TWI427292B - 檢測轉移性癌症之方法及套組 - Google Patents

Description

檢測轉移性癌症之方法及套組

本發明揭示一種診斷癌轉移之方法及套組。特定言之，本發明提供一種於哺乳動物體液中測量細胞凋亡易感蛋白(the cellular apoptosis susceptibility,CAS)(GenBank編號U33286)及CAS多肽以篩選或診斷癌轉移之方法及套組。

近年來，癌症治療有顯著之進展，尤其是以手術或放射療法治療原發癌之治癒成功率改善，此對於癌症治療有長足貢獻。篩選轉移性癌症對於癌症治療相當重要。非轉移性癌通常可被切除，而轉移性癌通常不容易以外科切除腫瘤來治療。因此非轉移性癌通常藉外科手術切除來治療，而對於罹患已擴散或轉移癌症之病人，可利用放射線、化療或放射及化療之組合療法來治療。是以，一個可診斷癌轉移之方法或套組，對於判別癌症之轉移性，以至於提供治療癌症之最有效方法，相當有幫助。血清癌轉移標記(serological tumor metastatic marker)對於轉移性癌之篩選、判定、診斷、預後、評估有幫助，也對癌症治療之反應及癌症復發監測相當有幫助(Basuyau等人，2001;Thomas and Sweep,2001;Petricoin等人，2006;Brenner等人，2007;Rodrigues等人，2007;Shields等人，2007;Skates等人，2007;Wang等人，2007;Zhang and Chan,2007)。

癌轉移涉及多步驟過程，包括癌細胞脫離原來位置、分解細胞外基質(extracellular matrix,ECM)及穿過細胞外基質而遷移之能力(Bogenrieder and Herlyn, 2003)。近來，有關癌轉移之機制推測如下：(1)癌細胞於原發癌群落內增生；(2)新血管生成；(3)惡性癌細胞滲透及穿透新生成之血管；(4)癌細胞於人體液系統內循環；(5)癌細胞到達轉移標的器官；(6)癌細胞由血管中外滲(extravasate)；(7)癌細胞於標的器官中增生；及(8)形成癌轉移病竈(metastatic focus)。

轉移性癌細胞於轉移過程中可分泌細胞外基質分解蛋白酶以分解細胞外基質。基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)為參與細胞外基質分解過程之酵素(Nguyen等人，1998;Holmbeck等人，2004;Lee等人，2007)。MMP-2於癌轉移過程中之細胞外基質降解扮演重要角色(Stetler-Stevenson等人，1993)。研究顯示，癌細胞的基質金屬蛋白酶生產量，可於分泌(secretion)的層面被調控(Taraboletti等人，2000)。因此，轉移性癌細胞可能演變產生具有增強基質金屬蛋白酶分泌之能力，藉此來增進其轉移能力(Moser等人，1994;Jena,2005)。

細胞凋亡易感蛋白(cellular apoptosis susceptibility protein,CAS或CSE1L/CAS)(GenBank編號U33286)是在一個反義DNA(anti-sense DNA)的研究中被發現，CAS的反義DNA可使細胞對於假單胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor)引起之細胞凋亡(apoptosis)具有抵抗性(Brinkmann等人，1995a)。CAS蛋白亦可調控殺蟲劑賽滅寧(cypermethrin)(Izaguirre等人，2006)、干擾素-γ(Jiang等人，2007)及化療藥物(Liao等人，2008a;Liao等人，2008b)所引發之細胞凋亡。CAS 基因為酵母菌染色體分離基因(CSE1 )之人類同源物(Brinkmann等人，1995b)。由於CAS蛋白可與微管(microtubules)及importin-α(一種核運輸受體)(Kutay等人，1997)連結，CAS蛋白主要分布於細胞核及圍繞細胞核周為圍之細胞質區域。病理研究顯示，CAS蛋白在癌組織的表現量與高的癌階段(high cancer stage)及高的癌等級(high cancer grade)以及癌症病人的不良預後，呈正相關(Wellmann等人，1997;Boni等人，1999;Behrens等人，2001;Peiro等人，2001;Wellmann等人，2001;Behrens等人，2003;Seiden-Long等人，2006)。

目前查得的，和CAS蛋白相關的專利包括：US 6,664,057係關於鑑別一種與癌症有關之人類染色體20q13.2上之新穎擴增子(amplicon)(此擴增子含CAS 基因)。US 6,072,031是關於CAS蛋白之cDNA及胺基酸序列，用於偵測正常及癌細胞中CAS 基因之表現及擴增，此外將反義CAS基因序列引入活細胞中可抑制細胞凋亡。US 6,207,380是關於用於偵測、診斷、判定階段、監測、預知、活體內造影、預防或治療或判定個體罹患泌尿系統疾病及病症(如泌尿系統癌)傾向之多肽及多核苷酸。該等序列係衍生自角蛋白/細胞角蛋白、CAS或mat-8多肽及多核苷酸。US 6,207,380亦揭示特異結合至角蛋白/細胞角蛋白、CAS或mat-8編碼之多肽或蛋白質之抗體，該分子有助於治療泌尿道疾病、腫瘤或轉移。故US 6,207,380描述利用特異結合至角蛋白/細胞角蛋白、CAS或mat-8之抗體以治療泌尿道疾病、腫瘤或轉移。US 6,232,086揭示CAS蛋白質之cDNA及胺基酸序列，其係用於偵測正常細胞及癌細胞中CAS基因之表現及放大。US 6,156,564係關於偵測人類增生性細胞之方法，其包含測量人類細胞檢體中人類CAS蛋白質之表現量，以及偵測該人類CAS蛋白質表現量係較正常非增生性人類細胞之人類CAS蛋白質表現量高至少兩倍以上。US 6,440,737是關於調控CAS基因表現之反義化合物、組合物及方法。由上述之說明可知這些先前技藝(專利)的內容，都在偵測細胞層級之CAS基因表現。根據上述先前技藝之內容及申請專利範圍，且其均未描述或請求測量哺乳動物體液之CAS蛋白含量用以篩選或診斷癌轉移。

癌轉移乃為大部份癌症病人之主要死因。癌轉移為高階癌症及癌症死亡之主要特徵。一個可靠的癌轉移血液篩選標記，對於篩選轉移性癌很有幫助。對於結腸直腸癌，其為高死亡率的癌症之一。非轉移性的結腸直腸癌通常可藉外科手術切除來治療，且5年存活率超過90%，而轉移性結腸直腸癌通常不可藉外科手術切除來治療，且5年存活率可能僅約5%(Breslow等人，1997;Rex等人，2006)。因此，可靠的血清標記將有助於篩選轉移性結腸直腸癌(Bresalier等人，2004;Stein等人，2006;Lassmann等人，2007;Gupta等人，2008;Ransohoff等人，2008)。癌胚抗原(CEA,Carcinoembryonic Antigen)為一種高度糖化的蛋白，是常用於評估結腸直腸癌預後之腫瘤標記(Gold and Freedman,1965;Hammarstrm,1999)。藉由放射免疫試驗方法，Thomson等人發現97%之結腸直腸癌病人血液中存在高量的CEA(Thomson等人，1969)。不過，隨後的研究顯示，腸癌病人血液之高CEA血液含量，看來只與罹患特別嚴重的腸癌轉移(特別是腸癌轉移到肝)之腸癌病人有關(Moertel等人，1993)。而許多研究指出，血液CEA含量增加並不必然與結腸或直腸癌轉移有關(Hsu TC 2006;Saito等人，2005)，罹患良性結腸直腸疾病之病人亦可能具有較高之血清CEA含量(Fong等人，1985)。因此，CEA之主要臨床功能在於手術切除後之結腸直腸癌的癌復發監測，若CEA值增加表示癌症復發，若CEA值正常則代表癌症未復發(Go,1976;Savrin等人，1979;Chu等人，1991)。是以，目前醫療界仍然需要有助於癌轉移之診斷及預後判別之血清轉移性標記。或是可增進癌轉移之診斷及預後判別之血清轉移性標記之方法及套組。

