JP2009507227A - メラノーマを診断するための方法及びプローブ組み合わせ - Google Patents

メラノーマを診断するための方法及びプローブ組み合わせ Download PDF

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Abstract

本発明はメラノーマで増加又は減少又はアンバランスになっている染色体領域に対するプローブの組み合わせ及びその使用方法の発見に基づき、特異性と感度の高いメラノーマ細胞検出アッセイを提供する。

Description

（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は言及により本明細書に組込む米国仮出願第６０／７１３，７９９号（出願日２００５年９月２日）の優先権を主張する。
メラノーマは重要な臨床問題である。メラノーマの発生率と死亡率は女性の肺癌を除く他の全悪性腫瘍よりも急速に増加しつつある。病理はメラノーマの診断を確定するための最大の基準となる。多くの症例を現行病理基準で確実に分類することができるが、熟練した病理学者間でもコンセンサスが得られない症例がかなりある。曖昧さが標準臨床プラクティスに及ぼす影響は最近のオランダの研究に例証されている。最も一般的な診断上の問題を明確にするために、臨床病理学者が先に調査した１０６９個の連続メラニン細胞性病変を専門家パネルが再調査した。当初は浸潤性メラノーマとして分類された症例の１４％（２２／１５８）でパネルは病変を良性であるとみなし、１６．６％（８５／５１３）でパネルは当初は良性と診断されたものを悪性であるとみなした（Ｖｅｅｎｈｕｉｚｅｎら，Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１８２：２６６−７２．１９９７）。
診断の曖昧さは患者に大きな悪影響を与える。メラノーマを良性であると誤分類すると、生命にかかわる可能性があり、良性病変を悪性と診断すると、重大な合併症を発生する可能性がある。曖昧な症例に対する現行医療プラクティスは悪性と判断するのが一般的である。しかし、広範囲の再切除、センチネルリンパ節生検、及びアジュバントαインターフェロン等の治療選択肢の合併症と診断の不確実性により、低侵襲性治療レジメンを採用することが多い。一般に、このレジメンは限定的再切除と綿密な臨床追跡を要する。従って、良性病変をもつ患者は依然として重大な外科手術の副作用と診断の情緒的緊張を強いられ、実際にメラノーマをもつ患者は最適治療を受けられない可能性がある。現状では、これらの曖昧さを最終的に解決する方法は存在しない。これらの不確実性を減らすことのできる診断試験があるならば、多大な臨床効果が得られよう。本発明はこの必要性に対処するものである。
従来の研究によると、メラノーマは特定染色体領域の高頻度増加又は減少の存在により母斑と相違することが示されている。原発性メラノーマの比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）によると、６ｑ、８ｐ、９ｐ、及び１０ｑの増加と、１ｑ、６ｐ、７番染色体、８ｑ、１７ｑ、及び２０ｑの減少がメラノーマにおける最も一般的なＤＮＡコピー数変化であることが分かっている（Ｂａｓｔｉａｎら，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１６３：１７６５−７０，２００３）。しかし、このような研究はメラノーマを選択的に検出するために高レベルの感度と特異性をもつプローブ組み合わせについては洞察を与えていない。本発明は多色蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）試験を使用するプローブ組み合わせがメラノーマで一般に異常であるとされている染色体領域のコピー数変化を検出する能力の評価に基づく。
ＷＯ９７／０３２１１ ＷＯ９６／３９１５４ Ｖｅｅｎｈｕｉｚｅｎら，Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１８２：２６６−７２．１９９７ Ｂａｓｔｉａｎら，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１６３：１７６５−７０，２００３ Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈ．２，"Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ" Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮＹ（「Ｔｉｊｓｓｅｎ」） Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄ．）Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１） Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ６００，Ｂａｓｅｒｇａ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ編（ＮＹＡＳ １９９２） Ｍｉｌｌｉｇａｎ（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１９２３−１９３７；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ） Ｍａｔａ（１９９７）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４４：１８９−１９７ Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：８６９２−８６９８ Ｓａｍｓｔａｇ（１９９６）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ６：１５３−１５６
本発明はメラノーマを高い感度と特異性で検出できるため、悪性メラノーマを良性メラニン細胞性病変から区別することが可能なプローブ組み合わせの発見に基づく。メラノーマ検出方法は少なくとも２個のプローブのセット、多くの場合には少なくとも３個のプローブのセット、所定態様では、４個のプローブのセットを使用して、一般にｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、メラニン細胞性病変に由来する生体サンプルを評価する。メラノーマ検出に有用なプローブは６番染色体計数プローブ、７番染色体計数プローブ、８番染色体計数プローブ、９番染色体計数プローブ、１０番染色体計数プローブ、染色体領域１７ｑを標的とするプローブ、染色体領域１０ｑを標的とするプローブ、染色体領域６ｐを標的とするプローブ、染色体領域６ｑを標的とするプローブ、染色体領域９ｐを標的とするプローブ、染色体領域８ｐを標的とするプローブ、染色体領域８ｑを標的とするプローブ、染色体領域１ｑを標的とするプローブ、染色体領域７ｑを標的とするプローブ、染色体領域２０ｑを標的とするプローブ、及び染色体領域１１ｑを標的とするプローブから選択することができる。従って、本発明のプローブセットは１ｑ、６ｐ、６ｑ、７ｑ、８ｐ、８ｑ、９ｐ、１０ｑ、１１ｑ、１７ｑ、及び２０ｑから構成される群から選択される染色体領域に対するプローブを含む。プローブセットは更に６番、７番、８番、９番、又は１０番染色体に対する染色体計数プローブを含むことができる。多くの場合には、有用なプローブセットは染色体サブ領域、例えば１ｑ２３、１ｑ３１、６ｐ２５、６ｑ２３、７ｑ３４、８ｐ２２、８ｑ２４、９ｐ２１、１０ｑ２３、１１ｑ１３、１７ｑ２５、又は２０ｑ１３に対する少なくとも１個のプローブを含む。
１側面では、本発明は患者からの生体サンプルにおけるメラノーマ細胞の存在の検出方法を提供し、前記方法は、
ａ）６番染色体計数プローブ、１０番染色体計数プローブ、染色体領域６ｐ（例えば６ｐ２５）を標的とするプローブ、染色体領域６ｑ（例えば６ｑ２３）を標的とするプローブ、染色体領域７ｑ（例えば７ｑ３４）を標的とするプローブ、染色体領域１１ｑ（例えば１１ｑ１３）を標的とするプローブ、染色体領域１７ｑ（例えば１７ｑ２５）を標的とするプローブ、染色体領域１ｑ（例えば１ｑ３１）を標的とするプローブ、及び染色体領域２０ｑ（例えば２０ｑ１３）を標的とするプローブから構成される群から選択される少なくとも２個のプローブの組み合わせとサンプルを接触させる段階と；
ｂ）各プローブがその標的染色体又は染色体領域上のポリヌクレオチド配列と選択的に結合して安定なハイブリダイゼーション複合体を形成する条件下でセットの各プローブをサンプルと共にインキュベートする段階と；
ｃ）プローブ組み合わせのハイブリダイゼーションパターンをメラノーマの有無について検出及び分析する段階を含む。ハイブリダイゼーションパターンがプローブの標的染色体領域に少なくとも１カ所の増加又は減少又はアンバランスを示す場合にはメラノーマであると判定する。プローブ組み合わせは一般に０．２９以下の理想との差（ＤＦＩ）値をもつ。所定態様では、ＤＦＩ値は約０．２０以下である。本発明の方法で使用するプローブ組み合わせとしては、約０．２９以下のＤＦＩ値をもつ表６に記載の２個、３個、及び４個のプローブの組み合わせが挙げられる。
多くの場合には、少なくとも２個のプローブの組み合わせにおけるプローブの１個は染色体サブ領域６ｐ２５を標的とする。所定態様では、２個のプローブの組み合わせは染色体サブ領域６ｐ２５を標的とする第１のプローブと、１０番染色体計数プローブ、サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブ、及び染色体サブ領域６ｑ２３を標的とするプローブから構成される群から選択される第２のプローブからなる。
本発明の方法は６番染色体計数プローブ、１０番染色体計数プローブ、染色体領域６ｐ（例えば６ｐ２５）を標的とするプローブ、染色体領域６ｑ（例えば６ｑ２３）を標的とするプローブ、染色体領域７ｑ（例えば７ｑ３４）を標的とするプローブ、染色体領域１１ｑ（例えば１１ｑ１３）を標的とするプローブ、染色体領域１７ｑ（例えば１７ｑ２５）を標的とするプローブ、染色体領域１ｑ（例えば１ｑ３１）を標的とするプローブ、及び染色体領域２０ｑ（例えば２０ｑ１３）を標的とするプローブから構成される群から選択される３個のプローブをもつプローブセットを利用することもできる。所定態様では、３個のプローブの組み合わせにおける３個のプローブのうちの１個は染色体サブ領域６ｐ２５を標的とする。従って、メラノーマを検出するための３個のプローブの組み合わせは多くの場合には、
ａ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３を標的とするプローブと、６番染色体計数プローブ；
ｂ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１を標的とするプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブ；
ｃ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブ；
ｄ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブ；
ｅ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブ；
ｆ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブ；
ｇ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１を標的とするプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブ；
ｈ）染色体サブ領域１ｑ３１を標的とするプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブ；
ｉ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４を標的とするプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブ；
ｊ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブ；
ｋ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブ；
ｌ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３を標的とするプローブ；
ｍ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブ；
ｎ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブ；及び
ｏ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブから構成される群から選択される。
所定態様では、メラノーマを検出するために少なくとも４個のプローブの組み合わせを使用することができ、プローブは６番染色体計数プローブ、１０番染色体計数プローブ、染色体領域６ｐ（例えば６ｐ２５）を標的とするプローブ、染色体領域６ｑ（例えば６ｑ２３）を標的とするプローブ、染色体領域７ｑ（例えば７ｑ３４）を標的とするプローブ、染色体領域１１ｑ（例えば１１ｑ１３）を標的とするプローブ、染色体領域１７ｑ（例えば１７ｑ２５）を標的とするプローブ、染色体領域１ｑ（例えば１ｑ３１）を標的とするプローブ、及び染色体領域２０ｑ（例えば２０ｑ１３）を標的とするプローブから構成される群から選択される。所定態様では、組み合わせにおける４個のプローブのうちの１個は染色体サブ領域６ｐ２５を標的とする。従って、メラノーマの検出に使用する４個のプローブの組み合わせは、
ａ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、６番染色体計数プローブと、１０番染色体計数プローブ；
ｂ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブと、６番染色体計数プローブ；
ｃ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
ｄ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
ｅ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
ｆ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
ｇ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、６番染色体計数プローブ；
ｈ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、６番染色体計数プローブ；
ｉ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、６番染色体計数プローブ；
ｊ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
ｋ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
