CN101285049B - 一种获得血管平滑肌细胞的方法及体外构建血管 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种获取血管平滑肌细胞的方法，它它包括步骤：将脂肪干细胞(ADSCs)诱导分化成血管平滑肌细胞(VSMCs)，所述的诱导条件为：转化生长因子β1(TGFβ1)5±3ng/ml，血小板源性生长因子(PDGF)50±30ng/ml。本发明还公开了在体外利用上述方法得到的血管平滑肌细胞构建组织工程化血管移植物的方法。

Description

一种获得血管平滑肌细胞的方法及体外构建血管

技术领域

本发明涉及组织工程，尤其涉及获得血管平滑肌细胞的方法和由此体外构建血管的方法。

背景技术

对于组织工程化血管而言，首要解决的问题是种子细胞的来源以及数量问题。以往的研究主要集中在自体非必需血管壁细胞的体外培养和扩增方面。自体血管细胞极易受来源有限，细胞扩增能力不足等因素的影响而被限制。干细胞研究兴起后，研究者们对热点之一的骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Stem Cells，BMSCs)研究后发现，在特定诱导环境下可使其呈现血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cells，VSMCs)类似的生长方式，并表达血管平滑肌细胞的特异性标记物，诱导后的细胞可以与生物材料良好结合。虽然成体干细胞的应用大大拓展了种子细胞的来源，克服了胚胎干细胞应用中存在的伦理性问题。但骨髓穿刺给病人带来很大的痛苦。

脂肪干细胞(Adipose derived stem cells，ADSCs)是一类存在于脂肪组织基质中，增殖能力强、具有多向分化潜能的成体干细胞。而临床上脂肪抽吸术后脂肪组织大多丢弃，造成了宝贵干细胞的大量浪费。ADSCs与BMSCs同样起源于中胚层，在干细胞表面分子表达方面二者有诸多相似之处，体外诱导实验也证实二者均具备多向分化潜能。ADSCs获取方便，对机体损伤更小，易于被患者接受，但对ADSCs能否向血管平滑肌细胞分化尚未见诸报道。

因此本领域迫切需要提供将ADSCs作为血管组织工程种子细胞的方法。

种子细胞、支架材料、构建体系是组织工程技术的基本要素。对于组织工程化血管而言，构建体系的优化至关重要。血管组织不同于骨和软骨等实体组织，其壁细胞始终处于较为恒定和节律性的力学作用下，并且这种力学作用通过液体作为传递媒体。血管特殊的生长方式和运作环境决定了组织工程血管必须首先在体外进行构建。在体外构建血管组织时，对细胞材料复合物施以动态力学刺激可以促进血管组织的形成。虽然已有报道显示通过模拟血管搏动，对缚于硅胶管上的血管平滑肌细胞与PGA材料的复合物施加搏动力学刺激可初步构建血管组织。但本领域还需要进一步以ADSCs为种子细胞，在体外动态力学刺激环境下，以使诱导后的ADSCs复合生物材料形成血管样组织。从而在有了质和量保证的种子细胞、良好的生物支架基础上建立血管构建技术。

发明内容

本发明旨在提供由脂肪组织获得血管平滑肌细胞的方法。

本发明的另一个目的是提供由上述方法得到的血管平滑肌细胞细胞构建组织工程化血管移植物。

在本发明的第一方面，提供了一种获得血管平滑肌细胞的方法，它包括步骤：在分化诱导条件下培养脂肪干细胞，从而将脂肪干细胞(ADSCs)诱导分化成血管平滑肌细胞(VSMCs)。

在另一优选例中，所述的分化诱导条件为：转化生长因子β1(TGFβ1)5±3ng/ml，且血小板源性生长因子(PDGF)50±30ng/ml。

在另一优选例中，分化诱导时ADSCs细胞密度为1.0-4.0×10⁴/cm²。

在另一优选例中，所述的ADSCs由脂肪消化、分离、培养得到。

在另一优选例中，TGFβ1为5±1ng/ml，PDGF为50±10ng/ml。

在另一优选例中，诱导时ADSCs细胞密度为1.5-3.0×10⁴/cm²。

在另一优选例中，所述的PDGF选自PDGF-AA，PDGF-BB，或PDGF-AB。更佳地为PDGF-BB。

在另一优选例中，所述的诱导条件还有在37±2℃诱导10-30天。

在本发明的第二方面，提供了一种脂肪干细胞的用途，所述的用途包括：(1)用于制备血管平滑肌细胞的种子细胞；或(2)作为制备血管移植物的种子细胞。

在本发明的第三方面，提供了一种由上述方法得到的血管平滑肌细胞。

在本发明的第四方面，提供了一种上述方法获得的血管平滑肌细胞的用途，所述的用途包括：(1)用于制备器官移植中的移植物；或(2)作为种子细胞制备血管移植物。

在另一优选例中，所述的用途是用于制备同种同体、同种异体或异种异体间的血管移植物。

在本发明的第五方面，提供了一种制备组织工程化血管移植物的方法，它包括步骤：

a.将如权利要求4所述的血管平滑肌细胞接种于片状的药学上可接受的生物可降解材料，形成细胞材料复合物；

b.将细胞材料复合物包卷于弹性材料管；

c.在适合平滑肌生长的条件下培养步骤b的细胞材料复合物3-15天；

d.施加动力学刺激，从而得到组织工程化血管移植物。

在另一优选例中，步骤c中将步骤b的细胞材料复合物培养3-15天。

在另一优选例中，步骤d中通过弹性材料管施加以下动力学刺激，继续培养20-250小时，搏动频率50-200次/分钟，流量120-350ml/分钟，压力40±10mmHg，搏动频率和流量是线性渐增的，从而得到组织工程化血管移植物。

在另一优选例中，所述的动力学刺激是间歇性的。

在另一优选例中，其特征在于，在施加动力学刺激的同时加入细胞因子进行培养。

在本发明的第六方面，提供了一种由上述方法得到的组织工程化血管移植物。

据此，本发明提供了将ADSCs作为血管组织工程种子细胞的方法。本发明还提供了在有了质和量保证的种子细胞、良好的生物支架基础上建立血管构建的技术。

附图说明

图1显示了倒置相差显微镜所观察到的体外培养的ADSCs；

其中A是原代ADSCs接种24小时；B是第一代的ADSCs细胞；C是经联合诱导后的第一代ADSCs；D是经联合诱导的细胞长至融合后。Bar＝500μm

图2显示了各组细胞计数结果。

图3显示了平滑肌α肌动蛋白(α-SM-actin)免疫荧光检测结果；

其中A是诱导组细胞；B是未诱导组细胞；C是脐动脉平滑肌细胞；D是软骨细胞。Bar＝100μm

图4显示了平滑肌肌球蛋白重链(Smooth Muscle Myosin Heavy Chain，SM-MHC)免疫荧光检测结果；

其中E是诱导组细胞；F是未诱导组细胞；G是脐动脉平滑肌细胞；H是软骨细胞。Bar＝200μm

图5显示了各组细胞肌钙结合蛋白(calponin)表达情况；

其中I是诱导组细胞；J是未诱导组细胞；K是脐动脉平滑肌细胞；L是软骨细胞。Bar＝100μm

图6显示了RT-PCR检测α-SM-actin，SM-MHC，Calponin和平滑肌-22α(SM-22α)表达的结果；

其中A是α-SM-actin；B是SM-MHC；C是Calponin；D是SM-22α。

图7显示了Wstern-blot检测SM-22α表达的结果；

其中A是脐动脉平滑肌；B是诱导组细胞；C是未诱导组细胞；D是软骨细胞。

图8显示了流式细胞仪的检测结果；

其中A是流式细胞仪检测诱导前平滑肌标记表达阳性率的结果；B是流式细胞仪检测诱导后平滑肌标记表达阳性率的结果。

图9显示了血管紧张素(Angiotensin-II)作用前后细胞荧光强度变化情况；

其中A、D、G为加药前荧光表现；B、E、H为加药后瞬间荧光表现；C、F、I为药物作用结束后恢复基态的荧光表现。A、B、C是脐动脉平滑肌细胞；D、E、F是诱导组细胞；G、H、I是未诱导组细胞。

