JP5579999B2 - ヒト第２０染色体の２０ｑ１３領域における新規アンプリコンおよびその使用 - Google Patents

Description

本出願は、米国特許出願番号（「ＵＳＳＮ」）第０８／６８０，３９５号（１９９６年７月１５日出願）；およびＵＳＳＮ ０８／７３１，４９９号（１９９６年１０月１６日出願）に関連する。本出願はまた、上記出願の各々をそれら全体として、かつ全ての目的のために参考として援用する。

本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって与えられた助成金番号ＮＩＨ／ＮＣＩ ５Ｐ５０ＣＡ−５８２０７−０６の下、米国政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。

（発明の分野）
本発明は、癌遺伝学および細胞遺伝学の分野に関する。特に、本発明は、癌に関連する、ヒト第２０染色体上の新規なアンプリコンに関連する核酸配列の同定に関する。より詳細には、本発明は、約２０ｑ１３でのゲノム核酸増幅の領域における、新規な「アンプリコン」の同定に関する。これらの核酸配列は、種々の癌の診断および予後におけるプローブとして使用され得る。

（発明の背景）
染色体異常は、しばしば、遺伝障害、変性疾患および癌に関連する。染色体全体の欠失または増殖、および染色体セグメントまたは特異的領域の欠失あるいは増幅は、癌における共通の出来事である（Ｓｍｉｔｈ（１９９１）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１８：Ｓｕｐｐｌ．１：５−１４；ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｅｒ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０７２：３３−５０）。実際に、ＤＮＡ配列の増幅および欠失は、癌の原因であり得る。例えば、プロトオンコジーンおよび腫瘍抑制遺伝子はそれぞれ、頻繁に腫瘍形成の特徴である（Ｄｕｔｒｉｌｌａｕｘ（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．４９：２０３−２１７）。明らかに、癌に関連する特定のゲノム領域の同定およびクローニングは、腫瘍形成の研究に対して、ならびに診断および予後のより良好な手段を開発することにおいての、両方で重要である。

比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）を使用する研究は、ヒト乳房腫瘍において約２０倍増幅されたゲノム領域を明らかにした（Ｍｕｌｅｒｉｓ（１９９４）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ １０：１６０−１７０；Ｋａｌｌｉｉｏｎｉｅｍｉ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２１５６−２１６０；Ｉｓｏｌａ（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４７：９０５−９１１）。これらの領域は、腫瘍進行または治療に対する応答において役割を果たし得る、優位に作用する遺伝子をコードすることが予測される。これらの増幅された領域のうち３つは、以下の確立されたオンコジーンに関連した：１７ｑ１２のＥＲＢＢ２、８ｑ２４のＭＹＣならびに１１ｑ１３のＣＣＮＤ１およびＥＭＳ１。乳癌において、ＥＲＢＢ２およびＣＣＮＤ１／ＥＭＳ１の増幅ならびに過剰発現は、平均与命の減少に関連する（Ｇａｕｄｒａｙ（１９９２）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２７６：３１７−３２８；Ｂｏｒｇ（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６：１３７−１４３）。ＭＹＣ増幅は、リンパ節関与、進行段階の癌および再発の危険性の増加に関連した（Ｂｏｒｇ（１９９２）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５１：６８７−６９１；Ｂｅｒｎｓ（１９９５）ｇｅｎｅ １５９：１１−１８）。明らかに、乳癌または他の腫瘍細胞に関連する、さらなる増幅されたゲノム領域の同定は、腫瘍形成の研究に対して、および癌診断を開発することにおいて重要である。

ＣＧＨ研究において見出された増幅された領域のうちの１つは、第２０染色体、特に、２０ｑ１３上に存在した。２０ｑ１３の増幅は、その後、種々の腫瘍型において存在すること、および攻撃的な腫瘍挙動に関連することが見出された。２０ｑ１３コピー数の増加は、乳癌細胞株の４０％および原発性乳房腫瘍の１８％において見出された（Ｋａｌｌｉｉｏｎｉｅｍｉ（１９９４）前出）。２０ｑ１３でのコピー数増加はまた、以下の癌の２５％より多くにおいて報告されている：卵巣（Ｉｗａｂｕｃｈｉ（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：６１７２−６１８０）、結腸（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：６００２−６００５）、頭部および頸部（Ｂｏｃｋｍｕｈｌ（１９９６）Ｌａｒｙｎｇｏｒ．７５：４０８−４１４）、脳（Ｍｏｈａｐａｔｒａ（１９９５）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ １３：８６−９３）、および膵臓（Ｓｏｌｉｎａｓ−Ｔｏｌｄｏ（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ２０：３９９−４０７）。２０ｑ１３領域は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して、乳房腫瘍および乳房細胞株においてより高い分解能で分析された。２０ｑ１３内の１．５メガベース（Ｍｂ）の広範に増幅された領域が、同定された（Ｓｔｏｋｋｅ（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２６：１３４−１３７）；Ｔａｎｎｅｒ（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：４２５７−４２６０）。間期ＦＩＳＨは、乳癌の２９％および７％においてそれぞれ、低レベル（＞１．５×）および高レベル（＞３×）の２０ｑ１３配列増幅を明らかにした（Ｔａｎｎｅｒ（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１：１４５５−１４６１）。高レベルの増幅は、攻撃的な腫瘍表現型と関連した（Ｔａｎｎｅｒ（１９９５）前出；Ｃｏｕｒｊａｌ（１９９６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７４：１９８４）。別の研究は、ＦＩＳＨを使用して１４６の未培養乳癌腫における染色体２０ｑに沿った１４の遺伝子座を分析し、以下を含む、３つの独立して増幅された領域を同定した：２０ｑ１３．２のＲＭＣ２０Ｃ００１領域（この場合の９．６％において高度に増幅された）、ＰＴＰＮ１領域の３Ｍｂ近位（６．２％）、および２０ｑ１１のＡＩＢ３領域（６．２％）（Ｔａｎｎｅｒ（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３４４１−３４４５）。明らかに、２０ｑ１３内の増幅された領域の明確な特徴付けは、これらの癌の診断および予後における重要な工程である。

培養細胞における染色体２０ｑのコピー数の増加もまた、進行性腫瘍の表現型特徴（不死化およびゲノムの不安定性を含む）に関連した。例えば、２０ｑ１１−ｑｔｅｒでのコピー数の増加は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６Ｅ７またはＨＰＶ１６でそれぞれ感染させた後の、ヒト尿路上皮（ｕｒｏ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）細胞（ＨＵＣ）（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ（１９９４）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．８：２２２７−２２４０）およびケラチノサイト（Ｓｏｌｉｎａｓ−Ｔｏｌｄｏ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：３８５４−３８５９）において頻繁に観察された。さらに、２０ｑ１３．２でのコピー数の増加は、いくらかのＨＰＶ１６ Ｅ７をトランスフェクトしたＨＵＣ株におけるｐ５３非依存性のゲノム不安定性に関連した（Ｓａｖｅｌｉｅｖａ（１９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １４：５５１−５６０）。これらの研究は、２０ｑ（特に、２０ｑ１３．２）上の１以上の遺伝子の発現の増加が、乳癌および他の固形腫瘍の進化に寄与することを示唆する。いくつかの候補オンコジーンは、ＡＩＢ１（Ａｎｚｉｃｋ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：９６５−９６８）、ＢＴＡＫ（Ｓｅｎ（１９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １４：２１９５−２００）、ＣＡＳ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６：１８７−１９４）およびＴＦＡＰ２Ｃ（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３５：２６２−２６４）を含む、２０ｑ上で増幅されるものとして同定されている。明らかに、腫瘍表現型に関連する２０ｑ１３中の核酸配列の明確な特徴付けは、これらの癌の診断および予後における重要な工程である。本発明は、これらおよび他の必要性を満たす。

（発明の要旨）
本発明は、癌および腫瘍形成に関連する核酸の新規領域の同定およびゲノムマッピングに関する。

本発明は、ヒト核酸のサンプル中のアンプリコンの存在についてスクリーニングするための新規な方法を提供する。この方法の第１の工程は、ヒト細胞由来の核酸のサンプルおよびプローブを提供する。ここで、このプローブは、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０までを含む核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む。第２の工程は、このヒト核酸にプローブを接触させる工程を含み、ここで、このプローブは、プローブがヒトゲノム核酸にストリンジェント条件下で選択的に結合する条件下で、ヒトゲノム核酸と接触され、ハイブリダイゼーション複合体を形成する。最後の工程は、このハイブリダイゼーション複合体の形成を検出する工程である。１つの実施態様において、このヒト核酸は、ゲノムＤＮＡであり得、このゲノムＤＮＡは、乳房腫瘍細胞から単離され得る。この検出工程は、アンプリコンのコピー数を決定する工程をさらに包含する。

この方法において、このプローブはまた、Ｄ２０Ｓ１２０とＤ２０Ｓ２１１との間の距離にわたる核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含み得る。代替的な実施態様において、このプローブは、ＡＦＭａ２３３ｗｇ１、ＡＦＭ０８０ｙａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群より選択されるＳＴＳマーカーに特異的にハイブリダイズする核酸を含み得る。このプローブはまた、Ｄ２０Ｓ２１１、Ｄ２０Ｓ８５４、Ｄ２０Ｓ８７６、Ｄ２０Ｓ１０４４、Ｄ２０Ｓ９１３、Ｄ２０Ｓ７２０およびＤ２０Ｓ１２０からなる群より選択されるＧＤＢ遺伝子座核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含み得る。あるいは、このプローブはまた、ＲＭＣ２０Ｂ４０９７、ＲＭＣ２０Ｂ４１０３、ＲＭＣ２０Ｐ４０１６、ＲＭＣ２０Ｂ４１３０、ＲＭＣ２０Ｐ４１８５、ＲＭＣ２０Ｂ４１８８、ＲＭＣ２０Ｂ４１０９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１０、ＲＭＣ２０Ｐ４０２８、ＲＭＣ２０Ｐ４００３、ＲＭＣ２０Ｂ４０９９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１８、ＲＭＣ２０Ｐ４０６９、ＲＭＣ２０Ｂ４１２１、ＲＭＣ２０Ｂ４０８７およびＲＭＣ２０Ｐ４０７０からなる群より選択されるクローン化されたゲノム核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含み得る。

別の実施態様において、このプローブは、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０までを含む核酸配列のいくらかまたは全てを増幅し得るポリメラーゼ連鎖反応プライマー対を含み得る。この検出工程は、このポリメラーゼ連鎖反応増幅反応の形成を検出する工程を包含し得る。このポリメラーゼ連鎖反応プライマー対は、ＡＦＭａ２３３ｗｇ１、ＡＦＭ０８０ｙａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群より選択されるＳＴＳ ＰＣＲプライマー対であり得る。

本発明の方法において、このプローブは、固体表面に結合され得、そしてこの結合されたプローブは、核酸アレイのメンバーであり得る。ヒト核酸は、検出可能な組成物で標識され得る。この検出可能な組成物は、フルオレセインまたはテキサスレッドであり得る。代替的な実施態様において、プローブが、検出可能な組成物で標識され得る。この方法はさらに、参照細胞由来の核酸を提供し、ここで、この参照細胞核酸は、ヒトゲノム核酸より前に、またはヒトゲノム核酸と同時に、このプローブと接触される。この方法はさらに、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを提供し得、ここでこのＣｏｔ−１ ＤＮＡは、ヒトゲノム核酸にプローブを接触させる前に、ヒトゲノム核酸にハイブリダイズされる。

本発明はまた、ヒトゲノム核酸のサンプル中のアンプリコンの存在についてスクリーニングするための核酸プローブを提供し、このプローブは、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０までを含む核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む。あるいは、このプローブは、以下のものに特異的にハイブリダイズする核酸を含み得る：Ｄ２０Ｓ１２０とＤ２０Ｓ２１１との間の距離にわたる核酸配列；または、ＡＦＭａ２３３ｗｇ１、ＡＦＭ０８０ｙａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群より選択されるＳＴＳマーカー；または、Ｄ２０Ｓ２１１、Ｄ２０Ｓ８５４、Ｄ２０Ｓ８７６、Ｄ２０Ｓ１０４４、Ｄ２０Ｓ９１３、Ｄ２０Ｓ７２０およびＤ２０Ｓ１２０からなる群より選択されるＧＤＢ遺伝子座核酸配列；または、ＲＭＣ２０Ｂ４０９７、ＲＭＣ２０Ｂ４１０３、ＲＭＣ２０Ｐ４０１６、ＲＭＣ２０Ｂ４１３０、ＲＭＣ２０Ｐ４１８５、ＲＭＣ２０Ｂ４１８８、ＲＭＣ２０Ｂ４１０９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１０、ＲＭＣ２０Ｐ４０２８、ＲＭＣ２０Ｐ４００３、ＲＭＣ２０Ｂ４０９９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１８、ＲＭＣ２０Ｐ４０６９、ＲＭＣ２０Ｂ４１２１、ＲＭＣ２０Ｂ４０８７およびＲＭＣ２０Ｐ４０７０からなる群より選択されるクローン化されたゲノム核酸配列。

別の実施態様において、このプローブは、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０までを含む核酸配列のいくらかまたは全てを増幅し得るポリメラーゼ連鎖反応プライマー対を含み得る。このポリメラーゼ連鎖反応プライマー対は、ＡＦＭａ２３３ｗｇ１、ＡＦＭ０８０ｙａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群より選択されるＳＴＳ ＰＣＲプライマー対であり得る。

本発明はまた、ヒト核酸のサンプル中のアンプリコンの存在についてスクリーニングするためのキットを提供し、このキットは、プローブを含む区画を含み、ここで、このプローブは、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０までを含む核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む。あるいは、このプローブは、以下のものに特異的にハイブリダイズする核酸を含み得る：Ｄ２０Ｓ１２０とＤ２０Ｓ２１１との間の距離にわたる核酸配列；または、ＡＦＭａ２３３ｗｇ１、ＡＦＭ０８０ｙａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群より選択されるＳＴＳマーカー；または、Ｄ２０Ｓ２１１、Ｄ２０Ｓ８５４、Ｄ２０Ｓ８７６、Ｄ２０Ｓ１０４４、Ｄ２０Ｓ９１３、Ｄ２０Ｓ７２０およびＤ２０Ｓ１２０からなる群より選択されるＧＤＢ遺伝子座核酸配列；または、ＲＭＣ２０Ｂ４０９７、ＲＭＣ２０Ｂ４１０３、ＲＭＣ２０Ｐ４０１６、ＲＭＣ２０Ｂ４１３０、ＲＭＣ２０Ｐ４１８５、ＲＭＣ２０Ｂ４１８８、ＲＭＣ２０Ｂ４１０９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１０、ＲＭＣ２０Ｐ４０２８、ＲＭＣ２０Ｐ４００３、ＲＭＣ２０Ｂ４０９９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１８、ＲＭＣ２０Ｐ４０６９、ＲＭＣ２０Ｂ４１２１、ＲＭＣ２０Ｂ４０８７およびＲＭＣ２０Ｐ４０７０からなる群より選択されるクローン化されたゲノム核酸配列。

