CN101955914A

CN101955914A - 一种具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系

Info

Publication number: CN101955914A
Application number: CN2009100547440A
Authority: CN
Inventors: 程树群; 胡华生; 王涛; 程嘉颖; 谢东; 吴孟超
Original assignee: Oriental Hepatobiliary Surgery Hospital Second Military Medical University Of Chinese Pla
Current assignee: Oriental Hepatobiliary Surgery Hospital Second Military Medical University Of Chinese Pla; Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2009-07-14
Filing date: 2009-07-14
Publication date: 2011-01-26
Anticipated expiration: 2029-07-14
Also published as: CN101955914B

Abstract

本发明公开了一种具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系(CCTCC NO：C200913)及其建系方法，将该细胞形成的皮下移植瘤接种到裸鼠肝脏成瘤后，能检测到门静脉癌栓的形成，具有很强的门静脉癌栓形成能力。建系方法包括以下步骤：(1)人肝癌门静脉癌栓组织在裸鼠皮下移植；(2)皮下移植瘤传代；(3)利用第五代皮下移植瘤进行裸鼠肝脏接种；(4)利用肝脏肿瘤进行原代培养建系。其优点表现在：CSQT-2细胞是从人门静脉癌栓组织中取材的，通过裸鼠肝脏异种原位移植后培养出来，该细胞系具有很强的门静脉癌栓形成能力，对肝癌门静脉癌栓形成机制及倾向性生长机制有其他现存肝癌细胞系无法比拟的优点，具有广泛的应用前景。

Description

一种具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系

技术领域

本发明涉及微生物动物细胞领域，具体涉及具有门静脉转移潜能的肝癌细胞系。

背景技术

原发性肝癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，未经治疗的病人中位生存期不到一年。手术切除是目前肝癌治疗最有效的措施。但即使切除了肿瘤，术后大多数病人仍死于术后肿瘤复发转移。肝癌转移的主要特征是向门静脉内生长而形成门静脉癌栓。上海东方肝胆外科医院对5524例肝癌患者行肝肿瘤切除术，切除标本发现门静脉内已形成癌栓的比例达67.1％(中华外科杂志，2001，39：25-28)；通过对肝癌门静脉癌栓生长特征的研究提出了癌栓分为5型8个亚型(中国现代普通外科进展，2003，6：171-173)，对肝癌合并门静脉癌栓的患者的临床治疗及预后判断提供了重要的参考。但是目前对肝癌门静脉癌栓形成的分子机制方面的研究还不够深入，纵观国内外人肝癌细胞系模型，尚无具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系，无法在动物体内构建门静脉癌栓形成的过程，也就难以了解癌栓倾向性生长的分子机制，无法寻找癌栓形成的防治策略。

CN1338512A公开了利用人肝癌原位接种至裸鼠肝脏，从裸鼠的肺转移灶中取材建立了人肝癌细胞系，为肝癌肺转移的机理和防治肺转移提供了适宜的实验材料。而CN1232874A公开了利用人肝癌高转移的裸鼠模型移植瘤作为建系瘤源，采用体外培养结合动物体内再接种生长的方式交替进行，建成具有高转移潜能的细胞系MHCC97。而来源于人肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系及其建系方法方面罕有报道，具有门静脉转移倾向的肝癌细胞系则未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系，命名为：人肝癌细胞系CSQT-2，保藏在武汉：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：武汉大学，保藏日期：2009-02-19，保藏编号：C200913。

本发明的第二个目的在于提供一种具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系(CCTCC NO：C200913)的建系方法。

为实现上述发明目的，本发明公开如下技术方案：

一种具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系(CCTCC NO：C200913)，其特征在于：将该细胞形成的皮下移植瘤接种到裸鼠肝脏成瘤后，能检测到门静脉癌栓的形成，具有很强的门静脉癌栓形成能力，且裸鼠门静脉癌栓与原移植瘤的组织结构相似。这株细胞系的核型分析显示为超三倍体，主流在67-94条，占总数的88％。

一种具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系(CCTCC NO：C200913)的建系方法，包括以下步骤：