图10显示了Angiotensin-II作用前后细胞荧光强度随时间变化情况；

其中A是脐动脉平滑肌细胞；B是诱导细胞；C是未诱导细胞。

图11显示了血管紧张素II作用前后荧光强度改变。

图12显示了倒置相差显微镜下的加工后的PGA材料；

其中A、B是加工后的PGA材料大体及镜下形态；C是接种细胞后12小时；D是接种细胞后48小时。

图13显示了细胞接种一周后电镜照片；

其中A是放大400倍；B是放大1500倍。

图14显示了反应器内培养四周后形态观察结果。

图15显示了培养四周后取材，大体形态观察结果；

其中A、C是搏动培养组织；C、D是静态培养组织。

图16显示了培养4周后组织学观察结果(H.E.染色)；

其中A是正常血管(脐动脉)；B是搏动组细胞；C是静态培养组细胞。

图17显示了培养4周后组织学观察结果(masson染色)；

其中A是正常血管(脐动脉)；B是搏动组组织；C是静态培养组。

图18显示了培养4周后免疫组化染色检测α-SM-Actin表达的结果；

其中A是正常血管(脐动脉)；B是搏动组；C是静态培养组。

图19显示了本发明实施例2中用于构建组织工程化血管移植物的生物反应器；

其中a是生物反应器；b是生物反应槽。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，发现由吸脂术后废弃的脂肪得到的脂肪干细胞，经过适宜的诱导条件可以诱导分化为血管平滑肌细胞；具体而言，所述的诱导条件是同时加入一定量的转化生长因子和血小板源性生长因子，在37±2℃诱导10-18天。

经过上述方法得到的血管平滑肌细胞，在引入特定的动力学刺激后，可在体外构建性能良好的组织工程化血管。

如本文所用，术语“BMSCs(Bone Marrow Stem Cells，骨髓基质干细胞)”是从骨髓中得到的具有增殖分化能力的干细胞。

如本文所用，术语“ADSCs(Adipose derived stem cells，脂肪干细胞)”是指从脂肪组织中得到的具有增殖分化能力的干细胞。所述的脂肪组织来源于哺乳动物，更优选于人。

如本文所用，术语“诱导”或“诱导分化”是指体外培养的ADSCs分别在成脂肪诱导条件下，表达脂肪细胞表型。

血管平滑肌细胞

本发明提供的获得血管平滑肌细胞的方法包括步骤：将ADSCs诱导分化成VSMCs。

本发明提供的将ADSCs诱导分化成血管平滑肌细胞的方法是在培养液基础上添加生长因子，所述的生长因子包括TGFβ1和PDGF。

对于所使用的ADSCs没有特别的限制，一种优选的方法是从脂肪组织得到ADSCs。所述的脂肪组织来源广泛，一种较佳的来源是哺乳动物，更佳地是来源于人吸脂术中废弃的皮下脂肪。脂肪组织经过消化、分离、培养得到ADSCs。所述的ADSCs是原代或传代后的ADSCs，较佳地，是经过传代后，造血系，内皮系细胞的污染迅速降低，细胞成分得以相对纯化的ADSCs。

诱导时ADSCs的接种密度为1.0-4.0×10⁴/cm²，较佳地为1.5-3.0×10⁴/cm²。

本发明所述的将ADSCs诱导分化为VSMCs的诱导因子包括间充质细胞有丝分裂剂和细胞增殖抑制剂。所述的间充质细胞有丝分裂剂选自PDGF，优选PDGF-BB；所述的细胞增殖抑制剂选自TGFβ1。

所使用的诱导因子的浓度为：5±3ng/ml的TGFβ1，50±30ng/ml的PDGF；较佳地，5±1ng/ml的TGFβ1，50±10ng/ml的PDGF。

本发明所使用的诱导条件还有：在37±2℃诱导10-30天，优选15-25天。

可以使用本领域常规的培养液，例如(但不限于)：M-199，EGM-2。

生物可降解材料

可用于本发明的组织工程化软骨的材料是医学上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)：

(a)人工合成的高分子可降解性材料，例如聚α-羟基酸(如聚乳酸PLA、聚羟基乙酸PGA、聚羟基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polya分钟oacid)、假聚氨基酸(pesudo-polya分钟oacid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；

(b)天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖(glycosa分钟oglycan，GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸盐、藻酸钙凝胶等；各种脱细胞基质；

(c)上述材料的混合物或复合材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合材料。

组织工程化血管移植物

将本发明诱导分化的VSMCs接种到生物可降解材料上形成细胞-生物材料复合物，将这一细胞-生物材料复合物在特定的动力学刺激下生长，便能形成弹性好的组织工程化血管。

具体地，本发明的组织工程化血管的制备方法是：

a.将一定数量的血管平滑肌细胞接种于片状的药学上可接受的生物可降解材料，形成细胞-材料复合物；

b.将细胞材料复合物包卷于弹性材料管；

c.在适合平滑肌生长的条件下培养步骤b的细胞材料复合物3-15天(更佳地4-7天)；

d.通过弹性材料管施加以下动力学刺激，继续培养20-250小时(较佳地50-200小时，更佳地100-160小时)，搏动频率50-200次/分钟，流量120-650ml/分钟，压力40±10mmHg，搏动频率和流量是线性渐增的，从而得到组织工程化血管移植物。

在给予动力学刺激的同时，可以添加其它各种细胞因子、生长因子、各种转基因成分。

本发明提供的组织工程化血管的形状通常为环状。本发明提供的组织工程化血管的厚度，没有特别限制，通常为5-200μm，较佳地为10-50μm，更佳地为20-40μm。

本发明提供的组织工程化血管中VSMCs浓度通常为0.5×10⁶-5×10⁸/ml或更高，较佳地为1×10⁶-1×10⁸/ml，更佳地为5×10⁶-5×10⁷/ml。通常，以培养液调整VSMCs的浓度，然后与生物可降解材料混合。混合时，培养液与生物可降解材料的比例没有特别限制，但以该材料能够吸附的培养液的最大量为宜。

本发明提供的组织工程化血管中还可复合其它各种细胞因子、生长因子、各种转基因成分，从而保持平滑肌细胞表型、促进平滑肌细胞生长。

本发明的方法形成的组织工程化血管移植物或平滑肌细胞，可直接植入体内皮下、平滑肌细胞缺损处。

本发明的主要优点在于：

1、利用废弃脂肪组织，ADSCs来源充足，获取方便，扩增迅速，有独特优势。

2、通过体外诱导有效获取VSMCs。

3.模拟哺乳动物血液动力学环境构建性能佳的组织工程化血管移植物。

下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold SptingHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

获得血管平滑肌细胞

材料和方法

一、材料与试剂

1.材料：

脂肪组织来源于上海第九人民医院整复外科脂肪抽吸术患者，均为女性，年龄20-45岁，抽吸部位为腹部，方式为电动负压式。

2.试剂：

胎牛血清	GIBCO公司(美国)
		M-199	GIBCO公司(美国)
L-谷氨酰胺	上海实生生物技术有限公司
		抗坏血酸	上海实生生物技术有限公司
青霉素	华北制药有限公司
		链霉素	华北制药有限公司
胰蛋白酶	上海实生生物技术有限公司
		维生素C	Sigma公司(美国)
I，II型胶原酶	Worthington公司(美国)
		TGF-beta-1	Sigma公司(美国)
PDGF-BB	Sigma公司(美国)
		RT-PCR引物	由上海生工生物工程公司合成
TaKaRa RNA PCR试剂盒	Biotech公司(美国)
		TRIZOL液	Invitrogen公司(美国)
牛血清白蛋白(BSA)	Sigma公司(美国)