別の実施態様において、このキットのプローブは、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０までを含む核酸配列のいくらかまたは全てを増幅し得るポリメラーゼ連鎖反応プライマー対を含み得る。このポリメラーゼ連鎖反応プライマー対は、ＡＦＭａ２３３ｗｇ１、ＡＦＭ０８０ｙａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群より選択されるＳＴＳ ＰＣＲプライマー対であり得る。このプローブは、クローン化されたヒト核酸であり得、そしてこのクローン化されたヒトゲノム核酸は、固体表面に結合され得る。この結合されたプローブは、核酸アレイのメンバーであり得る。このキットはさらに、細胞中の２より多いアンプリコンのコピーの検出が、癌または腫瘍形成の診断または予後であり得ることを示す、説明書をさらに含み得る。

例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１） ヒト核酸のサンプル中のアンプリコンの存在についてスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下：
ヒト細胞由来の核酸のサンプルおよびプローブを提供する工程であって、ここで、該プローブは、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０までを含む核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、工程；
該ヒト核酸に該プローブを接触させる工程であって、ここで、該プローブは、該プローブがヒトゲノム核酸にストリンジェント条件下で選択的に結合する条件下で、該ヒトゲノム核酸と接触され、ハイブリダイゼーション複合体を形成する、工程；および
該ハイブリダイゼーション複合体の形成を検出する工程
を包含する、方法。
（項目２） 前記ヒト核酸が、ゲノムＤＮＡである、項目１に記載の方法。
（項目３） 前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程が、前記アンプリコンのコピー数を決定する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目４） 前記ゲノム核酸が、乳房腫瘍細胞から単離される、項目１に記載の方法。
（項目５） 前記プローブが、Ｄ２０Ｓ１２０とＤ２０Ｓ２１１との間の距離にわたる核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、項目１に記載の方法。
（項目６） 前記プローブが、ＡＦＭａ２３３ｗｇ１、ＡＦＭ０８０ｙａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群より選択されるＳＴＳマーカーに特異的にハイブリダイズする核酸を含む、項目１に記載の方法。
（項目７） 前記プローブが、Ｄ２０Ｓ２１１、Ｄ２０Ｓ８５４、Ｄ２０Ｓ８７６、Ｄ２０Ｓ１０４４、Ｄ２０Ｓ９１３、Ｄ２０Ｓ７２０およびＤ２０Ｓ１２０からなる群より選択されるＧＤＢ遺伝子座核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、項目１に記載の方法。
（項目８） 前記プローブが、ＲＭＣ２０Ｂ４０９７、ＲＭＣ２０Ｂ４１０３、ＲＭＣ２０Ｐ４０１６、ＲＭＣ２０Ｂ４１３０、ＲＭＣ２０Ｐ４１８５、ＲＭＣ２０Ｂ４１８８、ＲＭＣ２０Ｂ４１０９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１０、ＲＭＣ２０Ｐ４０２８、ＲＭＣ２０Ｐ４００３、ＲＭＣ２０Ｂ４０９９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１８、ＲＭＣ２０Ｐ４０６９、ＲＭＣ２０Ｂ４１２１、ＲＭＣ２０Ｂ４０８７およびＲＭＣ２０Ｐ４０７０からなる群より選択されるクローン化されたゲノム核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、項目１に記載の方法。
（項目９） 前記プローブが、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０までを含む核酸配列のいくらかまたは全てを増幅し得るポリメラーゼ連鎖反応プライマー対を含み、そして前記検出工程が、該ポリメラーゼ連鎖反応増幅反応の形成を検出する工程を包含する、項目１に記載の方法。
（項目１０） 前記ポリメラーゼ連鎖反応プライマー対が、ＡＦＭａ２３３ｗｇ１、ＡＦＭ０８０ｙａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群より選択されるＳＴＳ ＰＣＲプライマー対である、項目９に記載の方法。
（項目１１） 前記プローブが、固体表面に結合される、項目１に記載の方法。
（項目１２） 前記結合されたプローブが、核酸アレイのメンバーである、項目１１に記載の方法。
（項目１３） 前記ヒト核酸が、検出可能な組成物で標識される、項目１に記載の方法。
（項目１４） 前記検出可能な組成物が、フルオレセインまたはテキサスレッドである、項目１３に記載の方法。
（項目１５） 前記プローブが、検出可能な組成物で標識される、項目１に記載の方法。
（項目１６） 項目１に記載の方法であって、ここで、該方法はさらに、参照細胞由来の核酸を提供し、ここで、該参照細胞核酸は、前記ヒトゲノム核酸より前に、または該ヒトゲノム核酸と同時に、前記プローブと接触される、方法。
（項目１７） 項目１に記載の方法であって、ここで該方法はさらに、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを提供し、ここで該Ｃｏｔ−１ ＤＮＡは、前記ヒトゲノム核酸に前記プローブを接触させる前に、該ヒトゲノム核酸にハイブリダイズされる、方法。
（項目１８） ヒトゲノム核酸のサンプル中のアンプリコンの存在についてスクリーニングするための核酸プローブであって、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０までを含む核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、核酸プローブ。
（項目１９） Ｄ２０Ｓ１２０とＤ２０Ｓ２１１との間の距離にわたる核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、項目１８に記載のプローブ。
（項目２０） ＡＦＭａ２３３ｗｇ１、ＡＦＭ０８０ｙａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群より選択されるＳＴＳマーカーに特異的にハイブリダイズする核酸を含む、項目１８に記載のプローブ。
（項目２１） Ｄ２０Ｓ２１１、Ｄ２０Ｓ８５４、Ｄ２０Ｓ８７６、Ｄ２０Ｓ１０４４、Ｄ２０Ｓ９１３、Ｄ２０Ｓ７２０およびＤ２０Ｓ１２０からなる群より選択されるＧＤＢ遺伝子座核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、項目１８に記載のプローブ。
（項目２２） ＲＭＣ２０Ｂ４０９７、ＲＭＣ２０Ｂ４１０３、ＲＭＣ２０Ｐ４０１６、ＲＭＣ２０Ｂ４１３０、ＲＭＣ２０Ｐ４１８５、ＲＭＣ２０Ｂ４１８８、ＲＭＣ２０Ｂ４１０９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１０、ＲＭＣ２０Ｐ４０２８、ＲＭＣ２０Ｐ４００３、ＲＭＣ２０Ｂ４０９９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１８、ＲＭＣ２０Ｐ４０６９、ＲＭＣ２０Ｂ４１２１、ＲＭＣ２０Ｂ４０８７およびＲＭＣ２０Ｐ４０７０からなる群より選択されるクローン化されたゲノム核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、項目１８に記載のプローブ。
（項目２３） Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０までを含む核酸配列のいくらかまたは全てを増幅し得るポリメラーゼ連鎖反応プライマー対を含む、項目１８に記載のプローブ。
（項目２４） 前記ポリメラーゼ連鎖反応プライマー対が、ＡＦＭａ２３３ｗｇ１、ＡＦＭ０８０ｙａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群より選択されるＳＴＳ ＰＣＲプライマー対である、項目２３に記載のプローブ。
（項目２５） ヒト核酸のサンプル中のアンプリコンの存在についてスクリーニングするためのキットであって、該キットは、プローブを含む区画を含み、ここで、該プローブは、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０までを含む核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、キット。
（項目２６） 前記プローブが、Ｄ２０Ｓ１２０とＤ２０Ｓ２１１との間の距離にわたる核酸を含む、項目２５に記載のキット。
（項目２７） 前記プローブが、ＡＦＭａ２３３ｗｇ１、ＡＦＭ０８０ｙａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群より選択されるＳＴＳマーカーに特異的にハイブリダイズする核酸を含む、項目２５に記載のキット。
（項目２８） 前記プローブが、Ｄ２０Ｓ２１１、Ｄ２０Ｓ８５４、Ｄ２０Ｓ８７６、Ｄ２０Ｓ１０４４、Ｄ２０Ｓ９１３、Ｄ２０Ｓ７２０およびＤ２０Ｓ１２０からなる群より選択されるＧＤＢ遺伝子座核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、項目２５に記載のキット。
（項目２９） 前記プローブが、ＲＭＣ２０Ｂ４０９７、ＲＭＣ２０Ｂ４１０３、ＲＭＣ２０Ｐ４０１６、ＲＭＣ２０Ｂ４１３０、ＲＭＣ２０Ｐ４１８５、ＲＭＣ２０Ｂ４１８８、ＲＭＣ２０Ｂ４１０９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１０、ＲＭＣ２０Ｐ４０２８、ＲＭＣ２０Ｐ４００３、ＲＭＣ２０Ｂ４０９９、ＲＭＣ２０Ｐ４０６９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１８、ＲＭＣ２０Ｂ４１２１、ＲＭＣ２０Ｂ４０８７およびＲＭＣ２０Ｐ４０７０からなる群より選択されるクローン化されたゲノム核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、項目２５に記載のキット。
（項目３０） 前記プローブが、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０までを含む核酸配列のいくらかまたは全てを増幅し得るポリメラーゼ連鎖反応プライマー対を含む、項目２５に記載のキット。
（項目３１） 前記ポリメラーゼ連鎖反応プライマー対が、ＡＦＭａ２３３ｗｇ１、ＡＦＭ０８０ｙａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群より選択されるＳＴＳ ＰＣＲプライマー対である、項目３０に記載のキット。
（項目３２） 前記プローブが、クローン化されたヒト核酸である、項目２５に記載のキット。
（項目３３） 前記クローン化されたヒトゲノム核酸が、固体表面に結合される、項目２５に記載のキット。
（項目３４） 前記結合されたプローブが、核酸アレイのメンバーである、項目３３に記載のキット。
（項目３５） 細胞中の２より多いアンプリコンのコピーの検出が、癌または腫瘍形成の診断または予後であり得ることを示す、説明書をさらに含む、項目２５に記載のキット。

本発明の性質および利点のさらなる理解は、詳細な説明の残りの部分、図面および特許請求の範囲を参照することによって明らかになり得る。

本明細書中に引用される全ての刊行物、ＧｅｎＢａｎｋ登録証書（配列）、特許および特許出願は、全ての目的のために参考として本明細書中に明確に援用される。

図１は、ハイブリダイゼーション分析を使用する、腫瘍（「Ｓ２１」）の２０ｑ１３．２領域の分析の結果を示す。このグラフは、腫瘍Ｓ２１において選択された２０ｑ１３．２クローンについての比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）比を示し、これは、「Ｇ／Ｒ」、すなわち赤色蛍光（テキサスレッドｄＣＴＰ）に対する緑色蛍光（フルオレセインｄＣＴＰ）の比を、この２０ｑ１３．２コンティグクローンに対するゲノム核酸ハイブリダイゼーションの量の関数として表す。 図２は、第２０染色体の２０ｑ１３．２領域における、選択されたマーカーおよびクローンの分布ならびに位置を示す。２０ｑ１３ゲノム核酸インサートを含む３つの隣接したＹＡＣ（８５６ａ１０、９３１ｈ６、８２０ｆ５）を、水平線として示す。 図３は、乳癌細胞株ＭＣＦ７（上パネル）、ならびに２つの乳癌腫瘍、Ｓ２１およびＳ５０（下の２つのパネル）を使用する、２０ｑ１３．２の高分解能アレイ分析の結果を示す。上パネルは、コンティグのアレイプローブの位置を示す。この上パネル中のプローブクローンを、表１に列挙する；クローン名は、最後の４桁の数で示した。

（定義）
本発明の理解を容易にするために、多くの用語を以下に定義する。

本明細書中で使用される場合、用語「アンプリコン」とは、変更されたコピー数で存在する場合に癌に関連するゲノム核酸の領域をいう。例えば、本発明は、異常なコピー数で存在する場合に癌に関連する、ヒト染色体２０ｑ１３．２上の新規な核酸配列を提供する。代表的に、本発明の核酸配列は、癌（例えば、乳癌）に関連する場合、増加されたコピー数を有する。従って、用語「アンプリコン」とは、これらの新規な配列についてをいう。しかし、このコピー数はまた、いくつかの環境下で減少され得る。従って、本発明は、コピー数における変化を分析して、癌をスクリーニングおよび診断するためのプローブとして使用され得る核酸を提供する。高分解能アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（「アレイＣＧＨ」）を使用して、本発明のアンプリコン由来の配列を、核酸サンプル中の単一コピー数の変化決定するためのプローブとして使用され得る。コピー数の決定（定量）はまた、癌の予後において補助し得る。なぜなら、アンプリコンのコピー数の増加は、攻撃性の腫瘍表現型に関連するからである。特に、本発明のプローブは、特に２０ｑ１３．２領域における、例えば、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０までを含む核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む。代替的な実施態様において、このプローブは、Ｄ２０Ｓ１２０とＤ２０Ｓ２１１との間の距離にわたる任意の核酸配列；２０ｑ１３．２領域における任意のクローン、ＧＤＢ遺伝子座またはＳＴＳマーカー（例えば、表１に列挙される例示的クローン、ＧＤＢ遺伝子座、ＳＴＳおよび他のマーカー（例えば、ＷＩ−９２２７））に特異的にハイブリダイズする核酸を含み得る。

本明細書中で使用される場合（例えば、表１および図２において使用される場合）、用語「Ｄ２０Ｓ１２０」、「Ｄ２０Ｓ２１１」、「Ｄ２０Ｓ１９３」および同様の「Ｄナンバー」とは、Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（「ＧＤＢ」）の命名であり、これらは、特定の染色体にマッピングされた特定のゲノム核酸配列をいう（例えば、Ｌｅｔｏｖｓｋｙ（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：９４−９９を参照のこと）。これらの遺伝子座およびＳＴＳの命名の情報は、公共のデータベース上で利用可能であり、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｄｂ．ｏｒｇ／を参照のこと。表１は、本発明の新規なアンプリコンを同定するために使用される高密度アレイを含むクローンについての、ＧＤＢ遺伝子座およびそれらに対応するＳＴＳ名を列挙する。これらのＧＤＢ遺伝子座は、ヒト第２０染色体の２０ｑ１３．２領域をマッピングする。遺伝子座「Ｄ２０Ｓ１２０」、「Ｄ２０Ｓ２１１」および「Ｄ２０Ｓ１９３」は、以下でさらに詳細に記載される。