本發明提供一種檢測癌轉移之方法。該方法包含以下步驟：(a)取得自哺乳動物之體液；及(b)測量該體液中CAS(cellular apoptosis susceptibility)蛋白或CAS多肽含量，以篩選或診斷癌轉移。

本發明亦提供測量哺乳動物體液中CAS蛋白或CAS多肽含量之套組，以檢測癌轉移，該套組包含特異結合CAS蛋白之抗體。

本發明首先發現CAS蛋白是一種分泌性蛋白，且與癌轉移有關，另外也發現CAS蛋白於轉移性癌症病人之血液中有較高之盛行率。因此，CAS蛋白於篩選及診斷癌轉移上具有臨床用途。

本文中之「癌轉移」意指：癌細胞散播並於非鄰接之位置形成新生長病竈(即形成癌轉移)之能力。從原位腫瘤生長轉變為轉移性疾病，係視原發位腫瘤細胞侵犯局部組織及越過組織障壁之能力而定。癌細胞開始進行轉移時，必須先穿透上皮細胞基底膜，之後侵犯組織間基質。對於遠端癌轉移，內滲作用(intravasation)需要腫瘤細胞侵犯下內皮細胞基底膜，而在腫瘤細胞外滲作用(extravasation)時亦需要此腫瘤細胞侵犯下內皮細胞基底膜之過程。惡性之發展亦與腫瘤引發之血管新生作用有關，其不僅使原發腫瘤可擴展，且更由於新生成之血管基底膜具有缺陷，使腫瘤細胞可輕易進入血管內。

本文中動物之「癌症」意指：具有引發癌症之細胞之典型特徵(例如失控之增生作用、永生、轉移潛力、快速生長及增生速率及某些特有的型態特徵及細胞標記)之細胞存在。在某些情況下，癌細胞呈腫瘤形式，但其亦可能於動物中單獨存在或以獨立細胞(如白血病細胞)於血流中循環。

本文中之用語「檢測癌轉移」或「診斷癌轉移」意指，判定哺乳動物的癌(腫瘤)是否有轉移。「檢測癌轉移」亦指獲得有關哺乳動物癌細胞轉移之可能性之間接證據。可單獨利用本發明之方法、或利用本發明之方法與其他方法併用或根據有關哺乳動物健康狀態之資訊來檢測癌轉移。

本文中「體液」意指：哺乳動物個體排泄或分泌或不排泄或不分泌之流體(例如血漿、尿液、腹水、肋膜積液、唾液、淋巴液或糞便)。技藝人士均了解，體液檢體如有需要可於分析前經稀釋。「取得體液」意指獲取用於本發明所描述方法之體液。

一種藉由測量哺乳動物體液中CAS蛋白或CAS多肽含量以檢測癌轉移之方法，該方法包含以下步驟：(a)取得得自哺乳動物之體液；及(b)測量該體液中CAS蛋白或CAS多肽含量，以篩選或診斷癌轉移。

CAS蛋白為此技藝中所習知。CAS (cellular apoptosis susceptibility)基因(GenBank編號U33286)之DNA序列如下所示：

CAS(cellular apoptosis susceptibility)蛋白(蛋白質ID編號AAC50367.1)之胺基酸序列如下所示：

根據本發明之一實施例，哺乳動物為人類。根據本發明之一實施例，可藉由利用免疫結合試驗檢測體液中CAS蛋白或CAS多肽含量來測量CAS蛋白含量。

檢測係基於測量體液中CAS蛋白或CAS多肽含量。可利用數種已知之免疫結合試驗中之任何一種以檢測及/或定量CAS蛋白。免疫試驗通常利用直接或非直接標定劑來標定由抗體及抗原所形成之複合物。標定劑本身可為包含抗體/抗原複合物之基團之一部分(即直接標定劑)，故標定劑可為經標定之CAS蛋白或經標定之CAS抗體。或者，標定劑可為特異結合至抗體/CAS蛋白複合物之第三基團(例如二級抗體)(二級抗體通常對產生一級抗體之物種所產生之抗體具特異性)。標定劑可經可偵測基團(例如生物素)修飾，而另一分子(例如鏈黴抗生物素)可特異性結合至該可偵測基團。多種不同可偵測基團係為本領域之技藝人士所熟習。在試驗過程中，每次試劑結合步驟之後均需有反應及/或清洗步驟。反應步驟可自約5秒至數小時，視情況為約5分鐘至約24小時。然而，反應時間視試驗形式、抗原、溶液體積、濃度等條件而定。雖試驗可於一溫度範圍內進行，但其通常於室溫下進行。

在不顯著影響試驗中抗體特異性結合之情況下，用於試驗之特定標記或可偵測基團並非本發明之關鍵。可偵測基團可為任何具有可偵測物理或化學性質之物質。在免疫試驗之領域中已發展許多可偵測標記，一般而言，大部分可用於該等免疫試驗方法之標記均可應用於本發明。因此，標記為任何可經光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、光學、電、流式細胞儀或化學方法偵測之組合物，可用於本發明之標記包括磁珠、螢光染劑、放射標記、酵素(例如辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶及其他普遍用於ELISA者)及諸如膠態金或彩色玻璃或塑膠珠(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)之比色分析標記。標記可利用此技藝中習知之方法直接或間接連接於試驗中所欲之成分上。檢測標記之方法為熟習此項技藝者所熟知。因此，當標記為(例如)放射活性標記時，檢測方法包括閃爍計數器或照相軟片(使用自動放射顯影時)。當標記為螢光標記，其可藉由利用適當波長之光激發螢光物質並偵測其所發出之螢光來偵測。螢光可用肉眼、照相軟片、利用諸如電荷耦合元件(CCDs)之電偵測器或光電倍增管等方法偵測。同樣地，酵素標記可藉由提供適當之該酵素之受質並偵測所得反應物來偵測。最後，簡單比色分析標記可藉由觀察與標記相關之顏色來偵測。

測量體液中之CAS多肽之結果可用於診斷或篩選轉移性癌症。CAS多肽之偵測包含該多肽之定量或定性偵測且包含與控制值之實際比較，或者，其可以其中偵測本身即顯示增加量之方式實施。在一實施例中，體液中CAS多肽之檢測係在CAS多肽的量在非轉移性癌症檢體之量會低於轉移性癌症檢體的量。因此在該檢測中，若於體液中偵測到任何CAS多肽，則顯示癌轉移之存在。如下述，數種方法中之任一種均可用於測量CAS含量。可藉由偵測CAS多肽本身或藉由偵測CAS蛋白活性來偵測CAS多肽。偵測可包含定量CAS(例如多肽含量、蛋白質含量或蛋白質活性)，或可為CAS含量或存在或不存在之定性評估(特別是與控制組含量比較)。多種方法中之任何一種均可用於上述任一偵測方法中，如以下所述。

本發明亦提供藉由測量哺乳動物體液中CAS蛋白或CAS多肽含量以偵測癌轉移之套組，其包含CAS專一性抗體。

本發明亦提供用於上述偵測及診斷應用之套組。於診斷或偵測應用上，該套組可包含下述任何一者或所有：檢測試劑、緩衝液、CAS專一性抗體或可與CAS蛋白或CAS多肽結合且可顯示體液中CAS蛋白或CAS多肽含量之化學藥品、多肽及其他分子。

此外，該套組可包含指示性資料，其包含實施本發明方法之指示(即計畫)。指示性資料通常包含書寫或印刷之資料，但不限於此。任何可儲存該指示並將其傳達至末端使用者之工具均在本發明預期中。該等工具包括(但不限於)電子儲存媒體(例如磁碟、磁帶、卡帶、晶片)、光學媒體(例如CD ROM)及其他類似者。該等工具可包含連結至網際網路站點以提供該指示性資料。