胎牛血清	GIBCO公司(美国)
		氯仿	中国医药集团上海化学试剂公司
异丙醇	中国医药集团上海化学试剂公司
		绵羊血清	上海华美生物公司
琼脂糖(Agarose)粉剂	Sigma公司(美国)
		单克隆鼠抗人	Dako Cytomation公司(美国)
α-SM-actin
		单克隆鼠抗人SM-MHC	CHEMLCOW公司(加拿大)
单克隆鼠抗人calponin	Abcam公司(美国)
		多克隆羊抗人SM-22α	Abcam公司(美国)
血管紧张素II	Sigma公司(美国)
		羊抗鼠二抗	DAKO Carpinteria(美国)

3.主要仪器及器皿

恒温恒湿培养箱	Forma公司(美国)
		一次性10ml注射器	上海米沙瓦医科工业有限公司
培养皿，24及6孔板	Falcon公司(美国)
		离心管	Falcon公司(美国)
离心机	Biofuge(德国)
		低温高速离心机	Biofuge(德国)
倒置相差显微镜	Olympus公司(日本)
		精密天平	Mettler Toledo公司(瑞士)
超净工作台	上海医疗器械公司
		微量可调移液管	EPPENDORF公司(美国)

恒温恒湿培养箱	Forma公司(美国)
		震荡器	上海医疗器械公司
细胞计数仪	Beckman公司(美国)
		电泳仪	Amersham pharmcia biotech公司(美国)
STS-2型脱色摇床	上海琪特分析仪器有限公司
		电泳图象分析软件	上海天能公司
激光共聚焦显微镜	LSN-510，Zeiss(德国)

4.主要培养液和试剂的配制：

(1)含10％FBS基础培养液：

M-199培养基粉剂	10g/L
		胎牛血清	100ml/L
NaHCO<sub>3</sub>	2.2g/L
		抗坏血酸	37.5mg/L
L-谷氨酰胺	300mg/L
		青霉素	10万u/L
链霉素	10万u/L

调节pH值至7.2，经无菌0.22μm滤器过滤后分装，4℃保存备用。

(2)PBS的配制：

NaCl	8g/L
		KCl	0.2g/L
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O	2.9g/L
		KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	0.2g/L

调节pH值至7.2，分装，经1.034×10⁵Pa高压蒸汽灭菌20分钟。冷却后加青霉素、链霉素各100u/ml，4℃保存备用。

(3)胰酶-EDTA消化液的配制：

称取胰蛋白酶0.25g，EDTA 0.04g，适量PBS充分溶解，调pH至7.4，补三蒸水定容至200ml。0.22μm过滤除菌，分装，4℃保存。

(4)生长因子稀释液：

0.1％的牛血清白蛋白，4mM HCl，以PBS为溶剂。

(5)诱导液配制：

在M-199培养液基础上添加生长因子，调整浓度为TGF-β-1为5ng/ml，PDGF-BB为50ng/ml，生长因子稀释后-20℃保存，使用前解冻加入培养液。

二、实验方法

(一)ADSCs的分离，接种，扩增：

1.脂肪抽吸术中获取的脂肪，以无菌培养瓶装载，4℃下迅速转移至超净台；

2.吸净下层血液，无菌PBS冲洗两次，分装于50ml离心管，每管20ml脂肪；

3.每管加入等体积的I型胶原酶液，浓度为0.075％，37℃消化30分钟，摇床转速100rpm；

4.消化结束，300g离心10分钟，小心吸除上层脂肪油层和大部分上清，100μm滤网过滤离心成分，PBS洗涤两次，以含10％FBS的M-199培养液重悬细胞，取少量细胞悬液用4％乙酸等体积稀释破坏红细胞，常规计数有核细胞数，然后以5.0×10³/cm²的密度接种于100mm的Falcon培养皿中进行原代培养，培养条件：37℃、5％CO₂、95％空气，100％湿度。

5.培养24小时后首次换液，换液时先轻轻摇动培养皿使未贴壁的红细胞浮起，吸除含大量红细胞的培养液，PBS洗涤2-3次，此时在低倍镜下可清楚地见到大量点状贴壁细胞。加入新鲜培养液，继续在相同的条件下培养。4-5天后细胞可达到近融合状态，可进行传代。

6.细胞生长达到近融合状态后，吸除培养液，少量PBS洗涤一次，加入1.5-2.0ml的消化液(含0.02％EDTA的0.125％胰蛋白酶)，镜下见大部分细胞胞质回缩、形态变圆后，轻轻吸除消化液，加入适量的含血清的M-199培养液中止消化，收集细胞悬液、计数，以1.5×10⁴/cm²细胞密度接种于新的培养皿内，继续在相同的条件下培养。三天换液一次，每次更换三分之二量的培养液，一般4-5天后又可达到融合状态，可继续传代培养。

(二)TGFβ1和PDGF-BB对ADSCs的诱导分化与实验分组

1.细胞培养

取上述第一次传代后的ADSCs即可开始进行体外诱导，准备诱导时，传代接种密度应比一般接种密度要高一些，以2.0×10⁴/cm²细胞密度为宜，因为诱导剂量的TGFβ1对细胞增殖有较明显的抑制作用。一股在细胞全部贴壁后即可加入诱导因子。

2.诱导液加入

待细胞全部贴壁后，弃去旧培养液，加入含TGFβ1(5ng/ml)、PDGF-BB(50ng/ml)的M-199诱导液，置于37℃、5％CO₂、100％饱和湿度的条件下培养，隔日更换三分之二量的培养液，注意观察细胞形态的变化，一般4-5天后达到融合状态，可传代后继续用诱导液培养，于体外诱导21天时进行血管平滑肌细胞特异性表型的鉴定。

3.对照组细胞培养

对照组用含10％FBS的M-199培养液培养传代，传代以1.5×10⁴/cm²细胞密度接种即可，与诱导组同时传代，同期观察。

(三)细胞鉴定

1.细胞形态观察：倒置相差显微镜下，每日观察细胞生长情况和形态特征变化。

2.细胞生长曲线：收集体外原代培养融合时的细胞，精确计数。以10⁴个细胞/孔的密度接种于24孔板，各孔含对应的诱导或无诱导培养液1ml，常规培养并按时更换相应的培养液。体外培养8天，每天每组各取3个孔精确计数、计算均值与标准差，数据汇总后绘制生长曲线。

3.免疫荧光检测

(1)以脐动脉平滑肌细胞为阳性对照，人耳廓软骨细胞为阴性对照。细胞检测前，诱导组细胞，未诱导组细胞，脐动脉平滑肌细胞，皮肤成纤维细胞分别接种于盖玻片(经硫酸、乙醇处理，高压高温灭菌)，准备细胞爬片；

(2)诱导至预定时间，取出爬片，PBS漂洗2分钟×3次；

(3)用乙醇∶冰醋酸(99∶1)固定细胞15分钟，PBS漂洗2分钟×3次；

(4)滴加0.25％Triton X-100作用10分钟，PBS漂洗2分钟×3次；

(5)1％绵羊血清常温封闭30分钟；

(6)0.5％BSA稀释一抗单克隆鼠抗人α-SM-actin，滴加于玻片，湿盒4℃过夜；

(7)弃一抗，PBS漂洗2分钟×3次，滴加异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗鼠二抗，37℃孵育30分钟，PBS漂洗2分钟×3次；碘化丙啶(PI)(1∶1000)37℃孵育5分钟；