(1)人肝癌门静脉癌栓组织在裸鼠皮下异种移植：

取手术切除的新鲜手术癌栓标本用D-Hand’s冲洗干净，剔除纤维组织和血污，取鲜鱼肉状即活力强的部位剪成1mm大小碎块异种移植于裸鼠的皮下，建立人肝癌门静脉癌栓裸鼠模型。

(2)皮下移植瘤传代；

术后观察裸鼠2次/日，皮下移植瘤长至直径为1.5cm左右时取出，去除坏死组织，将新鲜的肿瘤组织剪切成约1mm大小，手术埋于裸鼠大腿背侧皮下，如此反复操作，构建了皮下移植瘤的传代模型。

(3)利用第5代皮下移植瘤进行裸鼠肝脏接种：

从第5代的皮下移植瘤组织取材，进行裸鼠肝脏接种，形成裸鼠原位移植瘤模型，其肝脏成瘤能力为100％，成瘤潜伏期为11±2天。

(4)利用肝脏肿瘤进行原代培养建系：

包括：a.癌栓细胞的获取及原代培养；b.肿瘤“细胞岛”的克隆扩大培养；c.肿瘤细胞的传代培养并建系。

本发明所公开的一种具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系及其建系方法，其优点表现在：1、该细胞系(CCTCC NO：C200913)是从门静脉癌栓取材的，对肝癌门静脉癌栓形成机制及倾向性生长机制有其他现存肝癌细胞系无法比拟的优点。(目前所存的肝癌细胞系多从肝癌原发灶、肝癌的肺转移灶中取材，比如MHCC97。)2、将该细胞形成的皮下移植瘤接种到裸鼠肝脏成瘤后，能检测到门静脉癌栓的形成，具有很强的门静脉癌栓形成能力。3、建系方法的特异性：从人肝癌门静脉癌栓取材并进行裸鼠原位移植，然后建立的细胞系，具有门静脉转移潜能，对门静脉癌栓的形成机制研究提供了适宜的材料。

附图说明

下面结合说明书附图，对本发明进一步详细说明。

命名为CSQT-2的一种具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系，保藏在武汉：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2009-03-02，保藏编号：C200913。

图1：门静脉癌栓裸鼠皮下移植瘤。

图2：裸鼠肝脏移植瘤。

图3：单层贴壁生长的CSQT-2细胞(40×)，细胞为簇样生长，细胞成典型的上皮样细胞，其形状不规则，排列紧密，界限清楚，生长接触性抑制丧失。

图4：CSQT-2扫描电镜(3000×)，细胞表面有皱褶，周围有微绒毛或指状突起。

图5：CSQT-2细胞的透射电镜图片(3000×)，具有丰富的细胞器，箭头所指为细胞间紧密连接。

图6：CSQT-2细胞的生长曲线图，在DMEM培养条件下，细胞群体倍增时间为36小时。

图7：CSQT-2细胞的核型分析图，为超三倍体核型。

图8：CSQT-2细胞的染色体众数表。

图9：CSQT-2细胞的镜下门静脉癌栓(HE染色40×)。

具体实施方式

实施例

一、门静脉癌栓裸鼠皮下移植瘤模型及肝脏原位移植模型的构建

(一)、材料

1.手术器械

敷料剪，眼科镊，直尖剪，弯尖剪，眼科剪，持针钳(上海医疗器械有限公司手术器械厂)

2.标本来源

上海东方肝胆外科医院患者刘××(住院号115581)，男，60岁，术前征得患者本人同意，签署知情同意书，术中切除的肝癌及门静脉癌栓标本。术后病理诊断为肝细胞癌伴门静脉癌栓。

