および５’−ＣＧＣＴＡＧＧＣ
ＴＣＡＣＣＴＣＴＡＴＡＧＴＧ−３’（配列番号２）（逆方向）であり、そして
コドン６１プライマーは、５’−ＣＴＧＣＡＧＧＡＴＴＣＣＴＡＣＣＧＧＡ−３
’（配列番号３）および５’−ＡＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧＧＣＡ−３
’（配列番号４）であった。ＰＣＲを、２５μｌの反応容積中ＧｅｎｅＡｍｐ
ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉ
ｎＥｌｍｅｒ）において実施した。各ＰＣＲ反応物は、３．５ｍＭＭｇＣｌ ₂ 、０．２ｍＭｄＮＴＰ、０．６２５ＵＴａｑＧｏｌｄＰｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、各々０．５μＭ
の正方向プライマーおよび逆方向プライマー、ならびに５０〜３００ｎｇのゲノ
ムＤＮＡを含んだ。ＰＣＲサイクル条件は以下である：９５℃１５分間、次いで
９５℃１５秒間、５５℃３０秒間、そして７２℃６０秒間を３５サイクル、そし
て最後に７２℃にて１０分間ホールドする。

【０１５０】配列決定する前に、ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ産物プレ（Ｐｒｅ）−配列決定キッ
ト（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を使用し
て精製し、過剰なプライマーおよびヌクレオチドを除去した。蛍光ＤＮＡ配列決
定を、ＢｉｇＤｙｅターミネーター配列決定化学（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、実施した。手短には、３０〜５０ｎｇの精製
されたＰＣＲ産物および３．２ｐｍｏｌの配列決定プライマーを、製造業者の指
示に従って、１５μｌの反応物において配列決定するために使用した。この配列
決定産物を、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０カラムを使用して精製し、減圧濃縮機に
おいて乾燥し、そして３μｌのゲルローディング緩衝液（８３％脱イオン化した
ホルムアミド、１７％ゲルローディング色素）（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ）中に再懸濁した。次いで、ＡＢＩ自動化シークエンサーに対し
て０．５μｌのサンプルを変性配列ゲル上にロードした。全てのサンプルを、変
異の存在／非存在を確認するために正方向および逆方向の両方において配列決定
した。そのデータを、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウエア（ＧｅｎｅＣｏｄｅ
ｓ，ＡｎｎＡｒｂｏｒ，ＭＩ）を使用して分析した。

【０１５１】（組織アレイを使用する、染色体１１ｐコピー数のＦＩＳＨ分析）腫瘍細胞を決定的に同定し得る、高品質ハイブリダイゼーションのケースを、
１０２のケースから入手した。この６１．４％という収率は、本発明者らが黒色
腫から構築したアレイと比較すると比較的低いものであった。分析され得ないほ
とんどのケースは、接合部メラニン細胞の単一細胞または小さな集団からのみ構
成される非常に小さなスピッツ母斑であり、その結果、新生物メラニン細胞は、
そのアレイにおいて確実には認識され得なかった。３９のケース（３８．２％）
が、男性患者に由来し、そして６１のケース（５９．８％）が女性患者に由来し
、２のケースについて性別が未知であった。平均年齢は、３０．０歳であった。
５２（５１％）のケースが、スピッツの色素紡錘細胞母斑改変体（ＰＳＣＮ）の
特徴を有した。

【０１５２】ハイブリダイゼーション効率を、多くのバイオプシーにおいて示された正常な
表皮におけるハイブリダイゼーションシグナルを計数することによって評価し得
る。正常なケラチノサイトにおける、試験プローブおよび参照プローブのための
平均コピー数は、それぞれ１．７および１．６であった。ハイブリダイゼーショ
ンを、３つの別個の切片のアレイを分析し、そして２つ以上の切片からのカウン
トが、４７ケース（４６．１％）について入手可能であった。これらの４５のケ
ース（９５．７％）において、別個のカウントの結果は同一であり、１つのケー
スにおいて、決定的な増幅が１つの分析において観察され、そして他の切片に存
在する細胞には見い出されなかった。１１ｑに対する参照プローブと比較したと
き、腫瘍細胞の３０％よりも多くが、１１ｐの少なくとも３倍増のシグナルを有
した場合にのみ、増幅に得点をつけた。これらの判定基準に従って、１１ｐの増
幅を、１２ケース（１１．８％）において見い出した。増幅を有するケースの平
均厚は、１１ｐの正常コピー数を有するケースの厚さよりも有意に大きかった（
１．１ｍｍ対０．６ｍｍ、ｐ＝０．０１）。無作為に検索されたケースのセット
内の増幅頻度は、６／８４（７．１％）であったが、厚さについて選択された１
８ケースのは、６ケース（３３．３％）が、染色体１１ｐの増幅を示した。

