CN113817777B - 来源于人的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种来源于人的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系及其构建方法，来源于人的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系的保藏编号为CCTCC NO：C2021213，构建方法包括：向原代分离的先天性巨大黑痣细胞转染SV40LT抗原基因，筛选阳性克隆并传代培养以获得永生化的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系。本申请克服了目前无法长期体外培养人先天性巨大黑痣细胞的缺陷，可获得与原代先天性巨大黑痣形态和特性无明显差别的永生化细胞系，为先天性巨大黑痣的发病分子机制、靶向药物筛选研究提供便利条件。

Description

来源于人的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系及其构建方法
技术领域
本申请涉及肿瘤细胞系构建技术领域，具体涉及一种来源于人的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系及其构建方法。
背景技术
黑色素细胞是人类皮肤组织中的一类重要细胞，主要存在于表皮基底层中，大约占基底层细胞的5％-10％。正常皮肤黑色素细胞合成并分泌黑色素为角质细胞所摄取，从而保护皮肤细胞免受紫外线的伤害。当皮肤黑色素细胞异常增殖聚集时，形成的病灶称为黑色素细胞痣。先天性黑色素细胞痣(congenital melanocytic nevi,CMN)是指出生时即有或出生后几周内出现的黑痣，相关研究报道其在新生儿中的发病率约为1％-6％，当CMN累及成年患者体表长径＞20cm时称为先天性巨大黑色素细胞痣(giant congenitalmelanocytic nevi,GCMN)，其发病率约为1/20000。GCMN往往严重影响患者容貌，导致患者严重的自卑心理，此外，GCMN的终身恶变几率可高达5％-15％。同时，约3％-12％的GCMN患者同时伴有痣细胞累及中枢神经系统，称为神经皮肤黑变病(neurocutaneous melanosis,NCM),该病目前无有效的治疗手段，一旦出现神经系统症状，患者往往3年内死亡。
GCMN病理生理改变主要表现为真皮层内大量痣细胞增殖聚集，目前对于其形成机制仍未完全明确，大量研究认为其与NRAS基因的体细胞突变有关。以往对于先天性巨痣等这一类涉及体表大部皮肤的良性肿瘤的治疗手段极其有限，手术切除几乎是唯一途径。近几年靶向治疗领域的研究进展给这类良性肿瘤的治疗带来新曙光。然而，GCMN为良性肿瘤，在体外研究中，其肿瘤细胞很难长期培养。目前国际上尚无永生化的先天性巨大黑痣良性细胞系，给GCMN的发病分子机制、治疗靶点探究、靶向药物开发带来极大限制。
发明内容
本申请提供一种来源于人的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系及其构建方法，可以获得与原代先天性巨大黑痣形态和特性无明显差别的永生化良性肿瘤细胞系。
本申请提供一种来源于人的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系，命名为GNC-9H-01，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：C2021213。保藏单位名称为：中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)，保藏单位代码为CCTCC-中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉武汉大学，保藏时间为2021年08月04日。
本申请的来源于人的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系的标本来源为女性的手臂先天性巨大黑痣组织。
相应的，本申请还提供一种来源于人的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系的构建方法，包括：向原代分离的先天性巨大黑痣细胞转染SV40LT抗原基因，筛选阳性克隆并传代培养以获得永生化的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系。
可选地，在本申请的一些实施例中，构建方法包括：
步骤S1：提取原代先天性巨大黑痣细胞，对原代先天性巨大黑痣细胞进行培养以得到待转染细胞培养物；
步骤S2：以慢病毒对待转染细胞培养物进行病毒感染；
步骤S3：对经病毒感染后的细胞培养物进行阳性克隆筛选；
步骤S4：对经阳性克隆筛选后的细胞培养物进行传代培养，以得到永生化的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系。
