CN102697581A - 一种构建组织工程血管的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种血管脱细胞基质膜片的制备方法，所述的方法是沿新鲜血管纵轴剪开血管，剔除外膜及刮除内皮层，切成长方形血管块，沿血管块所在平面切成长方形薄片，脱细胞后冻干。本发明还提供一种构建组织工程血管的方法，它包括下列步骤：a）按上述方法制备血管脱细胞基质膜片；b）培养血管平滑肌细胞；c）三明治法构建组织工程血管。本发明优点在于：切片方法可制备得到更有利于细胞迁移和增殖的充分脱细胞的血管支架，同时可构建任意口径的组织工程血管；三明治法构建组织工程血管可保证种子细胞充分种植于膜片的多孔结构中，利于其伸展和增殖，获得的组织工程血管性能优良。

Description

一种构建组织工程血管的方法

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，具体地说，是一种血管脱细胞基质膜片的制备方法，及基于该方法的构建组织工程血管的方法。

背景技术

血管疾病是我国目前死亡率最高疾病之一，血管移植是其主要的外科治疗手段。血管移植手术中需要利用组织工程血管来替代病患血管。组织工程血管是利用组织工程学方法，用血管种子细胞（内皮细胞、平滑肌细胞）与相关细胞外基质（支架材料）复合，以构建从形态到功能都接近活体血管的组织工程化血管。

血管组织支架是活细胞在体外生长所需的支持物，提供一个供种子细胞生长的三维空间，便于细胞黏着、生长和新陈代谢。支架材料除了应具有良好的生物相容性、血液相容性、无免疫原性和一定的可塑性、抗张强度和弹性，还应有适合细胞迁移和增殖的多孔结构、与细胞长入和基质分泌相当的生物降解速度、有利于细胞贴附和增殖的表面化学特性。

目前常用的支架材料有天然材料、人工合成材料和复合材料。应用于组织工程血管研究的天然材料包括甲壳素、葡聚糖明胶、胶原蛋白、弹性蛋白、多聚氨基酸、多肽、透明质酸及其复合物、某些组织的脱细胞基质等。天然材料支架本身包含许多生物信息，能够提供细胞所需的信号，且与细胞亲和性强，能为细胞提供近似体内的发生发育的细胞外基质支架条件，能使细胞聚集成组织，控制组织结构，调节细胞表型，并具有极低的免疫排斥反应和良好的顺应性，是构建组织工程血管的良好载体。现在应用较多的脱细胞血管基质材料均富含胶原，保持着胶原纤维、弹性蛋白等结构蛋白的构象和原有的排列分布，力学特性及强度与脱细胞前相似。

中国期刊《中国修复重建外科杂志》，2003年第17卷第2期，刊出的论文“脱细胞基质与血管内皮细胞体外相容性的研究”，公开了一种利用0.1%胰蛋白酶、0.02%乙二胺四乙酸钠和1.0% Triton X-100对猪主动脉作用24小时和176小时进行脱细胞，结果证明酶-化学除垢剂的脱细胞方法几乎使细胞完全脱落，且基质纤维的三维结构变得疏松，体外空增的异体猪序贯内皮细胞可以种植在脱细胞基质上并且具有伸展和增殖功能。但实际上该方法还存在以下缺陷：（1）采用完整的猪主动脉置入脱细胞溶液中，势必导致脱细胞溶液与猪主动脉不能充分接触，脱细胞效率低，进而影响移植后近、远期的血管通畅率；（2）只能构建特定直径（与原猪主动脉直径相同）的脱细胞基质及组织工程血管，仍未解决临床上常用的小口径血管移植物来源有限的问题。因此，亟需一种脱细胞化程度高的脱细胞基质的制备方法，及可构建任意口径组织工程血管的方法，但是目前关于这类方法还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种血管脱细胞基质膜片的制备方法。

本发明的再一的目的是，提供一种构建组织工程血管的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种血管脱细胞基质膜片的制备方法，所述的方法是沿血管纵轴剪开血管，剔除外膜及刮除内皮层，切成长方形血管块，沿血管块所在平面切成长方形薄片，脱细胞后冻干。

所述的血管取自成年猪主动脉弓及升主动脉。

所述的长方形血管块长15mm，宽10mm。

所述的长方形薄片的厚度是20μm。

所述的脱细胞是采用质量分数1%的SDS溶液脱细胞。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种构建组织工程血管的方法，它包括下列步骤：

a）按照如上所述的方法制备血管脱细胞基质膜片；

b）培养血管平滑肌细胞；

c）三明治法构建组织工程血管：胰蛋白酶消化步骤b）获得的平滑肌细胞，将步骤a）的血管脱细胞基质膜片和消化后的平滑肌细胞按照“膜片－细胞悬液－膜片－细胞悬液”的方式在硅胶管上层层叠加，置入含低糖DMEM和FBS的培养液中培养。