ｌ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
ｍ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
ｎ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
ｏ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
ｐ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブ；
ｑ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブ；
ｒ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
ｓ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
ｔ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
ｕ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
ｖ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；及び
ｘ）染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、６番染色体計数プローブから構成される群から選択することができる。
プローブ組み合わせは上記典型的サブ領域を標的とするプローブを含む組み合わせに限定されない。該当染色体領域を標的とする任意プローブを使用することができる。
典型的態様では、本発明のメラノーマ検出方法は皮膚生検サンプル等の皮膚サンプルを使用する。所定態様では、生体サンプルはホルマリン固定パラフィン包埋サンプルとすることができる。プローブセットのメンバーが標的染色体又は染色体領域／サブ領域と選択的にハイブリダイズする条件下で生体サンプルをハイブリダイズさせる。プローブは多くの場合には蛍光ラベルで標識する。所定態様では、プローブセットのハイブリダイゼーションを同時に実施し、即ちプローブを同一サンプルに同時にハイブリダイズさせる。プローブセットのハイブリダイゼーションパターンを評価し、病変に悪性メラノーマ細胞が存在するか否かを判定する。
本発明はメラノーマを診断するためのプローブの組み合わせ（２個、３個、又は４個のプローブの組み合わせ）と、このようなプローブ組み合わせを含むキットも提供する。組み合わせのメンバーであるプローブは６番染色体計数プローブ、１０番染色体計数プローブ、染色体領域６ｐ（例えば６ｐ２５）を標的とするプローブ、染色体領域６ｑ（例えば６ｑ２３）を標的とするプローブ、染色体領域１１ｑ（例えば１１ｑ１３）を標的とするプローブ、染色体領域１７ｑ（例えば１７ｑ２５）を標的とするプローブ、及び染色体領域１ｑ（例えば１ｑ３１）を標的とするプローブから構成される群から選択される。一般に、本発明のプローブ組み合わせはメラノーマに関して約０．２９未満のＤＦＩ値をもつ。多くの場合には、プローブ組み合わせは約０．２未満のＤＦＩをもつ。従って、本発明のプローブセットは上記に具体的に記載した２個、３個、又は４個のプローブの任意組み合わせである。
「メラノーマ」又は「皮膚メラノーマ」又は「悪性メラノーマ」なる用語は表皮、付属器構造（例えば毛嚢）、及び場合によっては真皮に通常存在し、更には粘膜、髄膜、結膜、及びブドウ膜等の皮膚以外の部位にも存在する色素細胞であるメラニン細胞の悪性新生物を意味する。皮膚メラノーマには悪性黒子型メラノーマ、表在拡大型メラノーマ（ＳＳＭ）、結節型メラノーマ、及び末端黒子型メラノーマ（ＡＭ）の少なくとも４種がある。皮膚メラノーマは一般に例えば表皮と真皮の境界部における単一メラニン細胞の増殖として開始する。細胞はまず水平に増殖し、数ミリ〜数センチの皮膚の１領域に沈降する。上記のように、大半の場合には、形質転換したメラニン細胞は色素産生量が増加するので、臨床医は患部を容易に検出することができる。
「メラニン細胞性病変」なる用語は良性、局所中等度悪性、又は悪性経過をとり得るメラニン細胞の蓄積を意味する。「メラニン細胞性病変」は「母斑」や「黒子」や「褐色細胞腫」等の良性メラニン細胞性新生物と、「メラノーマ」や「悪性青色母斑」等の悪性メラニン細胞性新生物の両者を包含する。
動物の「腫瘍」又は「癌」なる用語は無制御増殖、不死性、転移の可能性、急速増殖及び増殖率を含む非定型増殖又は形態等の特徴と、所定の特徴的形態特徴をもつ細胞の存在を意味する。多くの場合に、癌細胞は腫瘍形態となるが、動物の体内に単独で存在する場合もある。「腫瘍」は良性と悪性の両者の新生物を包含する。「新生」なる用語は良性と悪性の両者の非定型増殖を意味する。
本明細書で使用する「特異的にハイブリダイズする」、「特異的ハイブリダイゼーション」、及び「選択的にハイブリダイズする」なる用語は核酸分子がストリンジェント条件下で特定ヌクレオチド配列と優先的に結合、２本鎖化、又はハイブリダイズすることを意味する。「ストリンジェント条件」なる用語はプローブがそのターゲットサブ配列と優先的にハイブリダイズし、他の配列とハイブリダイズする程度が低いか又は全くハイブリダイズしない条件を意味する。（例えばアレイ、サザン又はノーザンハイブリダイゼーション等における）核酸ハイブリダイゼーションに関して「ストリンジェントハイブリダイゼーション」及び「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、各種環境パラメーター下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションの詳細な手引きは例えばＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈ．２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ” Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮＹ（「Ｔｉｊｓｓｅｎ」）に記載されている。一般に、高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件は規定イオン強度及びｐＨで特定配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは（規定イオン強度及びｐＨ下で）ターゲット配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である。超ストリンジェント条件は特定プローブのＴｍと等しくなるように選択される。サザン又はノーザンブロットでアレイ上又はフィルター上に１００個を上回る相補的残基をもつ相補的核酸のハイブリダイゼーションのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の１例は標準ハイブリダイゼーション溶液を使用して４２℃である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄ．）Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ、及び下記の詳細な説明参照）。
本明細書で使用する「核酸」なる用語は１本鎖又は２本鎖のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを意味する。この用語は参照核酸のように、所望目的のために同等又は改善された結合特性をもつ天然ヌクレオチドの既知アナログを含む核酸、即ちオリゴヌクレオチドを包含する。この用語は天然ヌクレオチドと同様に又は所望目的のために改善された速度で代謝される核酸も包含する。この用語は更に合成主鎖をもつ核酸様構造も包含する。本発明により提供されるＤＮＡ主鎖アナログとしてはホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３’−Ｎ−カルバメート、モルホリノカルバメート、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ６００，Ｂａｓｅｒｇａ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ編（ＮＹＡＳ １９９２）；Ｍｉｌｌｉｇａｎ（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１９２３−１９３７；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）参照。ＰＮＡはＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位等の非イオン性主鎖を含む。ホスホロチオエート結合はＷＯ９７／０３２１１；ＷＯ９６／３９１５４；Ｍａｔａ（１９９７）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４４：１８９−１９７に記載されている。この用語に包含される他の合成主鎖としてはメチル−ホスホネート結合又は交互メチルホスホネート及びホスホジエステル結合（Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：８６９２−８６９８）と、ベンジルホスホネート結合（Ｓａｍｓｔａｇ（１９９６）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ６：１５３−１５６）が挙げられる。核酸なる用語は遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドプライマー、プローブ及び増幅産物と同義に使用される。
「生体サンプル」又は「検体」なる用語はメラノーマをもつ疑いがあるか又はメラノーマをもつ患者から得られたサンプルを意味する。一般に、サンプルはメラノーマ細胞を含む疑いのある身体領域のホルマリン固定パラフィン包埋皮膚生検を含む。メラノーマをもつ疑いのある患者に加え、生体サンプルは更に、腫瘍が完全に除去されたという診断又は判断の確認のために、メラノーマをもつと診断されたことのある対象に由来するものでもよい（「断端陰性」）。更に、生体サンプルはこの組織に存在するメラニン細胞がメラノーマであるか母斑であるかを判断するためにリンパ節等の非皮膚組織に由来するものでもよい。生体サンプルは診断を明確にするために曖昧な診断をもつ患者に由来するものでもよい。サンプルは「パンチ」、「シェーブ」、掻爬、細針吸引物、センチネルリンパ節又は切除生検に由来するものでもよいし、あるいは、断端陰性を判断するために疑わしい病変を含む領域又は疑わしいかもしくは既知の病変の周囲の領域の他の切除片に由来するものでもよい。
緒言
本発明はメラノーマを選択的に検出するために使用することができる感度と特異性の高い染色体プローブセットの同定を一因とする。プローブセットは個々のプローブよりも高い感度と特異性が得られる。従って、本発明はこのようなプローブセットを使用するための方法及び組成物を提供する。プローブとは遺伝子座特異的プローブと、一般にセントロメア領域にハイブリダイズする染色体計数プローブを包含する。
染色体プローブ
本発明で使用するプローブはある程度メラノーマの疑いのあるメラニン細胞性腫瘍をもつ患者からの生体サンプルに存在する核酸とのハイブリダイゼーションに使用される。本発明の方法では通常、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用する。典型的態様では、プローブは蛍光ラベルで標識される。
「染色体プローブ」又は「染色体プローブ組成物」とは染色体のある領域と特異的にハイブリダイズする１個以上のポリヌクレオチドを意味する。プローブが結合できるターゲット配列は様々な長さとすることができ、一般に約７０，０００ヌクレオチド〜約８００，０００ヌクレオチドである。例えば１００，０００ヌクレオチド未満の領域や、１０，０００ヌクレオチド未満の領域とハイブリダイズする短いプローブも使用することができる。
特定染色体領域に対するプローブは例えば約５０〜約１，０００ヌクレオチド長のサイズの複数のポリヌクレオチドフラグメントを含むことができる。
染色体計数プローブ
染色体計数プローブは細胞中の特定染色体数を計数することが可能な任意プローブである。染色体計数プローブは一般に反復ＤＮＡ配列である特定染色体のセントロメア又はその近傍（「ペリセントロメア」と言う）の領域を一般に認識し、これと結合する。染色体のセントロメアは細胞分裂中の忠実な分離に必要であるため、一般に該当染色体実体に相当するとみなされる。特定遺伝子座に対応するＦＩＳＨシグナル数（コピー数）を対応するセントロメアのシグナル数と比較することにより、特定染色体領域が通常存在する完全染色体の減少又は増加（数的異常）からこの領域の欠失又は増幅を区別することができる。この比較を実施するための１つの方法は遺伝子座に相当するシグナル数をセントロメアに相当するシグナル数で割る方法である。比が１未満の場合には遺伝子座か減少又は欠失していると判断され、比が１よりも大きい場合には遺伝子座が増加又は増幅していると判断される。同様に、染色体内の増加又は減少のアンバランスを判定するために、同一染色体上（例えば染色体の２本の異なるアーム上）の２個の異なる遺伝子座を比較することもできる。
染色体のセントロメアプローブの代わりに、当業者に自明の通り、染色体アームプローブを使用して完全染色体減少又は増加を概算することもできる。しかし、このようなプローブのシグナル減少は必ずしも完全染色体の減少を意味しないので、このようなプローブは染色体計数ほど正確ではない。染色体計数プローブの例としてはＡｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，ＤｅｓＰｌａｉｎｅｓ，ＩＬ（旧Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）から市販されているＣＥＰ（登録商標）プローブ（例えばＣＥＰ（登録商標）１２及びＸ／Ｙプローブ）か挙げられる。
染色体計数プローブと、染色体領域又はサブ領域を標的とする遺伝子座特異的プローブは当業者が容易に作製することができ、あるいは、例えばＡｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）やＣｙｔｏｃｅｌｌ（Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から市販されている。このようなプローブは標準技術を使用して作製される。染色体プローブは例えば蛋白質核酸やクローン化ヒトＤＮＡ（例えばヒトＤＮＡ配列インサートを含むプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、及びＰ１人工染色体（ＰＡＣ））から作製することができる。該当領域はＰＣＲ増幅やクローニングにより得ることができる。あるいは、染色体プローブは合成により作製することができる。
遺伝子座特異的プローブ
本発明で使用することができるプローブとしては、染色体領域（例えば１ｑ、６ｐ、６ｑ、７ｑ、１１ｑ、１７ｑ、及び２０ｑ）又は染色体領域のサブ領域（例えば１ｑ２３、１ｑ３１、６ｐ２５、６ｑ２３、７ｑ３４、１１ｑ１３、１７ｑ２５、又は２０ｑ１３）と選択的にハイブリダイズするプローブが挙げられる。このようなプローブを遺伝子座特異的プローブとも言う。遺伝子座特異的プローブターゲットは少なくとも１００，０００ヌクレオチドを含むことが好ましい。遺伝子座特異的プローブはメラノーマが増加又は減少していることが分かっている染色体領域の特定遺伝子座と選択的に結合する。プローブはエキソン、イントロン、及び／又は調節配列（例えばプロモーター配列等）を含むコーディング領域又は非コーディング領域又はその両者を標的とすることができる。