可选地，在本申请的一些实施例中，步骤S1～步骤S4使用MelM培养液，MelM培养液含有黑色素细胞生长因子，胎牛血清，其中还含有青霉素，链霉素。
可选地，在本申请的一些实施例中，步骤S1包括：
步骤S11：取临床切除的先天性巨大黑痣皮肤组织，采用消化法得到肿瘤细胞悬液；
步骤S12：将肿瘤细胞悬液接种于培养瓶中培养，消化传代后获得待转染细胞培养物。
可选地，在本申请的一些实施例中，步骤S2包括：
步骤S21：以慢病毒对待转染细胞培养物转染SV40LT抗原基因，不使用助染剂；
步骤S22：对经转染SV40LT抗原基因的细胞培养物进行培养，并传代3～4次。
本申请将SV40LT抗原基因稳定整合到宿主细胞基因组上，然而稳定转染的效率是非常低的，本申请通过构建慢病毒表达载体提高转染效率。
可选地，在本申请的一些实施例中，慢病毒感染所述待转染细胞的MOI值可以为80～120，也可以为90～110，优选的，MOI值为100。
可选地，在本申请的一些实施例中，慢病毒为SV40LT过表达慢病毒，慢病毒载体包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。SV40LT抗原片段常用于整合入宿主细胞基因组并表达，通过调控细胞周期，致使细胞进入无限增殖的永生化状态，本申请中通过转染SV40LT抗原片段得到永生化的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系。
可选地，在本申请的一些实施例中，慢病毒中携带有嘌呤霉素的基因，采用嘌呤霉素进行阳性克隆筛选；慢病毒也可以携带其它标记基因，例如其它抗生素的基因，根据慢病毒中携带的标记选择相应的筛选条件；具体的，慢病毒为CMV-SV40LT-Puro慢病毒，采用嘌呤霉素对转染后的先天性巨大黑痣细胞进行筛选，存活的即为阳性克隆。
可选地，在本申请的一些实施例中，步骤S3包括：
步骤S31：采用嘌呤霉素对转染后的先天性巨大黑痣细胞进行筛选，处理3d后存活的细胞，即为阳性克隆。
可选地，在本申请的一些实施例中，嘌呤霉素的浓度可以为2.5～3.5ug/mL，也可以为2.7～3.2ug/mL，优选的，嘌呤霉素的浓度为3ug/mL。
可选地，在本申请的一些实施例中，步骤S4包括：
步骤S41：每48～72小时更换培养基，细胞长满皿底的70％～80％时进行消化传代。
可选地，在本申请的一些实施例中，进行传代时的分种率为1：2。
此外，本申请还提供一种上述的来源于人的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系在药物筛选中的应用。
本申请构建了一种来源于人的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系，具有以下有益效果：
1)GNC-9H-01细胞是国内第1株建立的来源于先天性巨大黑痣的良性肿瘤细胞系，具有中国人的遗传背景，同时目前国外未见同类细胞系报道，该细胞系的建立为我国在先天性巨大黑痣的基础研究中提供无法比拟的细胞模型优势。
2)一般情况下，无论是良性还是恶性肿瘤，其从体内转移到体外培养后，由于微环境的改变，不易存活，因此在一般体外培养条件下要使肿瘤细胞传代是十分困难的，使得针对原代细胞进行的研究推进较难，而GNC-9H-01细胞为永生化的良性细胞，根据本发明给出的培养条件，可在体外稳定存活及传代，为先天性巨大黑痣相关的研究提供了良好的材料。
3)本发明公开了GNC-9H-01细胞的建系方法，具有良好的可借鉴性和推广性，可以有效、经济地建立先天性巨大黑痣的良性肿瘤细胞系。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是GCMN患者病灶皮肤的组织切片HE染色图；
图2是单层贴壁生长的原代细胞(100X)光镜形态图；
图3是单层贴壁生长的P15代GNC-9H-01细胞(100X)光镜形态图；
图4是GNC-9H-01细胞透射电镜(2000X)图；
图5是GNC-9H-01细胞的生长曲线图；
图6是GNC-9H-01细胞类型鉴定流式图；
图7是GNC-9H-01细胞免疫荧光图；
图8是Sanger测序图；
图9是GNC-9H-01细胞的裸鼠种植瘤模型图。
具体实施方式
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请提供一种来源于人的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系及其构建方法。以下分别进行详细说明。需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。
在本申请中，“转染”是细胞在一定条件下主动或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。