所述的平滑肌细胞是人平滑肌细胞。

所述的硅胶管外直径为6mm，所述的细胞悬液每滴加5μl则所述的膜片环绕叠加20层。

所述的组织工程血管是在含5% CO₂ 的37℃培养箱中培养，隔两天半量换液（即隔两天倒出一半培养液，并补充进去相同体积的新鲜培养液），培养1周。

本发明优点在于：

1、本发明的构建组织工程血管的方法通过切片方法可制备得到充分脱细胞的血管脱细胞基质膜片，该膜片更有利于细胞的迁移和增殖，是一种良好的支架材料，同时切片方法可构建任意口径的组织工程血管，从而解决了临床上特定口径血管来源有限的问题；

2、本发明的构建组织工程血管的方法采用三明治法，将血管脱细胞基质膜片和平滑肌细胞按照“膜片－细胞悬液－膜片－细胞悬液”的方式在硅胶管上层层叠加，可保证平滑肌细胞充分种植于膜片的多孔结构中，利于其伸展和增殖，获得的组织工程血管性能优良。

附图说明

附图1是血管脱细胞基质膜片的鉴定图。

附图2是冻干的脱细胞基质膜片及和人平滑肌细胞复合后的图，A：脱细胞基质膜片大体观；B：人脐动脉平滑肌细胞；C：人脐动脉平滑肌细胞接种在膜片上；D：人脐动脉平滑肌细胞经CM-Dil标记。

附图3是三明治法构建组织工程血管模式图。

附图4是组织工程血管的体内成熟与鉴定图，A：组织工程血管裸鼠体内8周；B，C：裸鼠体内8周的大体观；D：CM-Dil染色；E：DAPI染色；F：D和E图的叠加；G：HE染色整体观；H：HE染色；I：Masson染色。

附图5是组织工程血管与正常猪主动脉弹性模量的比较图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1  应用血管脱细胞基质膜片构建组织工程血管

一、材料和方法

1、血管脱细胞基质膜片的制备与检测

取新鲜成年猪主动脉弓及升主动脉，沿血管纵轴剪开血管后，剔除外膜及刮除内皮层，切成长15mm，宽10mm长方形血管块。冰冻切片机沿血管块所在平面切成厚度20μm的长方形薄片，置入质量分数1% SDS（上海生工购买的SDS溶液，取1g溶液，加入99ml纯水）溶液，于摇床震荡8小时。切片用蒸馏水漂洗过夜，常规苏木素-伊红（HE）染色和二脒基苯基吲哚（DAPI）（invitrogen，美国）荧光染色，检测膜片脱细胞程度，另外对膜片行弹性蛋白和一型胶原免疫组化染色，检测细胞外基质情况。切片用冷冻干燥机（Virtis，美国）冻干，冻干温度是－50-－55℃，时间过夜，冻干后备用。

2、人血管平滑肌细胞的培养

取人脐动脉，于超净工作台上清除结缔组织，剥除动脉外膜，纵向剖开血管，钝性刮除内膜面，去除内皮细胞，剩余血管中膜组织。用含100U/mL青、链霉素的生理盐水反复冲洗后，用眼科弯剪反复剪切成1mm×1mm大小的组织块，并把剪切好的组织小块均匀摆置于瓶底，组织块间距0.5cm。盖好瓶盖，轻轻翻转培养瓶，让瓶底朝上并向瓶内注入适量低糖DMEM（Hyclone，美国，货号SH30021.01B，葡萄糖浓度1000mg/ml）含10%胎牛血清（FBS，Hyclone，美国）的培养液，置于含5% CO₂ 的37℃孵箱内放置2-4h使组织块干涸并与瓶壁贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，使组织块完全浸入培养液中，继续静置培养3-5d。待有细胞从组织块周围游出后换液，待90％融合后传代。

3、三明治法构建组织工程血管

用0.25%胰蛋白酶消化收集培养的平滑肌细胞，经过CM－Dil标记后用含体积分数10% FBS的低糖DMEM培养液重新悬浮至10×10⁶/ml，将血管脱细胞膜片和平滑肌细胞按照“膜片－细胞悬液－膜片－细胞悬液”的方式在外直径为6mm的硅胶管上层层叠加，细胞悬液每滴5μl，共环绕叠加20层膜片。静置半个小时后放入50mL离心管中，加低糖DMEM，10％FBS的培养液覆盖复合物，置于含体积分数5% CO₂ 的37℃培养箱培养。隔2d半量换液，培养1周后裸鼠皮下移植，8周后取材。