(8)荧光显微镜下观察，绿色荧光细胞为阳性细胞。

4.流式细胞检测

(1)消化后的细胞悬液用0.5％BSA-PBS离心1000rpm，5分钟，2次，制成单细胞悬液；

(2)诱导及非诱导细胞分装入Eppendorf管，保证每管含1×105以上的细胞，离心，分别加入抗α-SM-Actin，SM-MHC，Calponin单克隆抗体10μl，PBS50μl，混匀，4℃避光孵育30分钟；0.5％BSA-PBS离心1000rpm，5分钟，洗掉未结合抗体；

(3)0.5％BSA-PBS离心1000rpm，5分钟，洗掉未结合抗体；

(4)各管同时加入FITC标记的抗小鼠二抗4μl，混匀，4℃避光孵育30分钟，PBS离心1000rpm，5分钟，洗掉未结合抗体；

(5)1％多聚甲醛固定后，流式细胞仪检测；

(6)用只加有FITC标记二抗，而未加一抗的细胞作同型对照，以此设定阳性细胞阈值，其他标记阳性率与同型对照阳性率差值为实际细胞阳性率。

5.mRNA抽提以及RT-PCR检测

(1)细胞mRNA的抽提

①分别收集诱导细胞、非诱导细胞、阳性对照和阴性对照细胞于离心管中，弃培养液，PBS洗涤干净。分别加TRIZOL液1ml，充分混合，并用5ml一次性针筒来回抽吸4-5次，移入1.5ml的Eppendorf管粉碎细胞，冰浴静止15秒；

②加入400ul氯仿，剧烈振荡15-30秒，冰浴静止5分钟。在低温离心机内，12000rpm×15分钟，4℃离心；

③小心吸取上清0.8ml于另一Eppendorf管内，加入等量异丙醇(4℃预冷)，轻摇15秒。室温静置5分钟。低温离心机内，12000rmp×15分钟，4℃离心；

④弃上清，各加入75％乙醇(0.01％焦碳酸二乙酯(DEPC)配制)1ml，混匀，7500rpm×5分钟，4℃离心；

⑤去水渍(风干)，各加20μl 0.01％DEPC水溶解，测OD值，调整RNA浓度为1μg/ul，电泳鉴定后-70℃保存。

(2)RT-PCR反应

①逆转录反应(RT反应)

逆转录反应的各种成分按表1加样：

表1RT反应体系

组分	体积(μl)
		MgCl<sub>2</sub>	4
10×RNA PCR缓冲液	2
		RNAse Free dH<sub>2</sub>O	8.5
dNTP	2
		RNA酶抑制剂(RNAse Inhibitor)	0.5
逆转录酶(Reverse Transcriptase)	1
		寡聚脱氧胸腺苷酸引物(Oligo dT-Adaptor primer)	1
实验样品	2

反转录反应条件：

55℃20分钟；99℃5分钟；5℃5分钟。

②聚合酶链反应(PCR)：

1)引物序列见表2：

表2引物序列与产物

目的mRNA	上游引物	下游引物	产物(bp)
				α-SM-Actin	5.GGTGATGGTGGGAATGGG3.	5.GCAGGGTGGGATGCTCTT3.	188

目的mRNA	上游引物	下游引物	产物(bp)
				SM-MHC	5.CGGCAACTCGTGTCCAAC3.	5.TGCTTTCGCTCGTCTTCC 3.	515
Calponin	5.GGCGAAGACGAAAGGAAA3.	5.GGGTACTCGGGAGTCAGACAG3.	447
				SM-22α	5.AGCAGATGGAGCAGGTGG3.	5.CAGTGACAGAGCCTCAAAGC3.	469

2)按表3反应组成调制PCR反应体系：

表3PCR反应体系

组分	体积(μl)
		MgCl<sub>2</sub>	1.5
10×RNA PCR缓冲液	2
		灭菌蒸馏水	9.6
TaKaRa Taq DNA聚合酶	0.3
		cDNA	2
上游PCR引物	0.3
		下游PCR引物	0.3
脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)	1.6
		甘油	2
上游β-肌动蛋白引物	0.2
		下游β-肌动蛋白引物	0.2

PCR反应条件：

a.1％Agarose胶的配制：

a1.称取Agarose粉剂0.4g，加入电泳缓冲液40ml，于100ml烧瓶中加热至Agarose完全融解并沸腾；

a2.待凝胶冷却至60℃，加入溴化乙锭(EB)4μl，混匀；

a3.在加好梳子的配胶槽中倒入凝胶，冷却凝固备用。

b.加样及电泳：

b1.把已凝固的Agarose胶置入新鲜1×TAE电泳缓冲液中，让缓冲液液面刚好浸过Agarose胶；

b2.加样缓冲液4μl与100bp的核酸分子量标记物4μl混匀，小心地加入Agarose胶的加样孔中；

b3.加样缓冲液4μl与PCR产物6μl混合均匀，小心地加入Agarose胶的加样孔中；

b4.电泳条件：80伏，电泳时间约45分钟。

电泳结果条带与maker条带位置进行比较，其余4℃保存备用。用Origin6.1进行统计分析。

6.Wstern-Blot检测

试剂制备及操作

(1)三去污裂解缓冲液

50mmol/LTris·Cl(pH8.0)

150mmol/LNaCl

100μg/ml苯甲基磺酰氟(PMSF)

1μg/ml胰蛋白酶肽

1％Tween-20

0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)

(2)蛋白样品

①诱导组、未诱导组、阳性对照组和阴性对照组各取1×10⁶细胞，用预冷PBS漂洗，加预冷三去污裂液500μl，冰上裂解30分钟；

②轻轻刮入Eppendorf管内，12000rpm，4℃离心5分钟；

③取上清液，加等体积2×上样缓冲液(Tris·Cl(pH6.8)100mmol/L，DTT(二硫苏糖醇)200mmol/L，4％SDS(十二烷基磺酸钠)，0.2％溴酚兰，甘油20％，β-巯基乙醇40ul/ml)④100℃沸水浴变性10分钟，冷却备用。

(3)配胶

①配制8％分离胶

30％：0.8％(AA(丙烯酰胺)：Bis(甲叉双丙烯酰胺))2ml；4×Tris·Cl(pH8.8)1.9ml；ddH₂O 3.5ml，10％AP(过硫酸铵)50μl；N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)10μl

酒精擦拭玻璃板、电泳槽，安装后加入双蒸水检查渗漏情况。加入TEMED后，即刻开始聚合反应，立即混匀，消除气泡，倒板，上层加入少量ddH₂O封闭防止氧化，待20-30分钟后胶凝固，用滤纸吸去上层水分待加入积层胶。

②配制4％积层胶

30％∶0.8％(AA∶Bis)0.7ml

4×Tris·Cl(pH6.8)1.25ml

ddH₂O  3ml

10％AP 25μl

TEMED  5μl

胶灌注后，插入1.5mm梳子，待凝固，防止气泡产生。

(4)上样

①拔出梳子，ddH₂O冲洗梳孔，吸干；

②微量加样器每孔加样品20μl，按照诱导组、未诱导组、阳性对照和阴性对照排列；

③同时加入蛋白分子量标记物(蛋白Marker)液。

(5)电泳

18mA电流，约4h，溴酚兰至胶下缘停止电泳。

(6)转膜

①电泳结束，卸下凝胶，置于转移缓冲液中，蒸馏水冲淋后置Saram保鲜膜上，用塑料板撬起玻璃板，胶置于转移缓冲液中(25mMTris碱，192mM甘氨酸，20％甲醇)；