本申请中的慢病毒属于逆转录病毒，将慢病毒改造得到的慢病毒表达载体，由于其感染效率高和感染范围广成为实验中经常使用的真核载体，慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果，与其他逆转录病毒相比，慢病毒有着独特的优势：感染宿主更为广泛，对于比较难转染的细胞，比如原代细胞、不分化的细胞和干细胞等，可以大幅度提高靶基因的感染效率，明显提高靶基因插入到目的细胞的概率；慢病毒表达载体稳定导入宿主细胞的靶基因，提高靶基因的转录活性，使其在宿主细胞中高表达；构建成功的慢病毒表达载体能够插入约5kb，或者更大片段的基因。
本申请实施例提供一种来源于人的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系，来源于人的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系命名为GNC-9H-01，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：C2021213。
本申请实施例还提供一种来源于人的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系的构建方法，包括：向原代分离的先天性巨大黑痣细胞转染SV40LT抗原基因，筛选阳性克隆并传代培养以获得永生化的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系。
本申请的构建方法包括以下步骤：
步骤S11：取临床切除的先天性巨大黑痣皮肤组织，采用消化法得到肿瘤细胞悬液；
步骤S12：将肿瘤细胞悬液接种于培养瓶中培养，消化传代后获得待转染细胞培养物。
步骤S21：以慢病毒对待转染细胞培养物转染SV40LT抗原基因，不使用助染剂；
步骤S22：对经转染SV40LT抗原基因的细胞培养物进行培养，并传代15次。
步骤S31：采用嘌呤霉素对转染后的先天性巨大黑痣细胞进行筛选，处理3d后存活的细胞，即为阳性克隆。
步骤S41：每48～72小时更换培养基，细胞长满皿底的70％～80％时进行消化传代。
在步骤S11中，将剪切后的先天性巨大黑痣皮肤组织置入DMEM培养液配置的0.25％的分散酶溶液中，4℃过夜后经0.1％胶原酶消化，70μm细胞滤网过滤以收集细胞，重悬得到肿瘤细胞悬液。
在步骤S12中，将肿瘤细胞悬液接种于培养瓶中培养，以胰酶消化，将消化好的细胞1:2接种于培养瓶中，以获得待转染细胞培养物。
在步骤S21中，慢病毒感染所述待转染细胞的MOI值可以为80～120，也可以为90～110，优选的，MOI值为100。
在步骤S21中，慢病毒为SV40LT过表达慢病毒，慢病毒载体包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
在步骤S31中，嘌呤霉素的浓度可以为2.5～3.5ug/mL，也可以为2.7～3.2ug/mL，优选的，嘌呤霉素的浓度为3ug/mL。
在步骤S41中，进行传代时的分种率为1：2。
本申请实施例中涉及培养基的说明：
ScienCell公司的MelM培养液，货号2201。所述MelM含有黑色素细胞生长因子(MleGS,Cat.No.2252)，胎牛血清(FBS,Cat.No.0002)，其中还含有青/链霉素(P/S,Cat.No.0503)。
本申请实施例中涉及慢病毒表达载体的说明：
SV40LT过表达慢病毒载体为CMV-SV40-LT，由上海吉玛制药技术有限公司构建。
本申请实施例中涉及其它细胞培养材料的说明：
70μm细胞滤网(美国FALCON公司)；XI型胶原酶(美国Sigma公司)；分散酶(美国Sigma公司)；0.25％Trypsin-EDTA(美国Gibco公司)；密闭型与非密闭型T25细胞培养瓶(美国Corning公司)，无血清细胞冻存液(美国Sciencell公司)，Polybrene(美国Sigma公司)，6孔板(美国Corning公司)，12孔板(美国Corning公司)，倒置显微镜(日本Olympus公司)。
下面结合具体实施例进行说明。
在一具体实施例中，标本来源为上海交通大学附属第九人民医院整复外科患者谢XX，女，7岁，术前患者征得患者本人同意，签署知情同意书，术中切取手臂先天性巨痣病灶组织。术后病理诊断为：先天性巨大黑色素痣。
实施例一、肿瘤细胞的获取及原代培养
本实施例提供先天性巨大黑痣细胞的获取及原代培养的方法，具体包括如下步骤：
1)肿瘤细胞的获取：取临床切除的先天性巨大黑痣皮肤组织(约3*3cm)，将手术切取组织标本置于生理盐水纱布中保湿，无菌手套包裹，冰盒运输。在超净台中用灭菌PBS冲洗组织标本3次，采用无菌的外科剪刀对组织标本进行剪切，剪切成宽2mm的长条状。将剪切后的组织置于DMEM培养液配置的0.25％的分散酶溶液中,4℃冰箱过夜。第二天取出组织标本于37℃温箱中复温1小时，而后将组织倒入10cm培养皿中，采用无菌手术镊分离表皮、真皮。将获得的真皮组织用无菌眼科剪剪碎，放入0.1％胶原酶溶液中，置入37℃摇床中消化2小时。70μm细胞滤网过滤至50ml离心管中，1500RPM离心5min。收集细胞沉淀，用MelM培养液重悬细胞并接种于T25培养瓶中，37℃，5％CO2培养。