特定遺伝子座のターゲティングが所望される場合には、標的遺伝子の全長にハイブリダイズするプローブが好ましいが、必ずしもそうでなくてもよい。所与サンプルの細胞で対照に比較してプローブに対するシグナル数が増加又は減少している場合には、夫々対応領域が増加又は減少していると判断される。所定態様では、遺伝子座特異的プローブはその遺伝子異常がメラノーマと相関する癌遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子とハイブリダイズするようにデザインすることができる。遺伝子座特異的プローブは例えば８ｑ２４、９ｐ２１、１７ｑ、及び２０ｑ１３等の染色体領域の遺伝子座とハイブリダイズすることができる。これらの領域を標的とする典型的な遺伝子座特異的プローブは夫々Ｃ−ＭＹＣ、Ｐ１６、ＨＥＲ２、及びＺＮＦ２１７に対するプローブである。
本発明で使用するプローブはメラノーマで増加又は減少している染色体アーム上の領域（本明細書では染色体領域とも言う）、例えば１７ｑ、１０ｑ、６ｐ、６ｑ、１ｑ、７ｑ、１１ｑ及び２０ｑを標的とする。増加又は減少は該当染色体アームを標的とする任意プローブを使用して決定することができる。多くの場合には、サブ領域（例えば１７ｑ２５、１０ｑ２３、６ｐ２５、６ｑ２３、１ｑ２３、１ｑ３１、７ｑ３４、１１ｑ１３又は２０ｑ１３）を標的とするプローブを利用する。本発明に関して、本明細書で染色体サブ領域に対するプローブと言う場合には該当染色体アームを表す。更に、本明細書で使用するサブ領域の表示は指定バンドと一般に両側の約１０メガ塩基のゲノム配列を含む。
プローブ選択法
単にメラノーマを検出することができるプローブセットを選択してもよいが、一般にはメラノーマと他の良性メラニン細胞性病変を区別できるものを選択する。従って、一般にはメラノーマと良性母斑を区別するための各種プローブセットのＤＦＩ値を測定するようにプローブセットの分析を実施する。
本発明の方法で使用するプローブセットは実施例に記載する原理を使用して選択することができる。プローブセット内の染色体プローブの組み合わせはメラノーマに関する感度、特異性、及び検出能により選択する。感度とは疾患（例えばメラノーマ）が存在する場合に試験（例えばＦＩＳＨ）がこれを検出する能力を意味する。より厳密には、感度は真陽性／（真陽性＋偽陰性）として定義される。高感度試験は偽陰性結果が少ないが、低感度試験は偽陰性結果が多い。他方、特異性とは疾患が存在しない場合に試験（例えばＦＩＳＨ）が陰性結果を与える能力を意味する。より厳密には、特異性は真陰性／（真陰性＋偽陽性）として定義される。高特異性試験は偽陽性結果が少ないが、低特異性試験は偽陽性結果が多い。
一般に、メラノーマの検出に関して感度と特異性の組み合わせが最高の染色体プローブセットを選択すべきである。プローブセットの感度と特異性の組み合わせは［（１−感度）２＋（１−特異性）２］１／２として定義される理想とのパラメーター距離（ＤＦＩ）により表すことができる。ＤＦＩ値は０〜１．４１４であり、０は感度１００％と特異性１００％のプローブセットに相当し、１．４１４は感度０％と特異性０％のプローブセットに相当する。本発明では、メラノーマ識別用に選択されたプローブセットは最大約０．２９のＤＦＩ値をもつ。一般にはＤＦＩ値が約０．２０未満のプローブセットのほうが良好な結果が得られる。
１セットで使用することができるプローブ数は制限されないが、所定態様では、（コンピューターイメージング技術を使用せずに）観察者により目視される１セット内のプローブ数は実用的理由から、例えばハイブリダイゼーション後に目視区別可能なシグナルを提供するユニークなフルオロフォア数により制限することができる。例えば、（例えば人間の目に赤、緑、水色、及び金色シグナルとして見える）一般に４又は５個のユニークなフルオロフォアを単一プローブセットで簡便に使用することができる。一般に、１セット内のプローブ数が増加するにつれてアッセイの感度は増加する。しかし、プローブの追加に伴って感度の増加は次第に少なくなり、所定点ではプローブセットにそれ以上プローブを追加してもアッセイの感度は有意に増加しなくなる（「収量逓減」）。１プローブセットのプローブ数を増加すると、アッセイの特異性が低下する場合もある。従って、本発明のプローブセットは一般に感度と特異性の最適バランスが得られるように必要に応じて２個、３個、又は４個の染色体プローブを含む。
個々のプローブはセット内の他のプローブを相補する能力に基づいて本発明のプローブセットに加えるように選択される。具体的には、所与メラノーマ内で同時に高頻度で変化しない染色体又は染色体サブ領域を標的にする。従って、プローブセットの各プローブは相補し合い、即ちセット内の他のプローブが識別できない場合にメラノーマを識別する。どのプローブが相補し合うかを判断する１つの方法は腫瘍検体群で最低のＤＦＩ値をもつ単一プローブを識別する方法である。その後、最初のプローブが識別できなかった腫瘍サンプルで他のプローブを試験し、最低測定ＤＦＩ値をもつプローブを最初のプローブと共にセットに加える。その後、所望ＤＦＩ値をもつ染色体プローブの完全なセットが得られるまでこれを繰返せばよい。
どのプローブが最良にメラノーマを検出できるかを判定するために使用することができる１つの方法は判別分析である。この方法は個々のプローブが正常検体に比較して試験検体（例えばメラノーマ）で統計的差異のある異常細胞百分率を検出できるか否かを評価する。染色体（又は遺伝子座）増加又は染色体（又は遺伝子座）減少を示す細胞の検出のどちらを使用してもメラニン細胞性病変をもつメラノーマ患者で新生細胞を識別することができる。しかし、ランダムなシグナルオーバーラップ及び／又はハイブリダイゼーション不良により正常細胞にアーチファクトとして染色体減少が生じる場合もある。皮膚生検を評価するために広く使用されているホルマリン固定パラフィン包埋材料切片では、切片化プロセスにおける核トランケーションにより染色体材料のアーチファクト減少が生じる場合もある。従って、染色体増加のほうが新生細胞の存在の確実な指標であることが多い。
プローブセットを選択する際には個々の染色体増減のカットオフ値を決定する必要がある。「カットオフ値」なる用語は染色体異常に関連するパラメーターの値であり、カットオフ値を上回る検体とカットオフ値を下回る検体の２群に検体集団を分割する値を意味する。例えば、パラメーターは遺伝子異常（例えばターゲット領域の増減）をもつ集団内の細胞の絶対数又は百分率とすることができる。特定プローブについて減少又は増加のある検体内の細胞の絶対数又は百分率がカットオフ値よりも高い場合には、サンプルはメラノーマに陽性であると判断される。
有用なプローブセットは多くの場合には、１ｑ２３、１ｑ３１、６ｐ２５、６ｑ２３、７ｑ３４、１１ｑ１３、１７ｑ２５、及び２０ｑ１３から構成される群から選択される染色体領域に対するプローブ、及び／又は６番及び１０番染色体の染色体計数プローブ（例えばＡｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｃ．から市販されているＣＥＰ（登録商標）６、及びＣＥＰ（登録商標）１０）を含む。このようなプローブセットはメラノーマの存在を検出し、メラノーマを良性検体から区別することができる。
メラノーマを検出及び／又はメラノーマを良性検体から区別することが可能なプローブセットは１ｑ２３、１ｑ３１、６ｐ２５、６ｑ２３、７ｑ３４、１１ｑ１３、１７ｑ２５、２０ｑ１３を標的とするプローブ、又は例えば６番もしくは１０番染色体のペリセントロメア領域に対する染色体計数プローブの群から選択される２個以上のプローブを含むことができる。所定態様では、プローブセットは、ａ）６ｐ２５に対するプローブと１０番染色体計数プローブ、ｂ）６ｐ２５に対するプローブと１１ｑ１３に対するプローブ、ｃ）６ｐ２５に対するプローブと６ｑ２３に対するプローブ、ｄ）６ｐ２５に対するプローブと２０ｑ１３に対するプローブ、ｅ）１０番染色体計数プローブと１ｑ３１に対するプローブ、ｆ）６ｐ２５に対するプローブと１ｑ３１に対するプローブ、ｇ）６ｑ２３に対するプローブと１ｑ３１に対するプローブ、ｈ）７ｑ３４に対するプローブと６ｐ２５に対するプローブ、ｉ）６ｑ２３に対するプローブと１ｑ２３に対するプローブ、ｊ）６ｑ２３に対するプローブと、６ｐ２５に対するプローブと、６番染色体計数プローブ、ｋ）６ｐ２５に対するプローブと、１ｑ３１に対するプローブと、１７ｑ２５に対するプローブ、ｌ）１１ｑ１３に対するプローブと、６ｐ２５に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ、ｍ）６ｐ２５に対するプローブと、１１ｑ１３に対するプローブと、１７ｑ２５に対するプローブ、ｎ）６ｐ２５に対するプローブと、１ｑ３１に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ、ｏ）６ｐ２５に対するプローブと、１ｑ３１に対するプローブと、１１ｑ１３に対するプローブ、ｐ）１ｑ３１に対するプローブと、１１ｑ１３に対するプローブと、１７ｑ２５に対するプローブ、ｑ）６ｑ２３に対するプローブと、６ｐ２５に対するプローブと、１１ｑ１３に対するプローブ、ｒ）２０ｑ１３に対するプローブと、７ｑ３４に対するプローブと、６ｐ２５に対するプローブ、ｓ）６ｐ２５に対するプローブと、６ｑ２３に対するプローブと、６番染色体計数プローブと、１０番染色体計数プローブ、ｕ）６ｐ２５に対するプローブと、１ｑ３１に対するプローブと、１１ｑ１３に対するプローブと、１７ｑ２５に対するプローブ、ｖ）６ｐ２５に対するプローブと、１ｑ３１に対するプローブと、１０番染色体計数プローブと、１７ｑ２５に対するプローブ、ｗ）１１ｑ１３に対するプローブと、１０番染色体計数プローブと、６ｑ２３に対するプローブと、６ｐ２５に対するプローブ、ｘ）６ｑ２３に対するプローブと、６ｐ２５に対するプローブと、１ｑ３１に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ、又はｙ）６ｑ２３に対するプローブと、６番染色体計数プローブと、６ｐ２５に対するプローブと、１１ｑ１３に対するプローブを含む。
プローブハイブリダイゼーション
プローブをその核酸ターゲットに特異的にハイブリダイズさせるための条件は一般に特定ハイブリッドを作製するための所与ハイブリダイゼーション法で利用可能な条件の組み合わせを含み、その条件は当業者が容易に決定することができる。このような条件は一般に制御下の温度、液相、及び染色体プローブとターゲットの接触を含む。ハイブリダイゼーション条件はプローブ濃度、ターゲット長、ターゲット及びプローブＧ−Ｃ含量、溶媒組成、温度、並びにインキュベーション時間等の多数の因子によって異なる。プローブをターゲットと接触させる前に少なくとも１段階の変性段階が必要である。あるいは、プローブと核酸ターゲットの両者を相互接触中に変性条件に付してもよいし、変性後にプローブを生体サンプルと接触させてもよい。その後、例えば２〜４×ＳＳＣとホルムアミドの約５０：５０容量比混合物の液相中で約２５〜約５５℃の温度で例えば約０．５〜約９６時間、又はより好ましくは約３２〜約４０℃の温度で約２〜約１６時間プローブ／サンプルをインキュベートすることによりハイブリダイゼーションを実施することができる。特異性を増すために、その開示内容を言及により本明細書に組込む米国特許第５，７５６，６９６号に記載されているような未標識ブロッキング核酸等のブロッキング剤を本発明の方法と併用してもよい。当業者に自明の通り、プローブをサンプル中に存在するその核酸ターゲットと特異的にハイブリダイズさせるために他の条件も容易に利用することができる。
適切なインキュベーション時間の完了後、染色体プローブとサンブルＤＮＡの非特異的結合を一連の洗浄により除去することができる。温度及び塩濃度は所望ストリンジェンシーに合わせて適切に選択される。必要なストリンジェンシーレベルは遺伝子配列に対する特定プローブ配列の複雑さにより異なり、既知遺伝子組成のサンブルとプローブを系統的にハイブリダイズさせることにより決定することができる。一般に、約６５〜約８０℃の温度で約０．２×〜２×ＳＳＣと約０．１％〜約１％の非イオン性界面活性剤（例えばＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ４０））を使用して高ストリンジェンシー洗浄を実施することができる。低ストリンジェンシー洗浄が必要な場合には、低温で塩濃度を増加して洗浄を実施することができる。
プローブハイブリダイゼーションパターンの検出
ハイブリダイゼーションプローブは当分野で公知の任意手段を使用して検出することができる。ラベル含有部分を染色体プローブと直接又は間接的に会合させることができる。「ラベル含有部分」又は「検出部分」なる用語は一般にそのターゲットとのハイブリダイゼーション後に該当プローブを検出できるように、染色体プローブと直接又は間接的に会合した１又は複数の分子群を意味する。ハイブリダイズした各プローブが検出時に相互に目視区別されるように、特定セット内のプローブ毎に異なるラベル含有部分を選択する。蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を利用し、染色体プローブを異なる蛍光ラベル含有部分で標識することが好ましい。特定波長の放射線を照射すると蛍光発光する有機分子であるフルオロフォアを染色体プローブに直接結合するのが一般的である。多数のフルオロフォアがＤＮＡに適した反応形態で市販されている。
フルオロフォアと核酸プローブの結合は当分野で周知であり、利用可能な任意方法により実施することができる。フルオロフォアを例えば特定ヌクレオチドと共有結合させ、ニック翻訳、ランダムプライミング、ＰＣＲ標識等の標準技術を使用して標識ヌクレオチドをプローブに組込むことができる。あるいは、トランスアミノ化しておいたプローブのデオキシシチジンヌクレオチドにリンカーを介してフルオロフォアを共有結合させることができる。プローブの標識方法はいずれも言及により本明細書に組込む米国特許第５，４９１，２２４号とＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（２００２），Ｙ．−Ｓ．Ｆａｎ，Ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ２，“Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｔａｒｇｅｔｓ，”Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，ｐ．２１−４０，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓに記載されている。
プローブを標識するために使用することができる典型的なフルオロフォアとしては、ＴＥＸＡＳ ＲＥＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ＣＡＳＣＡＤＥブルーアセチルアジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｄｅｓ Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ）及びＳｐｅｃｔｒｕｍＧｏｌｄ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）が挙げられる。