②相应尺寸的滤纸(2×)和硝酸纤维素膜(1×)置于转移缓冲液平衡15分钟；

③打开转膜仪，由负极到正极(黑为负极，白为正极)依次平铺海绵、滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜各一层、再铺一层滤纸、海绵，赶走气泡，关闭转膜仪；

④转膜仪置转膜槽内，槽内倒入转移缓冲液，靠负极槽内加入冰袋，盖实，90V电压，4℃转移2小时。

(7)杂交

①取出转移膜，用洗涤缓冲液(0.1％Tween-20-PBS)漂洗转移膜10分钟×2次(转移蛋白面朝下)，转移膜用10ml 0.5％封闭缓冲液(Blocking Buffer)液封闭4℃过夜；

②以0.3％Blocking Buffer稀释一抗(1∶1000)置冰浴；

③弃封闭液，倾入一抗液，保证转移膜完全浸入，置湿盒内，37℃孵育1小时；

④一抗孵育结束，以洗涤缓冲液洗涤10分钟×3次，室温摇床温和震荡；

⑤0.3％Blocking Buffer按1∶10000稀释生物素化抗小鼠二抗，一抗洗涤完毕，加入二抗杂交液，37℃孵育1小时；

⑥二抗杂交完毕，弃二抗，用洗涤缓冲液洗涤10分钟×3次，室温摇床温和震荡。

(8)显色

室温下滴加显色底物氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(NBT/BCIP)5-6ml，温和震荡5-10分钟，可见暗紫色条带。以预先染色的10-180kDa分子量标准品对照确定分子量。

7.激光共聚焦显微镜检测Ca²⁺浓度相对变化

(1)标准细胞外液配制(单位：mmol/l)

成分	NaCl	KCl	N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)	CaCl<sub>2</sub>	葡萄糖(Glucose)
						浓度	148	3	10	3	8

pH调节至7.3，4℃保存备用。

(2)制作细胞爬片，诱导组，非诱导组，阳性对照组细胞各1.5×10⁴个/爬片，爬片预置入6孔板，以各自诱导或非诱导液继续培养3天。

(3)弃去培养液体，标准细胞外液漂洗3次，然后每孔加入1ml细胞外液，外加20μl Fluo-3-Am荧光素，37℃避光孵育30分钟。

(4)弃孵育液，以标准细胞外液漂洗×3次，将爬片转移至样品槽内，槽内预注入1ml标准细胞外液。

(5)在激光共聚焦显微镜下480nm波长激光激发，每3妙拍摄一帧荧光照片，至预定时间迅速注入10μlPBS溶解的血管紧张素II浓缩液(10^-4mol/L)，继续观察荧光强度变化直至恢复基态。

(6)记录视野内所有细胞荧光强度全程数值，统计结果，SAS软件统计分析。

结果

一、细胞形态观察

脂肪组织初分离细胞接种6小时后，细胞开始贴壁；24小时完全贴壁(图1A)，48小时内细胞生长处于停滞状态，细胞形态呈小的圆形，直径约5μm，色深。48小时后，细胞伸展呈成纤维细胞样，生长有方向性，宽度增加至20μm左右。3天后可观察有克隆开始形成。

传代后细胞仍呈成纤维细胞样生长(图1B)。未经诱导的ADSCs呈纺缍形或梭形，原代呈集落样生长，类成纤维细胞样生长，有一定的方向性，传代后可形成单层。

PDGF-BB与TGFβ₁联合诱导的ADSCs生长较慢，细胞体积明显增大，但形态无明显改变，仍呈成纤维细胞样生长(图1C)；生长达融合后可向复层方向生长，形成平滑肌细胞所特有的“峰-谷”生长模式(图1D)。

结果表明，经PDGF-BB与TGFβ₁联合诱导的ADSCs可形成平滑肌细胞。

二、生长曲线

将P₁代诱导与非诱导细胞计数结果分别绘制生长曲线，累积各组每天计数结果，绘制细胞计数的生长曲线，(见图2)。

统计分析结果表明，诱导后的细胞体外扩增能力显著降低(P＜0.01)，相差约1.5倍左右。

三、平滑肌细胞特异标记物表达相关检测

1.免疫荧光

见图3-5。

结果表明，经诱导的ADSCs及脐动脉平滑肌细胞均表达平滑肌特异标记α-SM-actin，SM-MHC和Calponin，未诱导细胞及软骨细胞则无表达。

2.RT-PCR检测

见图6。

结果表明，未经诱导的ADSCs未见α-SM-actin，SM-MHC，Calponin以及SM-22αmRNA表达，而经过诱导的细胞均检测到有相应的mRNA表达，与脐动脉平滑肌细胞类似。

3.Wstern-Blot检测

见图7。

Wstern-Bloting半定量检测SM-22α的结果表明，以脐动脉平滑肌为标准，诱导后细胞阳性表达约为平滑肌的42％，未经诱导的ADSCs则在1％以下，软骨细胞接近零。

4.流式细胞仪检测

见图8。

结果表明，三种平滑肌标记α-SM-actin，SM-MHC，Calponin，诱导前表达率分别为3.26±1.31％，3.55±1.6％，4.02±1.81％(图8A)，诱导后阳性率分别为48.13±8.31％，45.33±10.68％，39.13±9.42％(图8B)。诱导前与诱导后差异具有显著性(P＜0.01)。

四、钙离子流动实验

见图9-11。

结果表明，在接受Angiotensin-II刺激前，平滑肌细胞，诱导组细胞，未诱导组细胞荧光强度平均相对值分别为547.13±49.44，511.95±12.18，480.65±17.11，三者无显著性差异(P＞0.05)。在受到1×10^-6mol/L Angiotensin-II作用后，平滑肌细胞和诱导组细胞均产生瞬间胞液钙离子转移，激光共聚焦显微镜下显示细胞荧光强度瞬时增强，然后迅速恢复到基态，荧光强度峰值平均相对值分别为1134.38±98.82，825.92±22.48，Angiotensin-II作用前后平滑肌和诱导组荧光值有显著性差异(P＜0.01)；而未诱导组细胞药物作用后荧光强度峰值平均相对值为530.24，药物作用前后无显著性差异(P＞0.05)，说明对Angiotensin II未产生明显应答。

结果显示，分化后的细胞经血管紧张素II刺激产生瞬间胞液钙离子转移并偶联细胞收缩反应，细胞荧光强度呈现瞬间增高变化，未诱导组则变化不明显；二者有明显差异。证实诱导后细胞具备对血管活性药物刺激的反应。

实施例2

构建组织工程化血管移植物

材料和方法

(一)主要实验材料

胎牛血清	GIBCO公司(美国)
		M-199	GIBCO公司(美国)
L-谷氨酰胺	上海实生生物技术有限公司
		抗坏血酸	上海实生生物技术有限公司

胎牛血清	GIBCO公司(美国)
		青霉素	华北制药有限公司
链霉素	华北制药有限公司
		胰蛋白酶	上海实生生物技术有限公司
维生素C	Sigma公司(美国)
		I型胶原酶	Worthington公司(美国)
TGF-beta-1	Sigma公司(美国)
		PDGF-BB	Sigma公司(美国)
单克隆鼠抗人α-SM-actin	Dako Cytomation公司(美国)
		辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗	DAKO，Carpinteria，(美国)

(二)主要仪器设备

37℃、5％CO<sub>2</sub>培养箱	Forma公司(美国)
		一次性10ml注射器	上海米沙瓦医科工业有限公司
100mm培养皿，6孔板	Falcon公司(美国)
		50ml离心管	Falcon公司(美国)
离心机	Biofuge公司(德国)
		倒置相差显微镜	Olympus公司(日本)
超净工作台	上海医疗器械公司
		扫描电子显微镜	Hitachi公司(日本)
医用硅胶管(6mm，8mm)	上海医用橡胶制品公司