2)原代细胞传代：小心吸去培养液，用1xPBS清洗；弃掉1xPBS后，加入适量胰酶；在显微镜下观察细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。弃去胰酶，加入适量预热的新鲜培养液中止消化，将细胞吹打分散均匀，将细胞悬液吸入15mL离心管中，室温，1500rpm，离心5min，弃去培养液，加入新鲜培养液，将细胞吹打均匀。将消化好的细胞1：2接种于细胞瓶中。
实施例二、肿瘤细胞SV40LT稳转细胞株构建
本实施例提供肿瘤细胞SV40LT稳转细胞株构建方法，具体包括如下步骤：
1)预实验：感染细胞MOI(感染复数)值筛选：先天性巨大黑痣细胞的MOI为100时，感染效率最高。
助染剂polybrene浓度的选择：经预实验摸索，polybrene对GMCN黑痣细胞的细胞毒性较大，同时采用无polybrene转染方法转染效率满意，故本转染方案中未使用polybrene助染。
2)细胞准备：小心吸去培养液，用1xPBS清洗；弃掉1xPBS后，加入适量胰酶；在显微镜下观察细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。弃去胰酶，加入适量预热的新鲜培养液，将细胞吹打分散均匀，将细胞悬液吸入15mL离心管中，室温，1500rpm，离心5min，弃去培养液，加入新鲜培养液，将细胞吹打均匀，血球计数板计数。以5×105/2ml的密度加入到6孔板中；细胞培养箱，37℃，5％CO2，孵育24h；取出6孔板，换新鲜培养液2ml/孔。
3)加入构建好的含有SV40LT片段的慢病毒(25μl/孔)，不使用助染剂。
4)24小时后更换为新鲜完全培养基。
5)转染完成后，将转染后的先天性巨大黑痣细胞传代3～4次后，加入3μg/ml的嘌呤霉素处理3d后存活的细胞确定为转染成功的先天性巨大黑痣细胞。
实施例三、肿瘤细胞的传代培养
本实施例提供肿瘤细胞的传代培养方法，具体包括如下步骤:
1)根据细胞的状态及培养液颜色的变化，每隔2～3天更换MelM培养基，细胞长满皿底的80％左右即应及时消化传代，分种率1：2，其中1瓶继续培养，1瓶冻存留种。
2)培养细胞进行传代，至少20代以上，此时的细胞为永生化细胞。
实施例四、验证方法
在本实施例中，对上述构建的永生化的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系进行检测，具体方法如下：
1.形态学
1.1组织形态
取GCMN皮肤组织标本约1*1cm大小，置于4％多聚甲醛溶液中固定、石蜡包埋，切片后HE染色并于镜下观察组织形态，组织切片HE染色图如图1所示，由图1结果可见，皮肤真皮层有大量痣细胞浸润，皮肤附属器可见累及，真皮浅层黑痣细胞伴大量黑色素颗粒富集。
1.2原代细胞光镜形态
原代细胞接种2天后，观察细胞的生长状态及形态特征，原代细胞光镜形态图如图2所示，由图2结果可见，细胞胞体较小，有典型的高折光特性，每个细胞伴2-5支纤细修长的伪足。
1.3永生化细胞光镜形态
光镜下观察单层贴壁生长的P15代GNC-9H-01细胞形态特征，P15代细胞光镜形态图如图3所示，由图3结果可知，细胞胞体形态不一，部分细胞呈扁平煎蛋状，胞内见显著黑色素累积，部分细胞呈小胞体伴多细长伪足，说明GNC-9H-01细胞形态较原代细胞未发生明显变化。
1.4永生化细胞电镜形态
取P20代细胞，透射电镜观察细胞的超微结构，细胞透射电镜图如图4所示，由图4结果可知，图4左侧为人正常黑色素细胞，右侧为GNC-9H-01永生化细胞，GNC-9H-01细胞内可见不同生长阶段的黑色素小体，同时GNC-9H-01细胞内黑色素小体数量较正常人原代黑色素细胞增多。
2.细胞生长曲线的绘制及细胞群体倍增时间
取生长良好的对数生长期细胞，胰酶消化细胞，轻轻吹匀，并行细胞计数。重悬后的细胞以每孔2ml(1×105个细胞)接种于6孔板，每组3个复孔，即共接种3块板。24小时后，将6孔板第1个孔细胞消化、计数细胞数量，而后第48小时(2day)、72小时(3day)、96小时(4day)、120小时(5day)、144小时(6day)分别计数6孔板第2、3、4、5、6个孔的细胞数，以时间为横坐标，以细胞数为纵坐标，绘制细胞生长曲线，并用半高度法计算细胞的倍增时间，如图5所示，分别是人正常黑色素细胞(MC)、人先天性巨大黑痣原代细胞(GNC)、人先天性巨大黑痣永生化细胞P20代(Im GNC P20)和P30代(Im GNC P30),由图5结果可知，GNC-9H-01细胞的增殖速度较原代人正常黑色素细胞慢，倍增时间约为72小时，人先天性巨大黑痣永生化细胞与原代细胞表现出类似的生长曲线。
3.流式鉴定细胞类型