当業者に自明の通り、ラベル含有部分としてフルオロフォアの代わりに他の物質又は色素も使用することができる。発光物質としては、例えば放射性発光、化学発光、生物発光及び燐光ラベル含有部分が挙げられる。あるいは、間接手段により可視化される検出部分も使用できる。例えば、当分野で公知の日常的方法を使用してプローブをビオチン又はジゴキシゲニンで標識した後に、検出のために更に処理することができる。ビオチン含有プローブの可視化はその後、検出可能なマーカーと共役したアビジンとの結合により実施することができる。検出可能なマーカーはフルオロフォアとすることができ、その場合には、プローブの可視化と判別はＦＩＳＨについて上述したように実施することができる。
あるいは、不溶性呈色物の生成に適した基質とラベル部分の酵素反応により、ターゲット領域にハイブリダイズした染色体プローブを可視化することもできる。別個のラベル部分の選択により各プローブをセット内の他のプローブから判別することができる。その後、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）又は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と共役したアビジンと適切な基質と共にインキュベーションすることによりセット内のビオチン含有プローブを検出することができる。アルカリホスファターゼの基質としては５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートとニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）が使用され、ＨＲＰの基質としてはジアミノベンジジンが使用される。
フルオロフォアで標識したプローブ又はプローブ組成物を使用する態様では、検出法は蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、又はプローブハイブリダイゼーションを測定するための他の手段を利用することができる。複数フルオロフォアを観察するために適切な任意顕微鏡撮像法を本発明の方法と併用することができる。蛍光顕微鏡を使用する場合には、各フルオロフォアの励起に適した光線下で適当な１又は複数のフィルターを使用してハイブリダイズしたサンプルを観察することができる。あるいは、ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ、Ｂｉｏ Ｖｉｅｗ又はＡｐｐｌｉｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ等の自動ディジタルイメージングシステムを使用してもよい。
メラノーマに関する患者のスクリーニング及び診断
本発明の検出方法はメラノーマをもつか又はメラノーマをもつ疑いのある対象から生体サンプルを採取する段階を含む。生体サンプルは一般にメラニン細胞性病変を含む組織サンプルである。多くの場合に、生体サンプルはホルマリン固定パラフィン包埋サンプルである。サンプルを染色体プローブと接触させ、サンプル中にメラノーマが存在する場合には、サンプルに存在するその核酸ターゲットとプローブを特異的にハイブリダイズさせる条件下でメラノーマを選択的に検出する。セットのプローブは同時にハイブリダイズさせてもよいし、順次ハイブリダイズさせてもよく、各ハイブリダイゼーションの結果をディジタル画像化し、プローブを除去した後、サンプルを残りのプローブとハイブリダイズさせることができる。複数のプローブセットをこのようにサンプルにハイブリダイズさせることもできる。
生体サンプルは、例えば診断を確認するためもしくは断端陰性を確定するため、又はリンパ節等の他の組織でメラノーマ細胞を検出するために、メラノーマをもつ疑いのある患者又はメラノーマをもつと診断された患者に由来するものとすることができる。生体サンプルは診断を明確にするために曖昧な診断をもつ患者に由来するものでもよい。生体サンプルは診断を確認するために組織病理学的に良性の病変をもつ対象に由来するものでもよい。生体サンプルは当分野の多数の方法の任意のものを使用して採取することができる。潜在的メラニン細胞性病変を含む生体サンプルの例としては、パンチ生検、シェーブ生検、細針吸引物、もしくは外科切除生検等の切除皮膚生検；又はリンパ節組織、粘膜、髄膜、結膜、もしくはブドウ膜等の皮膚以外の組織に由来する生検から得られるものが挙げられる。他の態様では、生体サンプルは皮膚の該当領域のシェービング、除毛、又は剥離により採取することができる。
上記のように、生体サンプルをホルムアルデヒド等の固定剤で処理し、パラフィン包埋し、本発明の方法で使用するために切片化することができる。あるいは、新鮮又は凍結組織をガラススライドに押し付け、無傷の核を含み且つ切片化のトランケーションアーチファクトのない細胞単層（タッチ標本と言う）を形成してもよい。これらの細胞を例えば１００％エタノールや３：１メタノール：酢酸等のアルコール溶液で固定すればよい。パラフィン包埋検体の厚い切片から核を抽出し、トランケーションアーチファクトを減らし、外部包埋材料をなくすこともできる。一般に、生体サンプルが得られたら、回収し、当分野で公知の標準方法を使用してハイブリダイゼーション前に処理する。このような処理は一般にプロテアーゼ処理とホルムアルデヒド等のアルデヒド溶液で更に固定する段階を含む。
サンプルのプレスクリーニング
検出に先立ち、その開示内容を言及により本明細書に組込む米国特許第６，１７４，６８１号に開示されているような見かけの細胞学的異常に基づいて場合により細胞サンプルを予備選択してもよい。予備選択は疑わしい細胞を識別することにより、スクリーニングをこれらの細胞に絞ることができる。予備選択はスクリーニングを迅速にすることができ、陽性結果を見落とさない確率が増加する。予備選択中には、生体サンプルからの細胞を顕微鏡スライドに載せ、一般に形成異常細胞及び新生細胞に関連する細胞学的異常を目視検査する。このような異常としては、核寸法、核形状、及び核染色の異常が挙げられ、通常はプローブとそのターゲットＤＮＡのハイブリダイゼーション後にヨウ化プロピジウムや４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）等の核酸染色試薬又は色素による核の対比染色により評価される。一般に、新生細胞は核が拡大し、不規則形状となり、及び／又は斑状染色パターンを示す。ヨウ化プロピジウムは一般に約０．４μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌの濃度で使用され、６１４ｎｍの発光ピーク波長で観測可能な赤色蛍光ＤＮＡ特異的色素である。ＤＡＰＩは一般に約１２５ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用され、４５２ｎｍの発光ピーク波長で観測可能な青色蛍光ＤＮＡ特異的染色試薬である。この場合には、検出に予備選択された細胞のみの染色体減少及び／又は増加を計数する。染色体減少及び／又は増加を評価するためには、少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも３０〜４０個のオーダーの予備選択細胞を選択することが好ましい。組織切片上の疑わしい領域の予備選択はＨ＆ＥやＰＡＰ染色等の従来手段により染色した連続切片で実施することができ、疑わしい領域に病理学者又は他の熟練技術者が印を付けることができる。その後、同一領域をＦＩＳＨで染色した連続切片上で位置付けし、この領域内で核を計数する。印を付けた領域内で、計数は上記のような異常特徴を示す核に限定することができる。
あるいは、細胞学的又は組織学的特徴とは無関係に検出用細胞を選択してもよい。例えば、顕微鏡スライド上の１又は複数の領域内のオーバーラップしない全細胞を染色体減少及び／又は増加について評価することができる。別の例として、顕微鏡スライド上に連続して出現する少なくとも約５０個、より好ましくは少なくとも約１００個のオーダーのスライド上の細胞（例えば形態変化を示す細胞）を選択して染色体減少及び／又は増加について評価することができる。
ハイブリダイゼーションパターン
「ターゲット領域」又は「核酸ターゲット」なる用語はその減少及び／又は増加がメラノーマの存在の指標となる特定染色体位置に存在するヌクレオチド配列を意味する。「ターゲット領域」又は「核酸ターゲット」は本発明のプローブにより特異的に認識され、本発明の方法で本発明のプローブとハイブリダイズする。
染色体減少及び／又は増加の評価に選択した細胞について染色体プローブセットとターゲット領域のハイブリダイゼーションパターンを検出し、記録する。染色体プローブの各々により発生した特定シグナルの有無によりハイブリダイゼーションを検出する。「ハイブリダイゼーションパターン」なる用語は選択された細胞サンプル全体で各プローブについて、均等にマッチする対照サンプルにおける染色体数に対するこのような評価に選択された細胞の染色体減少／増加の定量を意味する。減少／増加の定量は同一又は異なる染色体上のある遺伝子座と別の遺伝子座の比を評価する測定を含むことができる。各プローブとのハイブリダイゼーションを示す領域の数により各細胞内のターゲット領域数を測定したら、相対染色体増加及び／又は減少を定量することができる。各プローブの相対増加又は減少は各細胞内の別個のプローブシグナル数を正常細胞（即ちコピー数が２である細胞）で予想される数と比較することにより測定される。ケラチン生成細胞、繊維芽細胞、及びリンパ球等のサンプル中の非新生細胞を参照正常細胞として使用することができる。正常プローブシグナル数よりも多い場合に増加とみなし、正常数よりも少ない場合に減少とみなす。あるいは、細胞が異常であるとみなすために、細胞１個プローブ１個当たり最少数のシグナルが必要な場合もある（例えばシグナル５個以上）。減少の場合と同様に、細胞が異常であるとみなすために、プローブ１個当たり最大数のシグナルが必要な場合もある（例えばシグナル０、又はシグナル１個以下）。
少なくとも１カ所の増加及び／又は減少を示す細胞の百分率を遺伝子座毎に記録する。本発明のプローブセットにより識別される遺伝子異常の少なくとも１カ所が細胞に存在する場合に、この細胞は異常であるとみなす。夫々増加又は減少を示す細胞の百分率がアッセイで使用する任意プローブのカットオフ値を上回る場合に、サンプルは増加又は減少に陽性であると言うことができる。あるいは、細胞が異常であるとみなすために２カ所以上の遺伝子異常が必要な場合もあり、特異性を増す効果がある。例えば、増加がメラノーマ悪性腫瘍又は前駆病変の指標であるとき、サンプルは例えば少なくとも２カ所以上のプローブ含有領域の増加を示す細胞を少なくとも４個含んでいる場合に陽性であるとみなす。
診断及び／又は予後用プローブ組み合わせ及びキット
本発明はメラノーマを検出するために使用することができる特異性と感度の高いプローブ組み合わせと、診断、研究、及び予後用キットを含む。これらのプローブ組み合わせは一般に約０．２９未満、多くの場合には約０．２０未満のＤＦＩをもつ。キットはプローブセットを含み、更に緩衝液等の試薬を含むことができる。キットは本発明の方法を実施するための手順（即ちプロトコール）を含む説明書を含むことができる。説明書は一般に文書又は印刷物を含むが、これらに限定されない。このような説明書を記憶し、エンドユーザーに伝達することが可能な任意媒体が本発明により意図される。このような媒体としては限定されないが、電子記憶媒体（例えば磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えばＣＤＲＯＭ）等が挙げられる。このような媒体はこのような説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むものでもよい。
プローブ選択
ＣＧＨデータベース。プローブ選択の基準としたＣＧＨデータはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏで取得し、先に文献に記載している（Ｂａｓｔｉａｎら，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１６３：１７６５−７０，２００３）。データは原発性皮膚メラノーマ検体１３６個（表在拡大型メラノーマ（ＳＳＭ）６３個、悪性黒子型メラノーマ（ＬＭＭ）３０個、末端黒子型メラノーマ（ＡＬＭ）２３個、結節型メラノーマ（ＮＭ）４個、分類不能（ＮＣ）１０個、及び神経内に発生するメラノーマ６個）と、良性母斑検体５３個（青色母斑１９個、先天性母斑７個、スピッツ母斑２７個）から取得した。（染色体Ｘ及びＹを除く）１ｐテロメア〜２２ｑテロメアのゲノムを染色体のギムザバンドパターンに従って５７１個の「ビン」に分割し、各ビンに対応するＣＧＨ比（腫瘍と対照の蛍光強度比）が染色体増加（比＞１．２）及び減少（比＜０．８）を反映するものと解釈した。これらの閾値は先に文献に記載したように正常ＤＮＡ間のハイブリダイゼーション比に基づいて決定した（Ｂａｓｔｉａｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．；５８：２１７０−５，１９９８）。増減によりメラノーマを識別するビン毎に、母斑とメラノーマを区別するための感度、特異性及びＤＦＩ値を計算した。母斑をメラノーマから区別するための最良のビン組み合わせを決定するために、４個までの組み合わせでビンを試験し、組み合わせ毎に感度、特異性及びＤＦＩ値を計算した。
ＦＩＳＨプローブセット
８個のユニークなプローブセットでＦＩＳＨを実施した。各プローブセットはＣＧＨデータ解析（上記参照）から性能良好と判定されたプローブ組み合わせ（低ＤＦＩ値）で優勢であった染色体のセントロメアもしくは特異的遺伝子座に特異的な遺伝子座特異的識別子又は染色体計数プローブ３又は４個から構成した（表１）。染色体計数プローブはこれらの染色体（例えば９番染色体の９ｐ２１）上の対応する遺伝子座特異的識別子の対立遺伝子増減又はこれらの染色体の数的異常を判定するために加えた。
ＬＳＩ（登録商標）１７ｑ２５（ＴＫ１）、ＬＳＩ（登録商標）６ｐ２５（ＲＲＥＢ１）、ＬＳＩ（登録商標）７ｑ３４（ＢＲＡＦ）、ＬＳＩ（登録商標）ＬＰＬ（８ｐ２２）、ＬＳＩ（登録商標）１ｑ３１（ＣＯＸ２）、及びＬＳＩ（登録商標）１ｑ２３（ＮＴＲＫ１）プローブを除き、ＬＳＩ（登録商標）及びＣＥＰ（登録商標）プローブはＡｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ａｂｂｏｔｔｍｏｌｅｃｕｌａｒ．ｃｏｍ）から市販されているが、ＬＳＩ（登録商標）ｐ１６（９ｐ２１）とＬＳＩ（登録商標）２０ｑ１３はＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ（登録商標）で標識したものしか市販されていない。ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ（登録商標）ラベルの代わりに、核酸出発材料をトランスアミノ化した後に夫々Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲの商標）と５−（及び６−）−カルボキシローダミン６Ｇ（金色）を使用して化学標識した。トランスアミノ化及び標識法は言及により本明細書に組込むＢｉｔｔｎｅｒら，米国特許第５，４９１，２２４号に記載されている。