(三)血管样组织构建

1.聚乙醇酸(Polyglycolic Acid，PGA)材料支架的制作

称取约30mg编织PGA，抽成单丝后，均匀排列编制成片状，压实，边缘修剪整齐，置于培养皿内，75％酒精浸泡消毒一小时。PBS飘洗三次，吸干，转移至无菌培养皿，无菌培养液注入，培养箱内作无菌测试，备用。

2.细胞准备

ADSCs细胞的获取，传代，诱导同于实施例1，待细胞诱导至约三周时，接近80％融合，消化，重悬成细胞悬液，并调整细胞浓度为50×10⁶个/毫升，备用。

3.细胞接种

PGA支架置于培养皿中，吸干，转移至新无菌培养皿，吸取细胞悬液约0.6ml，均匀滴加接种于支架材料上，放入37℃、5％CO₂、100％饱和湿度的条件下培养5-6小时，待细胞完全贴附后，缓缓向皿内加入基础培养液，直至没过材料高度，继续置入培养箱内培养。48小时后，轻轻吸除原培养液，加入成平滑肌诱导培养液继续培养。

4.血管生物反应器准备

本发明所采用的血管生物反应器为自制，见图19，它主要包括：①控制系统②动力系统③管道系统④反应槽。

控制系统为指令输入系统，可通过触屏式按键输入反应器各项运转参数，诸如搏动频率，每分钟流量，搏动作用时间以及放松时间等等；动力系统为一低速马达，可根据控制系统指令，通过改变转速，以改变流量大小；反应槽为核心系统，由四个独立的培养槽并联而成，由外径6mm硅胶管连接搏动液出入口，由其发挥搏动效应，细胞与材料复合物将缚于该硅胶管上，当硅胶管搏动时，细胞材料复合物将同时受力。每个培养槽均有槽盖，与槽体间有缝隙以便于CO₂气体弥散。硅胶管道位于槽中央，管道系统与培养槽相对隔离，避免污染，以8mm硅胶管道连接反应槽，马达和节流阀门，使之成为一密闭的环路系统，搏动液体可在其中循环往复运动，马达转速改变可改变其流量，节流阀门节奏性开放和关闭，造成灌流液流动间断性受阻，使得管路内压节奏性改变，使得反应槽内的硅胶管受到节奏性搏动力，而细胞材料复合物也同时受力。

使用时，先将管路清洗后，引入培养箱，注意入口密封。将管路按照顺序连接好，节流阀门位于反应槽后(顺液体流动方向)。回流槽内注满生理盐水作为搏动液。将6mm外径硅胶管清洗后，套于反应槽中培养槽内的搏动液出入口上，插紧。

安装完毕，启动反应器，先打开搏动控制界面，设定关闭时间和开放时间，(如关闭和开放时间均为500ms，则搏动频率为60次/分钟)，然后转至流量控制界面，设定液体流动方向，流量上限为450ml/分钟。在最大流量下，工作4-5小时，检查无漏水，证实密封合格，反应槽即可送消毒处理。

反应槽由有机塑料制成，使用前，首先将其在稀硫酸内浸泡12小时，除去表面氧化物，取出后用自来水彻底洗净，再以蒸馏水清洗三次，自然晾干，手术巾包裹后，送环氧乙烷消毒处理，用前在超净台内打开。

细胞接种至PGA后，继续培养约5-6天，待细胞在材料表面融合成膜，即可转移至反应器培养。先从培养皿边缘轻轻吸除大部分培养液，在超净台上打开反应槽包装，以无菌眼科镊子小心将膜片状细胞材料复合物转移至反应槽内硅胶管上，绕2-3圈，使之与硅胶管紧密贴附，无菌缝线作简单固定处理。缓缓向槽内加入培养液，至没过细胞材料。送放入37℃、5％CO2、100％饱和湿度的条件下，不开反应器，继续静态培养5-6天，待细胞材料复合物紧密融合包裹后，即可开启反应器。

反应器启动后，按照搏动频率先慢后快，流量先小后大原则，由低频(60次/分钟)到高频(165次/分钟)，低流量(250ml/分钟)到高流量(450ml/分钟)递增，每日工作约4-5小时。反应器换液每周一次。

5.实验分组

实验分两组，诱导后的细胞复合PGA后分动态培养和静态培养两组，均采用诱导培养液，细胞材料卷至硅胶管后，反应器运转时开始计时。培养四周时取材作进一步检测。

6.形态学观察

培养4周后，观察各组色泽变化，形态有无改变。

7.扫描电镜检测

接种后一周的细胞-材料复合物，PBS冲洗三次，电镜固定液固定30分钟，PBS冲洗，1％锇酸固定45分钟，PBS冲洗，脱水，临界点干燥；喷金，电镜扫观察。

8.组织学检测

体外培养4周时，对各组进行H.E.染色，主要观察组织中细胞分布和细胞基质分泌情况。Massons’s三色染色观察基质中胶原纤维分布。α-SM-actin免疫组化检测其在组织中的表达情况。

H.E.染色

1)组织取材后，4％多聚甲醛固定过夜，送石蜡包埋；

2)蜡块-20℃冷冻20分钟，切片机切片；

3)烤片，70℃，持续30分钟；

4)含黏附牢固的载玻片迅速置入二甲苯I(10分钟)，然后依次为二甲苯II，二甲苯III，时间各自为5分钟；

5)依次通过100％乙醇I，100％乙醇II，95％乙醇I，95％乙醇II，95％乙醇III，80％乙醇，各浸入约2s，结束后水洗；

6)沥净水渍，苏木素染色20分钟，水洗；

7)迅速过1％盐酸酒精分化(2s)，水洗，然后流水洗1-2小时；

8)脱水，依次通过80％乙醇，伊红染料，95％乙醇I，95％乙醇II，95％乙醇III，100％乙醇I，100％乙醇II，二甲苯I，二甲苯II，二甲苯III，各自浸入2秒；

9)晾干，树胶封片，显微镜下观察，摄片。

Massons三色染色

1)蜡块-20℃冷冻20分钟，切片机切片；

2)烤片，70℃，持续30分钟；

3)含黏附牢固的载玻片迅速置入二甲苯I(10分钟)，然后依次为二甲苯II，二甲苯III，时间各自为5分钟；

4)依次通过100％乙醇I，100％乙醇II，95％乙醇I，95％乙醇II，95％乙醇III，80％乙醇，各浸入约2秒，结束后水洗；

5)天青石蓝染料染色，颜料滴加至玻片，常温染色10分钟，水洗；

6)苏木素染，玻片浸入苏木素染料，常温染色10分钟，水洗；

7)迅速过1％盐酸酒精分化(2秒)，水洗，然后流水洗1-2小时；

8)复合染液染色，颜料滴加至玻片，常温染色20分钟，水洗；

9)0.2％冰醋酸，清洗玻片×2次；

10)磷钨酸分化，15分钟；

11)回收磷钨酸，0.2％冰醋酸，清洗玻片×2次；

12)亮绿染色，颜料滴加至玻片，常温染色15分钟；

13)0.2％冰醋酸，清洗玻片×2次；迅速过95％乙醇I，95％乙醇II，95％乙醇III，100％乙醇I，100％乙醇II，二甲苯I，二甲苯II，二甲苯III脱水，各自浸入2秒；