實施例 抗體

實施例所使用之抗體為鼠抗CAS抗體(clone 24)(BD Pharmingen,San Diego,CA,USA)、鼠抗-CAS抗體(3D8)(Abnova,Taipei,Taiwan)山羊抗CAS抗體(C-20)及兔抗MMP-2抗體(H-76)(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)、兔抗CAS抗體(AP1935a)(Abgent,San Diego,CA,USA)、鼠抗β肌動蛋白抗體(Ab-5)(Lab Vision,Fremont,CA,USA)、結合至Alexa Fluor 488(或Alexa Fluor 568)之山羊抗鼠(或抗兔)IgG二級抗體(Molecular Probes,Eugene,OR,USA)。

製造表現CAS蛋白的載體

以Trizol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)將細胞總RNA自HT-29人類結腸直腸癌細胞抽取。利用第一股cDNA合成套組(Clontech Laboratories,Palo Alto,CA,USA)進行反轉錄反應。使含有1μg經DNase處理之總RNA、20 pmol寡(dT)₁₈ 引子、50mM Tris-HCl pH 8.3、75mM KCl、3mM MgCl₂ 、0.5mM之各dNTP、1單位RNase抑制劑,及200units/μg RNA之MMLV反轉錄酶之反轉錄反應混合物(20μl)於42℃反應1小時。於含有5μl反轉錄反應混合物、100ng各引子、0.3mM Tris-HCl pH 8.0、1.5mM KCl、1μM EDTA、1%甘油、0.2mM各dNTP及1μl50×Advantage 2 polymerase mix(Clontech)之50μl反應混合物中進行PCR反應。用於放大CAS cDNA(GenBank編號U33286)之引子為5'-TATAGCAATGGAACTCAGCGATGC(SEQ ID NO:3)(正股引子)及5'-AGTTTAAAGCAGTGTCACACTGGC(SEQ ID NO:4)(反股引子)。於GeneAmp PCR System 9700(Perkin-Elmer,Norwalk,CT. USA)中，以下列條件進行35循環之反應，以複製DNA：94℃30秒，65℃30秒及72℃200秒，加上72℃10分鐘之最終延長步驟。將複製之DNA產物溶解於含有溴化乙錠之1%瓊脂糖凝膠。將DNA抽取並選殖至pGEM-T載體(Promega Corporation,Madison,WI,USA)並隨後選殖至pcDNA3.1真核表現載體(Invitrogen)中，以獲得pcDNA-CAS載體。以Apa I及Hind III切割pcDNA-CAS載體，並將516-bp之CAS片段(bp 1至516)以反義方向選殖入pcDNA3.1載體之Apa I及Hind III限制切位，以獲得pcDNA-anti-CAS載體。DNA序列以DNA定序來確認。

細胞及DNA轉殖

MCF-7乳癌細胞、HT-29人類結腸直腸癌細胞及B16-F10黑色素瘤細胞係購自American Type Culture Collection(Manassas,VA,USA)。以10%之胎牛血清(FBS)、100units/ml盤尼希林、100μg/ml鏈黴素及2mM穀胺酸補充之Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)於37℃、濕潤之5% CO₂ 大氣條件下培養細胞。利用脂質轉染胺試劑(Invitrogen)以載體轉染細胞。以高濃度G418篩選經轉染之細胞3週。收集多重抗藥性純系(>100)並增殖成大量細胞培養物。將經轉染之細胞維持於含有200μg/ml G418之培養基中。用於本文所述實驗之細胞則培養於不含G418之培養基中。MCF-CAS細胞(以pcDNA-CAS載體轉染之MCF-7細胞株)、MCF-anti-CAS細胞(以pcDNA-anti-CAS載體轉染之MCF-7細胞株)、MCF-EV細胞(以pcDNA3.1空載體轉染之MCF-7細胞株、B16-CAS細胞(以pcDNA-CAS載體轉染之B16-F10細胞株)、B16-anti-CAS細胞(以pcDNA-anti-CAS載體轉染之B16-F10細胞株)及B16-EV細胞(以pcDNA3.1空載體轉染之B16-F10細胞株)係先前所建構(Liao et al.,2008b;Liao et al.,2008c)。

免 疫墨點法

以PBS洗滌細胞並刮取法收集細胞。以PBS洗滌並以RIPA緩衝液(25mM Tris-HCl[pH 7.2]、0.1% SDS、0.1%氚核X-100、1%去氧膽酸鈉、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM原釩酸鈉、1mM苯甲磺酰氟、10μg/ml抑肽酶(aprotinin)及5μg/ml亮抑蛋白酶肽(leupeptin))溶解收集之細胞。以BCA蛋白質檢測套組(Pierce,Rockford,IL,USA)測定蛋白質濃度。將50μg之蛋白質檢體裝填至SDS-聚聚丙烯醯胺凝膠。將蛋白質轉漬至nitrocellulose membranes(Amersham Pharmacia,Buckinghamshire,UK)。nitrocellulose membranes於4℃下和blocking buffer(1% BSA,50mM Tris-HCl,pH 7.6,150mM NaCl,0.1% Tween-20)放置16小時。再將墨點於室溫(RT)下與一級抗體反應1小時，接著與horseradish peroxidase結合之二級抗體反應1小時。利用ECL西方墨點偵測系統(Amersham Pharmacia)以增強化學發光測定蛋白質含量。

免疫螢光

將生長於蓋玻片(12x12mm)之細胞以1000rpm旋轉10分鐘。以PBS洗滌並以4%多聚甲醛(paraformaldehyde)固定細胞，接著於4%多聚甲醛(paraformaldehyde)和0.1% Triton X-100處理細胞，再將細胞以含有0.1% BSA及0.5% Tween-20之液體反應。使細胞與一級抗體反應並以PBS洗滌，接著與Alexa Fluor 488(或568)山羊抗鼠(或抗兔)IgG二級抗體反應。以Zeiss Axiovert 200M倒立式螢光顯微鏡檢察蓋玻片。本實驗共進行三次獨立實驗，每次實驗含兩個蓋玻片，每片蓋玻片隨機取5個視野觀察。

MMP-2及CAS分泌分析

將相同數量之細胞接種於100-mm細胞培養盤。由於胎牛血清(FBS)含有大量內源性MMP-2，FBS亦可能影響CAS免疫墨點試驗，因此，先使細胞生長至快滿(sub-confluence)後以磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)洗滌，接著將細胞轉移至不含血清之培養液培養36小時。之後收集該培養液，並以10,000rpm離心10分鐘以移除任何可能之懸浮細胞或細胞殘骸，收集上清液。測定細胞數，並以抗MMP-2抗體及抗CAS抗體對細胞數校正過之培養液樣本進行免疫墨點分析。

以Matrigel做細胞侵犯性分析

於4℃將matrigel(BD Biosciences)和不含聚乙烯吡咯啶酮之8μm孔徑聚碳酸濾紙(polyvinylpyrrolidone-free polycarbonate filters)反應(用於研究經轉染之B16-F10細胞的侵犯性，此matrigel以1:10的比例稀釋於DMEM中；若用於經轉染之MCF-7細胞的侵犯性，此matrigel以1:50的比例稀釋於DMEM中)36小時，之後於37℃反應2小時。以DMEM洗滌濾紙4次後將其置於微趨化性室(microchemotaxis chambers)中。以0.1%胰蛋白酶-EDTA(trypsin-EDTA)處理細胞並將之重新懸浮於含有10% FBS之DMEM培養基，之後以不含血清之DMEM培養液洗滌細胞。最後將細胞(1x10⁵ )懸浮於DMEM(200μl)並置於趨化性室(microchemotaxis chambers)之上層隔間。將含有20% FBS之細胞培養培養基(300μl)置於趨化性室之下層當作化學引誘劑之來源。於細胞培養培養箱中培養10小時(用於研究經轉染之B16-F10細胞的侵犯性)或24小時(用於研究經轉染之MCF-7細胞的侵犯性)後，以棉花棒完全拭去趨化性室(microchemotaxis chambers)之上層隔間濾紙上面之細胞。以甲醇固定趨化性室(microchemotaxis chambers)之上層隔間濾紙下面之細胞，並以Liu's A及Liu's B試劑染色，之後於顯微鏡下計數。亦計數侵入微趨化性室之細胞。於每一重覆之實驗中判定10個隨機選擇之視野之腫瘤細胞。