ＬＳＩ（登録商標）１ｑ３１（ＣＯＸ２）プローブは５個のＢＡＣクローン（識別番号ＲＰＣＩ−１１−７０Ｎ１０，ＲＰＣＩ−１１−８０９Ｆ１１，ＲＰＣＩ−１１−１０４Ｂ２３，ＲＰＣＩ−１１−４５７Ｌ１０，ＲＰＣＩ−１１−３３９Ｉ２）から作製した。ＬＳＩ（登録商標）１７ｑ２５（ＴＫ１）プローブは２個のＢＡＣクローン（識別番号ＲＰＣＩ１１−２１９ｇ１７，ＲＰＣＩ１１−１５３ａ２３）から作製した。ＬＳＩ（登録商標）６ｐ２５（ＲＲＥＢ１）は２個のＢＡＣクローン（識別番号ＲＰＣＩ１１−４０５ｏ１０，ＲＰＣＩ１１−６１ｏ１）から作製した。ＬＳＩ（登録商標）７ｑ３４（ＢＲＡＦ）は２個のＢＡＣクローン（識別番号ＲＰＣＩ１１−８３７ｇ３，ＣＩＴＤ−２５１６ｊ１２）から作製した。ＬＳＩ（登録商標）ＬＰＬ（８ｐ２２）は２個のクローン（識別番号６７−ｏ２１，ＣＴＤ−２２８６−Ｌ９）から作製した。ＬＳＩ（登録商標）１ｑ２３（ＮＴＲＫ１）は２個のＢＡＣクローン（識別番号ＲＰＣＩ１１−１０７ｄ１６，ＲＰＣＩ１１−３５６ｊ７）から作製した。クローンはＢＡＣ Ｐａｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。プローブをトランスアミノ化した後、テキサスレッド（赤）、６−［フルオレセイン５−（及び−６）−カルボキサミド］ヘキサン酸スクシンイミジルエステル（緑）、５−（及び６−）−カルボキシローダミン６Ｇスクシンイミジルエステル（金色）又は５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステルを使用して標識した。
試験集団及び分析用サンプルの作製
試験はマイクロ組織アレイに集約したメラノーマ８６個及び良性母斑３１個の検体と、メラノーマ９４個及び良性母斑９５個のＦＦＰＥ皮膚生検検体に由来する切片で実施した。
組織生検検体を含むパラフィンブロックを５μｍ厚に切断し、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ（登録商標）正荷電スライド（ＴｈｅｒｍｏＳｈａｎｄｏｎ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）にマウントした。全スライドを５６℃で一晩乾燥して組織をスライドに固定した後、室温で保存した。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに備え、３回交換して５分ずつＨｅｍｏ−Ｄｅ（登録商標）Ｓｏｌｖｅｎｔ ａｎｄ Ｃｌｅａｒｉｎｇ Ａｇｅｎｔ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓａｆｅｔｙ Ｓｏｌｖｅｎｔｓ，Ｋｅｌｌｅｒ，ＴＸ）に浸した後に、無水エタノールで１分ずつ２回リンスすることによりアレイ検体スライドを脱パラフィン処理した。乾燥後、４５％ギ酸／０．３％ Ｈ２Ｏ２で１５分間処理した後に３分間水でリンスすることにより検体を更にｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに備えた。次にサンプルを８０℃のＶｙｓｉｓ Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｃ）に１０分間浸した後、水で３分間リンスした。次にスライドを３７℃のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液（３５μｇプロテイナーゼＫ／ｍｌバッファー；Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｃ．）に１０分間浸し、０．０１Ｎ ＨＣｌに３分間浸し、水で３分間リンスし、７０％、８５％、及び１００％エタノールで１分ずつ脱水し、乾燥させた。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに備え、３回交換して５分ずつＨｅｍｏ−Ｄｅ（登録商標）Ｓｏｌｖｅｎｔ ａｎｄ Ｃｌｅａｒｉｎｇ Ａｇｅｎｔ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓａｆｅｔｙ Ｓｏｌｖｅｎｔｓ，Ｋｅｌｌｅｒ，ＴＸ）を浸した後に、無水エタノールで１分ずつ２回リンスすることにより組織切片を脱パラフィン処理した。乾燥後、８０℃の１×ＳＳＣ ｐＨ６．３で３５分間処理することにより検体を更にｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに備え、水で３分間リンスした。次にスライドを３７℃のＰｒｏｔｅａｓｅ溶液（４ｍｇプロテアーゼ／ｍｌ ０．２Ｎ ＨＣｌ）に１５分間浸し、水で３分間リンスし、７０％、８５％、及び１００％エタノールで１分ずつ脱水し、乾燥させた。
ＦＩＳＨハイブリダイゼーション
作製した検体スライドをＨＹＢｒｉｔｅ（登録商標）自動共変性オーブン（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｃ）でＦＩＳＨプローブ溶液とハイブリダイズさせた。スライドをオーブン表面に載せ、プローブ溶液を組織切片（一般に１０μｌ）に添加し、カバースリップをプローブ溶液に被せ、カバースリップの縁部をラバーセメントでスライドにシールした。オーブン共変性／ハイブリダイゼーションサイクルを７３℃で５分間変性及び３７℃で１６〜１８時間ハイブリダイゼーションに設定した。ハイブリダイゼーション後、スライドをＨＹＢｒｉｔｅから取り出し、ラバーセメントを除去した。スライドを室温の２×ＳＳＣ（ＳＳＣ＝０．３Ｍ ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸ナトリウム）／０．３％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（ＮＰ４０；Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｃ．）に２〜１０分間浸し、カバースリップを除去した。次にスライドを７３℃ ２×ＳＳＣ／０．３％ ＮＰ４０に２分間浸し、非特異的に結合したプローブを除去し、暗所で乾燥させた。ＤＡＰＩ Ｉ褪色防止液（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｃ．）を検体に加え、核を可視化した。
ＦＩＳＨシグナルの計数
ＤＡＰＩ対比染色剤、ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ（登録商標）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｏｌｄ（登録商標）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ（登録商標）、及びＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ（登録商標）の単一帯域フィルターを装着したエピ蛍光顕微鏡でスライドを分析した。患者の臨床又は組織学的所見を知らされずにＦＩＳＨシグナル計数を実施した。プローブセットＩ〜Ｖは組織マイクロアレイとハイブリダイズさせ、１検体当たり４０個の細胞を分析した。プローブセットＶＩ〜ＶＩＩＩは検体切片とハイブリダイズさせ、１検体当たり３０個の細胞を分析した。細胞密度の低い検体では、データ解析に最低２０個の核を使用する必要があった。
計数データの解析
検体内の各細胞核に記録されたシグナルのＦＩＳＨ数を使用して対応する遺伝子座を正常（常染色体上の遺伝子座に２シグナル）、減少による異常（１又は０シグナル）、又は増加による異常（＞２シグナル）に分類することができる。数個のパラメーターを検体内の異常遺伝子座増減の尺度として定義した。
検体内で計数された細胞の百分率に基づくパラメーター：
％増加：１）単一遺伝子座では、％増加はこの遺伝子座に対応する＞２シグナルの細胞の百分率である。
２）ある遺伝子座（遺伝子座１）が別の遺伝子座（遺伝子座２）に比較して増加している場合には、増加は遺伝子座１シグナルが遺伝子座２シグナルよりも多い細胞の百分率である。
％減少：１）単一遺伝子座では、％減少はこの遺伝子座に対応する＜２シグナルの細胞の百分率である。
２）ある遺伝子座（遺伝子座１）が別の遺伝子座（遺伝子座２）に比較して減少している場合（例えばＭＹＢ／ＣＥＰ６）には、減少は遺伝子座１（例えばＭＹＢ）シグナルが遺伝子座２（例えばＣＥＰ６）シグナルよりも少ない細胞の百分率である。
％異常：１）単一遺伝子座では、％異常はこの遺伝子座に対応する＞２シグナル又は＜２シグナルの細胞の百分率である。
２）２個の遺伝子座（遺伝子座１と遺伝子座２）のバランスが異常である場合には、異常は遺伝子座１シグナル数が遺伝子座２シグナル数と等しくない細胞の百分率である。
単一検体内で計数された全細胞の平均に基づくパラメーター：
平均遺伝子座コピー数：単一遺伝子座では、平均コピー数はこの遺伝子座に対応するシグナル数を全計数細胞で合計し、計数細胞数で割った値である。
平均遺伝子座比：２個の遺伝子座の比（遺伝子座１／遺伝子座２）（例えば表６に示すＭＹＢ／ＣＥＰ６）では、平均遺伝子座比は全計数細胞の遺伝子座１（例えばＭＹＢ）シグナル数の合計を全計数細胞の遺伝子座２（例えばＣＥＰ６）シグナル数の合計で割った値である。
上記５個のパラメーターの値を検体毎に各遺伝子座と関連遺伝子座対（例えば６ｑ２３（ＭＹＢ）とＣＥＰ６のように同一染色体上の遺伝子座）について集計し、計数に不十分なシグナル品質の検体を除く母斑及びメラノーマ検体群について各パラメーターの平均（ｘ）と標準偏差（ｓ）を計算した。
上記５個のパラメーターのうちの１個により測定される特定遺伝子座異常がメラノーマをもつ患者群に由来するサンプルとメラノーマを示さない患者群に由来するサンプルを区別する識別能の尺度として、（ｘ１−ｘ２）２／（ｓ１ ２＋ｓ２ ２）として定義される判別値（ＤＶ）を使用した。前記式中、ｘ１及びｓ１はメラノーマ検体群の特定遺伝子座パラメーターの平均（ｘ）及び標準偏差（ｓ）であり、ｘ２及びｓ２は良性母斑検体群のこのパラメーターの平均及び標準偏差である。ＤＶ値が大きいほど、２つの患者群を区別する識別能が高い。別の判別尺度として、スチューデントのｔ検定を使用し、母斑検体群とメラノーマ検体群の差が統計的に有意であるか否か（確率＜０．０５を有意とみなした）を判定するために、両群間で各パラメーターの測定値を比較した。
１７個の遺伝子座の各々について各種遺伝子座パラメーターにカットオフを適用することにより感度と特異性を計算した。％増加、％減少、及び％異常のパラメーターでは、各パラメーターの値がカットオフ値を上回る場合に検体は特定遺伝子座に陽性であるとみなした。平均遺伝子座コピー数と平均遺伝子座比のパラメーターでは、カットオフ値を適用し、１）コピー数もしくは比が異常に高い（表６に比増加で示す）か、２）コピー数もしくは比が異常に低い（表６に比減少で示す）か、又は３）１）と２）の両方であるかを区別することができ、１）ではパラメーター値がカットオフ値よりも大きい場合に陽性であると判定し、２）ではパラメーター値がカットオフ値よりも小さい場合に陽性であると判定した。なお、１）と２）のカットオフ値は同一でなくてもよい。
特定診断をもつ検体を検出するための感度は陽性群における検体の割合に等しかった。計数に十分な品質のＦＩＳＨシグナルをもつ細胞を少なくとも２０個得られなかった検体は計算から除外した。同一基準を使用して陽性であった対照群検体（偽陽性）の割合を１から引いた値として対照群に対する感度を計算した。単一プローブでは、１％の増分で０〜１００％の異常細胞のカットオフ値について感度、特異性及びＤＦＩを計算した。感度と特異性の両者を加味した「理想値との差」（ＤＦＩ）パラメーターを使用して各プローブ又はプローブ組み合わせの相対性能を評価した。
プローブ組み合わせでは、各々に選択したパラメーターにより測定した場合に各遺伝子座に異なるカットオフ値をもたせることができる２種の異なる方法によりカットオフを適用した。プローブ組み合わせの標的遺伝子座のいずれかが夫々のカットオフに陽性であるならば、検体を陽性とみなした。１％の増分で０〜１００％の異常細胞の個々のカットオフ値の並べ替え分析は３個以上のプローブの組み合わせには（過度の計算時間が必要となるため）実際的でなかったので、まず良性母斑検体群の遺伝子座パラメーターの平均と標準偏差に基づいてカットオフを計算した。ｘ＋ｎ＊ｓ（式中、ｘ及びｓは母斑検体群における特定遺伝子座特異的パラメーターの平均と標準偏差であり、ｎは一般に０．１の増分で−１〜３の乗数である）としてカットオフを生成した。プローブ組み合わせでは、ｎを同一値とした以外は組み合わせにおける各プローブ及びパラメーターに夫々のｘ及びｓを使用してカットオフ値を計算した。悪性検体と良性検体を区別するための最良のカットオフ値を見出すために、ｎの最小値（例えば−１）についてカットオフ値を計算した後、これらのカットオフ値に基づいて感度、特異性及びＤＦＩ値を計算し、ｎを（例えば０．１ずつ）増加させ、ｎの最大値（例えば３）に達するまで計算を繰返した。この手順により、母斑群における異常レベルと変動度に基づいて各プローブに調整したカットオフ値を得た。第一近似では、ｘとｓの公倍数に基づいてカットオフを求め、ｎの各値で組み合わせにおける各プローブ及びパラメーターについて母斑群に対する類似の特異性（パラメーター値の正規分布をとる）を設定する。より良好な性能のプローブ組み合わせを見出すために、各カットオフ又はカットオフ値セットのプローブ及びプローブ組み合わせをＤＦＩ最低値から最高値まで並べ替えた。第２の方法により最高性能のプローブ組み合わせの最適カットオフ値（最低ＤＦＩ値）を更に改善した。この方法では、第一の方法により設定した最適カットオフを挟む狭いカットオフ範囲で増分を小さくしてカットオフを独立して変動させた。
上記カットオフ範囲で４個のプローブの組み合わせまでの可能な全プローブ組み合わせについて感度、特異性及びＤＦＩ値を計算することにより、プローブ相補性を評価した。異常を測定するための５個の異なるパラメーターを使用して各プローブも試験した。試験した該当パラメーターを表２〜６に示す。２個のプローブを併用したほうが個別に使用するよりも低いＤＦＩ値を達成できる場合に２個のプローブは相補する。ランダムイベントの組み合わせによりＤＦＩ値が低下する可能性を減らすと共に、計算時間を短縮するために、一般に、これらの計算では判別分析（表３）でｐ値が０．０５未満のプローブのみを使用した。試験したカットオフ値の範囲（上記参照）で特定プローブ及びパラメーター又はプローブ組み合わせについて１−特異性に対して感度をプロットすることにより、受信者操作特性（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ：ＲＯＣ）グラフを作成した。プローブ組み合わせではカットオフ値を独立して変動させるため、各特異性値に複数の感度値を生じるので、各特異性のカットオフ値の最適組み合わせに相当する各特異性値の最高感度値のみをプロットした。曲線の下の面積（面積が大きいほど性能は良好）又はグラフ上の点（０，１）（特異性１００％，感度１００％）までの最接近距離によりこれらの曲線からプローブ又はプローブ組み合わせの相対性能を評価することができる。なお、曲線上の任意点から点（０，１）までの距離はＤＦＩ値に等しく、ＤＦＩ値の低いプローブ組み合わせのほうがＤＦＩ値の高いものよりも性能が良好である。特定プローブ組み合わせで最低ＤＦＩ値に結び付けられるカットオフがこの組み合わせの最適カットオフである。しかし、用途によっては、感度と特異性の相対臨床重要性を考慮した後に、ＤＦＩ値が低めのＲＯＣ曲線上の点を選択してもよい。例えば、偽陽性率が高くてもできるだけ多くの癌を識別するほうが重要である場合には、低感度、高特異性且つ低ＤＦＩの曲線上の点よりも、やや高感度、低特異性且つ高ＤＦＩの曲線上の点を選択することができる。
結果