【０１５３】（Ｈ−ＲＡＳ変異）Ｈ−ＲＡＳのオンコジーン変異は、代表的にエキソン１のコドン１２、１３、
およびエキソン２のコドン６１を含む（Ｂａｒｂａｃｉｄ，Ｍ．，Ａｎｎｕ．Ｒ
ｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ；５６：７７９〜８２７、１９８７）。本発明者らは、Ｆ
ＩＳＨが染色体１１ｐの増幅を検出した９ケースならびにＦＩＳＨが染色体１１
ｐの正常コピー数を示した１３ケースのＨ−ＲＡＳのエキソン１および２を配列
決定した。１１ｐ増幅を有する、９ケースのうち５つのケース（５６％）が、Ｈ
ＲＡＳ変異を有し、正常な１１ｐのコピー数を有するケースよりも有意に多く（
ｐ＝０．０２）、１つだけが（８％）変異を有した。３の変異は、６１Ｇｌｎ→
Ｌｅｕ（図１Ｅ）、２つの６１Ｇｌｎ→Ａｒｇおよび１つの１２Ｇｌｙ→Ａｒｇ
であった。

【０１５４】さらに、本発明者らは、以前の本発明者らのＣＧＨ分析（Ｂａｓｔｉａｎら、
Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１３：１０６５〜１０６９、１９９９
）のために使用された１１のスピッツ母斑のＨ−ＲＡＳを配列決定した。Ｈ−Ｒ
ＡＳ変異を、ＣＧＨが、染色体１１ｐの増加したコピーを検出した全ての３つの
ケース（１００％）において同定した。これらの全ては、コドン６１を含み；２
つのケースが、グルタミンからアルギニンへの転移を有し、そしてその他が、ロ
イシンへの転移を有した。ＣＧＨが、染色体１１ｐの正常コピー数を見出した７
つのケースが、Ｈ−ＲＡＳの両方のエキソンの野生型配列を有した。

【０１５５】Ｈ−ＲＡＳを配列決定した合計３３のスピッツ母斑のうち、増幅された１１ｐ
を有する８／１２ケース（６７％）は、Ｈ−ＲＡＳ変異を有しており、染色体１
１ｐの正常コピー（１／２１または５％）を有するケースよりも有意に多かった
（ｐ＜０．０００１）。

【０１５６】（増幅された染色体１１ｐを有するケースの組織学的特徴）増幅は、化合物または主に皮内スピッツ母斑において最も共通であり（１１／
４７または２３．４％）、そしてスピッツ母斑の色素紡錘細胞母斑改変体におい
て希に生じただけであった（１／５２または１．９％；ｐ＝０．０００７）。１
１ｐの増幅を有するケースは、染色体１１ｐの正常コピー数を有するケースにお
いてはあまり生じない、いくつかの組織学的特徴を頻繁に示した（表２）。この
腫瘍は、一般的に、基部のコラーゲン束間に広がる単一細胞を示し、でたらめに
配列されたコラーゲンおよび著しい線維形成のパターンを生じた（８／１２、ｐ
＝０．０００５）。細胞は、代表的に、繊細な核膜を有する小胞性核および豊富
な両染性細胞質を有した。基部における細胞は、薄い好酸性膜によって囲まれる
ことが頻繁に見受けられ（５／１２）、そのことは、１１ｐの正常コピー数を有
する８７のケースのうちの３つにおいてのみ観察された（ｐ＜０．０００１）。
これらの膜はレチクリン染色で陽性に染色された（示さず）。１１ｐ増幅を有す
るケースはまた、特に、サイズおよび形および染色強度が異なる核を有する多形
性であり（ｐ＜０．０００１）、そしていくつかのケースにおいて核内封入体で
ある。これらの特徴はまた、以前の研究（Ｂａｓｔｉａｎら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ
．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１３：１０６５−１０６９、１９９９）における比較ゲ
ノムハイブリダイゼーションによって、染色体１１ｐの増幅を示した３つのケー
スにおいて示された。１１ｐ増幅と患者の年齢もしくは性別との関連は見られな
かった。