動物癌轉移實驗

於正常環境下(22℃；50%溼度；12小時之光/暗週期)將6至7週大之C57BL/6小鼠(國家實驗動物中心，台北，台灣)圈養於動物室。以活的B16-EV細胞或B16-anti-CAS細胞注射C57BL/6小鼠之尾靜脈。每一實驗組別包含11隻以B16-EV細胞注射之小鼠及11隻以B16-反-CAS細胞注射之小鼠，總共有66之小鼠用於本實驗。注射後25天將小鼠犧牲並驗屍。以肉眼檢驗及顯微檢驗計數肺中之腫瘤數。小鼠之飼育及實驗程序均依照台灣中央研究院實驗動物管理委員會之規範。

免疫組織化學

以6μm福馬林固定/石蠟包埋之癌組織切片進行免疫組織化學。切片於二甲苯去石蠟並於分段乙醇復水後，於95℃下將其浸於檸檬酸鹽緩衝液中10分鐘。本免疫組織化學反應利用Histostain套組(Zymed,San Francisco,CA,USA)以經標記鏈黴抗生物素-生物素法(abeled streptavidin-biotin method)進行免疫組織化學偵測。以3%溶於水之過氧化氫遮蓋組織切片內源性過氧化酶活性，之後於室溫下以5% BSA培育1小時以遮蓋非專一性染色。於室溫下使切片與50倍稀釋之抗CAS抗體(clone 24)反應1小時，之後與生物素化之二級抗體反應，最後與過氧化酶標定之鏈黴抗生物素(biotinylated secondary antibodies and peroxidase-labeled streptavidin)反應。以二氨基聯苯胺(diaminobenzidine)使切片顯影並以蒸餾水洗滌，最後以Mayer's蘇木清(Mayer's hematoxylin)進行複染。

血清檢體

在告知捐贈者同意下取得47位健康捐贈者之血清檢體。捐贈者之平均年齡為58.5±11.6歲(平均±S.D.,範圍為17-79歲)。自89位台灣台中童綜合醫療社團法人童綜合醫院之病患以及57位台灣彰化基督教醫院之結腸直腸癌病患，取得未經癌治療處理之癌血清檢體。在遵循IRB核准之指導方針之告知同意下，於診斷時取得檢體。檢體(包括取自台灣彰化基督教醫院之結腸直腸癌血清檢體)包括66位罹患原發癌症之病患(平均年齡56.2±17.0歲，範圍為20-91歲)、25位罹患侵犯型癌症(平均年齡51.3±16.6歲，範圍為43-84歲)及55例轉移性癌症(平均年齡61.9±14.9歲，範圍為26-94歲)。收集檢體並使血液於室溫下培養至少30分鐘，以形成凝塊。接著使檢體於4℃以1300g離心20分鐘，收集血清保存於-80℃以備後續檢測使用。將所有檢體以特定標籤標示以保護病患隱私。在進行分析前所有檢體都未經解凍。將檢體以10,000rpm離心10分鐘，以移除任何可能之懸浮細胞或細胞殘骸，上清液用於CAS分析。所有轉移性癌症病例經病理診斷為患有遠端腫瘤轉移至其他器官或淋巴結。

在遵循IRB核准之指導方針之告知同意下，於診斷時自57位台灣彰化基督教醫院之結腸直腸癌病患取得未經前處理之結腸直腸癌血清檢體。根據結腸直腸癌之腫瘤-結-轉移(TNM)分類法將腫瘤分類。結腸直腸癌病患之基本特徵示於表1。上述結腸直腸癌病例包括27例非轉移性結腸直腸癌病人(11名男性，16名女性)及30例轉移性結腸直腸癌病人(15名男性，15名女性)。非轉移性組病患平均年齡為62.9±15.7歲(平均±S.D.,範圍為27-91歲)，轉移性組病患之平均年齡為64.21±16.7歲(範圍為26-94歲)。在非轉移組之原發癌中，3.7%為Tis、11.1%為T1、33.3%為T2、51.9%為T3及0%為T4；在轉移組之原發癌中，0%為Tis、6.7%為T1、6.7%為T2、80.0%為T3及6.7%為T4。根據TNM分類法，所有非轉移性癌症皆為N0M0；在轉移組中，淋巴結轉移檢查結果3.3%為N0、50.0%為N1及46.7%為N2，遠端轉移檢查結果73.3%為M0及26.7%為M1。

GST-CAS融合蛋白質產生及CAS蛋白質純化

GST-CAS融合蛋白質產生及CAS蛋白質純化。利用引子GGATCC ATGGAACTCAGCGATGCAAATCTG(SEQ ID NO:5)(正股引子，劃底線者為BamH I限制酶切位)及CTCGAG TTAAAGCAGTGTCACACTGGCTG(SEQ ID NO:6)(反股引子，劃底線者為Xho限制酶切位)以PCR複製經限制酶切開之pcDNA-CAS載體，以建構GST-CAS融合蛋白質之表現載體。將複製產物選殖入pGEX-4T-1載體(Amersham Pharmacia)之BamH I及Xho I的限制酶切位，以獲得pGEX-CAS載體。以DNA定序檢查DNA序列。以pGEX-CAS載體轉型E. coli 細菌株Rosetta(DE3)pLysS。將經轉型之E. coli 培養至O.D.600=1.2，接著以0.1mM異丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)處理細菌株5小時，以誘導細菌株生產GST-CAS融合蛋白。利用Bulk GST Purification Modules(Amersham Pharmacia)以谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠4B珠(glutathione-Sepharose 4B beads)純化GST-CAS融合蛋白。接著，以PBS洗滌含融合蛋白的管柱，再以還原之谷胱甘肽(reduced glutathione)(Amersham Pharmacia)溶離融合蛋白。於22℃以凝血酶(thrombin)(3units/100μg之融合蛋白質)(Sigma Chemicals,St Louis,MO,USA)切割GST-CAS融合蛋白16小時。以Ultra-4 Centrifugal Filter Units(Millipore,Billerica,MA,USA)移除凝血酶及GST。以同樣方式純化生長中之pGEX-4T-1轉型之細菌所產生之GST蛋白質(不含CAS蛋白)，並作為對照組。利用抗CAS抗體以免疫墨點法確認純化之CAS。以BCA蛋白質分析套組(Pierce,Rockford,IL,USA)測定CAS蛋白質濃度，且以純化之CAS蛋白質作為ELISA分析之標準以測定轉移性癌症病人之血液CAS蛋白質之截距值(cut-off value)。

酵素連結免疫吸附分析(ELISA)

將CAS抗體(C-20或clone 24)，固定於專門做酵素連結免疫吸附分析(ELISA)的96孔盤(96-well plates)(Costar,Cambridge,MA )的孔。再以溶於PBS之5% BSA與此96孔盤反應1小時。以PBS洗滌孔盤的孔，接著與血漿檢體(以PBS稀釋3倍)反應1小時。以PBST(溶於PBS之0.05% Tween-20)洗滌後，使孔與生物素結合之兔抗CAS抗體(biotin-conjugated rabbit anti-CAS antibodies)反應1小時。生物素結合之兔抗CAS抗體係利用Biotin Labeling Kit-NH2(Dojindo Laboratories,Kumamoto,Japan)，將AP1935兔抗CAS抗體生物素化(biotinylation)而製得。之後將孔以PBST洗滌並與鏈黴抗生物素結合之辣根過氧化酶(streptavidin-conjugated horseradish peroxidase)反應(R&D Systems,Minneapolis,MN)，並與ELISA受質試劑反應(R&D Systems)。以3個含PBS之空孔作為背景值，及3個未固定抗CAS抗體但有與所有其他ELISA試劑反應之孔作為對照組，以供校正。於30分鐘內以Thermo Multiskan EX Microplate Photometer(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)測量於450nm之吸光值。若檢體之OD值大於對照組之最高OD值，則代表其為CAS陽性。每一檢體均進行兩次分析，第一次分析使用C-20抗CAS抗體，第二次分析使用clone 24抗CAS抗體。兩次分析之結果均非常類似，顯示本實驗之準確性。