ＣＧＨデータベース解析とＦＩＳＨ用プローブの選択。ＣＧＨデータを使用してＦＩＳＨプローブ開発用遺伝子座を同定した。遺伝子座を同定する第１段階は、メラノーマ検体１３６個と良性母斑検体５６個に関して１ｐ〜２２ｑのゲノムの５７１個のビンの各々で感度、特異性及びＤＦＩ値を計算することであった。特異性はほぼ全遺伝子座で１００％であったので、感度のみをビン数に対して図１Ａ（減少）、Ｂ（増加）及びＣ（増幅）にプロットする。メラノーマ検出感度が最高の遺伝子座としては、減少については１ｐ２１、３ｑ２９、６ｑ２５．３、８ｐ２３、９ｐ２１、９ｑ２１．１、１０ｐ１５、１０ｑ２３．３、１１ｑ２５、１３ｑ３４、１６ｑ２４、及び１７ｐｔｅｒが挙げられ、増加については１ｑ２２、３ｐ２１．３、６ｐ２５．３、７ｐ２１、７ｑ３３、８ｑ２４．２、１５ｑ２６、１７ｑ２５、及び２０ｑ１３．３が挙げられ、増幅については５ｐ１５．３、１１ｑ１３．２、及び２２ｑ１３．１が挙げられる。増加及び減少領域は染色体全体又は染色体アームを含む時点で広いことが多く、ＦＩＳＨプローブ配置は重要ではないこと、即ち隣接バンドのＦＩＳＨプローブでも異常の検出に通常は類似の効率が得られることが分かった。
セントロメアの両側の非反復配列の状態からセントロメア状態を評価した。ＣＧＨデータは減少についてはセントロメア３、６、９及び１０を含み、増加についてはセントロメア１、６、７、８及び２０を含んでいたことから、セントロメアは高いメラノーマ検出感度をもつと予測された。
ＦＩＳＨプローブ開発用遺伝子座を同定する第２段階は、異なる遺伝子座が悪性腫瘍の検出のために相補する能力（即ち併用遺伝子座の感度が遺伝子座の個々の感度よりも高い）を試験することであった。このために、上記遺伝子座の２個、３個及び４個の可能な全組み合わせについて感度、特異性及びＤＦＩ値を計算した。表７はＣＧＨデータベースの１３６個のメラノーマ検体で最低ＤＦＩ値をもつ遺伝子座及び遺伝子座組み合わせの感度とＤＦＩ値を示す。単一遺伝子座ではアンバランス（増加、減少、又は増幅）、増加、減少、又は増幅に関する感度とＤＦＩ値を表示する。遺伝子座組み合わせでは、アンバランスに関する感度とＤＦＩ値のみを表示する。最低ＤＦＩ値（ＦＩＳＨ）をもつ個々の遺伝子座及び遺伝子座組み合わせを最低から最高ＤＦＩ値の順に表６に表示する。最低ＤＦＩ値をもつ組み合わせで最も出現頻度の高い１４個の遺伝子座をＴＭＡでのＦＩＳＨによる評価に選択し、表１のプローブセットＩ〜Ｖを構成した。これらの１４個の遺伝子座の分析後、個々のメラニン細胞性腫瘍の組織切片でＦＩＳＨプローブのサブセットを評価した（プローブセットＶＩ）。新規プローブの他の組み合わせ（プローブセットＶＩＩ〜ＶＩＩＩ；表１）もこのような切片で試験し、悪性腫瘍を検出するために相補した遺伝子座を同定した。
判別分析
良性母斑検体群とメラノーマ検体群で試験した各遺伝子座の各種パラメーターの平均と標準偏差を比較することにより、各ＦＩＳＨプローブがメラノーマをもつ患者群と良性母斑をもつ患者群を区別する能力をまず試験した。組織マイクロアレイハイブリダイゼーション及び各遺伝子座又は遺伝子座比について、表２は良性母斑検体群の該当データとして、評価した検体数（Ｎ）、増加（％増加）又は減少（％減少）を示す細胞の百分率の平均、平均遺伝子座コピー数（単一遺伝子座）又は平均遺伝子座比（２個の遺伝子座の比）、及び対応する標準偏差を示す。メラノーマ検体群の平均と標準偏差を計算し、組織マイクロアレイについて表３に示す。表３は特定プローブ又はプローブ比がメラノーマ検体と正常検体を区別する能力を反映する値であるＤＶとｐ値も示す。ＤＶとｐ値は一貫してｐ値が低いほどＤＶが高かった。ＤＶとｐ値に関する表３のＮＡなる記載はメラノーマ群の平均が良性母斑群よりも低かった場合を示す。
表３に示すｐ値によると、セントロメア８、セントロメア９、１ｑ２３、６ｐ２５、７ｑ３４、１７ｑ２５、及び２０ｑ１３遺伝子座の増加と、セントロメア７に対する７ｑ３４の増加は正常検体よりもメラノーマ検体のほうが有意に高い百分率の細胞で生じている。更に、６ｐ２５、８ｐ２２、８ｑ２４、９ｐ２１、１７ｑ２５、セントロメア６、及びセントロメア１０遺伝子座の減少と、セントロメア１０に対する１０ｑ２３の減少（ＰＴＥＮプローブを使用して識別）は正常検体よりもメラノーマ検体のほうが有意に高い百分率の細胞で生じている。ＤＶによると、２０ｑ１３及びセントロメア６遺伝子座の増加はメラノーマと母斑の判別レベルが最高であり、どちらもＤＶ＞１であった。同様に、９ｐ２１、セントロメア６及び１７ｑ２５遺伝子座の減少もＤＶ＞１を示した。
表３のデータに基づき、プローブサブセットを全組織切片とハイブリダイズさせ、ＤＶとｐ値を使用して同様に分析し、組織マイクロアレイで収集したデータを確認した。表５に示すように、組織マイクロアレイデータから増加を示す細胞に基づいて選択したプローブは類似性能をもつ。数個の新規プローブを組織切片で分析した（プローブセットＶＩＩ及びＶＩＩＩ；表１）。メラノーマについて平均と標準偏差を計算し、表５に切片について示す。表５は特定プローブ又はプローブ比がメラノーマ検体と正常検体を区別する能力を反映する値であるＤＶとｐ値も示す。ＤＶとｐ値は一貫してｐ値が低いほどＤＶが高かった。
表５に示すｐ値によると、１ｑ３１、６ｐ２５、６ｑ２３、７ｑ３４、９ｐ２１、１１ｑ１３、１７ｑ２５、２０ｑ１３の増加と、セントロメア６に対する６ｑ２３の増加は正常検体よりもメラノーマ検体のほうが有意に高い百分率の細胞で生じている。ＤＶによると、６ｐ２５の増加はメラノーマと母斑の判別レベルが最高であり、ＤＶ＝０．７であった。
単一プローブ感度、特異性及びＤＦＩ値
一定範囲のカットオフ値で切片にハイブリダイズさせた個々のプローブについて感度、特異性及びＤＦＩ値を計算し、表６に示す。メラノーマと母斑を比較すると、最低から最高ＤＦＩの順で６ｐ２５、１ｑ３１、７ｑ３４及び２０ｑ１３で最良のＤＦＩ値（即ち最低ＤＦＩ値）が得られた（表６）。これらのプローブのうちで、６ｐ２５の増加はＤＶ値、スチューデントのｔ検定比較とフィッシャーの両側正確確率検定によるｐ値、及びＤＦＩ値を含む単一プローブ性能の各種評価方法により一貫して最高性能であることが分かった。
相補性分析
どのプローブが組み合わせで最良に機能するかを判定するために、相補性分析を実施した。１〜４個のプローブの可能な全プローブ組み合わせについて良性母斑からメラノーマを区別するための感度、特異性及びＤＦＩ値を計算した。４個のプローブの組み合わせを分析したのは、４個のプローブから顕微鏡で観察するのに適した多色プローブセット（可視光発光ラベル）を構成し易いためである。最高性能プローブ組み合わせで得られたデータを表６に示す。
受信者操作曲線
試験したカットオフ値範囲で計算した感度と特異性を使用してＲＯＣプロットを作成した。表６でＤＦＩ値が低いことから性能良好と判断したプローブ組み合わせの数例のＲＯＣ曲線を図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃにプロットする。図２Ａ、２Ｂ及び２ＣのＲＯＣ曲線は遺伝子座の増減の双方を検出するプローブを使用して母斑検体集合群に対してメラノーマ検体を検出するための感度と特異性の関係を示す。プローブの組み合わせにより得られる改善（相補性）を示すために、４個の最良性能の単一プローブのＲＯＣ曲線をプロットする（図２Ｃ）。表６の項目はプロットの左上角（０，１）に最も近接する各曲線上の点に対応する。これらのプロット又は表６のデータから明らかなように、６ｐ２５の増加はメラノーマと良性母斑を区別するためにＣＥＰ（登録商標）１０欠損（０シグナル／細胞）、１１ｑ１３の増加、又は６ｑ２３の増加により相補される。単一プローブで０．２９０５（６ｐ２５増加）という低いＤＦＩが得られたので、プローブ組み合わせではアッセイにプローブを追加する費用の追加とプローブを計数するために必要な時間の追加に見合うようにＤＦＩ＜０．２９０５となることが望ましい。２個のプローブの組み合わせを表す図２ＢのＲＯＣ曲線では各々ＤＦＩ＜０．２９０５が得られ、３個のプローブの組み合わせではＤＦＩ＜０．２６２２（図２Ｂ）が得られ、４個のプローブの組み合わせではＤＦＩ＜０．１９３７（図２Ｃ）が得られる。
最良の総合プローブ組み合わせを図２Ｃに示す。ＲＯＣ曲線から明らかなように、６ｐ２５増加は６ｑ２３とセントロメア６の比により相補され（図２Ａの６ｐ２５増加単独のＲＯＣ曲線と、図２Ｂの６ｑ２３とセントロメア６の比に組み合わせた６ｐ２５のＲＯＣ曲線を比較されたい）、６ｑ２３とセントロメア６の比に組み合わせた６ｐ２５増加は１７ｑ２５増加により更に相補される（図２Ｃ）。対応するＲＯＣ曲線は感度９１％及び特異性９３％でＤＦＩ値＝０．１１２７である。図２Ｃで２番目に良好な性能のプローブセットは６ｐ２５と、６ｑ２３とセントロメア６の比と、１１ｑ１３増加のセットである。対応するＲＯＣ曲線は感度８８％及び特異性９７％でＤＦＩ＝０．１２５７である（表６）。
遺伝子座減少の測定はトランケーションアーチファクト（パラフィン切片）とシグナルオーバーラップ（任意検体調製物）により複雑になる可能性があるので、遺伝子座増加の測定のみに依存するプローブ組み合わせも評価した。プローブ６ｐ２５、６ｑ２３、６ｑ２３とセントロメア６の比、及び１７ｑ２５を含む全増加の４個のプローブのセットのデータを表６に示し、ＲＯＣ曲線の１例を図２Ｃにプロットする。対応するＲＯＣ曲線は感度８８％及び特異性９７％でＤＦＩ＝０．１２５７である（表６）。
メラノーマ検出
本プローブ選択試験に記載する４色プローブセット６ｐ２５、１７ｑ２５、６ｑ２３、及びＣＥＰ（登録商標）６と、６ｐ２５、６ｑ２３、ＣＥＰ（登録商標）６及び１１ｑ１３はメラノーマの診断に一致する染色体異常をもつ細胞の存在についてホルマリン固定パラフィン包埋皮膚生検サンプルを評価するために使用することができる。ＦＩＳＨハイブリダイゼーション用にサンプルを作製し、プローブ選択試験に記載したようにプローブセットとハイブリダイズさせる。プローブ選択試験に記載したように２０〜２００個の連続細胞を計数することにより各サンプルからの細胞を評価する。６ｐ２５の比増加、６ｐ２５異常、１７ｑ２５の増加又は６ｑ２３とセントロメア６シグナルの合計数の比≧１．１を示す細胞の百分率が夫々カットオフ値２．０％、６６％、１４％又は２６％よりも大きいサンプルをメラノーマ陽性とみなす。６ｐ２５の比増加、６ｐ２５異常、１１ｑ１３の増加又は６ｑ２３とセントロメア６シグナルの合計数の比≧１．１を示す細胞の百分率が夫々カットオフ値２．０、６６％、１３％及び２６％よりも大きいサンプルをメラノーマ陽性とみなす。メラノーマの検出に有用な他のプローブセットのハイブリダイゼーションパターンを表６に示す。
その他のプローブセット
メラノーマの検出に有用であると思われるプローブセットは上記ＣＧＨ試験からのＤＦＩ値（例えば０．１５未満）に基づいて選択することもできる。
従って、有用であることが判明した他のプローブ組み合わせは２個のプローブをもち、２個のプローブは、
ａ）９番染色体計数プローブと、染色体サブ領域９ｐ２１に対するプローブ；
ｂ）染色体サブ領域９ｐ２１に対するプローブと、２０ｑ１３に対するプローブ；
ｃ）８番染色体計数プローブと、染色体サブ領域９ｐ２１を標的とするプローブ；
ｄ）６番染色体計数プローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブ；
ｅ）６番染色体計数プローブと、８番染色体計数プローブ；
ｆ）染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、６ｐ２５に対するプローブ；
ｇ）染色体サブ領域９ｐ２１に対するプローブと、６ｐ２５に対するプローブ；
ｈ）８番染色体計数プローブと、染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブ；
ｉ）６番染色体計数プローブと、染色体サブ領域９ｐ２１を標的とするプローブ；
ｊ）染色体サブ領域９ｐ２１を標的とするプローブと、１７ｑ２５を標的とするプローブ；
ｋ）８番染色体計数プローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブ；
ｌ）染色体サブ領域９ｐ２１を標的とするプローブと、７ｑ３４を標的とするプローブ；
ｍ）染色体サブ領域９ｐ２１を標的とするプローブと、１ｑ２３を標的とするプローブ；
ｎ）染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブと、１ｑ２３を標的とするプローブ；及び
ｏ）９番染色体計数プローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブである。
３個のプローブをもつ有用なプローブ組み合わせは、
ａ）染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、９ｐ２１に対するプローブと、７ｑ３４に対するプローブ；
ｂ）９番染色体計数プローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域９ｐ２１を標的とするプローブ；
ｃ）９番染色体計数プローブと、８番染色体計数プローブと、染色体サブ領域９ｐ２１を標的とするプローブ；
ｄ）９番染色体計数プローブと、染色体サブ領域７ｑ３４を標的とするプローブと、染色体サブ領域９ｐ２１を標的とするプローブ；
ｅ）８番染色体計数プローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブ；
ｆ）６番染色体計数プローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域９ｐ２１を標的とするプローブ；
ｇ）６番染色体計数プローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域９ｐ２１を標的とするプローブ；
ｈ）８番染色体計数プローブと、１０番染色体計数プローブと、染色体サブ領域９ｐ２１を標的とするプローブ；
ｉ）８番染色体計数プローブと、染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域９ｐ２１を標的とするプローブ；並びに
ｊ）染色体サブ領域９ｐ２１、６ｐ２５、及び７ｑ３４を標的とする３個のプローブである。
４個のプローブをもつ有用なプローブ組み合わせは、
ａ）染色体サブ領域９ｐ２１、６ｐ２５、７ｑ３４、及び２０ｑ１３に対するプローブ；
ｂ）染色体サブ領域１ｑ２３、６ｐ２５、７ｑ３４、及び２０ｑ１３に対するプローブ；
ｃ）６番染色体計数プローブと、染色体サブ領域９ｐ２１を標的とするプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４を標的とするプローブ；並びに
ｄ）１０番染色体計数プローブと、染色体サブ領域９ｐ２１を標的とするプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４を標的とするプローブである。
従って、少なくとも２個のプローブのプローブ組み合わせとしては、
ａ）９番染色体計数プローブと、染色体領域９ｐに対するプローブ；
ｂ）染色体領域９ｐを標的とするプローブと、染色体領域２０ｑを標的とするプローブ；
ｃ）８番染色体計数プローブと、染色体領域９ｐを標的とするプローブ；
ｄ）６番染色体計数プローブと、染色体領域２０ｑを標的とするプローブ；
ｅ）染色体領域２０ｑを標的とするプローブと、染色体領域６ｐを標的とするプローブ；
ｆ）染色体領域９ｐを標的とするプローブと、染色体領域６ｐを標的とするプローブ；
ｇ）８番染色体計数プローブと、染色体領域６ｐを標的とするプローブ；