【０１５７】表２．スピッツ母斑における染色体１１ｐの増幅に関連する組織学的特徴

【０１５８】

【表２】ｎ欄におけるパーセンテージは、１０２ケースの総数に対して言及する。他のパ
ーセンテージは、それぞれの生物学的特徴を有するケースの数をいう。

【０１５９】Ｋｉ−６７抗体を使用して、細胞増殖を、１１ｐの増幅を有する１２ケースの
全ておよび染色体１１ｐの正常コピー数を有する２４のケースにおいて評価した
。免疫染色を、最初のブロックの切片に対して実施し、細胞の十分な数の検査を
可能にした。１１ｐ増幅を有するケースの１１／１２（９２％）および正常な１
１ｐのコピー数を有するケースの２０／２４（８３％）において、標識された核
の数が、０〜最大１％にわたった。合計５つのケースがより高い標識割合を有し
た：４つのケースが、正常な１１ｐコピー数およびせいぜい５％の標識指標を有
し、デモ−表皮性接合部において主にメラニン細胞に影響を及ぼした。ＦＩＳＨ
分析による染色体１１ｐの６コピーの平均および６１のＧ→Ａ変異を有した１つ
のケースは、１０％の標識指標を有した。それは、表在性のバイオプシーであり
、その結果、この母斑の深層領域における増殖速度は評価され得なかった。

【０１６０】（１１ｐ増幅を有するスピッツ母斑のα_Vβ₃インテグリンの過剰発現）細胞接着分子α_Vβ₃インテグリンの発現は、腫瘍の進行および黒色腫の侵襲と
相関し（Ａｌｂｅｌｄａら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１９９０，５０：６７５７
〜６７６４）、そして最近、スピッツ母斑において発現されることが報告された
（ＶａｎＢｅｌｌｅら、Ｈｕｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９９、３０：５６２〜５
６７）。１１ｐ増幅を有するケースにおいて頻繁に見い出されるかなりのコラー
ゲンの再構築をもたらすコラーゲン束間の単一細胞のパターンは、その細胞の著
しい侵襲能力の指標であった。β３インテグリンを検出するための免疫組織化学
を実施して、α_Vβ₃インテグリン発現のレベルを決定した。この分析は、合計８
０の有益なケースのうち、２９（４１．４％）が、α_Vβ₃インテグリンの発現を
示した（１＋以上）ことを示した。α_Vβ₃インテグリン発現は、ＨＲＡＳの増幅
と有意に関連した（ｐ＜０．０００１）。α_Vβ₃インテグリンを発現した２９の
ケースのうち、９つのケースが、ＨＲＡＳの増幅を有した。α_Vβ₃インテグリン
の発現を伴わない４１のケースのうち、２つのケースのみが、染色体１１ｐの増
幅を有した。１１ｐ増幅を有する全てのケースにおいて、α_Vβ₃インテグリンの
発現パターンは膜性であった。

【０１６１】要約すれば、本実施例は、Ｈ−ＲＡＳ変異は、スピッツ母斑のサブセット内に
存在し、そしてスピッツ母斑の示差的診断において補助するために、腫瘍サンプ
ルを分類する際の標的として使用され得る。

【０１６２】（実施例５：１１ｐ同腕染色体の同定）Ｈ−ＲＡＳの増幅を示した１０のスピッツ母斑サンプル（例えば、実施例１を
参照のこと）を、ＦＩＳＨを使用して１１ｐ同腕染色体の存在について分析した
。

【０１６３】この分析のために２つのプローブを使用した。第１のプローブＲＰＣＩ−１１
５６ｃ１３（これは、ＦＩＴＣで標識して、緑色蛍光シグナルとして検出した）
は、動原体（１１ｐ１１．２）に隣接する領域に対して染色体１１ｐをマッピン
グする。第２のプローブＲＰＣＩ−１１１３５ｈ０８（これは、Ｃｙ３で標識し
、赤色蛍光標識として検出した）は、１１ｑ１１にて動原体と隣接する染色体１
１のｑアーム上の配列とハイブリダイズする。正常なコントロール組織は、２色
（すなわち、１つの赤色シグナルおよび１つの緑色シグナルを含んだシグナルの
対）を含む対形成したハイブリダイゼーションシグナルの存在のみを示した。ス
ピッツ母斑由来の１０サンプル全てからの結果は、同じ色（緑色）の対形成した
ハイブリダイゼーションシグナルのさらなる存在を示した。これらの結果は、１
１ｐ同腕染色体の存在を実証する。