3.实验动物

BALB/c-nu/nu裸鼠，鼠龄为4～5周，由中国科学院上海斯莱克实验动物中心提供。

(二)、方法

将人门静脉癌栓新鲜组织种植到裸鼠皮下，构建皮下移植瘤模型，具体操作如下：

皮下移植瘤模型(命名为CSQT-2N)

a.将手术切除的新鲜手术肝癌及癌栓标本用D-Hand’s冲洗干净，剔除纤维组织和血污，取鲜鱼肉状即活力强的部位剪成1mm大小碎块，备用。

b.1％的戊巴比妥钠50ul/10g裸鼠，腹腔注射。

c.裸鼠大腿腹股沟侧用碘酒、酒精皮肤消毒，切开皮肤，将新鲜的肝癌组织或者癌栓组织碎块包埋到皮下后缝合皮肤，一只裸鼠种植四个点位。

d.待裸鼠苏醒后放回笼子。

e.术后观察裸鼠2次/日，皮下移植瘤长至直径为1.5cm左右时取出，去除坏死组织，剪切成约2mm大小，手术埋于裸鼠大腿背侧皮下，如此传代5-7次，获取生长旺盛的移植瘤进行肝包膜下原位移植。

f.计算第1代，第3代，第5代移植瘤的成瘤潜伏期，瘤体直径大小。

原位移植模型构建

a.脱颈处死稳定传代的第5代皮下荷瘤裸鼠，碘酒、酒精皮肤消毒，取出皮下肿瘤。

b.将皮下肿瘤立即浸入含青霉素、链霉素各100u/ml的1640培养基中。剔除周围结缔组织，取肿瘤生长旺盛的部分，剪成2mm大小碎块，备用。

c.实验动物以戊巴比妥钠(浓度1％，50ul/10g)腹腔麻醉，碘酒、酒精皮肤消毒，0.5％碘伏消毒，取左上腹横切口约1.5厘米，进入腹腔暴露肝左叶。先用8-0丝线穿过肝脏行8字缝合准备，然后用手术刀于丝线之间的肝包膜上戳一小孔，生理盐水纱布按压片刻止血，将肿瘤组织小块移植于肝包膜下，将8字缝合线拉紧固定，彻底止血后逐层关腹。

d.待裸鼠苏醒后放回饲养的笼子，5周后处死裸鼠。

e.观察指标为肝脏病理切片有无门静脉癌栓的形成。

(三)、结果

皮下移植瘤模型(CSQT-2N)

第1代移植瘤成瘤率为80％(16/20)，潜伏期为28±3天，肝脏及肺脏未见明显的转移灶。第3代移植瘤成瘤率为100％(20/20)，潜伏期为18±2天，肝脏及肺脏未见明显的转移灶。第5代移植瘤成瘤率为100％(20/20)，潜伏期为11±2天，皮下移植瘤如图1。具体情况详见表一。

表一CSQT-2N各代移植瘤成瘤性和转移性

*和第1代相比，p＜0.05

原位移植模型构建

从上述CSQT-2N模型中取材，将2mm大小肿瘤组织块植入肝脏后，可在肝脏形成明显的肿瘤灶，构建了人肝癌门静脉癌栓裸鼠原位移植模型，35天后处死荷瘤鼠，解剖后发现肝脏肿瘤呈白色、质硬，余肝有硬化结节形成(如图2)。

二、具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系的建立

(一)、材料

1.两种不同的细胞培养液及其配制方法

1.1培养液D/F∶DMEM/F12(1∶1)(美国GIBCO公司)，10％(v/v)胎牛血清(美国Biochrom AG公司)，EGF(Epidermal Growth Factor，表皮生长因子)20ng/ml(美国Sigma公司)，5ug/ml胰岛素，0.30g/L的L-谷氨酰胺，100U/L青霉素，100ug/L链霉素；

1.2培养液DMEM∶高糖DMEM培养基(美国GIBCO公司)，10％(v/v)胎牛血清(美国Biochrom AG公司)，0.30g/L的L-谷氨酰胺，100U/L青霉素，100ug/L链霉素。

2.其余细胞培养材料

细胞筛(美国BD公司)；程序冻存盒(美国NALGENE公司)；0.05％I型胶原酶溶液(美国Sigma Chemical公司，St.Louis，MO)；胰蛋白酶消化液：0.25％胰酶(美国GIBCO公司)+0.02％EDTA，PH值为7.3；细胞冻存液(DMEM∶FBS∶DMSO＝7∶2∶1)；D-Hank’S洗液(PH值为7.2-7.4)；