14)晾干，树胶封片，显微镜下观察，摄片。

免疫组化染色

1)蜡块-20℃冷冻20分钟，切片机切片；

2)烤片，70℃，持续30分钟；

3)含黏附牢固的载玻片迅速置入二甲苯I(10分钟)，然后依次为二甲苯II，二甲苯III，时间各自为10分钟；

4)依次通过100％乙醇I，100％乙醇II，95％乙醇I，95％乙醇II，95％乙醇III，80％乙醇，各浸入约2秒，结束后水洗；

5)PBS飘洗×3次；

6)0.3％H₂O₂清除非特异性过氧化物酶，常温处理10分钟；

7)弃去H₂O₂，PBS飘洗×3次；0.05％胰蛋白酶常温消化15分钟；

8)弃去胰蛋白酶，PBS飘洗×3次；1∶20稀释羊血清，常温封闭约30分钟；

9)弃去血清，滤纸吸干，滴加一抗(以0.1％牛血清白蛋白稀释，1∶50，单克隆鼠抗人α-SM-actin抗体)，4℃，湿盒避光，过夜；

10)弃去一抗，PBS飘洗×3次，滴加二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗)，37℃孵育30分钟；

11)弃去二抗，PBS飘洗×3次，显色(0.05％二氨基联苯胺(DAB)+0.03％H₂O₂)5-10分钟，充分水洗；

12)苏木素衬染1分钟，水洗，迅速过1％盐酸酒精分化(2秒)，水洗，然后流水洗1-2小时；

13)脱水，迅速过95％乙醇I，95％乙醇II，95％乙醇III，100％乙醇I，100％乙醇II，二甲苯I，二甲苯II，二甲苯III脱水，各自浸入2秒；

14)晾干，树胶封片，显微镜下观察，胞质内出现状棕黄色染色为α-SM-actin阳性。摄片。

结果

一、支架材料的制作与细胞材料的黏附

加工后的支架材料大小约为8×3cm，厚薄均匀，倒置相差显微镜下观察可见孔隙较为均一。(图12)

结果表明，接种后12h后倒置相差显微镜观察细胞已经在PGA表面贴附，开始呈扁圆形，逐渐沿着PGA纤维向四周伸展，48小时左右可填满PGA附近间隙，随时间延长，细胞与材料黏附更加紧密，细胞外基质成分增多，镜下表现为透光性均匀变低。

二、扫描电镜观察

细胞材料复合后培养，早期紧贴培养皿底部，72小时后边缘开始游离，至一周左右时完全脱离培养皿底部向上飘起。(图13)

扫描电镜显示结果表明，复合物经体外培养一周，基质已经充满整个支架，细胞通过基质与材料均匀融合为膜状，显示了细胞与材料良好的相容性。

三、大体形态观察

在反应器内搏动环境中培养4周后，形成的细胞材料复合物表面光滑，较柔韧，外观呈现灰白色(图14)。

从硅胶管上取下后，可保持圆筒状，外力作用后，按压部分可弹起恢复原状。而静态培养的细胞材料复合物表面粗糙，质地软，外观暗褐色，无明显弹性，外力作用后不能恢复原状(图15)。

四、组织学检测

见图16-18。

结果表明：

1.细胞材料复合物在反应器内搏动环境中培养4周后，H.E.染色可见细胞排列有一定方向性，分布均匀，胞核明显，细胞外基质丰富，但细胞分布由外向内逐渐稀疏，内部细胞稀疏，残留PGA及纤维样组织交织排列。而静态培养的细胞材料复合物细胞分布散乱，无明显方向性，细胞外基质少，PGA残留较多。

2.Masson三色染色显示动态培养组有较为丰富的胶原基质形成，但分布并不均匀。静态培养组胶原稀少，且纤维纤细。

3.免疫组化染色显示，动态培养组细胞约半数α-SM-actin染色阳性，搏动组靠近组织外层细胞有α-SM-actin表达，内层不明显。静态培养组只有少数的细胞α-SM-actin染色阳性，且分布散在。

讨论

平滑肌α肌动蛋白(α-SM-actin)的表达被认为是检测血管平滑肌的直接和必要证据。α-SM-actin是收缩型血管平滑肌的主要收缩蛋白成分，其总量占到收缩型血管平滑肌总蛋白量的40％，和全部肌动蛋白量的70％，分子量约42kDa。目前研究认为，α-SM-actin仅表达于血管平滑肌细胞H或者与血管平滑肌接触的细胞，如血管周细胞，肾小球近球细胞等。但同时有研究指出，α-SM-actin尚且短暂表达于中胚层来源的细胞在发育，组织修复重建的过程中。例如α-SM-actin可短暂表达于早期分化阶段的心肌，骨骼肌细胞，以及创伤修复过程中的肌成纤维细胞。体外培养的部分细胞在TGF-β1作用下可表达α-SM-actin，诸如肌成纤维细胞和微血管内皮细胞。因此单独α-SM-actin表达并不能作为证实细胞为血管平滑肌细胞的确定证据。但在血管生成过程中，α-SM-actin是处于分化阶段血管平滑肌最早表达的细胞标记物，并且仅表达于与早期内皮细胞形成的细胞索直接接触的周细胞(被认为是血管平滑肌)，未直接接触内皮细胞的中胚层来源间质细胞则无表达。虽然α-SM-actin表达早，但量上并不占优势，直到血管发育后期，α-SM-actin才占有平滑肌收缩蛋白的绝对优势。

平滑肌肌球蛋白重链(Smooth Muscle Myosin Heavy Chain，SM-MHC)。在所有肌性和非肌性细胞中，肌球蛋白都是最根本的收缩系统构成部分。该蛋白质分子大体可分为头、尾两部分，尾部组成了粗丝的主干，头部伸向粗处外。所谓细胞的收缩，即为细胞的肌动蛋白与肌球蛋自头部结合，激活肌球蛋白头部的ATP酶，从而使该酶分解ATP释放能，产生头部的摆动，从而肌节缩短，细胞收缩。平滑肌肌球蛋白重链有两种异构体，分子量分别为204kDa和200kDa，各自命名为SM-1和SM-2。MHC被认为是分化成熟的血管平滑肌重要标记物之一。Miano等人的实验证实，在小鼠胚胎发育早期，SM-MHC表达完全局限于血管平滑肌组织，最早出现于发育早期(受精后10天)的主动脉。主动脉及其分支之外的组织未检测到MHC mRNA表达，直到受精后第12-13天，早期发育的肠道组织平滑肌以及外周血管才检测到MHC mRNA表达，在此过程中发育的脑组织，骨骼肌，心肌组织均未检测到SM-MHC mRNA表达。但是，在体外培养的主动脉内皮细胞亚融合状态也可检测到MHC，肌成纤维细胞和肌上皮细胞也有这类情况。因此，虽然SM-MHC是血管平滑肌的高度特异标记物，但要确凿证实血管平滑肌仍需多个特异标记物的同时检测。

肌钙结合蛋白(calponin)是血管平滑肌内一种分子量28-34kDa的蛋白，主要作用是在Ca²⁺存在的环境下，与原肌球蛋白结合后，抑制肌动蛋白活化的肌球蛋白ATP酶活性。主要机制为与肌动蛋白结合后的磷酸化作用，因此肌钙结合蛋白被认为是调节平滑肌收缩的重要因子。

SM-22α，分子量约22-23kDa，其序列特征证实其在平滑肌内与肌钙结合蛋白具有同源性，但没有证据显示SM-22α与任何收缩蛋白绑定，其功能至今尚未明了

在成体器官中，肌钙结合蛋白和SM-22α几乎无一例外仅表达于血管平滑肌，Shannhan等发现在成年大鼠的主动脉，膀胱，输精管，子宫均检测到肌钙结合蛋白和SM-22α，但大脑，肾脏，骨骼肌等均无表达。体内免疫标记实验证实，肌钙结合蛋白和SM-22α最早于鸡胚胎发育的第4-6天在主动脉弓出现。对人类而言，肌钙结合蛋白最早在胚胎发育的8-10周被检测到低水平的表达，而到22-24周开始表达增强。因此这两类蛋白被认为是已经分化平滑肌的最早标记物之一。