【０１６４】本実施例および本明細書中に記載される実施形態は、単に例示目的のためであ
って、そしてそれらを考慮にいれた種々の改変または変化が、当業者に示唆され
、そして本出願の精神および範囲ならびに添付される特許請求の範囲内に含まれ
るべきであるということが理解される。本明細書中に列挙される全ての出版物、
特許、および特許出願が、全ての目的のために、その全体が参考として援用され
る。

【０１６５】（配列表）

【０１６６】

【化１】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、３２個の原発性皮膚黒色腫における染色体のコピー数の変化の概要を
示す。染色体のゲインを、染色体表意文字の右に線で示し、染色体喪失を、染色
体表意文字の左に線で示す。右の太線は、増幅を示し、左の太線は、１０の事例
における喪失を要約する（Ｂａｓｔｉａｎら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５８：２
１７０−５，１９９８）。

【図２】図２は、１７個のスピッツ母斑における染色体のコピー数の変化の概要を示す
。染色体のゲインを、染色体表意文字の右に線で示す。太線は、増幅を示す。

【図３】図３は、異常なＣＧＨプロフィールを有する４つのスピッツ母斑における、腫
瘍対参照ＤＮＡの蛍光強度の平均比プロフィールを示す。点線は、異常を規定す
るために使用された１．２および０．８の比閾値を示す。ｎは、それぞれのプロ
フィールについて測定された染色体の数を示す。