3.标本来源

实施例1中肝脏原位种植瘤组织。

4.实验动物

(二)、方法

从实施例1中肝脏原位种植瘤取材，采用消化法获取癌栓细胞，通过原代培养、肿瘤“细胞岛”(所谓“细胞岛”是指单细胞克隆形成的细胞集落，周围无细胞生成，貌似“岛屿”)的克隆扩大培养、肿瘤细胞的传代培养等步骤建立一株能在体外稳定传代的细胞系，具体的方法如下：

1.癌栓细胞的获取及原代培养

将新鲜裸鼠移植瘤组织剔除血污及坏死组织，用含5倍浓双抗(500u/mL青霉素和500ug/mL链霉素)D-Hank’S冲洗3次后剪成约1mm3大小，用0.1％的胶原酶(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)在37℃下消化30min，加入培养液DMEM(含10％胎牛血清)终止消化，用75um孔径的细胞筛(cell strainer)过滤，除去未消化组织，在滤液中加入D-Hank’s液3ml，1000rpm离心5min，弃去上清，用D-Hank’s液漂洗重悬细胞沉淀1次，1000rpm离心5min，弃去上清，将沉淀细胞悬浮于培养液D/F，接种于一次性塑料培养皿中(d＝35mm)，放入37℃，5％CO2的空气环境、饱和湿度的细胞培养箱中培养。

2.肿瘤“细胞岛”的克隆扩大培养

培养数天后，通过肿瘤细胞克隆消化法，获取纯种的肿瘤细胞，对肿瘤细胞进行扩大培养，避免了成纤维细胞对肿瘤细胞的抑制作用。具体方法如下：先将细胞接种到培养皿，培养5天～7天后，很多肿瘤细胞凋亡，但出现了一些生长旺盛的“细胞岛”，在倒置相差显微镜下对这些“细胞岛”位置在平皿底部用油性笔定位标记。将培养液吸弃，加入2ml胰蛋白酶消化液预消化，使用20ul移液枪吸取10ul培养液，让消化液保持在枪头管口处，将枪头置于所标记的“细胞岛”上面，吹出少量培养液，随即将培养液重新吸回移液枪的枪头内。将含细胞的培养液种入24孔板内，加入约1ml的D/F培养液继续培养。每隔3～4天换2/3的D/F培养液，细胞长满皿底的80％～90％后进行扩大培养。

3.肿瘤细胞的传代培养

根据细胞的状态及培养液颜色的变化，每隔3-4天更换2/3的D/F培养液，细胞长满皿底的80％-90％即应及时消化传代，分种率1∶2，接种细胞密度为5×10⁵/皿(d＝100mm)。D/F培养液体外培养到20代以后，细胞生长稳定，换用DMEM培养液进行培养。

(三)、结果

该细胞在体外连续传代一年多，目前已传至100多代，命名为CSQT-2。具体如下：

1.癌栓细胞的原代培养

原代细胞贴壁生长，1周后出现6个较大的“细胞岛”。

2.肿瘤“细胞岛”的克隆扩大培养

经过“细胞岛”的克隆扩大培养法，在6孔板中有一个“细胞岛”来源的细胞在5天后长满皿底，传代到小皿，6天后传代到中皿，4天后传代到大皿(d＝100mm)，在大皿里4天后长满皿底的80％，按1∶2传代(已经第六代)。此后细胞生长开始加速。

3.肿瘤细胞的传代培养

从第六代开始，每隔3天传代一次，每次分种率为1∶2，培养液使用D/F培养液。细胞生长稳定，到20代后，改换成DMEM培养液，细胞经过5天的生长缓慢期，然后继续以每3天一代的速度进行传代，目前已经在体外培养维持一年多，传代至100余代，命名为CSQT-2。