本明細書中で使用される場合、用語「特異的にハイブリダイズする」および「特異的なハイブリダイゼーション」および「選択的にハイブリダイズする」とは、ストリンジェント条件下で特定のヌクレオチドに優先的な、核酸分子の結合、二重鎖形成またはハイブリダイズをいう。用語「ストリンジェント条件」とは、プローブがその標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして他の配列により少ない程度でハイブリダイズするか、または全くハイブリダイズしない条件をいう。核酸ハイブリダイゼーションの状況下（例えば、アレイハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーションまたはノーザンハイブリダイゼーション）での「ストリンジェントハイブリダイゼーション」および「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、そして異なる環境パラメーター下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対する例示的ガイドは、例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔ Ｉ、第２章、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮＹ（「Ｔｉｊｓｓｅｎ」）に見出される。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融点（Ｔ_m）より約５℃低く選択される。Ｔ_mは、標的配列の５０％が、完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨ下）である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブについてのＴｍと等しく選択される。アレイ上あるいはサザンブロットまたはノーザンブロットのフィルター上に１００を超える相補的残基を有する、相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例は、標準的なハイブリダイゼーション溶液（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋおよび以下の詳細な議論を参照のこと）を使用して４２℃であり、このハイブリダイゼーションを一晩行う。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、０．１５Ｍ ＮａＣｌで、７２℃、約１５分間である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃で約１５分間の０．２×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）第１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）を参照のこと）。しばしば、低ストリンジェンシーの洗浄が、高ストリンジェンシーの洗浄に先立ち、バックグラウンドプローブシグナルを除去する。例えば、１００ヌクレオチドをこえるヌクレオチドの二重鎖についての中程度のストリンジェンシーの洗浄の例は、１×ＳＳＣで、４５℃、１５分間である。１００ヌクレオチドをこえるヌクレオチドの二重鎖についての低ストリンジェンシーの洗浄の例は、４〜６×ＳＳＣで、４０℃、１５分間である。

本明細書中で使用される場合、用語「検出可能な組成物で標識される」とは、検出可能な組成物（すなわち、標識）に結合された核酸をいう。検出は、例えば、顕微鏡的、光化学的、生化学的、免疫化学的、物理的または化学的手段により得る。例えば、有用な標識としては、以下が挙げられる：³²Ｐ、³⁵Ｓ、³Ｈ、¹⁴Ｃ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ；蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体、テキサスレッド）、電子密度試薬（例えば、金）、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に使用されるようなもの（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ））、比色標識（例えば、金コロイド）、磁気標識（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ^TM）、ビオチン、ジオキシゲニン、またはハプテンおよび抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なタンパク質。標識は、検出されるべき核酸、ペプチドまたは他の標的化合物中に直接組み込まれ得るか、あるいは標識は、その標的にハイブリダイズするかもしくは結合するプローブまたは抗体に結合され得る。ペプチドは、二次レポーターによって認識される、予め決定されたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体についての結合部位、転写アクチベーターポリペプチド、金属結合ドメイン、エピトープタグ）を組み込むことによって検出可能にされ得る。標識は、種々の長さのスペーサーアームによって結合され、可能性のある立体障害を減少し得るか、または他の有用もしくは所望の特性に対して影響を与え得る。Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ（１９９５）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ９：１４５−１５６を参照のこと。

本明細書中で使用される場合、用語「核酸」とは、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドをいう。この用語は、参照核酸として、所望される目的のために、類似のまたは改善された結合特性を有する天然のヌクレオチドの既知のアナログを含む、核酸、すなわちオリゴヌクレオチドを含む。この用語はまた、天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で、または所望される目的のためにその上に改善された速度で代謝される核酸を含む。この用語はまた、合成骨格を有する核酸様構造を含む。本発明によって提供されるＤＮＡ骨格アナログには、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミダイト、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３’−Ｎ−カルバメート、モルホリノカルバメート、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＰｒｅｓｓにおけるＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第６００巻、ＢａｓｅｒｇａおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編（ＮＹＡＳ １９９２）を参照のこと；Ｍｉｌｌｉｇａｎ（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１９２３−１９３７；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）。ＰＮＡは、非イオン性骨格（例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位）を含む。ホスホロチオエート結合は、ＷＯ ９７／０３２１１；ＷＯ ９６／３９１５４；Ｍａｔａ（１９９７）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４４：１８９−１９７に記載されている。この用語に含まれる他の合成骨格には、メチルホスホネート結合、または交互のメチルホスホネートおよびホスホジエステル結合（Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：８６９２−８６９８）ならびにベンジルホスホネート結合（Ｓａｍｔａｇ（１９９６）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．６：１５３−１５６）が含まれる。用語核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドプライマー、プローブ、および増幅産物に交換可能に使用される。

本明細書中で使用される場合、用語「核酸アレイ」とは、複数の標的エレメントであり、各々の標的エレメントは、サンプル核酸がハイブリダイズする固体表面に固定化された１つ以上の核酸分子（プローブ）を含む。標的エレメントの核酸は、特異的な遺伝子またはクローン由来の配列（例えば、本明細書中に開示される本発明のプローブ）を含み得る。他の標的エレメントは、例えば、参照配列を含む。種々の寸法の標的エレメントが、本発明のアレイにおいて使用され得る。一般的に、より小さな標的エレメントが好ましい。代表的には、標的エレメントは、直径約１ｃｍより小さい。一般的なエレメントサイズは、約１μｍ〜約３ｍｍ、好ましくは約５μｍと約１ｍｍとの間である。アレイの標的エレメントは、異なる密度で固体表面上に配置され得る。標的エレメントの密度は、多数の因子（例えば、標識の性質、固体支持体など）に依存する。当業者は、各々の標的エレメントが、異なる長さおよび配列のプローブ核酸の混合物を含み得ることを認識する。従って、例えば、標的エレメントは、１コピー以上のクローニングされたＤＮＡの断片を含み得、そして各コピーは、異なる長さのフラグメントに分解され得る。標的エレメント上に固定されたプローブ核酸の長さおよび複雑さは、本発明にとって重要ではない。当業者は、これらの要因を調節して、所定のハイブリダイゼーション手順のために最適なハイブリダイゼーションおよびシグナル産生を提供し得、そして異なる遺伝子またはゲノム位置間での必要とされる分解能を提供する。種々の実施態様において、プローブ配列は、約１ｋｂと約１Ｍｂとの間、約１０ｋｂと約５００ｋｂとの間、約２００〜約５００ｋｂの間、および約５０ｋｂ〜約１５０ｋｂの複雑さを有する。

本明細書中で使用される場合、用語「プローブ」または「核酸プローブ」は、サンプルに対するハイブリダイゼーションが検出され得る１つ以上の核酸フラグメントのコレクションであると定義される。このプローブは、以下に記載されるように、標識されなくともまたは標識されてもよく、その結果、標的またはサンプルへのその結合が検出され得る。このプローブは、１つ以上の特定の（あらかじめ選択された）ゲノムの部分由来の核酸の供給源（例えば、１つ以上のクローン、単離された全体の染色体、または染色体フラグメント、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅産物のコレクション）から作製される。本発明のプローブは、本明細書中で記載される領域において見出される核酸から作製される。プローブまたはゲノム核酸サンプルは、いくつかの様式でプロセスされ得る（例えば、反復核酸のブロッキングもしくは除去、または独特な核酸での富化）。用語「サンプル」は、検出された核酸をいうだけではなく、標的に適用される形態にある（例えば、核酸のブロッキングなどを伴う）検出可能な核酸をいう。核酸のブロッキングはまた、別々に言及され得る。「プローブ」が特異的に表すことは、その用語が使用される文脈から明確である。プローブはまた、アレイ中にある場合、固体表面（例えば、ニトロセルロース、ガラス、石英、融合したシリカスライド）に固定化された、単離された核酸であり得る。いくつかの実施態様において、プローブは、例えば、ＷＯ ９６／１７９５８に記載されるように、核酸のアレイのメンバーであり得る。高密度アレイを作製し得る技術もまた、この目的のために使用され得る（例えば、Ｆｏｄｏｒ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ７６７−７７３（１９９１）；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：Ｒ１７１−Ｒ１７４；Ｓｃｈｕｍｍｅｒ（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３；１０８７−１０９２；Ｋｅｒｎ（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：１２０−１２４；米国特許第５，１４３，８５４号を参照のこと）。当業者は、本明細書中に記載される特定のプローブの正確な配列がある程度まで改変されて、開示されたプローブに「実質的に同一」であるが、しかしそれが由来するプローブと同じ標的またはサンプルに特異的に結合する（すなわち、特異的にハイブリダイズする）能力を保持するプローブを作製し得ることを認識する（上記の議論を照のこと）。このような改変は、本明細書中に記載される個々のプローブに対する言及として詳細に網羅される。

本明細書中で使用される場合、用語「ヒト核酸のサンプル」とは、本発明のプローブに対するハイブリダイゼーションのために適切な形態でヒトＤＮＡまたはヒトＲＮＡを含むサンプルをいう。核酸は、単離、クローニング、または増幅され得る；それは、特定の染色体、または本明細書で開示される特定のアンプリコンもしくは欠失中の選択された配列（例えば、特定のプロモーター、遺伝子、増幅フラグメントまたは制限フラグメント、ｃＤＮＡなど）由来の、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡであり得る。核酸サンプルは、特定の細胞または組織から抽出され得る。核酸サンプルが調製される細胞または組織サンプルは、代表的には、アンプリコン増幅もしくは欠失または検出される転座と関連する癌を有すると疑われる患者から取られる。細胞サンプルおよび組織サンプルを単離する方法は、当業者に周知であり、そして吸引、組織切片、針生検などを含むがこれらに限定されない。しばしばサンプルは、患者由来のサンプルである「臨床サンプル」である。これは、組織学的目的のために取られた組織の切片（例えば、凍結切片またはパラフィン切片）を含む。このサンプルはまた、細胞培養物からの（細胞の）上清または細胞自体に由来し得るか、組織培養物、および、染色体異常を検出することまたはアンプリコンコピー数を決定することが所望され得る他の培地からの細胞に由来し得る。いくつかの場合において、核酸は、ハイブリダイゼーションの前に、ＰＣＲのような標準的な技術を用いて増幅され得る。サンプルは、固体上に固定された単離された核酸であり得る。サンプルはまた、個々の核酸が実質的にインタクトで残って、そして含むように調製され得る。

用語「配列タグ化部位」または「ＳＴＳ」とは、配列に基づく、クローニングしたＤＮＡセグメント（例えば、コンティグのメンバー、異常な制限部位（制限マップのメンバー）を含むセグメント、遺伝的にマッピングされたＤＮＡ多型を検出するプローブ、または特定の細胞遺伝学的バンドにインサイチュでハイブリダイズする配列）を「タグ化する」かまたは同定する方法をいう。ＳＴＳ指定を割り当てるために、各々のクローニングされたＤＮＡセグメントは、（少なくとも）約２００〜５００塩基対領域にわたって配列決定される。この配列データを用いて、ＰＣＲプライマーは設計され、そしてそれらがＰＣＲ増幅によるその特定の配列を同定するか、または「タグする」ために使用され得ることを確認するために試験される。セグメントおよびプライマー配列、ならびにＰＣＲアッセイ条件の公的データベースへの提出は、誰でも迅速かつ都合よく、実質的にいかなるゲノムクローンまたはフラグメントをも同定−およびマッピング−することを可能にする。例えば、Ｏｌｓｏｎ（１９８９）「Ａ ｃｏｍｍｏｎ ｌａｎｇｕａｇｅ ｆｏｒ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：１４３４−１４３５を参照のこと。

（発明の詳細な説明）
本発明は、ヒトの癌の検出、診断、および診断のために有用な、ヒト染色体２０の２０ｑ１３．２領域中の、新規な、核酸の限定される領域を同定する。本明細書中で開示される核酸領域は、しばしば、ヒトの癌（特にヒトの乳癌）における染色体異常およびコピー数の変化と関連する。この新規な領域は、「アンプリコン」と呼ばれる。なぜなら、これらは代表的には、癌細胞におけるコピー数を増加するからである。従って、これらの新規な配列は、コピー数の変化を検出して、疾患（例えば癌、特に乳癌）の存在についてスクリーニングするためのプローブおよび方法において使用される。さらに、コピー数の決定は、特定の癌の予後において使用され得る。なぜなら、高コピー数は、しばしば、攻撃的な腫瘍のふるまいおよび治療に対する不良な応答に関連するからである。

核酸領域、すなわちアンプリコンの増幅は、代表的には、増幅した表現型の原因である決定的な最小の「ｃｏｒｅ」遺伝子配列によって駆動される。多くの例において、この決定的なコア遺伝子は、オンコジーンをコードする。従って、増幅を駆動する最小遺伝子配列の同定は、オンコジーンを同定するようである。さらに、非常に増幅された領域を有する腫瘍は、代表的には、非常に増幅された２０ｑ１３．２領域を有する腫瘍を用いて観察されたように、より攻撃的な腫瘍であるようである。従って、最小の、または「増幅を駆動する」アンプリコン配列の定義および使用は、新規なかつ改善された診断的および予後的手順を生成する。癌細胞中での領域のコピー数を決定するための、より小さなまたは「最小の」アンプリコン遺伝子配列の使用は、より正確な結果（すなわち、より大きな遺伝子セグメントを使用して獲得された結果よりも、より良好な診断および予後）を生じる。本発明は、第２０染色体の２０ｑ１３．２領域中の、このようなより小さな、最小の「コア」領域、新規なアンプリコンを提供する。これは、以前に記載されたコア領域とは異なる。

高分解能アレイに基づく比較的なゲノムハイブリダイゼーション（アレイＣＧＨ）は、特に癌細胞（例えば、乳癌細胞）中の第２０染色体の２０ｑ１３．２領域中のコピー数の変動を分析するために適用された。２０ｑ１３．２配列の高分解能マッピングは、位置的に重複するクローンのアレイ（「コンティグ」と呼ばれる）を使用して達成された。コンティグを含むクローンの第２０染色体インサートの大部分は、サイズが約１メガベース（Ｍｂ）未満で、約１００〜２００キロベース（ｋｂ）の範囲であった。このことは、このアレイが、核酸サンプル由来の区切られた領域（「アンプリコン」）を非常に高程度の分解能まで物理的にマッピングし、そして定量することを可能にした。このことは、本発明の新規な２０ｑ１３．２アンプリコンの発見をもたらした。