血清CEA含量分析

利用Architect CEA Reagent kit(Abbott Laboratories,Abbott Park,IL)依照廠商說明書指示測量檢體之CEA含量。根據說明書指示，CEA值≧5ng/ml表示病理學上呈陽性。

統計分析

利用SPSS 14.0統計軟體分析數據。利用雙尾費氏精確檢定(two-tailed Fisher’s exact test)分析統計差異。α值為0.05或0.01則為統計上顯著。

實例1：MCF-7細胞細胞突起之CAS蛋白質似泡狀染色

利用clone 24抗CAS抗體以免疫螢光法研究MCF-7細胞之CAS分布。CAS可與微管(microtubules)(Scherf et al.,1996)及一種核運輸受體importin-α(Kutay et al.,1997)結合。因此，預期CAS應於細胞之週核區域呈現似顆粒染色；或其由於與微管結合而呈似微管染色。然而，除上述細胞質週核區域之似顆粒染色，CAS亦於MCF-7細胞之細胞突起處呈似囊泡狀(vesicle-like staining)顆粒染色(圖1)。圖1顯示利用clone 24抗CAS單株抗體以免疫螢光顯微鏡分析CAS蛋白質之細胞分佈。以X1及X2標示的細胞顯示CAS(箭頭處)於細胞突起處之似泡狀顆粒染色。比例尺30μm。細胞囊泡(Cytoplasm vesicles)於調控胞泌作用(exocytosis)及細胞分泌扮演重要角色(Pickett et al.,2006)。上述細胞突起處之CAS似囊泡狀染色顯示CAS可能於調控細胞分泌作用方面扮演重要角色。

實例2：CAS表現調控MMP-2在MCF-7細胞的細胞突起之尖端及邊緣之分 佈

MMP-2為分泌型蛋白質，故以雙重染色免疫螢光研究CAS表現對MMP-2在細胞分佈之影響。利用pcDNA3.1空載體、pcDNA-CAS載體及pcDNA-anti-CAS載體分別轉染MCF-7細胞，得到MCF-EV、MCF-CAS及MCF-anti-CAS細胞(圖2A)。MMP-2一般位於細胞質內。除了位於細胞質，實驗結果顯示MMP-2亦分佈於MCF-7細胞之細胞核(圖2B)。先前研究顯示，MMP-2存在於心肌細胞之細胞核，此與聚(ADP-核糖)聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase)的受切割而活化有關(Kwan et al.,2004)。因此，MMP-2分佈於MCF-7細胞之細胞核中是可理解的(圖2B)。在MCF-EV細胞及MCF-anti-CAS細胞中，細胞突起處鮮少發現CAS與MMP-2共位(colocalization)；但在MCF-CAS細胞，細胞突起處發現許多CAS與MMP-2共位，特別是在突起之尖端及邊緣(圖2B)。此結果顯示，CAS與含MMP-2之囊泡結合，且CAS表現增加可促進含MMP-2之囊泡移位至細胞突起處。圖2顯示CAS表現調控MMP-2於MCF-7細胞突起處尖端及邊緣之分佈。(A)利用抗CAS抗體以免疫墨點法分析MCF-EV、MCF-CAS及MCF-anti-CAS細胞中CAS表現。(B)利用抗CAS抗體及抗MMP-2抗體以免疫螢光法分析，CAS表現調控MMP-2於細胞突起處尖端及邊緣之分佈。請注意，圖中顯示MCF-CAS細胞之細胞突起處之尖端及邊緣CAS與MMP-2分佈增加，而MCF-anti-CAS細胞之細胞突起處之尖端及邊緣CAS與MMP-2分布減少。箭頭指示MCF-EV、MCF-CAS及MCF-anti-CAS細胞之一些細胞突起區域。比例尺=20μm。

實例3：CAS與圍繞細胞膜外圍之囊泡中之MMP-2共位

利 用抗CAS抗體及抗MMP-2抗體以免疫螢光法分析MCF-CAS細胞中CAS與MMP-2共位。在高解析度相片中可觀察到CAS與MMP-2於MCF-CAS細胞的細胞膜附近區域之細胞質及細胞突起處共位(圖3)。值得注意的是，有些CAS與細胞膜外圍的囊泡中之MMP-2共位(圖3箭號處)。由於MMP-2為分泌型蛋白質，上述結果顯示CAS可能與MMP-2一起被細胞分泌出細胞外。

圖3顯示CAS與圍繞MCF-7細胞膜外圍之囊泡中之MMP-2共位。箭號指出CAS與圍繞細胞膜外圍之囊泡中之MMP-2共位。比例尺=30μm。

實例4：CAS表現增加會增進B16-F10細胞之侵犯性

利用pcDNA3.1載體、pcDNA-CAS載體及pcDNA-anti-CAS載體分別轉染B16-F10黑色素瘤細胞(一種高度侵犯性癌細胞株)，得到B16-EV細胞、B16-CAS細胞及B16-anti-CAS細胞(圖4A)。MMP-2的分泌分析結果顯示，CAS表現增加會增進B16-F10黑色素瘤細胞分泌MMP-2，而CAS表現減少會降低B16-F10黑色素瘤細胞分泌MMP-2(圖4B)。用Matrigel做癌細胞侵犯性實驗，顯示CAS表現增加使B16-F10細胞之侵犯性增強249.2%(P =0.0019)，而CAS表現減少使B16-F10細胞之侵犯性達到75.7%(P =0.0073)之抑制。實驗結果顯示，B16-CAS細胞、B16-EV細胞及B16-anti-CAS細胞，侵犯之平均細胞數分別為89.5±10.7、35.9±9.4及8.7±2.2(細胞/視野)。因此，用Matrigel做癌細胞侵犯性實驗，顯示CAS可調控癌細胞之侵犯性。圖4顯示CAS表現調控B16-F10黑色素瘤細胞之侵犯性。(A)利用抗CAS抗體以免疫墨點法，分析B16-EV細胞、B16-CAS細胞及B16-anti-CAS細胞之CAS表現量。(B)利用抗MMP-2抗體以免疫墨點法分析收集自B16-EV細胞、B16-CAS細胞及B16-anti-CAS細胞之細胞培養液。(C)用Matrigel做癌細胞侵犯性實驗之B16-EV細胞、B16-CAS細胞及B16-反-CAS細胞侵犯性分析。上圖為侵犯細胞之代表性照片。實驗數據以三個獨立實驗之平均值表示。^#1 相較於B16-EV細胞，P =0.0019。^#2 相較於B16-EV細胞，P =0.0073。

實例5：CAS表現減少會降低B16-F10細胞之肺轉移

利用實驗動物腫瘤轉移實驗，以研究CAS表現對B16-F10黑色素癌細胞轉移之影響。B16-F10細胞對於C57BL/6小鼠具高度癌細胞轉移性，因此我們研究CAS減少是否會降低B16-F10細胞對C57BL/6小鼠的癌細胞轉移性。圖5顯示CAS表現減少會降低在C57BL/6小鼠體內，B16-F10癌細胞之肺轉移。在表2顯示了動物腫瘤轉移實驗結果，發現CAS表現減少，會使C57BL/6小鼠體內B16-F10癌細胞之肺轉移降低56%(P =0.0107)。注射B16-EV細胞之小鼠平均肺腫瘤數為32.7±6.5腫瘤數目/每隻鼠(平均腫瘤直徑2.6±1.8mm)，注射B16-anti-CAS細胞之小鼠平均肺腫瘤數為14.3±4.6腫瘤數目/每隻鼠(平均腫瘤直徑2.5±1.5mm)。上述結果顯示CAS表現減少會降低B16-F10癌細胞對C57BL/6小鼠的癌細胞轉移性。