利用黑色素细胞特异性标志物SOX10(Abnova，MAB14982，0.5ug/106个细胞)对GNC-9H-01细胞进行流式细胞仪分析。取100uL细胞悬液(细胞计数后用流式染色缓冲液调整浓度为1×107/mL)，加入0.5ug一抗，室温避光孵育15-30min，加入1～2mL流式染色缓冲液洗一次，用100uL流式染色缓冲液重悬，加入0.1uL小鼠来源荧光二抗避光孵育15-30min，加入1～2ml流式染色缓冲液洗一次，300g离心5min，弃上清，用500uL流式染色缓冲液重悬，立即上机检测，细胞流式结果如图6所示，由图6结果可知，该细胞系中99.4％为SOX10(+)的肿瘤细胞。
4.细胞免疫荧光
制备细胞爬片，4％多聚甲醛固定后进行细胞免疫荧光SOX10、S100B(Sigma，S2532，1：500)染色。用含0.1％Triton X-100的PBS室温孵育10分钟进行通透。用PBS洗涤爬片3次，每次5分钟。用3％BSA PBST(PBS+0.1％Tween 20)室温孵育30分钟进行封闭。用新鲜配置的封闭液稀释抗体(1：500)在湿盒中孵育1小时，37℃。用PBS洗涤3次，每次5分钟。用封闭液稀释二抗室温下避光孵育1小时。用PBS避光洗涤细胞3次，每次5分钟。滴加DAPI进行核复染。倒置荧光显微镜下拍照，-20℃保存爬片，细胞免疫荧光结果如图7所示，由图7结果可知，SOX10主要表达在细胞核中，S100主要表达于胞浆中。
5.Sanger测序
取P10代GNC-9H-01细胞，抽提DNA，Sanger测序看是否存在NRASQ61K、BRAFV600E热点突变，Sanger测序图如图8所示，由图8结果可知，GNC-9H-01细胞存在NRASQ61K突变，不存在BRAFV600E突变。
6.裸鼠种植瘤模型
取P20代GNC-9H-01细胞，胰酶消化，细胞计数，1500RPM离心后收集细胞沉淀，并用灭菌PBS溶液重悬成2*106/0.1ml的细胞悬液。取4周龄裸小鼠，气麻机诱导麻醉，右侧腋下皮肤采用75％酒精涂抹消毒。用1ml注射器吸取细胞悬液注射于裸鼠腋下皮肤皮下，注射量为单点0.1ml。而后小鼠于SPF动物房中培养并观察种植部位肿瘤形成与否。1个月时，处死裸鼠，取细胞种植部位的皮肤组织，固定包埋切片后HE染色观察。由图9结果可知，将2*106/0.1ml的GNC-9H-01注射入裸鼠腋下，一个月后未见明显肿瘤形成，解剖可见黑色的肿瘤细胞仍然存活，说明GNC-9H-01不具成瘤性，为良性肿瘤细胞系，没有发生恶性转化。
本申请构建了一种来源于人的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系，所得细胞系与原代先天性巨大黑痣形态和特性无明显差别，且为永生化的良性的肿瘤细胞系，为国内第1株建立的来源于人先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系，具有中国人的遗传背景，为先天性巨大黑痣相关的研究提供了良好的材料。
以上对本申请所提供的一种来源于人的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系及其构建方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。
序列表
<110> 上海交通大学医学院附属第九人民医院（上海第二医科大学附属第九人民医院）
<120> 来源于人的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系及其构建方法
<141> 2021-09-07
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2127
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atggataaag ttttaaacag agaggaatct ttgcagctaa tggaccttct aggtcttgaa 60
aggagtgcct gggggaatat tcctctgatg agaaaggcat atttaaaaaa atgcaaggag 120
tttcatcctg ataaaggagg agatgaagaa aaaatgaaga aaatgaatac tctgtacaag 180
aaaatggaag atggagtaaa atatgctcat caacctgact ttggaggctt ctgggatgca 240
actgagattc caacctatgg aactgatgaa tgggagcagt ggtggaatgc ctttaatgag 300
gaaaacctgt tttgctcaga agaaatgcca tctagtgatg atgaggctac tgctgactct 360
caacattcta ctcctccaaa aaagaagaga aaggtagaag accccaagga ctttccttca 420
gaattgctaa gttttttgag tcatgctgtg tttagtaata gaactcttgc ttgctttgct 480