本発明の新規なアンプリコンを同定した高分解能アレイにおいて使用されるクローンは、図３の一番上のパネルにおいて示される。このアレイは、１．５Ｍｂをカバーするクローンの重複するセットを含む。図３の一番上のパネルは、この高分解能アレイのコンティグを含むクローンの名称および相対位置を示す（図３において、プローブクローンの名称は、最後の４つの数字で省略されており、すなわち、クローンＲＭＣ２０Ｂ４０９７は、「４０９７」と省略されている）。図３は、いかに高分解能アレイ（「ＣＧＨ」）データが、増幅された領域中で、より小さな「決定的な」遺伝子セグメントを位置付けする際に補助し得るかを図示する（例えば、図示された重複するクローンのセットが、本発明の新規な２０ｑ１３．２アンプリコンを発見するためにアレイ中で使用されたように）。図３は、乳癌細胞株ＭＣＦ７（例えば、Ｂｅｎｚ（１９８９）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１：１７０４−１７０９を参照のこと）（上のパネル）、および２つの腫瘍、Ｓ２１およびＳ５０（下の２つのパネル）（Ｂａｙ Ａｒｅａ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ ＳＰＯＲＥ，ＵＣＳＦ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａより提供された）の高分解能分析の結果を示す。

表１はさらに、このアレイの種々のクローン（「ＲＭＣ」クローン名称、左側のカラム）および対応するＧＤＢ遺伝子座名（「Ｄ番号」）、ＳＴＳマーカー表示、ならびに公的ドメインからの他の関連する名称を例証する。いくつかのクローンは、公的なデータベース由来のいくつかのＳＴＳマーカー（例えば、ＲＭＣ２０Ｐ４０３０）を含む。多くのＳＴＳマーカー（およびそれらの関連するＰＣＲプライマー、上記のＳＴＳの定義を参照のこと）は、「Ｄ番号」によって表示されたＧＤＢ遺伝子座を同定するために使用され得る。「Ｄ」遺伝子座（例えば、Ｄ２０Ｓ９０２）はまた、別のクローンの表示（例えば、ＡＦＭｃ０２８ｚｃ５）と関連し得る。別の例は、クローンＲＭＣ２０Ｐ４００９であり、これはＳＧＣ３１０１０およびＷＩ−１６６９７を含む。

図３において、水平軸上のクローン的に関連する線の長さは、染色体に沿った距離に比例する。テロメアは右側にある。ＭＣＦ７（上のパネル）、腫瘍Ｓ２１（中間のパネル）、および乳房腫瘍Ｓ５０（下のパネル）についての高分解能アレイＣＧＨデータは、個々のクローン（プローブ）の長さおよび染色体に沿ったそれらのマッピングされた位置を表す、水平方向の黒い棒とともにプロットされる。それらは、それらのＣＧＨ比を示す垂直方向の高さでプロットされ、すなわち、より高い線がより多いコピー数を有する。測定の標準偏差は、約１０％であると見積もられる。

細胞株ＭＣＦ７において、急激なコピー数の増加が存在する。上昇した比は、クローンＲＭＣ２０Ｂ４０９７（「４０９７」）の遠位の部分に記録され、そして増加は、クローンＲＭＣ２０Ｂ４１０３（「４１０３」）およびＲＭＣ２０Ｂ４１３０（「４１３０」）を用いて検出され、これらは、より遠位にマッピングしている（表１を参照のこと、例えば、クローン４０９７はまた、ＳＴＳ表示ＡＦＭａ２３３ｗｇ１、ＧＤＢマーカー名Ｄ２０Ｓ２１１またはＤ２０Ｓ８５４によって同定され得る）。このコピー数は、測定の不確実性の範囲内で、この増幅された領域から遠位で一定になる。これらのデータは、ＭＣＦ７において、ＲＭＣ２０Ｂ４０９７の最も遠位部（「４０９７」の右側）にマッピングし、また部分的にＲＭＣ２０Ｂ４１０３（「４１０３」）およびＲＭＣ２０Ｂ４１３０（「４１３０」）に含まれ、そしてより遠位のクローンに全体的に含まれる高コピー数の領域が存在することを示す。従って、急激なコピー数の増加の位置（垂直方向の灰色線）は、重複クローン（ＲＭＣ２０Ｂ４０９７、ＲＭＣ２０Ｂ４１０３、およびＲＭＣ２０Ｂ４１３０）上の比から非常に正確にマッピングされ得る。

対照的に、腫瘍Ｓ２１およびＳ５０は、数百キロベース（ｋｂ）の距離にわたる、コピー数の比較的連続する変化を示す。腫瘍Ｓ５０において、コピー数のピークは、クローンＲＭＣ２０Ｂ４０９７（「４０９７」）の周辺に存在する。Ｓ５０の増幅領域の遠位の境界（テロメアに向かって図３の右側）は、およそＲＭＣ２０Ｐ４０２８（「４０２８」）からクローンＲＭＣ２０Ｐ４０１８（「４０１８」）までにマッピングする。腫瘍Ｓ２１について、増幅された領域の近位の境界（左側）は、（高分解能アレイ中で連続するクローンの適用範囲の領域内で）およそのクローン４０９７に位置付けされる。Ｓ２１において、染色体に沿ってより遠位に（右側に）動くに従って、コピー数は増加し続ける。

Ｓ２１（および別の腫瘍Ｓ５９、これらのデータは図３には示されていない）におけるコピー数の増加の大きさは著しい。これは、コンティグに対して遠位である（図３の右側）か、なおスキャニングアレイ上の次のマーカーＤ２０Ｓ１２０に対して近位である染色体領域に注意を集める（Ｄ２０Ｓ１２０は、マーカーＲＭＣ２０Ｂ４０８７に対して遠位にマッピングする；Ｄ２０Ｓ１２０は、ＲＭＣ２０Ｐ０７０中に含まれる；表１を参照のこと）。ＧＤＢマーカーＤ２０Ｓ１２０を含むクローンは、コピー数が上昇していないか、またはそのコピー数は、これらの腫瘍中で非常に減少されている（データは示さず）。３つの他の腫瘍について、遠位の境界は、Ｄ２０Ｓ１２０と次の最も遠位の標的クローン、Ｄ２０Ｓ１００との間にマッピングされた（データは示さず）；これらはまた、他の２０ｑ１３．２コンティグクローンと比較して、Ｄ２０Ｓ１２０で非常に減少したコピー数を有した。従って、これらの観察は、この新規な２０ｑ１３．２アンプリコンの遠位の境界が、一般的に、Ｄ２０Ｓ１２０の近くに存在することを示す。さらに、それらは、最少の増幅された領域の遠位の境界が、この遺伝子座に対して近位にマッピングすることを確立する。従って、新規なアンプリコンは、（近位から遠位へ）ＲＭＣ２０Ｂ４０９７（「４０９７」またはＤ２０Ｓ２１１、表１を参照のこと）とＤ２０Ｓ１２０（ＲＭＣ２０Ｐ０７０）との間に同定された。

この新規なアンプリコンはさらに、図１に示されるようにＦＩＳＨを用いて特徴付けされた。クローンＲＭＣ２０Ｃ００１、ＲＭＣ２０Ｂ４０９７（「４０９７」）、ＷＩ−９２２７、Ｄ２０Ｓ１２０、およびＤ２０Ｓ１００を、プローブとして使用した。増加したＧ／Ｒ比に基づいて、コピー数増幅の境界領域−アンプリコン−を検出した。新規な２０ｑ１３．２アンプリコンの遠位の境界は、Ｄ２０Ｓ１２０に対して近位であると決定された。この結論に到達するにおいて、腫瘍サンプルＳ２１のコピー数分析が、最も情報量が多かった。図１に示されるように、Ｓ２１では、上昇したコピー数の領域は、クローンＲＭＣ２０Ｂ４０９７（「４０９７」）の近位で始まり、そしてコンティグの最も遠位の部分、ＷＩ−９２２７（ＲＭＣ２０Ｂ４０８７、表１を参照のこと）においてコピー数が最も高い。コピー数は、Ｄ２０Ｓ１２０において上昇せず、これは、新規なアンプリコンの遠位の境界を、Ｄ２０Ｓ１２０に対して近位に配置する。このハイブリダイゼーションデータは、新規なアンプリコンが（近位から遠位へ）ＲＭＣ２０Ｂ４０９７とＤ２０Ｓ１２０（ＲＭＣ２０Ｐ０７０）との間に同定されたことを確証する。

（アンプリコン、プローブ、およびアレイをコードする核酸の特徴付け、単離、および合成）
本発明は、ヒト染色体２０ｑ１３．２由来の新規な核酸配列−新規なアンプリコン−の位置付け、クローニング、および発現を初めて提供した。本発明は、これらの配列を含むプローブを提供する。さらなる実施態様は、生物学的サンプル、特に、ヒトの癌におけるこれらのアンプリコン配列のコピー数の変化の存在をスクリーニングするための手段を提供する。アンプリコンのコピー数は一般に乳癌において変化するが、それらはまた、前立腺癌、子宮頸部癌、卵巣癌、膀胱癌、頭頸部の癌、および結腸癌を含むがこれらに限定されない、他の癌に診断的および予後的であり得る。

本発明は、科学文献および特許文献において十分に記載されている、当該分野で公知の任意の方法またはプロトコルと組み合わせて実施され得る。従って、本発明の新規な試薬および方法に対して特定の方法論および例を議論する前に、ほんのいくつかの一般的な技術を記載する。

（一般技術）
本発明の核酸をコードする全ＤＮＡまたはＲＮＡを単離する方法は、当業者に周知である。核酸の単離、精製、および操作のための技術、遺伝子、プローブ、およびアンプリコン配列、例えばライブラリーを産生させること、発現ベクターへのサブクローニング、プローブを標識すること、ＤＮＡハイブリダイゼーションなどは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ；Ｔｉｊｓｓｅｎ；「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ」、Ａｕｓｕｂｅｌ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９７）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）、に記載される。

本発明の核酸は、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または遺伝子組換えのハイブリッドに関わらず、種々の供給源から単離され得るか、またはインビトロで合成され得る。本発明の核酸は、例えば、トランスジェニック動物、形質転換された細胞、形質転換された細胞溶解物、または部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形態において発現され得る。配列決定方法は、代表的には、ジデオキシ配列決定（Ｓｅｑｕｅｎｑｓｅ，Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用するが、しかし、他のキットおよび方法が利用可能であり、そして当業者に周知である。

核酸およびタンパク質は、当業者に周知である多数の一般手段のいずれかによって、本明細書中に記載の本発明の教示および方法に従って、検出および定量される。これらには、いくつか名前を挙げると、例えば、分析的生化学的方法（例えば、分光光度法、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、および高速拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー）、種々の免疫学的方法（例えば、液体またはゲル沈降反応、免疫拡散（一重または二重）、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイなど）、サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット分析、ゲル電気泳動、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、他の核酸もしくは標的もしくはシグナルの増幅方法、放射性標識、シンチレーション計数、およびアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。

（合成核酸）
例えば、プローブ、アレイ、増幅のための鋳型などとしての使用のためのヌクレオチドは、以下に記載されるように、化学的に合成され得る。オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー、アンプリコンコード配列を含む合成核酸は、種々の溶液法または固相法によって調製され得る。ホスファイト−トリエステル化学、ホスホトリエステル化学、およびＨ−ホスホネート化学による核酸の固相合成のための手順の詳細な記載は、広範に利用可能である。例えば、自動合成機を使用するＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓの固相ホスホルアミダイトトリエステル法は、例えば、Ｉｔａｋｕｒａ、米国特許第４，４０１，７９６号；Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ、米国特許第４，４５８，０６６号および同第４，５００，７０７号に記載されている。Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２３：３９８９−３９９４；ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ，Ｇａｉｔ（編）、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．（１９８４）（Ｊｏｎｅｓ、第２章、Ａｔｋｉｎｓｏｎ、第３章、およびＳｐｒｏａｔ、第４章を参照のこと）；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ（１９８６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２７：４６９−４７２；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４０７（１９８６）もまた参照のこと。オリゴヌクレオチドを精製する方法には、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９８３）Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７−１４９に記載されるように、未変性アクリルアミドゲル電気泳動、アニオン交換ＨＰＬＣが含まれる。合成オリゴヌクレオチドの配列は、任意の化学分解法（例えば、Ｍａｘａｍ（１９８０）Ｍａｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６５：４９９−５６０，Ｘｉａｏ（１９９６）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ６：２４７−２５８、または固相化学分解手順については、Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．１８：２４９−２５２を参照のこと）を使用して確認され得る。

（核酸の増幅）
種々の実施態様において、本発明のアンプリコン配列は、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０までを含む核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸；Ｄ２０Ｓ１２０とＤ２０Ｓ２１１との間の距離にわたる核酸セグメントを含む。このアンプリコン領域中にマッピングされたクローン、ＧＤＢ遺伝子座、ＳＴＳマーカー、および他のクローニングされた核酸セグメントを表１に示し、そしてこれらには、例えば、ＷＩ−９２２７の核酸配列を含む。本発明の核酸は、当該分野で公知の任意の増幅方法論を用いて同定または生成され得る。

本発明のアンプリコン核酸は、アンプリコン配列（例えば、表１に示されるクローン、ＧＤＢ遺伝子座、およびＳＴＳマーカー）の任意のセグメントを含むか、またはこれに隣接するプライマー対を用いて増幅され得る。ＳＴＳマーカーは、マーカーを増幅するプライマー対によって部分的に規定される。Ｏｌｓｏｎ（１９８９）前出および上記の説明を参照のこと。１つの実施態様において、本発明のアンプリコンの存在および／またはコピー数は、ＰＣＲを用いて決定される。代替的な実施態様において、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー対は、以下からなる群から選択されるＳＴＳ ＰＣＲプライマー対である：ＡＦＭａ２３３ｗｇ１、ＡＦＭ０８０ｙａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７、およびＡＦＭ２７６ｘｈ１。本発明のアンプリコンのすべてもしくは一部の存在を検出するかまたはそのコピー数を定量するための他のＰＣＲプライマー対は、当業者によって容易に設計され得る。

本発明の核酸の増殖は、例えば、ハイブリダイゼーションプローブの構築、配列決定、クローンなどのために使用され得る。増幅プライマー対は、ヒト核酸のサンプル中のアンプリコン配列の存在についてスクリーニングするために使用され得る。プライマー対は、さらなるアンプリコン種（例えば、多型、対立遺伝子、および他の改変体など）を同定するために使用され得る。