本實驗中，每一實驗組別包括11隻B16-EV細胞注射之小鼠及11隻B16-anti-CAS細胞注射之小鼠，總共使用66之小鼠。以B16-EV活細胞或B16-anti-CAS活細胞(5×10⁴ 細胞於50μl DMEM/小鼠)注射C57BL/6小鼠之尾靜脈。11隻注射B16-EV細胞之小鼠及6隻注射B16-anti-CAS之小鼠於注射後3週死亡，故不納入統計。6隻小鼠(3隻注射B16-EV細胞之小鼠及3隻注射B16-anti-CAS之小鼠)並未於肺長出腫瘤，故亦故不納入統計。結果顯示，CAS表現減少會使C57BL/6小鼠體內B16-F10癌細胞之肺轉移降低56%。*相較於B16-EV細胞注射之小鼠，P =0.0107。

實例6：CAS為分泌型蛋白，且分泌性CAS蛋白存在於轉移性癌症病人之血清中

本實驗利用免疫墨點法研究CAS是否亦為分泌性蛋白。由於胎牛血清(FBS)含有許多蛋白質及其他物質，其可能影響本實驗。因此，先使B16-F10黑色素瘤細胞生長至快滿(sub-confluence)後以PBS洗滌，接著以不含胎牛血清之培養基培養此B16-F10黑色素瘤細胞。結果顯示，CAS蛋白存在於培養在不含胎牛血清之培養基B16-F10黑色素瘤細胞之培養液中(圖6A)。再者，免疫墨點結果顯示，B16-CAS細胞分泌CAS蛋白至不含胎牛血清之培養基的能力比B16-EV細胞強(圖6B)。上述結果顯示，CAS亦為分泌型蛋白，且細胞中CAS表現增加會促進CAS蛋白的分泌量。

利用收集自健康捐贈者及患有原位癌、侵犯性癌或轉移性癌之病人血清，檢查血清中CAS蛋白之存在。所有用於此實驗之轉移性癌症病例，皆為病理學上診斷為有腫瘤轉移至其他遠端器官或淋巴結。雖然人類血清中可能含有其他未知蛋白質或物質會影響CAS之偵測，藉由免疫墨點分析仍偵測到CAS蛋白存在於轉移性癌症病人之血清中(圖6A)。結果顯示，CAS明顯存在於轉移性癌症病人之血清中，但僅少量存在於侵犯性癌症病人之血清中(圖6A及C)。圖6顯示，CAS為分泌性蛋白，且分泌性CAS蛋白存在於轉移性癌症病人之血清中。(A)利用抗CAS抗體進行收集自轉移性癌症病人之血清檢體之免疫墨點分析。30μl之每一血清檢體及60μl之每一培養液收集自B16-F10細胞培養於含有或不含FBS之培養液用於本試驗中。以B16-F10細胞全細胞蛋白產物作為對照組。可於轉移性癌症病人之血清及缺少血清之B16-F10細胞之培養液中偵測到分泌性CAS。(B)CAS表現增加會促進CAS分泌至培養基中。利用抗CAS抗體進行收集自缺乏血清之B16-EV及B16-CAS細胞之改良性培養基之免疫墨點分析。(C)利用抗CAS抗體進行收集自健康捐贈者及患有轉移性癌症、侵犯性癌症或原位性癌症之病人之血清之免疫墨點分析。每一免疫墨點分析均重複3次並得到相似結果。此處顯示代表性之免疫墨點。

於分析分泌型CAS存在之試驗中，有先將血清檢體及改良性培養基以10,000rpm離心10分鐘並收集上清液，僅上清液用於本實驗。因此，所偵測到之分泌性CAS，不可能來自檢體中汙染之懸浮細胞或細胞殘骸。於免疫墨點試驗結果所顯示之CAS蛋白條帶相當強，尤其是培養液檢體。CAS之分子量約為110kDa(Scherf et al.,1996)。培養液檢體及癌症病人血清中之CAS蛋白質之分子量亦約為110kDa。因此，本實驗所鑑定之CAS蛋白不可能來自培養液檢體或轉移性癌症病人血清中破裂或溶解之細胞所釋出。

實例7：CAS於轉移性癌組織之基質及腺腔呈陽性染色

利用clone 24抗CAS抗體所進行之轉移性乳癌及結腸直腸癌組織之免疫組織化學分析顯示，CAS蛋白主要分布於轉移性乳癌之腺細胞(gland cells)的細胞質以及轉移性結腸直腸癌組織之腺細胞的細胞質(圖7)。CAS蛋白於癌組織之基質(stroma)亦呈陽性染色(圖7箭頭處)。重要的是，CAS蛋白於轉移性乳癌組織之腺細胞(gland cells)的腺腔(gland lumen)以及轉移性結腸直腸癌組織之之腺細胞的腺腔(gland lumen)亦呈陽性染色(圖7箭號處)。圖7顯示CAS蛋白於轉移性癌組織之分佈。利用抗CAS單株抗體進行轉移性結腸直腸癌(A、B及D)及乳癌(C)組織中CAS蛋白分佈之免疫組織化學分析。請注意，圖中顯示CAS蛋白於癌組織之基質(stroma)(A及B箭頭處)、腺細胞的腺腔(gland lumen)(C箭號處及D箭號處)呈陽性染色。比例尺代表50μm。CAS蛋白存在於轉移性乳癌組織之腺細胞的腺腔以及轉移性結腸直腸癌組織之腺細胞的腺腔，此結果顯示，CAS蛋白於轉移性癌症中為分泌性蛋白質。腫瘤微環境或基質由細胞外基質組成，其於調控癌轉移上扮演重要角色(Zigrino et al.,2005)。因此，CAS蛋白於轉移性癌組織基質中之陽性染色顯示，CAS蛋白會分泌至癌組織之基質並調控癌轉移。癌組織之腺體(gland)亦提供通道使轉移性癌細胞可侵犯鄰近組織或器官。CAS蛋白於癌化的腺細胞中之陽性染色顯示CAS蛋白於癌組織之分泌及癌轉移之調控可能扮演重要角色。再者，由癌組織之腺腔分泌之物質最後可能到達血管(Brandtzaeg et al.,1987;Pieper-Bigelow et al.,1990)。本研究之結果顯示，CAS蛋白於轉移性癌組織之腺腔呈陽性染色。因此，CAS蛋白可在轉移性癌症病人之血清中偵測到是可理解的。

實例8：CAS蛋白於轉移性癌症病人之血清中有較高之盛行率

利用ELISA試驗研究轉移性、侵犯性或原位性癌症病人血清中CAS蛋白之盛行率。結果顯示，轉移性、侵犯性及原位性癌症病人血清CAS蛋白盛行率分別為57.7%(15/26)、32.0%(8/25)及5.1%(2/39)(圖8A)。健康捐贈者之血清CAS蛋白盛行率為6.4%(3/47)。轉移性癌症組與健康捐贈者組間之P值<0.01，轉移性癌症組與原位性癌症組間之P值<0.01，轉移性癌症組與侵犯性癌症組間之P值<0.05，侵犯性癌症組與健康捐贈者組間之P值<0.05，且原位性癌症組與健康捐贈者組間之P值為0.685。以純化之CAS蛋白為標準，轉移性癌症病人血清中CAS蛋白之截距值(cut-off value)測定為。轉移性癌症病人血清中含有分泌性CAS蛋白，此並不限於特定種類之癌症。各種轉移性癌症種類中，血清CAS蛋白之比例為：乳癌75%(6/8)、肺癌75%(3/4)、子宮頸癌75%(3/4)、膽管癌100%(1/1)、唇癌100%(1/1)、下咽癌50%(1/2)、食道癌0%(0/2)、卵巢癌0%(0/1)、腮腺癌0%(0/1)、輸卵管網膜癌0%(0/1)及口腔癌0%(0/1)(圖8B)。上述結果顯示，CAS蛋白於轉移性癌症病人之血清中有較高之盛行率，故CAS蛋白可能可作為篩選轉移性癌症之血清標記。

圖8顯示分泌性CAS蛋白於轉移性癌症病人之血清中有較高之盛行率。(A)以ELISA測定健康捐贈者及原位性、侵犯性及轉移性癌症病人之血清CAS蛋白之盛行率。#轉移性癌症組與原位性癌症組間具顯著差異(P <0.01)。(B)轉移性癌症類型及於轉移性癌症偵測到之血清CAS蛋白比率。每種癌症之血清CAS蛋白陽性病例數對每種轉移性癌症之總數顯示於結果中。