atttacacca caaaggaaaa agctgcactg ctatacaaga aaattatgga aaaatattct 540
gtaaccttta taagtaggca taacagttat aatcataaca tactgttttt tcttactcca 600
cacaggcata gagtgtctgc tattaataac tatgctcaaa aattgtgtac ctttagcttt 660
ttaatttgta aaggggttaa taaggaatat ttgatgtata gtgccttgac tagagatcca 720
ttttctgtta ttgaggaaag tttgccaggt gggttaaagg agcatgattt taatccagaa 780
gaagcagagg aaactaaaca agtgtcctgg aagcttgtaa cagagtatgc aatggaaaca 840
aaatgtgatg atgtgttgtt attgcttggg atgtacttgg aatttcagta cagttttgaa 900
atgtgtttaa aatgtattaa aaaagaacag cccagccact ataagtacca tgaaaagcat 960
tatgcaaatg ctgctatatt tgctgacagc aaaaaccaaa aaaccatatg ccaacaggct 1020
gttgatactg ttttagctaa aaagcgggtt gatagcctac aattaactag agaacaaatg 1080
ttaacaaaca gatttaatga tcttttggat aggatggata taatgtttgg ttctacaggc 1140
tctgctgaca tagaagaatg gatggctgga gttgcttggc tacactgttt gttgcccaaa 1200
atggattcag tggtgtatga ctttttaaaa tgcatggtgt acaacattcc taaaaaaaga 1260
tactggctgt ttaaaggacc aattgatagt ggtaaaacta cattagcagc tgctttgctt 1320
gaattatgtg gggggaaagc tttaaatgtt aatttgccct tggacaggct gaactttgag 1380
ctaggagtag ctattgacca gtttttagta gtttttgagg atgtaaaggg cactggaggg 1440
gagtccagag atttgccttc aggtcaggga attaataacc tggacaattt aagggattat 1500
ttggatggca gtgttaaggt aaacttagaa aagaaacacc taaataaaag aactcaaata 1560
tttccccctg gaatagtcac catgaatgag tacagtgtgc ctaaaacact gcaggccaga 1620
tttgtaaaac aaatagattt taggcccaaa gattatttaa agcattgcct ggaacgcagt 1680
gagtttttgt tagaaaagag aataattcaa agtggcattg ctttgcttct tatgttaatt 1740
tggtacagac ctgtggctga gtttgctcaa agtattcaga gcagaattgt ggagtggaaa 1800
gagagattgg acaaagagtt tagtttgtca gtgtatcaaa aaatgaagtt taatgtggct 1860
atgggaattg gagttttaga ttggctaaga aacagtgatg atgatgatga agacagccag 1920
gaaaatgctg ataaaaatga agatggtggg gagaagaaca tggaagactc agggcatgaa 1980
acaggcattg attcacagtc ccaaggctca tttcaggccc ctcagtcctc acagtctgtt 2040
catgatcata atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc 2100
acacctcccc ctgaacctga aacataa 2127

Claims (1)

1.一种来源于人的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系，其特征在于，所述来源于人的先天性巨大黑痣良性肿瘤细胞系保藏于武汉大学保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：C2021213。
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