オリゴヌクレオチドは、種々のハイブリダイゼーション技術および条件を使用して、アンプリコン配列を同定、検出、および増幅するために使用され得る。適切なアンプリコン方法は、以下を含むがこれらに限定されない：ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲ（ＰＣＲ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，Ａ ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｉｎｎｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）およびＰＣＲ ＳＴＲＡＴＥＧＩＥＳ（１９９５）、Ｉｎｎｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（Ｉｎｎｉｓ））、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ（１９９０）Ｇｅｎｅ ８９：１１７）；転写増幅（Ｋｗｏｈ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：１１７３）；および自律的（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４）；Ｑβレプリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術（例えば、ＮＡＳＢＡ，Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）；以下を参照のこと、Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３０７−３１６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌ、ならびにＭｕｌｌｉｓ（１９８７）米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号；Ａｒｎｈｅｉｍ（１９９０）Ｃ＆ＥＮ ３６−４７；Ｌｏｍｅｌｌ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３５：１８２６（１９８９）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２９１−２９４（１９９０）；Ｗｕ（１９８９）Ｇｅｎｅ ４：５６０；Ｓｏｏｋｎａｎａｎ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：５６３−５６４。インビトロ増幅された核酸をクローニングするための方法は、Ｗａｌｌａｃｅ、米国特許第５，４２６，０３９号に記載される。大きな核酸を増幅する方法は、例えば、Ｃｈｅｎｇ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６９：６８４−６８５に要約される。

本発明は、アンプリコン含有核酸をコードするＤＮＡを調製するための上記の各々の方法からの生成物の増幅および操作または検出を提供する。ＰＣＲ技術において、増幅されるＤＮＡ領域の２つの境界に対して相補的なオリゴヌクレオチドプライマーが、合成されそして使用される（例えば、Ｉｎｎｉｓを参照のこと）。ＰＣＲは、核酸を増幅、同定、定量、単離、および操作するための種々のプロトコルにおいて使用され得る。これらのプロトコルにおいて、増幅およびハイブリダイゼーションのためのプライマーおよびプローブが生成され、これらは本明細書中に列挙したＤＮＡ配列のすべてまたは任意の部分を含む。

ゲノムＤＮＡを増幅する際に、１つの好ましい技術は、縮重オリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（「ＤＯＰ−ＰＣＲ」）であり、これは例えば、Ｔｅｌｅｎｉｕｓ（１９９２）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ４：２５７−２６３；Ｔｅｌｅｎｉｕｓ（１９９２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３：７１８−７２５；Ｘｉａｏ（１９９６）Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ．Ｇｅｎｅｔ．７５：５７−６２によって記載される。ＤＯＰ−ＰＣＲは、部分的に縮重した配列のオリゴヌクレオチドを利用する。この縮重は、低い最初のアニーリング温度を利用するＰＣＲプロトコルとともに、複数の、例えば、ヒトにおいて約１０⁶の、所定のゲノム中の均一に分散した部位からのプライミングを確実にする。

ゲノムＤＮＡを増幅するための別の好ましい技術は、例えば、Ｌｕｃｉｔｏ（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４４８７−４４９２；Ｍｉｙａｓｈｉｔａ（１９９４）Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．６６：５４−５７；Ｖｏｏｉｊｓ（１９９３）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５２：５８６−５９７に記載されるような、リンカー−アダプターＰＣＲによる。この手順において、ＤＮＡは、分別された染色体から抽出され、しばしば切断する制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓａｕ３Ａ１）を使用することによって完全に消化され、そして各々の末端において、アダプターオリゴヌクレオチドに連結される。次いで、これらのフラグメントは、プライマーとしてアダプターオリゴヌクレオチドに対して相同な配列を使用して、ＰＣＲを用いて増幅される。腫瘍ゲノムおよび正常なゲノムの高度に再現可能な大量の「提示」が、オリゴヌクレオチドアダプターに連結された、ナノグラム量の、制限エンドヌクレアーゼ切断されたＤＮＡからのＰＣＲによって作製され得る。

ＰＣＲ−増幅された配列はまた、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブとして、標識および使用され得る（しかし、本発明の核酸プローブは、本明細書中に記載されるように、当該分野において周知である任意の合成技術または他の技術を使用して生成され得る）。本発明の標識され増幅されたＤＮＡまたは他のオリゴヌクレオチドもしくは核酸は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ゲノムライブラリー、インサイチュ核酸などを含む、任意の核酸の供給源からのアンプリコン配列をさらに同定および単離するために、または同定および定量するために、プローブとして使用され得る。

（クローン）
本発明の核酸を得るための別の有用な手段は、例えば、ゲノムクローンまたはｃＤＮＡクローンまたは完全なゲノムクローンから単離された（または増幅された）インサートをスクリーニングおよびクローニングすることである。これらには、例えば、哺乳動物の人工染色体（例えば、Ａｓｃｅｎｚｉｏｎｉ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．１１８：１３５−１４２を参照のこと）（ヒトの人工染色体を含む、例えば、Ｗａｒｂｕｒｔｏｎ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８６：５５３−５５５；Ｒｏｕｓｈ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：３８−３９；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：３３３−３３５を参照のこと）；酵母の人工染色体（ＹＡＣ）；細菌の人工染色体（ＢＡＣ）；Ｐ１人工染色体（Ｗｏｏｎ（１９９８）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５０：３０６−３１６；Ｂｏｒｅｎ（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６：１１２３−１１３０）；ＰＡＣ（バクテリオファージＰ１由来のベクター、例えば、Ｉｏａｎｎｏｕ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．６：８４−８９；Ｒｅｉｄ（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４３：３６６−３７５；Ｎｏｔｈｗａｎｇ（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４１：３７０−３７８を参照のこと）；コスミド、プラスミド、またはｃＤＮＡに含まれるゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーが含まれる。ＢＡＣは、１２０＋Ｋｂインサートを含み得るベクターである。ＢＡＣは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆ因子プラスミド系に基づき、ミリグラム量で操作および精製するのに簡単である。なぜなら、ＢＡＣプラスミドは、細胞当たり１〜２コピーに保たれているからであり、ＹＡＣ（これもまた、本発明の方法において使用され得る）で観察される再配列の問題が除外されるからである。ＢＡＣベクターは、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子およびグリーン蛍光タンパク質遺伝子（Ｂａｋｅｒ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：１９５０−１９５６）のようなマーカー遺伝子を含み得る。ＹＡＣＳはまた、８０〜７００ｋｂのサイズの範囲でインサートを使用および含有し得る。例えば、Ｔｕｃｋｅｒ（１９９７）Ｇｅｎｅ １９９：２５−３０；Ａｄａｍ（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１１：１３４９−１３５８を参照のこと。Ｐ１は、７５〜１００ＫｂのＤＮＡインサートを含み得る、Ｅ．ｃｏｌｉに感染するバクテリオファージであり（Ｍｅｊｉａ（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ７：１７９−１８６；Ｉｏａｎｎｏｕ（１９９４）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ６：８４−８９）、λライブラリーと非常によく似た方法でスクリーニングされる。

（核酸の配列決定）
新規に単離されたＤＮＡの配列決定は、本発明のアンプリコンをコードする核酸を同定および特徴付けする。単離されたアンプリコンをコードする核酸の配列決定はまた、その配列の可能な機能的特徴（例えば、オンコジーンポリペプチドについてのコード配列、転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）など）を同定する。

アンプリコンをコードする核酸配列は、ベクター中のインサートとして、ベクターから遊離および単離されたインサートとして、または種々の他の形態のいずれかにおいて（すなわち、増幅産物として）配列決定され得る。インサートは、制限酵素によってベクターから遊離され得るか、またはＰＣＲによって増幅され得るか、またはポリメラーゼによって転写され得る。インサートの配列決定のために、Ｎ末端またはＣ末端に基づくプライマー、またはもともとのファージもしくは他のベクターにおける挿入点に基づくプライマーが使用され得る。さらなるプライマーは、重複する配列を提供するために合成され得る。種々の核酸配列決定技術が周知であり、そして科学文献および特許文献に記載される。例えば、Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ（１９８７）前出；配列決定のためのバイオセンサーチップの使用について、Ａｒｌｉｎｇｈａｕｓ（１９９７）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：３７４７−３７５３；Ｐａｓｔｉｎｅｎ（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２：１３９１−１３９７；Ｎｙｒｅｎ（１９９３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１７１−１７５を参照のこと。赤外線補助レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析もまた、大きな核酸セグメント（例えば、ゲノムクローン）を配列決定するために使用され得る；例えば、Ｂｅｒｋｅｎｋａｍｐ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：２６０−２６２を参照のこと。

（核酸の標識）
核酸を標識する方法は、当業者に周知である（上記の「検出可能な組成物を用いて標識する」の定義を参照のこと）。好ましい標識は、アレイにおける使用およびインサイチュハイブリダイゼーションのために適切である標識である。１つの実施態様において、本発明の核酸プローブまたはサンプルは、ハイブリダイゼーション反応の前に検出可能に標識される、あるいは、ハイブリダイゼーション産物に結合する検出可能な標識が使用され得る。このような検出可能な標識には、例えば、イムノアッセイの分野における物質のような、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の物質が含まれる。使用される特定の標識は、それがプローブのアレイに基づくハイブリダイゼーションまたはインサイチュハイブリダイゼーションを妨害しない限り、本発明には決定的ではない。しかし、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄなど）を用いて直接的に標識されたプローブは、染色体ＤＮＡハイブリダイゼーションのために好ましい。好ましい実施態様において、標識は、アッセイの感度を最大化するために可能なほどの低コピー数で検出可能であり、そしてなおいかなるバックグラウンドシグナルを上回って検出可能である。標識は、好ましくは高度に局在化したシグナルを有し、とりわけ、染色体（例えば、中期染色体として）に対して染色を物理的にマッピングする場合に高度の空間的な分解能を提供する。従って、特に好ましい蛍光標識は、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰおよびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ−５−ｄＵＴＰを含む（以下の実施例１を参照のこと）。

種々の実施態様において、標識は、当業者に公知の種々の手段においてプローブに結合し得る。種々の実施態様において、核酸プローブは、ニックトランスレーション、ＰＣＲ、またはランダムプライマー伸長を用いて標識される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。

（アンプリコンプローブ）
本発明は、ヒトゲノム核酸のサンプル中のアンプリコンの存在についてスクリーニングするための核酸プローブを提供する。種々の実施態様において、プローブは、核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む。この配列はＤ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０までを含み；そしてＤ２０Ｓ１２０とＤ２０Ｓ２１１との間の距離にわたる。これらのアンプリコン領域にハイブリダイズする任意のプローブが、サンプル中の対応する領域を検出する際の使用に適切である。表１を参照のこと。プローブを調製する方法は、当業者に周知である（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋまたはＡｕｓｕｂｅｌを参照のこと）。

１つの実施態様において、本発明のプローブは、以下からなる群より選択されるＳＴＳマーカーに特異的にハイブリダイズする核酸を含む：ＡＦＭａ２３３ｗｇｌ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｚ５２６３６）、ＡＦＭ０８０ｙａ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｚ２７０６７）、ＡＦＭ０６９ｙａｌ、ＷＩ−１６７４８（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｇ２４１３３）、ＷＩ−９９３９（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｇ１１７６６）、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｚ５１８７３）、ＷＩ−６５７８（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｇ０６１１５）、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｚ６６８２４）、ＷＩ−９２２７（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｇ０７１８９）、およびＡＦＭ２７６ｘｈ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｚ１７２０２）。

別の実施態様は、以下からなる群から選択されるＧＤＢ遺伝子座核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含むプローブを提供する：Ｄ２０Ｓ２１１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｚ２７０６７）、Ｄ２０Ｓ８５４（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｚ５２６３６）、Ｄ２０Ｓ８７６（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｚ５３２５８）、Ｄ２０Ｓ１０４４、Ｄ２０Ｓ９１３（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｚ５１８７３）、Ｄ２０Ｓ７２０、およびＤ２０Ｓ１２０（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｚ１７２０２）。

さらに別の実施態様は、以下からなる群から選択される、クローン化されたゲノム核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含むプローブを提供する：ＲＭＣ２０Ｂ４０９７、ＲＭＣ２０Ｂ４１０３、ＲＭＣ２０Ｐ４０１６、ＲＭＣ２０Ｂ４１３０、ＲＭＣ２０Ｐ４１８５、ＲＭＣ２０Ｂ４１８８、ＲＭＣ２０Ｂ４１０９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１０、ＲＭＣ２０Ｐ４０２８、ＲＭＣ２０Ｐ４００３、ＲＭＣ２０Ｂ４０９９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１８、ＲＭＣ２０Ｐ４０６９、ＲＭＣ２０Ｂ４１２１、ＲＭＣ２０Ｂ４０８７、およびＲＭＣ２０Ｐ４０７０。

本発明はまた、Ｄ２０Ｓ２１１〜Ｄ２０Ｓ１２０を含む核酸配列のいくつかまたは全てを増幅し得るポリメラーゼ連鎖反応プライマー対を含むサンプル中のアンプリコンの存在についてスクリーニングするためのプローブを提供する。１つの実施態様において、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー対は、以下からなる群から選択されるＳＴＳ ＰＣＲプライマー対である：ＡＦＭａ２３３ｗｇｌ、ＡＦＭ０８０ｙａｌ、ＡＦＭ０６９ｙａｌ、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄｌ２、ＷＩ−９２２７、およびＡＦＭ２７６ｘｈｌ。

プローブは、本明細書に開示されるように、１つ以上のアンプリコン核酸配列、またはこのような配列を含むクローンを組合せ、そして標識化することによって調製され得る。インサイチュハイブリダイゼーション方法論を使用してアンプリコン配列を検出する場合、この構築物は断片化されて、細胞へ容易に透過し、そして標的核酸にハイブリダイズする、より小さな核酸フラグメントを提供する。断片化は、当業者に周知の多くの方法のいずれかによってなされ得る。好ましい方法には、分子を選択的に切断するための制限酵素を用いる処理、またはあるいはＭｇ²⁺の存在下で核酸を短時間加熱することが、挙げられる。多くの場合において、ニックトランスレーションのような標識化プロセスは，適切な長さのプローブを提供し得る。プローブは、好ましくは、約５０塩基対（ｂｐ）〜約２０００ｂｐ、より好ましくは約１００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、そして最も好ましくは約１５０ｂｐ〜約５００ｂｐの範囲の平均フラグメント長に断片化される。