【図４】図４は、染色体１１ｐについてのプロープＲＭＣ１１Ｂ０２２（黒棒）および
染色体１１ｑについてのＲＭＣ１１Ｐ００８（白棒）の二重標的ハイブリダイゼ
ーション後の、ハイブリダイゼーションシグナルの頻度分布を示す。スピッツ母
斑の３つの事例を示す。事例２（Ａ、Ｂ）は、ＣＧＨによる染色体異常がないこ
とを示し、事例１３（Ｃ、Ｄ）は、ＣＧＨによる染色体１１ｐのゲインを有し、
事例１５（Ｅ、Ｆ）は、ＣＧＨによる異常を示さなかった。これは、大きな核を
有する腫瘍細胞の亜集団を有した。グラフＡ、Ｃ、Ｅは、腫瘍細胞におけるシグ
ナル分布を示す；グラフＢ、Ｄ、Ｆは、対応する障害のケラチノサイトにおける
シグナル分布を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/53 Ｍ 33/531 Ａ 33/531 33/566 33/566 33/58 Ａ 33/58 37/00 １０２ 37/00 １０２Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者ピンケル，ダニエルアメリカ合衆国カリフォルニア 94595，ウォルナットクリーク，マンザニータコート 31 Ｆターム(参考） 2G045 AA26 BA14 BB24 DA12 DA13 DA14 DA36 FA16 FA37 FB02 FB03 FB06 FB07 FB16 GC22 JA03 JA04 2G054 AA08 AB04 CA22 CA23 CE02 EA03 EB01 GA04 GB00 JA02 JA04 JA10 4B024 AA12 CA01 CA09 HA12 HA13 4B063 QA01 QA19 QQ08 QQ42 QQ58 QR32 QR56 QR66 QR82 QS25 QS34 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】患者由来の皮膚腫瘍サンプルのメラニン細胞母斑の存在につ
いてスクリーニングする方法であって、該方法は、１１ｐにおけるコピー数の増
加の存在または該患者由来の核酸サンプルの１ｑ、６ｐ、７ｐ、もしくは１０ｑ
におけるコピー数の変化の非存在を検出する工程を包含する、方法。
【請求項２】前記患者由来の前記核酸サンプルの９ｐにおけるコピー数の
変化の非存在を検出する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】請求項１に記載の方法であって、ここで該方法は、以下：ａ）前記患者由来の核酸サンプルを、１ｑ、６ｑ、７ｐ、９ｐ、１０ｑおよび
１１ｐからなる群から選択される染色体領域上の標的ポリヌクレオチド配列に選
択的に結合するプローブと接触させる工程であって、ここで該プローブは、該プ
ローブが該標的ポリヌクレオチド配列と選択的に結合して、安定なハイブリダイ
ゼーション複合体を形成する条件下で、該サンプルと接触させる、工程；ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体の該形成を検出する工程；およびｃ）１１ｐにおけるコピー数の増加の存在または１ｑ、６ｐ、７ｐ、９ｐもし
くは１０ｑにおけるコピー数の変化の非存在を検出し、それにより前記メラニン
細胞母斑の存在を決定する工程、によって実施される、方法。
【請求項４】前記標的核酸が、Ｈ−ＲＡＳである、請求項３に記載の方法
。
【請求項５】前記核酸サンプルが、間期核である、請求項１に記載の方法
。
【請求項６】前記プローブが、検出可能な組成物で標識されている、請求
項１に記載の方法。
【請求項７】前記検出可能な組成物が、直接標識および間接標識からなる
群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】前記直接標識が、Ｃｙ３である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】前記間接標識が、ジゴキシゲニンおよびビオチンからなる群
から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】前記間接標識が、蛍光色素によって検出される、請求項７
に記載の方法。
【請求項１１】前記蛍光色素がＦＩＴＣである、請求項１０に記載の方法
。
【請求項１２】前記サンプルを、第２の染色体領域に対する参照プローブ
と接触させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】請求項１２に記載の方法であって、ここで前記参照プロー
ブが、前記標的ポリヌクレオチド配列と選択的にハイブリダイズする該プローブ
上の蛍光標識から識別可能な蛍光標識で標識される、方法。
【請求項１４】ハイブリダイゼーション複合体を検出する前記工程が、前
記標的ポリヌクレオチド配列のコピー数を決定することを包含する、請求項１に
記載の方法。
【請求項１５】核酸の第１の収集物および第２の収集物において反復配列
のハイブリダイゼーション能力をブロッキングする工程をさらに包含する、請求
項１に記載の方法。
【請求項１６】反復配列を含む非標識ブロッキング核酸が、前記サンプル
と接触される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】前記非標識ブロッキング核酸が、Ｃｏｔ−１ＤＮＡであ
る、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】プローブが、固体基材に結合されている、請求項１に記載
の方法。
【請求項１９】前記プローブが、アレイのメンバーである、請求項１８に
記載の方法。
【請求項２０】患者由来のサンプル内のメラニン細胞新生物を分類する方
法であって、該方法は、１１ｐ染色体アームのコピー数の増加を検出し、それに
よりスピッツ母斑として該新生物を分類する工程を包含する、方法。
【請求項２１】１１ｐ同腕染色体の存在を検出する工程を包含する、請求
項２０に記載の方法。
【請求項２２】請求項２１に記載の方法であって、ここで前記検出工程は
以下：前記サンプル由来の核酸を検出可能な標識で標識された第１のプローブとハイ
ブリダイズさせる工程であって、ここで該プローブは動原体に隣接する染色体１
１ｐ上の標的核酸配列と選択的にハイブリダイズする、工程；および該第１のプローブに由来する対形成したハイブリダイゼーションシグナルの存
在を検出する工程、を包含する、方法。
【請求項２３】請求項２２に記載の方法であって、ここで前記検出工程が
、前記サンプルに由来する前記核酸を、前記第１のプローブから識別可能な第２
の検出可能な標識で標識された第２のプローブとハイブリダイズさせる工程をさ
らに包含し、ここで該第２のプローブが、前記動原体に隣接する染色体１１ｑ上
の標的核酸配列と選択的にハイブリダイズする、工程；および該第１のプローブ
に隣接する該第２のプローブを検出する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２４】前記第１の標識が、蛍光標識であり、そして前記第２の標
識が該第１の標識と色が異なる蛍光標識である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】患者サンプルのメラニン細胞新生物を分類する方法であっ
て、該方法は、サンプルにおける変異Ｈ−ＲＡＳ遺伝子の存在を検出して、それ
によりスピッツ母斑として該新生物を分類する工程を包含する、方法。
【請求項２６】前記変異Ｈ−ＲＡＳ遺伝子コピー数が、正常なサンプルと
比較して前記患者サンプルにおいて増加している、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】前記変異Ｈ−ＲＡＳ遺伝子が、コドン１２、１３および６
１からなる群から選択される該Ｈ−ＲＡＳ遺伝子のコドンにおいて変異されてい
る、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】患者由来のサンプルにおけるメラニン細胞新生物を分類す
る方法であって、該方法は、Ｈ−ＲＡＳ遺伝子の増幅を検出する工程を包含し、
ここで、該検出工程が、該Ｈ−ＲＡＳ遺伝子によってコードされるポリペプチド
を検出する工程を包含する、方法。
【請求項２９】前記ポリペプチドが、抗体を用いて検出される、請求項２
８に記載の方法。
【請求項３０】前記ポリペプチドの量が、イムノアッセイによって定量さ
れている、請求項２９に記載の方法。