ｈ）６番染色体計数プローブと、染色体領域９ｐを標的とするプローブ；
ｉ）染色体領域９ｐを標的とするプローブと、染色体領域１７ｑを標的とするプローブ；
ｊ）８番染色体計数プローブと、染色体領域２０ｑを標的とするプローブ；
ｋ）染色体領域９ｐを標的とするプローブと、染色体領域７ｑを標的とするプローブ；
ｌ）染色体領域９ｐを標的とするプローブと、染色体領域１ｑを標的とするプローブ；
ｍ）染色体領域２０ｑを標的とするプローブと、染色体領域１ｑを標的とするプローブ；及び
ｎ）９番染色体計数プローブと、染色体領域２０ｑを標的とするプローブが挙げられる。
少なくとも３個のプローブのプローブ組み合わせとしては、
ａ）染色体領域２０ｑを標的とするプローブと、染色体領域９ｐを標的とするプローブと、染色体領域７ｑを標的とするプローブ；
ｂ）９番染色体計数プローブと、染色体領域２０ｑを標的とするプローブと、染色体領域９ｐを標的とするプローブ；
ｃ）９番染色体計数プローブと、８番染色体計数プローブと、染色体領域９ｐを標的とするプローブ；
ｄ）９番染色体計数プローブと、染色体領域７ｑを標的とするプローブと、染色体領域９ｐを標的とするプローブ；
ｅ）８番染色体計数プローブと、染色体領域２０ｑを標的とするプローブと、染色体領域６ｐを標的とするプローブ；
ｆ）６番染色体計数プローブと、染色体領域２０ｑを標的とするプローブと、染色体領域９ｐを標的とするプローブ；
ｇ）６番染色体計数プローブと、染色体領域２０ｑを標的とするプローブと、染色体領域９ｐを標的とするプローブ；
ｈ）８番染色体計数プローブと、１０番染色体計数プローブと、染色体領域９ｐを標的とするプローブ；
ｉ）８番染色体計数プローブと、染色体領域６ｐを標的とするプローブと、染色体領域９ｐを標的とするプローブ；及び
ｊ）染色体領域９ｐを標的とするプローブと、染色体領域６ｐを標的とするプローブと、染色体領域７ｑを標的とするプローブが挙げられる。
少なくとも４個のプローブのプローブ組み合わせとしては、
ａ）染色体領域９ｐを標的とするプローブと、染色体領域６ｐを標的とするプローブと、染色体領域７ｑを標的とするプローブと、染色体領域２０ｑを標的とするプローブ；
ｂ）染色体領域１ｑを標的とするプローブと、染色体領域６ｐを標的とするプローブと、染色体領域７ｑを標的とするプローブと、染色体領域２０ｑを標的とするプローブ；
ｃ）６番染色体計数プローブと、染色体領域９ｐを標的とするプローブと、染色体領域２０ｑを標的とするプローブと、染色体領域７ｑを標的とするプローブ；及び
ｄ）１０番染色体計数プローブと、染色体領域９ｐを標的とするプローブと、染色体領域２０ｑを標的とするプローブと、染色体領域７ｑを標的とするプローブが挙げられる。
他の態様
以上、本発明を詳細な説明に関連して記載したが、当然のことながら、上記記載は本発明の例証を目的とし、その範囲を限定するものではない。本発明の他の側面、利点、及び変形も特許請求の範囲に含まれる。
本明細書に引用した全刊行物、特許、及び特許出願は言及により本明細書に組込み、各刊行物又は特許出願を言及により組込むと具体的に個々に記載しているものとして扱う。
図１Ａはメラノーマを検出するための個々の遺伝子座の感度に関するＣＧＨメラノーマデータの解析を示す。プロットはｘ軸の染色体バンド位置によりビンに分割した１番染色体のｐアームから２２番染色体のｑアームまでの完全ゲノムを示す。図１ＡはＤＮＡコピー数減少に対する感度を示す。図１ＢはＤＮＡコピー数増加に対する感度を示す。図１ＣはＤＮＡコピー数増幅に対する感度を示す。 図１Ｂはメラノーマを検出するための個々の遺伝子座の感度に関するＣＧＨメラノーマデータの解析を示す。プロットはｘ軸の染色体バンド位置によりビンに分割した１番染色体のｐアームから２２番染色体のｑアームまでの完全ゲノムを示す。図１ＡはＤＮＡコピー数減少に対する感度を示す。図１ＢはＤＮＡコピー数増加に対する感度を示す。図１ＣはＤＮＡコピー数増幅に対する感度を示す。 図１Ｃはメラノーマを検出するための個々の遺伝子座の感度に関するＣＧＨメラノーマデータの解析を示す。プロットはｘ軸の染色体バンド位置によりビンに分割した１番染色体のｐアームから２２番染色体のｑアームまでの完全ゲノムを示す。図１ＡはＤＮＡコピー数減少に対する感度を示す。図１ＢはＤＮＡコピー数増加に対する感度を示す。図１ＣはＤＮＡコピー数増幅に対する感度を示す。 図２Ａは数種のプローブ組み合わせの典型的なＲＯＣ曲線を示す。 図２Ｂは数種のプローブ組み合わせの典型的なＲＯＣ曲線を示す。 図２Ｃは数種のプローブ組み合わせの典型的なＲＯＣ曲線を示す。

Claims (37)

  1. 患者からの生体サンプルにおけるメラノーマ細胞の存在の検出方法であって、
    ａ）６番染色体計数プローブ、１０番染色体計数プローブ、染色体領域６ｐを標的とするプローブ、染色体領域６ｑを標的とするプローブ、染色体領域７ｑを標的とするプローブ、染色体領域１１ｑを標的とするプローブ、染色体領域１７ｑを標的とするプローブ、染色体領域１ｑを標的とするプローブ、及び染色体領域２０ｑを標的とするプローブから構成される群から選択される少なくとも２個のプローブの組み合わせとサンプルを接触させる段階と；
    ｂ）各プローブがその標的染色体又は染色体領域上のポリヌクレオチド配列と選択的に結合して安定なハイブリダイゼーション複合体を形成する条件下でセットの各プローブをサンプルと共にインキュベートする段階と；
    ｃ）プローブ組み合わせのハイブリダイゼーションパターンを検出し、ハイブリダイゼーションパターンがプローブの標的染色体領域に少なくとも１カ所の増加又は減少又はアンバランスを示す場合にはメラノーマであると判定する段階を含む前記方法。
  2. 少なくとも２個のプローブの組み合わせが０．２９以下の理想との差（ＤＦＩ）値をもつ請求項１に記載の方法。
  3. 少なくとも２個のプローブの組み合わせが約０．２０以下のＤＦＩ値をもつ請求項１に記載の方法。
  4. 少なくとも２個のプローブ組み合わせにおけるプローブの１個が染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブである請求項１に記載の方法。
  5. 少なくとも２個のプローブの組み合わせにおける第２のプローブが１０番染色体計数プローブ、サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブ、及び染色体サブ領域６ｑ２３を標的とするプローブから構成される群から選択される請求項４に記載の方法。
  6. 組み合わせが請求項１に記載の群から選択される少なくとも３個のプローブの組み合わせである請求項１に記載の方法。
  7. ３個のプローブのうちの１個が染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブである請求項６に記載の方法。
  8. 少なくとも３個のプローブの組み合わせが、
    ａ）染色体サブ領域６ｑ２３を標的とするプローブと、６番染色体計数プローブ；
    ｂ）染色体サブ領域１ｑ３１を標的とするプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブ；
    ｃ）染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｄ）染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブ；
    ｅ）染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｆ）染色体サブ領域１ｑ３１を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｇ）染色体サブ領域１ｑ３１を標的とするプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブ；
    ｈ）染色体サブ領域７ｑ３４を標的とするプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブ；
    ｉ）染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブ；
    ｊ）染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブ；
    ｋ）染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３を標的とするプローブ；
    ｌ）染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｍ）染色体サブ領域７ｑ３４を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブ；及び
    ｎ）染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブから構成される２個のプローブの群から選択される２個のプローブをもつ請求項７に記載の方法。
  9. 少なくとも３個のプローブの組み合わせが染色体サブ領域１ｑ３１を標的とするプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブをもつ請求項６に記載の方法。
  10. プローブの組み合わせが請求項１に記載の群から選択される少なくとも４個のプローブの組み合わせである請求項１に記載の方法。
  11. ４個のプローブのうちの１個が染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブである請求項１０に記載の方法。
  12. 更に、４個のプローブの組み合わせが、
    ａ）染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、６番染色体計数プローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｂ）染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブと、６番染色体計数プローブ；
    ｃ）染色体サブ領域１ｑ３１に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
    ｄ）染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｅ）染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、色体サブ領域１ｑ３１に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｆ）染色体サブ領域１ｑ３１に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｇ）染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、６番染色体計数プローブ；
    ｈ）染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、６番染色体計数プローブ；
    ｉ）染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、６番染色体計数プローブ；
    ｊ）染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
    ｋ）染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
    ｌ）染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
    ｍ）染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
    ｎ）染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｏ）染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｐ）染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブ；
    ｑ）染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブ；
    ｒ）染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｓ）染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｔ）染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
    ｕ）染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；及び
    ｖ）染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブ１０番染色体計数プローブから構成される３個のプローブの群から選択される３個のプローブをもつ請求項１１に記載の方法。
  13. 少なくとも４個のプローブの組み合わせが染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、６番染色体計数プローブをもつ請求項１０に記載の方法。
  14. 生体サンプルが皮膚生検である請求項１に記載の方法。
  15. 生体サンプルがホルマリン固定パラフィン包埋サンプルである請求項１４に記載の方法。
  16. プローブが蛍光標識されている請求項１に記載の方法。
  17. 患者からの生体サンプルにおけるメラノーマ細胞の有無の検出方法であって、
    ａ）６番染色体計数プローブ、１０番染色体計数プローブ、染色体領域６ｐを標的とするプローブ、染色体領域６ｑを標的とするプローブ、染色体領域７ｑを標的とするプローブ、染色体領域１１ｑを標的とするプローブ、染色体領域１７ｑを標的とするプローブ、染色体領域１ｑを標的とするプローブ、及び染色体領域２０ｑを標的とするプローブから構成される群から選択される少なくとも２個のプローブの組み合わせとサンプルを接触させる段階と；
    ｂ）各プローブがその標的染色体又は染色体領域上のポリヌクレオチド配列と選択的に結合して安定なハイブリダイゼーション複合体を形成する条件下でセットの各プローブをサンプルと共にインキュベートする段階と；
    ｃ）プローブ組み合わせのハイブリダイゼーションパターンをメラノーマの有無について検出及び分析する段階を含む前記方法。
  18. 請求項１に記載の群から選択される少なくとも２個のプローブを含み、メラノーマに関して約０．２９未満の理想との差（ＤＦＩ）値をもつプローブ組み合わせ。
  19. プローブ組み合わせが約０．２０未満のＤＦＩ値をもつ請求項１８に記載のプローブ組み合わせ。
  20. ２個のプローブが、
    ａ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｂ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブ；及び
    ｃ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブから構成される群から選択される請求項１８に記載のプローブ組み合わせ。