於CAS蛋白含量之ELISA試驗中，有先將血清檢體以10,000rpm離心10分鐘並收集上清液，僅上清液用於本實驗。因此，所偵測到之分泌性CAS蛋白的存在，不可能來自檢體中汙染之懸浮細胞或細胞殘骸。

實例9：CAS蛋白於轉移性結腸直腸癌組織之腺腔呈陽性染色

利用clone 24抗CAS單株抗體及轉移性結腸直腸癌腫塊組織切片進行之免疫組織化學顯示，CAS蛋白主要分布於結腸直腸腺細胞之細胞質(圖9)。CAS蛋白於轉移性結腸直腸癌組織之基質亦呈陽性染色(圖9箭頭處)。重要的是，CAS蛋白於結腸直腸癌組織之腺腔(gland lumen)亦呈陽性染色(圖9箭號處)，此結果顯示CAS蛋白可由結腸直腸癌組織分泌。圖9顯示利用免疫組織化學分析CAS蛋白於轉移性結腸直腸癌組織之分布。CAS蛋白於轉移性結腸直腸癌組織之基質(箭頭處)及腺腔(箭號處)呈陽性染色。比例尺代表50μm。腺體為分泌型器官，故上述結果顯示CAS蛋白於結腸直腸癌腺體分泌方面可能扮演重要角色。CAS蛋白存在於轉移性結腸直腸癌組織之基質、腺細胞細胞質及腺腔，此一結果顯示，CAS蛋白於轉移性結腸直腸癌中具分泌性，且CAS蛋白於結腸直腸癌及結腸直腸癌之轉移方面可能扮演重要角色。

實例10：CAS蛋白存在於轉移性結腸直腸癌病人之血清中

利用clone 24抗CAS單株抗體對收集自轉移性結腸直腸癌病人之血清進行免疫墨點分析。結果顯示，由於免疫墨點上有清楚之CAS蛋白質條帶，代表CAS蛋白明顯存在於轉移性結腸直腸癌病人之血清中(圖10)。因此，CAS蛋白亦為分泌性蛋白，且存在於轉移性結腸直腸癌病人之血清中。

圖10顯示利用clone 24抗CAS單株抗體對收集自培養於不含胎牛血清之培養基的B16-F10黑色素瘤細胞的培養液，及收集自轉移性結腸直腸癌病人之血清檢體，進行免疫墨點分析之結果。以B16-F10細胞全細胞蛋白產物作為對照組。可於轉移性癌症病人之血清，及培養於不含胎牛血清之培養基的B16-F10黑色素瘤細胞的培養液中偵測到分泌性CAS蛋白。上述免疫墨點分析重複3次並得到相似結果，本結果顯示代表性免疫墨點。

實例11：此實例研究所使用之結腸直腸癌病人之基本特徵

在遵循人體試驗委員會核准之指導方針之告知同意下，於診斷時自57位彰化基督教醫院之結腸直腸癌病患取得結腸直腸癌血清檢體。上述病患之基本特徵示於表1。上述癌症病例包括27例非轉移性結腸直腸癌病人(11名男性，16名女性)及30例轉移性結腸直腸癌病人(15名男性，15名女性)。非轉移性組病患平均年齡為62.9±15.7歲(平均±S.D.，範圍為27-91歲)，轉移性組病患之平均年齡為64.21±16.7歲(範圍為26-94歲)。根據結腸直腸癌之腫瘤-結-轉移(TNM)分類法將腫瘤分類。在非轉移組之原發癌中，3.7%為Tis、11.1%為T1、33.3%為T2、51.9%為T3及0%為T4；在轉移組之原發癌中，0%為Tis、6.7%為T1、6.7%為T2、80.0%為T3及6.7%為T4。根據TNM分類法，所有非轉移性癌症皆為N0M0；在轉移組中，淋巴結轉移檢查結果3.3%為N0、50.0%為N1及46.7%為N2，遠端轉移檢查結果73.3%為M0及26.7%為M1。

實例12：CAS蛋白於診斷結腸直腸癌之淋巴轉移時更優於CEA蛋白

以收集自27位非轉移性及30位轉移性結腸直腸癌病人之血清檢體分析分泌性CAS蛋白於轉移性結腸直腸癌之盛行率。病理檢查顯示所有病例皆為腺癌。所有轉移性病例經病理診斷為具有結腸直腸腫瘤轉移至其他遠端器官或結腸直腸腫瘤轉移至淋巴結。所有遠端轉移病例皆為肝臟轉移。ELISA結果顯示CAS蛋白於轉移性結腸直腸癌病人之陽性率為60%(18/30)，於非轉移性結腸直腸癌病人則為14.8%(4/27)(P =0.001)(表3)。血清CAS蛋白於健康捐贈者之陽性率為6.4%(3/47)。利用純化之CAS蛋白作為標準，轉移性結腸直腸癌病人血清CAS蛋白的截距值為≧3ng/ml。

分析這些病人之血清CEA蛋白含量，以比較CAS蛋白與CEA蛋白於檢測結腸直腸癌轉移之效率。本結果顯示，轉移性結腸直腸癌病人之病理性血清CEA蛋白之陽性機率為43.3%(13/30)，而非轉移性結腸直腸癌病患則為40.7%(11/27)(P =1)(表3)。因此，轉移性結腸直腸癌及非轉移性結腸直腸癌間之病理性血清CEA蛋白之陽性率並無顯著差異。有趣的是，在淋巴結轉移病例(即N1M0或N2M0)中，病理性血清CEA蛋白呈陽性之比率不高(36.3%，8/22)(表4)。然而，遠端轉移病例(即N0M1、N1M1及N2M1)中，病理性血清CEA蛋白呈陽性之比率高(62.5%，5/8)(表4)。再者，所有遠端轉移病例皆為結腸直腸腫瘤轉移至肝臟(表1)。上述結果與下列事實相符：腸癌之高血液CEA蛋白含量似乎與患高度轉移(特別是肝侵犯)之晚期結腸直腸癌疾病病人有關(Moertel et al.,1993)。相對的，淋巴結轉移病例中，血清CAS蛋白呈陽性之比例為63.6%(14/22)；而遠端轉移病例中，血清CAS蛋白呈陽性之比例為50.0%(4/8)(表4)。因此，CAS蛋白於鑑定結腸直腸癌轉移(包括結腸直腸癌之淋巴結轉移)效果優於CEA蛋白。

表3顯示測量血清CAS蛋白含量及血清CEA蛋白含量於鑑定結腸直腸癌之比較結果。表4顯示CAS蛋白及CEA蛋白於鑑定結腸直腸癌之淋巴結及遠端轉移之比較結果。

^a 淋巴結轉移：N0M0、N1M0AN2M0。^b 遠端轉移：N0M1、N1M1及N2M1。^c 所有病例皆為結腸直腸癌轉移至肝臟。^d 相較於CEA蛋白-陽性病例，P <0.01。^e 相較於CEA蛋白-陽性病貌，P =0.087。

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圖1顯示圖1顯示利用clone 24抗CAS單株抗體以免疫螢光顯微鏡分析CAS蛋白質之細胞分佈。以X1及X2標示的細胞顯示CAS(箭頭處)於細胞突起處之似泡狀顆粒染色。比例尺30μm。

圖2顯示CAS表現調控MMP-2於MCF-7細胞突起處尖端及邊緣之分佈。(A)利用抗CAS抗體以免疫墨點法分析MCF-EV、MCF-CAS及MCF-anti-CAS細胞中CAS表現。(B)利用抗CAS抗體及抗MMP-2抗體以免疫螢光法分析，CAS表現調控MMP-2於細胞突起處尖端及邊緣之分佈。請注意，圖中顯示MCF-CAS細胞之細胞突起處之尖端及邊緣CAS與MMP-2分佈增加，而MCF-anti-CAS細胞之細胞突起處之尖端及邊緣CAS與MMP-2分布減少。箭頭指示MCF-EV、MCF-CAS及MCF-anti-CAS細胞之一些細胞突起區域。比例尺=20μm。