三、CSQT-2肝癌细胞系生物学特性

在本实施例中，用常规方法对保存号为CCTCC NO：C200913的细胞系CSQT-2进行生物学特性的检测。方法如下：

(一)、实验方法

1.形态学

(1)大体形态

细胞接种2天后，观察群体细胞的生长形态。

(2)光镜

在倒置相差显微镜下观察培养的活细胞形态结构及其生长特点。

(3)电镜

取40代细胞，扫描及透射电镜观察细胞的超微结构。

2.细胞动力学

(1)细胞生长曲线的绘制及细胞群体倍增时间

取生长良好的对数生长期细胞(第20代)，胰蛋白酶消化细胞，轻轻吹匀，倍比稀释，以每孔100ul(0.6×10⁴)接种于96孔板，每孔再加入DMEM完全培养液100ul，使细胞终浓度为3×104/mL，每组3个复孔。另外一组使用D/F培养液做对照，培养板放入孵箱。24h后，在每组的3孔细胞中加入MTT20uL(5mg/mL)，置孵箱培养4h后取出，吸尽上清，加入DMSO 150uL，置孵箱30min后取出，吸尽孔内液体至一空白96孔板，微型振荡仪上振荡5min，选择波长为550nm，在ELISA仪上测定吸光值，取均值，DMSO做空白对照。其余细胞每2天更换培养液。以后每24h测定吸光值，连续7天，以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。用半高度法计算群体倍增时间。

(2)细胞贴壁率

取对数生长期细胞，观察细胞生长良好，胰蛋白酶消化细胞，轻轻吹匀，稀释悬液，计数，以每孔1.2×10⁴接种于24孔板中，共5孔，第0.25h、0.5h、1h、2h、4h分别计数贴壁细胞数，计算出每个时间点的贴壁率，并绘制贴壁率随时间变化图。

3.染色体分析

第40代对数生长期的CSQT-2细胞经秋水仙素(终浓度0.05ug/mL)处理1小时后，10％胰蛋白酶消化，1000r/min离心10min，吸去上清液。然后用0.075mol/L KCI低渗处理30min，加入固定液(甲醇∶冰乙酸＝3∶1)混匀预固定，同前离心，吸去上清，再重复固定两次，最后用适量固定液，轻轻吹匀制成细胞悬液，冰湿片滴片，室温老化后将标本放入预温87.5℃的Earle’s溶液中温育，片与片之间留有空隙，进行R显带，标本温育60min后，每隔5～10min取出1～2片，流水下冲洗。温育时间约在60～120min之间。用新鲜配制的10％Giemsa染色液染色8～10min，取出水洗，待干，用Leica CW4000Karyo分析软件镜检分析。

4.AFP与HBsAg检测

分别取第10代和第40代的CSQT-2细胞的培养上清，1200转/分离心12分钟，取上清，送第二军医大学东方肝胆外科医院检验科，检测AFP、HBsAg等。

5.冻存与复苏

细胞的冻存：每隔2-3代，留一皿细胞消化后进行冻存，具体方法如下：取一皿细胞常规胰酶消化后加入含血清的培养液终止消化后，进行细胞计数，按1000转/分离心5分钟，弃上清，用冻存液重悬细胞，最后冻存密度为1×10⁶个/ml，每个冻存管1ml。冻存管放置到程序冻存盒(美国NALGENE公司)内，-80℃过夜，次日放置到液氮中，长期保存。

细胞的复苏：从液氮中取出冻存管，在41℃水浴锅中用力振荡，在1分钟内使冻存液溶解，用1000转/分离心5分钟，弃上清，用培养液重悬细胞，利用胎盘蓝染色计数活细胞存活率，按1×10⁶个/皿(d＝100mm)接种，放入培养箱内培养，次日2/3量换液。

6.异体成瘤及门静脉癌栓形成能力检测

(1)将对数生长期的CSQT-2细胞，用0.25％胰蛋白酶消化后，制成1×10⁷细胞/mL细胞悬液，备用。

(2)实验动物与动物饲养：BALB/c-nu/nu裸鼠，4-6周龄，购自上海中科院斯莱克实验动物研究中心。实验过程中，裸鼠饲养于局部100级净化饲养柜中，自由进水、进食。细胞接种及给药均在局部100级净化工作台中进行。

(3)细胞异体接种：4～6周龄BALB/c-nu/nu裸鼠，雌雄不拘，每组5只，每只在双侧鼠蹊部皮下接种CSQT-2细胞悬液，按细胞数量分为3组，A组细胞为8×10⁴，B组细胞8×10⁵，C组细胞为8×10⁶。

(4)接种后第八天开始观察成瘤情况。出现肿瘤块，每隔4天称裸鼠体重，并用游标卡尺测量瘤块的长径(L)和短径(W)。体积(v)计算采用经验公式：v＝(W²×L)/2mm³。