（核酸ハイブリダイゼーション技術）
本明細書中に開示されるハイブリダイゼーション技術は、ヒト核酸のサンプルにおいてアンプリコンの存在についてスクリーニングするために、本発明の方法において使用され得る。本発明のアンプリコンを使用するハイブリダイゼーションはまた、２０ｑ１３．２（これは、多数の癌の存在および／または予後の指標である）におけるコピー数の変化を検出し得る。これらには、以下が含まれるが、これらに限定されない：乳房、前立腺、子宮頸部、卵巣、膀胱、頭部および頸部、ならびに結腸。この方法は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（上記の定義を参照のこと）で、ヒト核酸をプローブ（アンプリコン配列を含む）と接触させる工程、ハイブリダイゼーション複合体の形成を検出する工程、およびサンプル中のアンプリコンコピー数を定量する工程を包含する。ハイブリダイゼーション技術はまた、アンプリコン種、アイソフォーム、対立遺伝子ならびに多型性を含むアンプリコン遺伝子および遺伝子産物（すなわち、例えば、オンコジーンをコードするｍＲＮＡ）を同定、単離、ならびに特徴付けるために利用され得る。核酸ハイブリダイゼーション技術を使用する特定のＤＮＡおよびＲＮＡ測定のための種々の方法は、当業者に公知である。例えば、ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ，Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８５；Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと。

サンプル中のアンプリコンをコードする核酸の存在または非存在を評価するたための１つの方法は、サザン転写を含む。サザンブロットにおいて、ゲノムまたはｃＤＮＡ（代表的に、電気泳動ゲル上で断片化および分離される）は、標的遺伝子に特異的なプローブにハイブリダイズされる。標的領域に対するプローブからのハイブリダイゼーションシグナルと、正常なゲノムＤＮＡ（例えば、アンプリコン配列を含む腫瘍ゲノムの非増幅化部分）の分析からのコントロールプローブシグナルとのハイブリダイゼーションの強度の比較は、標的核酸の相対的コピー数の推定を提供する。

同様に、ノーザン転写は、アンプリコン配列を含むＲＮＡの検出のために使用され得る。例えば、ＲＮＡは、酸グアニジウム−フェノール−クロロホルム抽出方法を使用して所定の細胞サンプルから単離される。次いで、ＲＮＡは電気泳動されて異なる種を分離し、そしてゲルからニトロセルロースメンブレンへ転写される。サザン転写でのように、標識化プローブまたはＰＣＲを使用して、アンプリコン核酸の存在または非存在を同定し得る。

サンドイッチアッセイは、タンパク質または核酸を検出または単離するための商業的に有用なハイブリダイゼーションアッセイである。このようなアッセイは、しばしば、代表的には溶液中で、固体支持体および標的化「シグナル」核酸に共有結合的に固定化された「捕捉」核酸またはタンパク質を利用する。臨床的または他のサンプルは、標的核酸およびタンパク質を提供する。この「捕捉」核酸またはタンパク質および「シグナル」核酸またはタンパク質は、標的核酸またはタンパク質とハイブリダイズするか、または標的核酸またはタンパク質に結合して、「サンドイッチ」ハイブリダイゼーション複合体を形成する。有効にするために、シグナル核酸またはタンパク質は、実質的に捕捉核酸またはタンパク質とハイブリダイズまたは結合し得ない。

代表的に、オリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイゼーションを検出するために使用される標識化シグナル核酸である。相補的なプローブ核酸またはシグナル核酸は、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドの存在を検出するために代表的に使用されるいくつかの方法のいずれか１つによって標識化され得る。検出方法は、上記のような任意の標識を使用し得る。本発明の好ましい実施態様において、サンプル核酸は、テキサスレッドまたはフルオレセインで標識化される。他の標識には、標識化抗体に結合するリガンド、蛍光団、化学発光薬剤、酵素、および標識化リガンドに特異的な結合対メンバーとして作用し得る抗体が挙げられ得る。

ハイブリダイゼーション複合体の検出は、標的およびプローブのポリヌクレオチドまたは核酸の二重鎖に対して複合体を生成するシグナルの結合を必要とし得る。代表的に、このような結合は、リガンド結合体化プローブと、シグナルで結合体化した抗リガンドとの間のリガンドおよび抗リガンド相互作用（すなわち、抗体−抗原または相補的核酸結合）によって生じる。標識はまた、ハイブリダイゼーション複合体の間接的な検出を可能にし得る。例えば、標識がハプテンまたは抗原である場合、サンプルは、抗体を使用して検出され得る。これらの系において、シグナルは、抗体に対して蛍光標識もしくは放射性標識または酵素的分子を付着することによって生成される。ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、検出される標的核酸またはシグナルを倍増する、標的核酸またはシグナル増幅系の使用によって増強され得る。あるいは、配列は、一般に、非特異的ＰＣＲプライマーおよび変異の指標である特定の配列に対してプローブされた後に増幅された標的領域を使用して増幅され得る。

（インサイチュハイブリダイゼーション）
アンプリコン配列のコピー数またはタンパク質をコードするアンプリコンの発現のレベルを決定するための代替の手段は、インサイチュハイブリダイゼーションである。インサイチュハイブリダイゼーションアッセイは、周知である（例えば、Ａｎｇｅｒｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５２：６４９）。一般に、インサイチュハイブリダイゼーションは、以下の主要な工程を包含する：（１）分析される組織または生物学的構造の固定；（２）標的ＤＮＡの接近性を増大するため、および非特異的結合を減少するための、生物学的構造のプレハイブリダイゼーション処理；（３）生物学的構造または組織の核酸への、核酸の混合物のハイブリダイゼーション；（４）ハイブリダイゼーションにおいて結合しなかった核酸フラグメントを除去するためのハイブリダイゼーション後洗浄および（５）ハイブリダイズした核酸フラグメントの検出。これらの工程の各々において使用される試薬および使用のためのこれらの条件は、特定の適用に依存して変化する。

代表的なインサイチュハイブリダイゼーションにおいて、細胞は、固体支持体、代表的にはガラススライドに固定される。核酸がプローブされる場合、細胞は，代表的に熱またはアルカリを用いて変性される。次いで、細胞は、タンパク質をコードする核酸配列に特異的な標識化プローブのアニーリングを許容するために中程度の温度でハイブリダイゼーション溶液と接触させる。プローブは、代表的には標識化される（すなわち、放射性同位体または蛍光レポーターを用いる）。いくつかの適用において、繰り返し配列のハイブリダイゼーション能力をブロックすることが必要である。この場合において、ヒトゲノムＤＮＡまたはＣｏｔ−１ ＤＮＡを使用して、非特異的ハイブリダイゼーションをブロックする。好ましいサイズ範囲は、約２００ｂｐ〜約１００塩基、より好ましくは二本鎖のニックトランスレーション化核酸に対して約４００と約８００ｂｐとの間である。本発明の方法を用いる使用に適切なハイブリダイゼーションプロトコルは、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：１２２７〜１２３４；Ｐｉｎｋｅｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：９１３８〜９１４２；ＥＰＯ Ｐｕｂ．Ｎｏ．４３０，４０２；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３３巻、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃｈｏｏ編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（１９９４）に記載される。特定の好ましい実施態様において、Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ （１９９２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：５３２１〜５３２５（１９９２）のハイブリダイゼーションプロトコルが、使用される。

（核酸アレイ）
アンプリコンを含む配列の検出、コピー数の定量、配列決定などのための核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、アレイに基づく形式で実施され得る。アレイは、サンプル核酸とハイブリダイズされる、複数の異なる「プローブ」または「標的」核酸（または他の化合物）である。アレイ形式において、多数の異なるハイブリダイゼーション反応が、本質的に「並行して」実行され得る。これによって、迅速に、本質的に同時に、多数の遺伝子座の評価が、提供される。アレイに基づく形式でハイブリダイゼーション反応を実施する方法はまた、例えば、Ｐａｓｔｉｎｅｎ（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６０６〜６１４；（１９９７）Ｊａｃｋｓｏｎ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：１６８５；Ｃｈｅｅ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：６１０；ＷＯ９６／１７９５８に、記載される。

アレイ核酸プローブを、固体表面に固定化した。これらのプローブは、本発明の全てのアンプリコンの部分、ならびにゲノムのほかの部分由来のプローブを含む。アンプリコン核酸は、例えば、ＭＡＣ、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、Ｐ１、コスミド、プラスミド（上記のような）、ゲノムクローンのインターＡｌｕ ＰＣＲ産物、ゲノムクローンの制限消化物、ｃＤＮＡクローン、増幅（例えば、ＰＣＲ）産物などから得られ得る。種々の実施態様において、アレイ核酸は、以下に記載されるように、本発明のアンプリコン配列にわたるかまたは本発明のアンプリコン配列を含むクローンの、以前にマッピングされたライブラリー、ならびにゲノムの他の領域由来のクローンに由来する。アレイは、（試験サンプルおよび参照サンプルを用いて）サンプル核酸の単一集団とハイブリダイズされ得るか、または２つの示差的に標識化された収集物とともに使用され得る。

核酸を種々の固体表面上に固定化するための多くの方法は、当該分野で公知である。広範に種々の有機ポリマーおよび無機ポリマー、ならびに他の材料（天然および合成の両方）は、固体表面のための材料として利用され得る。例示的な固体表面には、例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、石英、ジアゾ化メンブレン（紙またはナイロン）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、およびセルロースアセテートが挙げられる。さらに、プラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなど）が、使用され得る。利用され得る他の材料には、紙、セラミックス、金属、メタロイド、半導体材料、サーメットなどが挙げられる。さらに、ゲルを形成し得る物質が、使用され得る。このような材料には、例えば、タンパク質（例えば、ゼラチン）、リポポリサッカリド、シリケート、アガロースおよびポリアクリルアミドが挙げられる。固体表面が多孔性である場合、種々の孔サイズが、系の性質に依存して利用され得る。

表面を調製するために、多くの異なる材料が、特に積層板として利用されて、種々の特性を獲得し得る。例えば、タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）または高分子の混合物（例えば、デンハルト溶液）を利用して、非特異的結合を回避し得、共有結合を単純化し得、シグナル検出などを増強し得る。化合物と表面との間の共有結合が所望される場合、その表面は、通常、多官能性であるか、または多官能化され得る。表面上に存在し、そして連結に使用され得る官能基には、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基などが挙げられ得る。広範に種々の化合物の種々の表面への連結の様式は周知であり、そして文献に十分に例示されている。例えば、分子への種々の官能基の導入による核酸の固定化のための方法は、公知である（例えば、Ｂｉｓｃｈｏｆｆ（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６４：３３６〜３４４；Ｋｒｅｍｓｋｙ（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：２８９１〜２９１０を参照のこと）。改変されたヌクレオチドは、改変されたヌクレオチドを含むＰＣＲプライマーを使用して、または改変されたヌクレオチドでの酵素的末端標識によって、標的上に配置され得る。本発明の核酸アレイのためのメンブレン支持体（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ポリプロピレン）の使用は、比較的高いエレメント密度で標的を配列する手動およびロボット利用の方法を利用する十分に開発された技術のために、有利である。このようなメンブレンは、一般に利用可能であり、そしてメンブレンへのハイブリダイゼーションについてのプロトコルおよび機器は、周知である。

所定のアッセイ形式を最適化するために、当業者は、メンブレンの型、蛍光色素、励起および放出バンド、スポットサイズなどの異なる組合せについての標識（例えば、蛍光）検出の感度を決定し得る。低い蛍光バックグラウンドのメンブレンが、使用され得る（例えば、Ｃｈｕ（１９９２）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １３：１０５〜１１４を参照のこと）。候補メンブレン上での種々の直径のスポット（「標的エレメント」）の検出についての感度は、例えば、蛍光的に末端標識されたＤＮＡフラグメントの連続希釈のスポッティングによって、容易に決定され得る。次いで、これらのスポットは、従来の蛍光顕微鏡を使用して画像化される。従って、感度、線形性、ならびに蛍光色素および固体表面（例えば、メンブレン、ガラス、石英ガラス）の種々の組合せからの達成可能なダイナミックレンジが、決定され得る。公知の相対比における蛍光色素の連続希釈の対もまた、分析され得る。これは、蛍光の比が、プローブが固定化される基材の検出器および蛍光によって許容されるダイナミックレンジにわたって、実際の蛍光色素比を反映する精度を決定する。

１ｍｍ直径〜１ｕｍの範囲である種々のサイズの標的エレメントが、これらの材料とともに使用され得る。少量の濃縮された固定化プローブＤＮＡを含む、より小さな標的エレメントは、高度に複雑な比較ハイブリダイゼーションのために使用され得る。なぜなら、各標的エレメントに結合するために利用可能なサンプルの総量が制限されるからである。従って、少量の濃縮されたＤＮＡを含む小さなアレイ標的エレメントを有することが有利であり、その結果、得られるシグナルが、高度に局在化されそして明るい。このような小さなアレイ標的エレメントは、代表的に、１０⁴／ｃｍ²よりも大きい密度を有するアレイにおいて使用される。１ｃｍ²面積の蛍光画像を定量し得る比較的単純なアプローチは、単一の画像における多数の標的エレメントからのデータの獲得を可能にすることが記載されている（例えば、Ｗｉｔｔｒｕｐ（１９９４）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １６：２０６〜２１３を参照のこと）。

メンブレンよりも十分に低い蛍光を有する固体表面基材（例えば、ガラス、石英、または小さなビーズ）上のアレイは、よりよい感度を達成し得る。ガラスまたは石英ガラスのような基材は、これらが非常に低い蛍光基材、および非常に効率的なハイブリダイゼーション環境を提供することにおいて有利である。標的核酸のガラスまたは合成石英ガラスへの共有的な付着は、多くの公知の技術に従って達成され得る（上記に記載される）。核酸は、市販の試薬を使用して、簡便にガラスに結合され得る。例えば、多くの官能基を有するシラン処理ガラス（ｓｉｌａｎｉｚｅｄ ｇｌａｓｓ）の調製のための材料は、市販されているか、または標準的技術を使用して調製され得る（例えば、Ｇａｉｔ（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．を参照のこと）。石英カバースリップ（これは、ガラスよりも少なくとも１０倍低い自己蛍光を有する）もまた、シラン処理され得る。

あるいは、プローブはまた、市販のコーティング化ビーズまたは他の表面上に固定化され得る。例えば、ビオチン末端標識化核酸は、市販のアビジンコーティング化ビーズに結合され得る。ストレプトアビジンまたは抗ジゴキシゲニン抗体はまた、例えば、プロテインＡを使用するタンパク質媒介カップリング、続く標準的プロトコルによって、シラン処理ガラスに付着され得る（例えば、Ｓｍｉｔｈ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：１１２２〜１１２６を参照のこと）。ビオチンまたはジゴキシゲニン末端標識化核酸は、標準的技術に従って調製され得る。ビーズに付着された核酸に対するハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション混合物においてそれらを懸濁すること、次いで、洗浄後の分析のためにガラス基材上にそれらを沈着させることによって達成される。あるいは、アビジンコーティングされているか、またはアビジンコーティングされていない、常磁性粒子（例えば、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子）が、使用され得る。