  21. 請求項１に記載の群から選択される少なくとも３個のプローブを含み、メラノーマに関して約０．２９未満の理想との差（ＤＦＩ）値をもつプローブ組み合わせ。
  22. ３個のプローブが、
    ａ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３を標的とするプローブと、６番染色体計数プローブ；
    ｂ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１を標的とするプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブ；
    ｃ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｄ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブ；
    ｅ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｆ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｇ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１を標的とするプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブ；
    ｈ）染色体サブ領域１ｑ３１を標的とするプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブ；
    ｉ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４を標的とするプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブ；
    ｊ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブ；
    ｋ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブ；
    ｌ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３を標的とするプローブ；
    ｍ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｎ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブ；及び
    ｏ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブから構成される群から選択される請求項２１に記載のプローブ組み合わせ。
  23. 請求項１に記載の群から選択される少なくとも４個のプローブを含み、メラノーマに関して約０．２９未満の理想との差（ＤＦＩ）値をもつプローブ組み合わせ。
  24. ４個のプローブが、
    ａ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、６番染色体計数プローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｂ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブと、６番染色体計数プローブ；
    ｃ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
    ｄ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｅ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｆ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｇ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、６番染色体計数プローブ；
    ｈ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、６番染色体計数プローブ；
    ｉ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、６番染色体計数プローブ；
    ｊ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
    ｋ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
    ｌ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
    ｍ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
    ｎ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｏ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｐ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブ；
    ｑ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブ；
    ｒ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｓ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｔ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
    ｕ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｖ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；及び
    ｘ）染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、６番染色体計数プローブから構成される群から選択される請求項２３に記載のプローブ組み合わせ。
  25. ６番染色体計数プローブ、１０番染色体計数プローブ、染色体領域６ｐを標的とするプローブ、染色体領域６ｑを標的とするプローブ、染色体領域７ｑを標的とするプローブ、染色体領域１１ｑを標的とするプローブ、染色体領域１７ｑを標的とするプローブ、染色体領域１ｑを標的とするプローブ、及び染色体領域２０ｑを標的とするプローブから構成される群から選択される２個のプローブの組み合わせ。
  26. 請求項２５に記載の群から選択される３個のプローブの組み合わせ。
  27. 請求項２５に記載の群から選択される４個のプローブの組み合わせ。
  28. 請求項１に記載の群から選択される少なくとも２個のプローブの組み合わせを含むキットであって、プローブ組み合わせがメラノーマに関して約０．２９未満の理想との差（ＤＦＩ）値をもつ前記キット。
  29. プローブ組み合わせが約０．２０未満のＤＦＩ値をもつ請求項２８に記載のキット。
  30. ２個のプローブが、
    ａ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｂ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブ；及び
    ｃ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブから構成される群から選択される請求項２８に記載のキット。
  31. 請求項１に記載のプローブ群から選択される少なくとも３個のプローブの組み合わせを含むキット。
  32. ３個のプローブが、
    ａ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３を標的とするプローブと、６番染色体計数プローブ；
    ｂ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１を標的とするプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブ；
    ｃ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｄ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブ；
    ｅ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｆ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｇ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１を標的とするプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブ；
    ｈ）染色体サブ領域１ｑ３１を標的とするプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブ；
    ｉ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４を標的とするプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブ；
    ｊ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５を標的とするプローブ；
    ｋ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブ；
    ｌ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３を標的とするプローブ；
    ｍ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｎ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブ；及び
    ｏ）染色体サブ領域６ｐ２５を標的とするプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３を標的とするプローブと、１０番染色体計数プローブから構成される群から選択される請求項３１に記載のキット。
  33. 請求項１に記載のプローブ群から選択される少なくとも４個のプローブの組み合わせを含むキット。
  34. ４個のプローブが、
    ａ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、６番染色体計数プローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｂ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブと、６番染色体計数プローブ；
    ｃ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
    ｄ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｅ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｆ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｇ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、６番染色体計数プローブ；
    ｈ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、６番染色体計数プローブ；
    ｉ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、６番染色体計数プローブ；
    ｊ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
    ｋ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１ｑ３１に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
    ｌ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
    ｍ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
    ｎ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｏ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｐ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブ；
    ｑ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブ；
    ｒ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｓ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｔ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域２０ｑ１３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブ；
    ｕ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；
    ｖ）染色体サブ領域６ｐ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、染色体サブ領域１１ｑ１３に対するプローブと、１０番染色体計数プローブ；及び
    ｘ）染色体サブ領域１７ｑ２５に対するプローブと、染色体サブ領域７ｑ３４に対するプローブと、染色体サブ領域６ｑ２３に対するプローブと、６番染色体計数プローブから構成される群から選択される請求項３３に記載のキット。
  35. メラノーマ診断用プローブセットを含むキットであって、プローブセットが６番染色体計数プローブ、１０番染色体計数プローブ、染色体領域６ｐを標的とするプローブ、染色体領域６ｑを標的とするプローブ、染色体領域７ｑを標的とするプローブ、染色体領域１１ｑを標的とするプローブ、染色体領域１７ｑを標的とするプローブ、染色体領域１ｑを標的とするプローブ、及び染色体領域２０ｑを標的とするプローブから構成される群から選択される２個のプローブの組み合わせである前記キット。
  36. メラノーマ診断用プローブセットを含むキットであって、プローブセットが請求項３５に記載のプローブ群から選択される３個のプローブの組み合わせである前記キット。
  37. メラノーマ診断用プローブセットを含むキットであって、プローブセットが請求項３５に記載のプローブ群から選択される４個のプローブの組み合わせである前記キット。
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