上述四类蛋白为血管平滑肌相对最为特异的细胞内标记物，Karen等认为，任何单一标记物的表达均可能在其它种类的细胞中发现，不足以作为证实细胞向平滑肌细胞分化的有力证据。但若多标记物同时检测表达，则预示该细胞可基本认定为平滑肌细胞。若同时表达α-SM-actin，SM-MHC，Calponin和SM-22α可有力证实被诱导细胞确实向平滑肌细胞方向发生分化。

本发明应用免疫荧光，RT-PCR，Western-Blot等不同水平检测手段，检测诱导后的ADSCsα-SM-actin，SM-MHC，Calponin和SM-22α表达情况，保证每个标记物至少有两类方法鉴定，证实诱导后细胞可清晰表达上述四类标记物，可认定诱导后的ADSCs向血管平滑肌方向发生了分化。

仅仅有了标记物的表达尚不足以表明所获得细胞可作为组织工程血管的候选种子细胞。作为种子细胞，除了要求数量充足，活力好，表型无异外，最重要的是要尽可能或完全的执行被替代组织细胞的各类功能。对于血管平滑肌而言，其最主要功能是在接受各类血管活性物质作用后，发生收缩或舒张的反应。血管紧张素II可与血管平滑肌表面相应受体结合，进而使血管平滑肌发生收缩反应。为此，我们利用激光共聚焦显微镜，动态观察摄取荧光素后的细胞在接受1μmol/L血管紧张素II作用后胞内Ca²⁺浓度的相对变化。Fluo-3-Am为一新型的高度特异性钙离子荧光指示剂，可以灵敏反映细胞内游离钙离子浓度变化，Fluo-3-Am进入细胞后经非特异性酯酶脱去Am酯，成为脂溶Fluo-3留在细胞内。Fluo-3与细胞内游离钙结合后，其荧光强度是本身的40倍以上，当用480nm波长激光激发时，荧光强度与游离钙离子浓度成正比。

本发明明确了体外培养环境下，应用TGF-β1与PDGF-BB联合诱导一定时间，可使ADSCs定向分化的平滑肌细胞特异性蛋白标志物表达阳性，能对血管活性物质的刺激产生收缩应答，显示出功能上的明显变化与细胞成熟分化相一致，表明细胞趋于分化归属收缩表型，但在体外血清培养中细胞处于增殖状态并可传代则符合去分化合成表型。依据平滑肌表型转化学说，处于合成表型的平滑肌细胞不具备收缩功能。鉴于以上学说和本发明结果，推测源于ADSCs分化后的平滑肌细胞可能是介于原始合成表型与收缩表型之间，呈中间体表型。TGF-β1与PDGF-BB联合诱导促进ADSCs分化，但同时也明显抑制了细胞的增殖，这也与细胞增殖实验的结果相一致。因此应调整好诱导分化与细胞增殖的关系，充分考虑到诱导因子对细胞增殖的抑制作用及诱导时间对细胞分化功能的影响，把握最佳诱导时机及诱导时间，以便得到数量充足，分化功能良好的种子细胞。

本发明采用的PGA是高结晶的线性聚酯。加工后可做成较大面积，具有一定生物力学特性，孔隙率高，分布均匀，吸水性能好。以此作为支架材料，接种诱导后的细胞后，很快细胞在材料表面达到融合，显示了良好的细胞相容性。

本发明结果显示，在静止培养环境下构建的血管样组织，结构分布不均匀，细胞散在，排列紊乱，这可能与营养成分作用不佳和诱导因子作用不均有关，提示我们需要改善培养条件，满足正常血管平滑肌细胞生长发育所需的要求。

细胞与材料的共培养包括静态培养和动态培养。静态培养即细胞与材料在静止状态、无特殊压力和环境变化的条件下所进行的培养；动态培养包括在生物体内的培养和体外模拟生物体内反应即生物反应器内的培养。血管生物反应器是应用剪切力和张力等力学因素，模拟人体血管搏动和血管冲刷作用，为体外构建组织工程化血管提供适宜的环境的装置，逐渐成为体外构建组织工程血管不可缺少的工具之一。

本发明使用自制的血管生物反应器，各组件可方便拆卸清洗，消毒，并且易于安装，形成闭合环路系统。反应槽由四个独立的培养槽并联连接，由外径6mm硅胶管连接循环搏动液出入口，由其发挥搏动效应，细胞与材料复合物将缚于该硅胶管上，当硅胶管搏动时，细胞材料复合物将同时受力。

血管生物反应器内最终希望生成接近生理条件下的血管组织，因此生物反应器所模拟的力学环境必须尽可能接近正常人体血管所处的生理环境。正常成人动脉收缩压值约100-120mmHg，脉搏约75次/分钟，而胚胎时期相应指标为30-40mmHg，160-180次/分钟^[13]。考虑到种子细胞为诱导的脂肪间充质细胞，我们认为诱导后的细胞应该类似胚胎发育早期的平滑肌细胞，处于较为幼稚的状态，因此反应器参数设定采用了类似胚胎时期的40mmHg，160次/分钟。

本发明在利用生长因子等诱导成分的同时施加间歇性力学刺激，目的在于观察处于力学作用下，是否更有利与ADSCs向血管平滑肌细胞表型分化，并最终形成均一、成熟的血管壁样组织。根据小口径血管在生理条件下所受到的搏动力作用情况，发明人利用血管上生物反应器对搏动力进行体外模拟。细胞材料所受力大小实际小于设定值，因为搏动力是由循环液作用，经过硅胶管传导，因硅胶管自身形变限制，只有部分力作用到构建组织上。但同时也避免了由于构建组织基质成分少，缺乏对力学作用的弹性缓冲作用从而导致细胞损伤。结果显示，施加搏动组能较为明显的促进诱导作用，细胞排列相对有序，胶原成分含量多，可表达血管平滑肌细胞特异收缩成分α-SM-Actin，证实体外诱导构建过程中施加合适的外力可与生长因子产生某种作用或联系，促进ADSCs向血管平滑肌的转变。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种获得血管平滑肌细胞的方法，其特征在于，它包括步骤：在分化诱导条件下培养脂肪干细胞，从而将脂肪干细胞诱导分化成血管平滑肌细胞；所述的分化诱导条件为：转化生长因子β15±3ng/ml，且血小板源性生长因子50±30ng/ml。

2.一种如权利要求1所述的方法得到的血管平滑肌细胞。

3.一种如权利要求2所述的血管平滑肌细胞的用途，其特征在于，所述的用途包括：(1)用于制备器官移植中的移植物；或(2)作为种子细胞制备血管移植物。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的用途是用于制备同种同体、同种异体或异种异体间的血管移植物。

5.一种制备组织工程化血管移植物的方法，其特征在于，它包括步骤：

a.将如权利要求2所述的血管平滑肌细胞接种于片状的药学上可接受的生物可降解材料，形成细胞材料复合物；

b.将细胞材料复合物包卷于弹性材料管；

c.在适合平滑肌生长的条件下培养步骤b的细胞材料复合物3-15天；

d.施加动力学刺激，从而得到组织工程化血管移植物；

所述的血管平滑肌细胞通过下述步骤获得：

在分化诱导条件下培养脂肪干细胞，从而将脂肪干细胞诱导分化成血管平滑肌细胞；所述的分化诱导条件为：转化生长因子β15±3ng/ml，且血小板源性生长因子50±30ng/ml。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的动力学刺激是间歇性的。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在施加动力学刺激的同时加入细胞因子进行培养。

8.一种如权利要求5所述的方法得到的组织工程化血管移植物。

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