圖3顯示CAS與圍繞MCF-7細胞膜外圍之囊泡中之MMP-2共位。利用抗CAS抗體及抗MMP-2抗體以免疫螢光分析MCF-CAS細胞中CAS與MMP-2之共位置。箭號指出CAS與圍繞細胞膜外圍之囊泡中之MMP-2共位。比例尺=30μm。

圖4顯示CAS表現調控B16-F10黑色素瘤細胞之侵犯性。(A)利用抗CAS抗體以免疫墨點法，分析B16-EV細胞、B16-CAS細胞及B16-anti-CAS細胞之CAS表現量。(B)利用抗MMP-2抗體以免疫墨點法分析收集自B16-EV細胞、B16-CAS細胞及B16-anti-CAS細胞之細胞培養液。(C)用Matrigel做癌細胞侵犯性實驗之B16-EV細胞、B16-CAS細胞及B16-反-CAS細胞侵犯性分析。上圖為侵犯細胞之代表性照片。實驗數據以三個獨立實驗之平均值表示。CAS表現增加會使B16-F10細胞之侵犯性增強249.2%(P =0.0019)，而CAS表現減少使B16-F10細胞之侵犯性受到75.7%(P =0.0073)之抑制。^#1 相較於B16-EV細胞，P =0.0019。^#2 相較於B16-EV細胞，P =0.0073。

圖5顯示CAS蛋白表現減少降低B16-F10細胞之肺轉移。注射B16-EV細胞之小鼠平均肺腫瘤數為32.7±6.5腫瘤/小鼠(平均腫瘤直徑2.6±1.8mm)，注射B16-anti-CAS細胞之小鼠平均肺腫瘤數為14.3±4.6腫瘤數目/每隻鼠(平均腫瘤直徑2.5±1.5mm)。CAS蛋白表現減少會使C57BL/6小鼠中B16-F10細胞之肺轉移降低56%(P =0.0107)。11隻注射B16-EV細胞之小鼠及6隻注射B16-anti-CAS之小鼠於注射後3週死亡。anti-CAS載體轉染降低(anti-CAS vector)注射之B16-F10細胞之小鼠之存活率，此可能是由於anti-CAS載體轉染降低B16-F10細胞之轉移能力。動物腫瘤轉移實驗結果顯示CAS蛋白可調控癌轉移。

圖6顯示，CAS為分泌性蛋白，且分泌性CAS蛋白存在於轉移性癌症病人之血清中。(A)利用抗CAS抗體進行收集自轉移性癌症病人之血清檢體之免疫墨點分析。30μl之每一血清檢體及60μl之每一培養液收集自B16-F10細胞培養於含有或不含FBS之培養液用於本試驗中。以B16-F10細胞全細胞蛋白產物作為對照組。可於轉移性癌症病人之血清及缺少血清之B16-F10細胞之培養液中偵測到分泌性CAS。(B)CAS表現增加會促進CAS分泌至培養基中。利用抗CAS抗體進行收集自缺乏血清之B16-EV及B16-CAS細胞之改良性培養基之免疫墨點分析。(C)利用抗CAS抗體進行收集自健康捐贈者及患有轉移性癌症、侵犯性癌症或原位性癌症之病人之血清之免疫墨點分析。每一免疫墨點分析均重複3次並得到相似結果。此處顯示代表性之免疫墨點。

圖7顯示CAS蛋白於轉移性癌組織之分佈。利用抗CAS單株抗體進行轉移性結腸直腸癌(A、B及D)及乳癌(C)組織中CAS蛋白分佈之免疫組織化學分析。請注意，圖中顯示CAS蛋白於癌組織之基質(stroma)(A及B箭頭處)、腺細胞的腺腔(gland lumen)(C箭號處及D箭號處)呈陽性染色。比例尺代表50μm。

圖8顯示分泌性CAS蛋白於轉移性癌症病人之血清中有較高之盛行率。(A)以ELISA測定健康捐贈者及原位性、侵犯性及轉移性癌症病人之血清CAS蛋白之盛行率。#轉移性癌症組與原位性癌症組間具顯著差異(P <0.01)。(B)轉移性癌症類型及於轉移性癌症偵測到之血清CAS蛋白比率。每種癌症之血清CAS蛋白陽性病例數對每種轉移性癌症之總數顯示於結果中。

圖9顯示CAS蛋白於轉移性結腸直腸癌組織之腺腔呈陽性染色。利用clone 24抗CAS單株抗體以免疫組織化學分析CAS蛋白於轉移性結腸直腸癌組織之分布。CAS蛋白於轉移性結腸直腸癌組織之基質(箭頭處)及腺腔(箭號處)呈陽性染色。比例尺代表50μm。

圖10顯示利用clone 24抗CAS單株抗體對收集自培養於不含胎牛血清之培養基的B16-F10黑色素瘤細胞的培養液，及收集自轉移性結腸直腸癌病人之血清檢體，進行免疫墨點分析之結果。以B16-F10細胞全細胞蛋白產物作為對照組。可於轉移性癌症病人之血清，及培養於不含胎牛血清之培養基的B16-F10黑色素瘤細胞的培養液中偵測到分泌性CAS蛋白。上述免疫墨點分析重複3次並得到相似結果，本結果顯示代表性免疫墨點。

(無元件符號說明)

Claims (13)

1. 一種活體外偵測哺乳動物癌轉移之方法，該方法包含：以免疫結合試驗測量取得自哺乳動物體液中之分泌型細胞凋亡易感蛋白(the cellular apoptosis susceptibility；CAS/CSE1L)蛋白或分泌型CAS/CSE1L多肽含量，以篩選或診斷轉移性癌症；其中當體液中之分泌型CAS/CSE1L蛋白含量或分泌型CAS/CSE1L多肽含量較未罹患癌症個體體液中或罹患非轉移性癌症病人體液中之分泌型CAS/CSE1L蛋白含量或分泌型CAS/CSE1L多肽含量增加時，則診斷為轉移性癌症。
2. 如請求項1之方法，其中該哺乳動物為人類。
3. 如請求項1之方法，其中該測量係檢測分泌型CAS/CSE1L蛋白含量。
4. 如請求項1之方法，其中該免疫結合試驗為ELISA。
5. 如請求項1之方法，其中該免疫結合試驗為免疫墨點法。
6. 如請求項1之方法，其中該免疫結合試驗為流式細胞分析。
7. 如請求項1之方法，其中該體液為血清、尿液、腹水、肋膜積液、唾液、淋巴液或糞便。
8. 如請求項7之方法，其中該體液為血清或尿液。
9. 如請求項1之方法，其中該轉移性癌症為大腸直腸癌、下咽癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、唇癌或膽管癌之轉 移。
10. 如請求項1之方法，其中當體液中之分泌型CAS/CSE1L蛋白含量或分泌型CAS/CSE1L多肽含量較未罹患癌症個體體液中之分泌型CAS/CSE1L蛋白含量或分泌型CAS/CSE1L多肽含量增加時，則診斷為轉移性癌症。
11. 如請求項1之方法，其中當體液中之分泌型CAS/CSE1L蛋白含量或分泌型CAS/CSE1L多肽含量較罹患非轉移性癌症病人體液中之分泌型CAS/CSE1L蛋白含量或分泌型CAS/CSE1L多肽含量增加時，則診斷為轉移性癌症。
12. 一種藉由測量哺乳動物體液中分泌型CAS/CSE1L蛋白含量或分泌型CAS/CSE1L多肽含量以檢測癌轉移之套組，其包含：CAS/CSE1L專一性抗體；檢測試劑、緩衝液、CAS/CSE1L專一性抗體或可與CAS/CSE1L蛋白或CAS/CSE1L多肽結合且可顯示體液中CAS/CSE1L蛋白或CAS/CSE1L多肽含量之化學藥品、多肽及其他分子；及指示該套組使用方法之指示性資料。
13. 如請求項12之套組，其中該哺乳動物為人類。