１つの特定の好ましい実施態様において、プローブ核酸は、表面（例えば、ガラスまたは石英表面）上にスポットされる。核酸は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびニトロセルロースの混合物中に溶解され、そしてアミノ−シランコーティング化ガラススライド上にスポットされる。小さな毛管を使用して、プローブ混合物を「スポット」し得る。

（核酸アレイを使用する比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ））
比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）は、単回実験において、ゲノム全体を通じてＤＮＡ配列コピー数バリエーションを検出およびマッピングし得る。ＣＧＨの１つの改変において、ゲノムは、中期染色体の使用による細胞遺伝地図として提供される。好ましい実施態様において、中期染色体の代わりに、ハイブリダイゼーションプローブは、本発明のアンプリコン配列（ならびに実施例１で詳細に記載されるような、ゲノムの他の配列）を含むゲノム配列のアレイである。相対的なコピー数はまた、中期染色体に基づくＣＧＨおよびアレイに基づくＣＧＨの両方において、蛍光的に標識化された試験核酸および参照核酸のハイブリダイゼーションによって測定され得る。

中期染色体に基づくＣＧＨにおいて、総ゲノムＤＮＡは、「試験」細胞集団および「参照」細胞集団から単離され、異なる蛍光色素で標識化され、そして正常な中期染色体に対してハイブリダイズされる。Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを使用して、繰り返し配列のハイブリダイゼーションを抑制する。染色体上のある位置における２つの蛍光色素の蛍光強度の得られた比は、試験ゲノムおよび参照ゲノムにおける対応するＤＮＡ配列のコピー数の比にほぼ比例する。従って、ＣＧＨは、中期染色体によって提供される細胞遺伝地図に参照される全ゲノムのコピー数分析を提供する。しかし、中期染色体ＣＧＨの使用は、分解能を１０〜２０メガベース（Ｍｂ）に制限し、接近した空間の異常性の分解能を妨げ、そしてＣＧＨの結果と細胞遺伝の精度を伴うゲノム情報および資源との関連性のみを可能にする。

従って、好ましい実施態様において、同様のハイブリダイゼーション方法論が、アンプリコン配列を含む核酸（または、アンプリコン配列を位置的にマッピングする場合には、目的の領域に隣接するゲノム核酸）を含むマッピングされたクローンのアレイを用いて使用される。これは、クローンのサイズおよび／またはクローン間の地図間隔によって決定される分解能によって、アンプリコンコピー数の測定を可能にする。アレイに基づくＣＧＨにおいて、分解能は、標的クローンのゲノム間隔によって決定される。プローブとしての連続的なクローン範囲の領域からの重複クローンの使用は、クローン長よりも短い（５０Ｋｂ程度低い）ゲノム分解能を有するマッピングを可能にする。従って、ここで、ヒトゲノムの物理的地図に対するアンプリコンの程度をマッピングすることの両方が可能である。この方法論はまた、アンプリコンの増幅レベルおよびアンプリコン内の部分領域を定量的に測定する。さらに、その分析時間は、中期染色体に基づくＣＧＨよりも非常に短いので、大量のサンプル（例えば、腫瘍または他の組織サンプル）上でこれらの分析を実施することが可能である。これは、速度および分解能の両方を増大し、これを用いて、反復性の異常領域（例えば、増幅、転座）が同定され得、そしてコピー数が確認された。

アレイＣＧＨは、いくつかの腫瘍が単一の領域にわたって均一の高いアンプリコンコピー数を有する一方、その他の腫瘍は、数百キロベースにわたって伸長するコピー数の連続的な変化を示したことを示してきた。増幅された領域内のコピー数におけるこれらの改変は、時々、薬物選択下におけるインビトロ系で観察されるように、コピー数が増加されるにつれ増幅されたセグメントの進行性の「トリミング」を含む増幅プロセスに起因し得る。従って、増幅を駆動する核酸配列、または「臨界配列」は、アンプリコン内の最も高いコピー数の位置で見出される。多くの増幅事象の後、この「臨界遺伝子」（最小アンプリコン配列）は、非駆動セグメントが「トリミング」された後に残存する。本発明は、第２０染色体の２０ｑ１３．２中の新規な臨界最小アンプリコン配列を同定する。

高コピー数の本発明のアンプリコンはまた、転写された配列および／または翻訳された配列（例えば、オンコジーンコード配列）を同定するために使用され得る。増幅された領域から候補オンコジーンを評価する際の中心工程の１つは、それらの発現を評価することである。腫瘍は、本発明のプローブを用いてスクリーニングされて、可能性のあるオンコジーン転写産物（すなわち、ｍＲＮＡ）が同定され得る。パラフィンに包埋される腫瘍サンプルの本発明のプローブとのハイブリダイゼーションは、アンプリコン転写産物の迅速な同定を可能にする。さらに、ｍＲＮＡに対するインサイチュハイブリダイゼーションは、１回のハイブリダイゼーションにおいて多くの異なる腫瘍における遺伝子発現の評価を可能にする。この胚スループット法は、候補オンコジーンから発現データを得るプロセスを、実質的に非常に加速させる。

（ヒト第２０染色体の２０ｑ１３．２領域）
本発明は、ヒト染色体２０ｑ１３．２における新規なアンプリコン配列を同定した。代替の実施態様において、例えば、プローブとして使用される本発明の単離されたアンプリコン配列は、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０を含み、かつＤ２０Ｓ１２０とＤ２０Ｓ２１１との間の距離にかかる核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸セグメントを含む。本発明のプローブは、Ｄ２０Ｓ１２０とＤ２０Ｓ２１１との間の距離にかかる任意の核酸配列、２０ｑ１３．２領域における任意のクローン、ＧＤＢ遺伝子座またはＳＴＳマーカー（例えば、表１に列挙される例示的なクローン、ＧＤＢ遺伝子座、ＳＴＳおよび他のマーカー（例えば、ＷＩ−９２２７））に特異的にハイブリダイズする核酸を含み得る。

コピー数において改変される場合、本発明のアンプリコンは、癌（特に、ヒト乳癌）に関連する。より攻撃的な腫瘍は、高いアンプリコンコピー数を有する可能性が高い。従って、本発明は、癌を診断、予後および処置するための、これらのアンプリコンを含む新規なプローブを提供する。本発明の新規なアンプリコンを特徴付けるに有用ないくつかの例示的な遺伝子座およびマーカーを、以下に特徴付ける。本発明の新規なアンプリコンセグメントを特徴付けるために使用され得るさらなるクローン、ＧＤＢ遺伝子座、ＳＴＳおよび他のマーカーについては表Ｉを参照のこと。

（Ｄ２０Ｓ１２０）
Ｄ２０Ｓ１２０は、例えば、Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ（１９９２）「Ａ ｓｅｃｏｎｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ」、Ｎａｔｕｒｅ ３５９：７９４−８０１；Ｇｙａｐａｙ（１９９４）「Ｔｈｅ １９９３−９４ Ｇｅｎｅｔｈｏｎ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ」Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７（２ Ｓｐｅｃ Ｎｏ）：２４６−３３９によって記載されるように、ヒト第２０染色体の２０ｑ１３領域にマップされたＧＤＢマーカーである。これはまた、クローンＡＦＭ２７６ｘｈ１またはＲＨ３６１として参照されている。Ｄ２０Ｓ１２０配列は寄託されている（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号第Ｚ１７２０２号）。そのＳＴＳマーカーの命名はＡＦＭ２７６ｘｈ１である（表１を参照のこと）。

（Ｄ２０Ｓ２１１）
Ｄ２０Ｓ２１１は、例えば、Ｇｙａｐａｙ（１９９４）（前出）によって記載されるように、ヒト第２０染色体の２０ｑ１３領域にマップされたＧＤＢマーカーである。そのＳＴＳマーカーは、ＡＦＭ０８０ｙａ１である（表１を参照のこと）。Ｄ２０Ｓ２１１配列は寄託されている（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号第Ｚ２７０６７号）。

（ＷＩ−９２２７）
ＷＩ−９２７７は、ヒト第２０染色体の２０ｑ１３領域にマップされた。１３１９塩基対のアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）マーカーである。ＷＩ−９２７７は寄託されている（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号第Ｇ０７１８９号）。

（Ｄ２０Ｓ９１３）
Ｄ２０Ｓ９１３は、例えば、Ｄｉｂ（１９９６）「Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ５，２６４ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅｓ」、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：１５２−１５４によって記載されるように、ヒト第２０染色体の２０ｑ１３領域にマップされたＧＤＢマーカーである。そのＳＴＳの命名は、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９である（表１を参照のこと）。Ｄ２０Ｓ９１３配列は寄託されている（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号第Ｚ５１８７３号）。

（プローブを含むキット）
本発明はまた、染色体異常および第２０染色体上のアンプリコンコピー数における変更の検出のための診断用キットを提供する。好ましい実施態様において、このキットは、本発明のアンプリコンに対する１つ以上のプローブを含む。このキットはさらに、ブロッキング核酸（すなわち、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ）およびキットの内容を使用する時および方法を記載する指示資料を含む。このキットはまた、以下の１つ以上を含み得る：プローブの検出を容易にするための種々の標識または標識化剤、ハイブリダイゼーションのための試薬（緩衝液、分裂中期スプレッド（ｍｅｔａｐｈａｓｅ ｓｐｒｅａｄ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および他のブロッキング剤を含む）、ｔＲＮＡ、ＳＤＳサンプリングデバイス（微細な針、スワブ、吸引機などを含む）、陽性および陰性ハイブリダイゼーションコントロールなど。

（実施例）
以下の実施例は、本発明の例示するために提供されるが、限定するためではない。

（実施例１：高分解能比較ゲノムハイブリダイゼーション方法論）
本発明は、ヒト核酸のサンプル中の本発明のアンプリコンの存在についてスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、プローブがストリンジェントな条件下でアンプリコン配列に選択的に結合し得る条件下で、核酸をアンプリコン配列含有プローブと接触させる工程、およびハイブリダイゼーション複合体の形成を検出する工程を包含する。以下の実施例は、好ましい方法論「高分解能の、アレイに基づく比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）」（これは、サンプル間の単一コピー数の差異を検出し得る）を詳述する。

（高分解能の、アレイに基づく比較ゲノムハイブリダイゼーション装置）
本発明は、改良された性能に寄与する、高分解能アレイＣＧＨ方法論に対する新規な特徴を提供する。高密度のプローブＤＮＡを、アレイ基板に結合させる。この基板は、代表的には、ガラスまたは石英の顕微鏡スライドである。石英スライドが好ましい。なぜなら、それらは、ガラスよりかなり低い固有の蛍光を有し、従って、蛍光測定を妨害し得るバックグラウンド光をあまり産生しないからである。ガラススライドもまた使用され得る。それらはあまり高価ではなく、そして適切な性能を提供する。

アレイからの蛍光シグナルを、ＣＣＤカメラに装着したカスタムビルト大視野画像化システム（広視野画像化システム）を使用して獲得する。アレイを含む溶融シリカまたは溶融石英の基板を、後側からプリズムを通じる励起光によって照射する。コリメーティングレンズ（スライドの下の全て）を通じてアークランプによって供給される励起光は、アレイ標的エレメントを通過する（サンプル核酸は固定したプローブにハイブリダイズされている）。この光は、カバースリップの上部表面の全内部反射を受け、そしてアレイに戻す。鏡はこの光を反射してプリズムに戻る。従って、光学表面における不完全性によって散乱される励起光のみがカバースリップを通過し、そして検出レンズ（スライドの上）に入る。蛍光を、一対のカメラレンズによって収集（検出）する。第１のカメラレンズは、標的からの蛍光発光を収集し、そして平行光を出す。これは、画像化される蛍光色素の波長バンドを選択する発光フィルターを通過する。第２のレンズは、ＣＣＤチップ上に収集された光を収束させる。同じ焦点距離を有する一対のレンズの使用は、１倍率を生じる（Ｗｉｔｒｕｐ（１９９４）前出）。

アレイプリンティング技術を、プリンティングスピードを増加させてアレイ製造を容易にすること、およびアレイの物理的サイズを減少させてハイブリダイゼーションに必要な標本核酸の量を最小化させることに集中させる。基本的なアプローチは、複数のプリンティングチップを有するプリントヘッドを使用することであり、その結果、多くの異なる標的は、平行にプリントされ得る。このことは、アレイをプリントするのに必要な時間を減少させる。アレイロボットの簡単な該略として、このプリントヘッドを、マイクロタイタープレートフィーダーとプリンティング位置との間の高速オーバーヘッドガントリー上で行う。アレイ基板を、Ｘ−Ｙステージを有するプリントヘッドの下におく。プリンティングピンを、プレートフィーダーとステージの間に位置するステーションにて洗浄する。９ピンプリントヘッドを、８６４ウェルマイクロタイタープレートのプリントアウトのために、３ｍｍ中心上にキャピラリーチューブを取り付けた３×３アレイのスプリングの形態で使用する。各キャピラリーを、そこを通して真空または圧力が供給される可撓性チュービングによってマニホルドに接続する。プリンティングの間にわずかな圧力を適用しながら、真空を使用して、クリーニング溶液をチップを通じて排出し、そしてそのチップにプリンティング溶液をロードする。

（アレイ分析のための核酸サンプルの調製）
任意の生物学的物質由来の核酸を使用して、分析のための標識サンプルを調製し得る。例えば、乳房組織の生検のために、疑われる原発性乳房腫瘍組織のスナップ凍結（ｓｎａｐ−ｆｒｏｚｅｎ）ブロックを、代表的には約４ミクロンにて凍結切断し（ｃｒｙｏｓｅｃｔ）、そして例えば、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色して、切片内の非悪性細胞に対する悪性細胞の比を決定し得る。ブロックトリミングによって除去可能な正常な管および小葉を含む領域を、スライド上にマークする。このブロックを、スライド上の切片と整列させて、そして冷却したカミソリ刃でトリミングする。トリミングしたブロックの次の１０〜２０の切片を、ＤＮＡ抽出のために微量遠心管中に収集する。ＤＮＡを、例えば、ＱＵＩａｍｐ組織キット（＃２９３０４）を用いて、製造業者の指示に従って単離し得る。溶解時間を、必要ならば、組織の状態に依存して延長し得る。サンプルもまた、ＲＮＡａｓｅＡとともにインキュベートする。ＤＮＡを、７０℃にて５分のインキュベーションの後に、水中のカラムから溶出させる。必要ならば、第２の溶出工程を使用して、収率を増加させ得る。