4、构建的组织工程血管的鉴定

4.1细胞检测

为了观察裸鼠体内形成的肌性管腔内细胞来源于接种的种子细胞而非宿主细胞，将接种前的人平滑肌细胞用染料CM－Dil标记，取材后肌性管腔经固定脱水处理后冰冻切片，荧光显微镜下观察。

4.2组织学检测

HE染色：将切片脱蜡水化后苏木素染色5分钟，冲洗后盐酸酒精分化数秒，自来水洗返蓝30分钟，伊红染色1分钟后乙醇脱水；二甲苯透明后中性树脂封片。

Masson 染色：将切片脱蜡水化后Weiger氏铁苏木素5-10分钟水洗后1%盐酸酒精分化后再次水洗，丽春红酸性品红液染5-10分钟，水洗后1%磷钼酸水溶液处理5分钟，绿液复染5分钟，1%冰醋酸处理1分钟，95%酒精脱水多次，无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

4.3生物力学检测

    将组织工程血管剪成3mm宽的环状后剪断，用千分尺测量其厚度后通过万能拉力检测仪（Instron-3343）检测其力学性能，计算弹性模量。取内径同样为6mm的小猪主动脉作为对照组。

二、结果

1、血管脱细胞基质膜片的脱细胞程度

应用冰冻切片机将猪升主动脉及主动脉弓切成20μm的薄片，分别经SDS处理8小时后 DAPI染色及HE染色。HE和DAPI染色证实20μm厚的切片经SDS处理8小时脱细胞完全（见图1），免疫组织化学染色显示，脱细胞后，依然保留了较好的细胞外基质成分：弹性蛋白和一型胶原（见图1）。经SDS脱完细胞的血管切片脱细胞基质韧性较强，冻干后呈白色片状，（见图2A），可作为支架材料用于进一步的肌性管腔的构建。

2、组织工程血管体内外构建

人脐动脉平滑肌细胞经过CM－Dil标记后荧光显微镜下观察为红色（见图2D）。将标记的细胞接种在20μm厚的血管脱细胞膜片上（见图2C），采用“三明治”复合的方法将平滑肌细胞和膜片复合（见图3），其中接种细胞浓度为10⁶/ml，体外培养1周后可见有肌性管腔样组织形成，然后移植到裸鼠皮下，使其进一步成熟。

3、构建组织工程血管的检测

裸鼠皮下移植8周后取材，大体看：构建的组织工程血管与裸鼠自身组织分界清晰，弹性好，硬度适中，内壁光滑，平放可独立支撑成管状（见图4A，B，C）。冰冻切片显示组织中存在大量红色荧光的细胞，这些细胞均匀分布于肌性管腔内，从而表明接种的种子细胞参与了肌性管腔的形成并且在管壁内部生长存活下来（见图4D，E，F）。HE切片显示组织结构致密，细胞分布均匀，Masson染色显示构建的组织工程血管中胶原纤维丰富（图4G，H，I）。生物力学检测表明，利用脱细胞基质膜片构建的组织工程血管弹性模量与直径为6mm的正常猪主动脉血管无统计学差异（P＝0.344）（见图5）。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种血管脱细胞基质膜片的制备方法，其特征在于，所述的方法是沿血管纵轴剪开血管，剔除外膜及刮除内皮层，切成长方形血管块，沿血管块所在平面切成长方形薄片，脱细胞后冻干。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的血管取自成年猪主动脉弓及升主动脉。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的长方形血管块长15mm，宽10mm。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的长方形薄片的厚度是20μm。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的脱细胞是采用质量分数1%的SDS溶液脱细胞。

6.一种构建组织工程血管的方法，其特征在于，它包括下列步骤：

a）按照权利要求1所述的方法制备血管脱细胞基质膜片；

b）培养血管平滑肌细胞；

c）三明治法构建组织工程血管：胰蛋白酶消化步骤b）获得的平滑肌细胞，将步骤a）的血管脱细胞基质膜片和消化后的平滑肌细胞按照“膜片－细胞悬液－膜片－细胞悬液”的方式在硅胶管上层层叠加，置入含低糖DMEM和FBS的培养液中培养。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的平滑肌细胞是人平滑肌细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的硅胶管外直径为6mm，所述的细胞悬液每滴加5μl则所述的膜片环绕叠加20层。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的组织工程血管是在含5% CO₂ 的37℃培养箱中培养，隔两天半量换液，培养1周。

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