(5)5只裸鼠肝脏接种后5周，处死荷瘤鼠，将肝脏病理切片进行HE染色，检测肿瘤门静脉转移情况。

7.克隆形成率

接种分散均匀的第40代CSQT-2细胞于6孔板中，每孔1000个细胞，加入2mlDMEM培养液，静止培养2-3周。当培养板中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。甲醇固定加适量结晶紫染料染色，计数克隆数，取平均值。集落形成率＝克隆数/接种细胞数×100％。

(二)、实验结果

1.形态学

(1)大体形态

细胞接种2天后，肿瘤细胞排列成索状生长，与肝小叶排列相似(见图3)。

(2)光镜

在倒置相差显微镜下观察培养的活细胞，大多呈多角形，胞浆丰富，核大，圆形，核仁多个而明显，可见核分裂和瘤巨细胞。

(3)电镜

扫描电镜显示细胞表面有皱褶，周围有微绒毛或指状突起(图4)。透射电镜显示细胞外形不规则，核大有畸变，核质比例增大，核膜有凹陷，有多个核仁，胞质内有丰富的游离核糖体、线粒体、内质网、溶酶体等细胞器，细胞表面有微绒毛，可见细胞间紧密连接(见图5)。

2.细胞动力学

(1)细胞生长曲线的绘制

细胞在两种不同培养基中的生长曲线(见图6)。在DMEM培养条件下，利用半高度法计算细胞群体倍增时间为36小时。

(2)细胞贴壁率

种植4小时后大部分细胞(98％以上)均可以贴壁生长。

3.染色体分析

染色体为三倍体和四倍体之间，主流在67-94条，占总数的88％，见图7、8。

4.肿瘤标志物及乙肝表面抗原检测

第10代和第40代CSQT-2细胞培养上清均未检测到AFP和HBsAg的分泌。

5.冻存与复苏

冻存后的细胞复苏，细胞的存活率约为70％，活细胞培养状况良好。

6.异体成瘤

皮下瘤成瘤率为95％，肝脏包膜下接种成瘤率100％；皮下瘤成瘤潜伏期时间为15±3天，而肝包膜下接种成瘤潜伏期为12±2天；发生肺转移情况是皮下成瘤有4只，而肝脏成瘤的3只在肉眼观下可发现肺脏表面可疑结节，可能是微小转移灶；皮下成瘤的发生肝内转移的裸鼠数2只，而肝包膜下接种的5只裸鼠均发生肝内转移；皮下成瘤裸鼠的肝脏病理切片未发现明显的镜下门静脉癌栓，而肝包膜下接种的镜下门静脉癌栓发生率为80％(如图9)。具体情况详见表二。

表二CSQT-2细胞成瘤性和转移性检测

*和皮下成瘤性比较，p＞0.05；#和皮下成瘤比较，p＜0.05

7.克隆形成率

通过计算得到肿瘤细胞的克隆形成率为35±3.0％。

Claims

1.一株具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系(CCTCC NO：C200913)，其特征在于：将该细胞形成的皮下移植瘤接种到裸鼠肝脏成瘤后，能检测到门静脉癌栓的形成，且裸鼠门静脉癌栓与原移植瘤的组织结构相似。

2.根据权利要求1所述的具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系(CCTCC NO：C200913)，其特征在于：所述门静脉癌栓的形成率为80％。

3.根据权利要求1所述的具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系(CCTCC NO：C200913)，其特征在于：该细胞系为异倍体核型，染色体数目和结构畸变。

4.根据权利要求1或3所述的具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系(CCTCC NO：C200913)，其特征在于：所述细胞系的核型分析显示为超三倍体，主流在67-94条，占总数的88％。

5.一株具有门静脉转移潜能的人肝癌细胞系(CCTCC NO：C200913)的建系方法，包括以下步骤：

(1)、人肝癌门静脉癌栓组织在裸鼠皮下移植；

(2)、皮下移植瘤传代；

(3)、利用第五代皮下移植瘤进行裸鼠肝脏接种；

(4)利用肝脏肿瘤进行原代培养建系。