このサンプル（すなわち試験）核酸を、フルオレセインで標識する。参照ＤＮＡを、別の試薬（代表的にはテキサスレッド）で標識する。標識を、標準的な手順および製造業者の指示に従って、ニックトランスレーションによって行う。

（アレイプローブ）
プローブとして使用するためのクローン化ゲノムＤＮＡを、上記のような当該分野で公知の任意のプロトコル（例えば、組換えまたはＰＣＲ増幅技術を含む）によって生成し得る。ＰＣＲ増幅を、公のデータベースにおけるＳＴＳプライマー対情報によって容易にする（例えば、Ｏｌｓｏｎ（１９８９）（前出）を参照のこと）。代表的な組換え技術もまた使用し得る。例えば、ＭＡＣ、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、Ｐｌｓ、コスミド、プラスミドまたはｃＤＮＡを含有するプローブ配列を生成し得る。１つの例示的なプロトコルにおいて、プラスミドは、細菌の５００ｍｌ培養物から、ＱＩＡＧＥＮマキシキット（＃１２１６２）を使用して、溶解緩衝液の量を約１．５倍〜２倍に増加させたことを除いて製造業者の指示に従って、単離する。ＤＮＡを、４００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）中に再懸濁し、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール（２５：２４：１の比）で抽出する。次いで、エタノールで沈殿させる。ＴＥ緩衝液中に再懸濁した後、ＤＮＡの濃度を、蛍光測定器（例えば、Ｈｏｅｆｅｒ ＴＫＯ １００）を用いて決定する。この手順により、代表的には、スライドに効率的に結合する核酸を生成するに十分な純度であり、かつ受容可能な低い自己蛍光を有する、４０〜８０μｇのＰ１またはＢＡＣ ＤＮＡが得られる。

以下に示す研究のためのアレイを、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびニトロセルロースの混合物中にプローブＤＮＡを溶解させ、そして得られた溶液のナノリットル量を、ガラスまたは石英キャピラリーを有するアミノ−シランコートアレイ基板上に堆積させることによって、作製した。プローブ溶液を、エタノール中に１０μｇのＤＮＡを沈殿させ、そして１μｌの水中にペレットを溶解させ、続いて約０．４μｇ／μｌのニトロセルロースを含む４μｌのＤＭＳＯを添加することによって作製する。ニトロセルロース溶液を、ＤＭＳＯ中にニトロセルロースメンブレン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ＃４１０５１−０１２）を溶解させることによって調製する。このニトロセルロースは、標的において数キロベースより長い長さのハイブリダイズ可能なＤＮＡフラグメントを保持する能力を実質的に改良したが、より小さなフラグメントには効率的には結合しない。

ガラス、石英または溶融シリカスライドを、５０％濃硫酸、５０％過酸化水素中で一晩インキュベーションすることによってクリーニングする。次いで、これらを、蒸留水中で１０回洗浄し、そして風乾し、そして１５分間９０℃まで加熱する。クリーニングしたスライドの表面を、０．１％アミノプロピルトリメトキシシランを含む９５％アセトン中に室温にて２分間浸漬することによってコートし、その後、アセトン中で５回洗浄し、そして風乾する。

得られたプローブ標的エレメントは一次ＤＮＡであり、質量で１５％未満のニトロセルロースを含む。この標的エレメントからの自己蛍光は無視できた。プローブＤＮＡのさらなる変性は、ハイブリダイゼーションの前には必要ではなかった。

（ハイブリダイゼーション）
ハイブリダイゼーションのために、低い障壁を、ゴムセメントを用いてアレイの周りに形成した。得られたウェルは、約０．６〜１ｃｍ²の面積である。ハイブリダイゼーションミックスは、代表的には、試験ＤＮＡおよび参照ＤＮＡを各々を約４００ナノグラム（ｎｇ）含む。試験ＤＮＡを、フルオレセインで標識し、そして参照ＤＮＡを、テキサスレッドで染色する（上記のとおり）。代表的なハイブリダイゼーション反応において、２００〜４００ｎｇの標識試験ＤＮＡ（ヒト核酸サンプル）および参照標識ＤＮＡを混合する。約３５〜約５０μｇのＣｐｔ−１（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）ＤＮＡもまた、ハイブリダイゼーションミックスに含めて、反復配列をブロックする。次いで、この混合物を、エタノールで沈殿させる。蛍光測定手段（例えば、Ｈｏｅｆｆｅｒ ＴＫＯ １００蛍光測定器）によってＣｏｔ−１の量を決定することが重要である。なぜなら、商業的供給業者によって使用される濃度の吸収測定は、頻繁に、ブロッキングＤＮＡの存在の有効量を３〜６倍まで過剰評価するからである。少なすぎるブロッキングＤＮＡを使用すると、小さな割合の変化を検出する能力は実質的に減少する。

沈殿したＤＮＡを、１０μｌのハイブリダイゼーションミックスに溶解させて、５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、２×ＳＳＣ、２％ＳＤＳおよび１００μｇのｔＲＮＡの最終組成を達成する。このウェルを、このハイブリダイゼーションミックスの１０μｌで満たす。カバースリップは使用しない。このハイブリダイゼーション溶液を、７０℃まで５分間加熱して、ＤＮＡを変成させ、次いで、３７℃にて約１時間インキュベートして、反復配列をブロックする。ハイブリダイゼーションを、ゆっくり揺れるテーブル上で３７℃にて１６〜７２時間進行させて、ハイブリダイゼーションミックスを標的の上に能動的に輸送する。このスライドを、２００μｌのハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ）を含みプローブを含まない小さな密封スライドボックス中に置いて、ハイブリダイゼーションの間の蒸発を防ぐ。

ハイブリダイゼーションの後、このスライドを、５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ（ｐＨ７）中で４５℃にて１５分間１回洗浄し、そして０．１％ＮＰ４０を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム中（ｐＨ８）で室温にて１回洗浄する。過剰な液体をスライドから排出させ、そしてアレイを１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩを含む抗消（ａｎｔｉｆａｄｅ）溶液中にマウントし、ＤＮＡを対比染色する。ガラスカバーストリップを、その場所にシールする。上記のように、このスライドを、アレイ装置に置き、そして蛍光を読み取る。

（分析データ）
スライド上の位置の関数としてのバックグラウンド蛍光を、プローブ蛍光色素画像（代表的には、フルオレセイン（サンプルＤＮＡ）およびテキサスレッド（参照ＤＮＡ））について計算し、そしてバックグラウンド補正した全フルオレセインおよびテキサスレッドの強度を、セグメント化した標的の各々について計算する（蛍光シグナルを、画像分析プログラムを用いて分析した）。２つの蛍光色素の強度もまた、各標的について計算する。この分析には、約１分かかる。次いで、このデータを、保存および画像分析プログラムによる分析のために、データベースに移す。

各画素の緑色強度と赤色強度との間のＰｅａｒｓｏｎの「ｒ」相関もまた、計算した。理想的には、標的における各画素の緑色および赤色強度は、互いに比例され、その結果、これらの測定のプロットを、直線にし、そしてその相関は、１．０であると予測する。実際には、「ｒ」値は、ほぼ１．０から非常に低い値までの範囲であり、このことは、データにおける散乱を示す。それゆえ、本発明者らは、任意に決定した０．８の閾値未満の相関を有する全てのスポット上の測定を捨てる。従って、最終比は、有用なシグナルを与える標的の比の平均を示す。

任意の画像分析プログラムを使用して上記の計算をなし得るが、これらの実験において、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ＣＧＨ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）のバリエーションを使用した。各標的クローンの４通りのスポットを、これらの実験において使用したように、代表的に、アレイにおいて使用する。この標的スポットの位置を、ＤＡＰＩ対比染色画像をセグメント化することによって決定した。

このアレイＣＧＨ手順を、以下の点で評価した：（ａ）反復配列を含まないモデル系、（ｂ）正常ヒト細胞、および（ｃ）公知のコピー数変化を含む細胞株。反復配列の比存在下の性能を、変動量のλＤＮＡでスパイクした２００μｇの全ヒトゲノムＤＮＡからなる試験ゲノムおよび参照ゲノムを用いて評価した。λＤＮＡはヒトゲノムの１．７×１０^-5の長さ（５０ｋｂ対３×１０⁶ｋｂ）を有するので、約３ｐｇのλＤＮＡは、単一コピーのヒト配列に等しい。試験ゲノムは、２００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ、ならびに１、２、２０、２００および２０００ｐｇのλＤＮＡを含んだ。その比をハイブリダイゼーションに関して正規化した。参照ゲノムは、２００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡおよび２０ｐｇのλＤＮＡを含んだ。２０ｐｇのλＤＮＡを参照において使用した。なぜなら、ハイブリダイゼーションにおけるより高い試験ゲノム濃度（２００および２０００ｐｇのλＤＮＡ）での二本鎖λ配列の再会合は、参照シグナルを抑制し、そして試験シグナルの対応するほぼ直線的な増加を生成するからである。しかし、試験蛍光シグナルおよび参照蛍光シグナルの比は、２つのゲノムにおけるλＤＮＡの量の比に比例して増加した。

単純な理論的検討は、蛍光色素がハイブリダイゼーションに示差的に影響しない場合は、蛍光比はコピー数比に正確に比例するはずであるという予想を導く。このような性能を、単一コピーの等価レベル未満から約１０³以上倍より高くまでの、全測定範囲にわたって達成した。それゆえ、ヒトゲノムのコスミドサイズのセグメントまたはより大きいものに関与するコピー数の増加または減少は、単一コピーレベルで検出可能であるはずである。重要なことに、より高いレベルの変化もまた、正確に定量され得る（反復配列が影響しない場合）。

（検出される単一コピー数の差異）
ヒト標本における測定を、約３Ｍｂの間隔で第２０染色体の長さに沿って分布するコスミド、Ｐ１およびＢＡＣクローン、ならびに染色体２０ｑ１３．２の１．５Ｍｂ領域にわたるコンティグからのクローンから作製される標的を含むアレイを用いて行った。このアレイはまた、公知のオンコジーンｃＭＹＣ、ｃＥＲＢＢ２、ｐ５３およびｐ１６についてのゲノムクローン、ならびに第Ｘ染色体の領域からのクローンを含む。正常な女性ＤＮＡに対する正常な男性ＤＮＡの比較を使用して、２つのゲノムにおける相対的に同じコピー数で存在する標的間の比における変動、ならびに低レベルのコピー数変化を検出する能力を評価した。第２０染色体標的の比（１．０の平均値を有するように正規化した）は、１．０＋／−０．１４の比であった（標準偏差）。第Ｘ染色体標的もまた含まれ、そしてその比（第２０染色体に対して正規化した）は、０．６３＋／−０．０４であった。それゆえ、この比は有意により低かった。従って、二倍体ゲノムにおける単一コピーの増加は、検出可能であった。０．５の期待値（一倍体コピー数についての）からの第Ｘ染色体比の偏差は、反復配列からのシグナルの不完全な抑制に起因する可能性が最も高い。

上記の実施例は、本発明を例示するために提供され、その範囲を限定するものではない。本発明の他の改変物は、当業者に容易に理解され、そして添付の特許請求の範囲によって包含される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願を、本明細書中に参考として援用する。

Claims (19)

1. ヒト核酸のサンプル中のアンプリコンの存在についてスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下：
   ヒト細胞由来の核酸のサンプルおよびプローブを提供する工程であって、ここで、該プローブは、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群より選択される少なくとも一つのＳＴＳマーカーに特異的にハイブリダイズする核酸を含む、工程；
   該プローブがヒトゲノム核酸に選択的に結合してハイブリダイゼーション複合体を形成する条件下で、該ヒト核酸に該プローブを接触させる工程；および
   該ハイブリダイゼーション複合体の形成を検出し、該アンプリコンの存在を確認する工程
   を包含する、方法。
2. 前記ヒト核酸が、ゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
3. 前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程が、前記アンプリコンのコピー数を決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
4. 前記ゲノム核酸が、乳房腫瘍細胞から単離される、請求項１に記載の方法。
5. 前記プローブが、前記染色体領域からの核酸配列のいくらかまたは全てを増幅し得るポリメラーゼ連鎖反応プライマー対を含み、そして前記検出工程が、該ポリメラーゼ連鎖反応増幅反応の形成を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
6. 前記ポリメラーゼ連鎖反応プライマー対が、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群より選択されるＳＴＳ ＰＣＲプライマー対である、請求項５に記載の方法。
7. 前記プローブが、固体表面に結合される、請求項１に記載の方法。
8. 前記結合されたプローブが、核酸アレイのメンバーである、請求項７に記載の方法。
9. 前記ヒト核酸が、検出可能な組成物で標識される、請求項１に記載の方法。
10. 前記検出可能な組成物が、フルオレセインまたはテキサスレッドである、請求項９に記載の方法。
11. 前記プローブが、検出可能な組成物で標識される、請求項１に記載の方法。
12. 請求項１に記載の方法であって、ここで、該方法はさらに、参照細胞由来の核酸を提供し、ここで、該参照細胞核酸は、前記ヒトゲノム核酸より前に、または該ヒトゲノム核酸と同時に、前記プローブと接触される、方法。
13. 請求項１に記載の方法であって、ここで該方法はさらに、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを提供し、ここで該Ｃｏｔ−１ ＤＮＡは、前記ヒトゲノム核酸に前記プローブを接触させる前に、該ヒトゲノム核酸にハイブリダイズされる、方法。
14. ヒトゲノム核酸のサンプル中のアンプリコンの存在についてスクリーニングするための核酸プローブであって、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群より選択されるＳＴＳマーカーに特異的にハイブリダイズする核酸を含む、核酸プローブ。
15. 前記プローブが請求項５〜６のいずれか１項に規定されるプローブである、請求項１４に記載の核酸プローブ。
16. ヒト核酸のサンプル中のアンプリコンの存在についてスクリーニングするためのキットであって、該キットは、請求項１４もしくは１５に記載のプローブを含む区画を含む、キット。
17. 前記プローブが、クローン化されたヒト核酸である、請求項１６に記載のキット。
18. 前記クローン化されたヒトゲノム核酸が、固体表面に結合される、請求項１７に記載のキット。
19. 前記結合されたプローブが、核酸アレイのメンバーである、請求項１８に記載のキット。

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