JP2007291140A - 癌診断用抗体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 EphA2の細胞内エピトープに特異的に結合する抗体の製法であって、(a)チロシン・リン酸化タンパク質を哺乳動物のリンパ節近位に注射し、(b)リンパ節細胞を上記哺乳動物から採取し、(c)リンパ節細胞をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマを形成し、(d)EphA2の細胞内エピトープに結合する抗体を産生する少なくとも1つのハイブリドーマを選び、そして(e)抗体を単離するステップを含む、EphA2の細胞内エピトープに特異的に結合する抗体の製法。
【選択図】なし
Description
本発明は、転移性疾患の診断に関する。より特に、本願発明は、転移性癌細胞内に過剰発現される特異的な上皮細胞チロシン・キナーゼを検出しうる試薬に関する。最も特に、本願発明は、上皮細胞チロシン・キナーゼに結合する試薬、及び癌診断へのそれら試薬の使用に関する。
癌細胞の転移は、1)原発腫瘍から分離し、2)局所組織中を遊走及び浸潤し、3)(リンパ液又は血液を介して)体内の遠位に場所を移し、4)異質な部位にコロニー形成し、そして5)この異質な環境の中で増幅及び生き残る細胞の能力を必要とする。これらの性質の全てが細胞接着に関係している。細胞接着は、細胞とその微小環境との物理的相互作用を制御する。細胞接着は、腫瘍細胞の増殖、死、及び分化を命令するシグナルをも惹起する。
Lindberg, R.A. and Hunter, T.,"cDNA Cloning and Characterization of Eck, an Epithelial Cell Receptor Protein-tyrosine Kinase in the Eph/elk Family of Protein Kinases", Mol.Cell.Biol. 10 (12), 6316-6324 (1990)
EphA2に特異的な抗体は、改良された方法により単離される。利用された方法は、応答性ハイブリドーマの増加された感受性及び多様性を意図する。この方法により、Ras形質転換ヒト上皮細胞からのチロシン・リン酸化タンパク質がリン酸化チロシン特異性を示す抗体を用いたアフィニティー・クロマトグラフィーにより単離される。そのチロシン・リン酸化タンパク質は、次にモノクローナル抗体製造のための抗原として使用される。低用量のチロシン・リン酸化タンパク質を、1日おきに10日間にわたりリンパ節近位に注射する(RIMMS法)。はれたリンパ節からのB細胞をその後単離し、そしてBcl−2過剰発現ミエローマと融合し、融合後のアポト−シスを最小限に抑える。この方法は、多様性、特異性、及びハイブリドーマ製造の費用効率の増加をもたらす。前記ハイブリドーマは、通常の癌細胞と悪性の癌細胞を区別しうる抗体を産生するハイブリドーマを同定するためにまずスクリーニングされる。現在まで、少なくとも450株の上述のハイブリドーマが同定されている。
D7ハイブリドーマにより産生された抗体を、正常な前立腺上皮細胞と転移性細胞の間のEphA2の差異のある発現を検出するために使用した。図1は、さまざまなヒト前立腺細胞株におけるEphA2発現を示す。まず図1Aに触れると、3つの転移性細胞株、LNCAP,DU145、及びPC3をEphA2発現のレベルについて試験する。これら3つの細胞株について、LNCAPは侵襲性が最も少なく、DU145はいくらかより侵襲性であり、そしてPC3は最も侵襲性である。EphA2発現を、D7抗体によるウエスタン・ブロッティングによって測定する。図1Aで理解されうるように、EphA2発現は、侵襲性と確かに相関する。
EphA2抗体を、転移性乳房細胞における変更されたEphA2発現を検出するために使用する。EphA2は正常乳房上皮細胞において発現される。図2は、乳癌細胞株における変更されたEphA2発現を説明する。図2で理解されるように、D7抗体を用いた全細胞溶解物からのウエスタン・ブロットは、非転移性乳房腫瘍から得られた細胞(ZR75−1,BT474,SKBR3)においてEphA2発現が全く存在しないことを明らかにする。それに反して、EphA2は、転移性乳癌細胞株(MDA−MB−435,MDA−MB−231)において過剰発現されている。したがってEphA2抗体は、転移性の診断に使用されうるところの、乳癌細胞における変更されたEphA2発現を検出する。さらに非転移性乳房上皮細胞において、EphA2の欠損が疾患の早期に発生し、そのため、たとえ他の知られたマーカーが正常状態を維持するときでも、EphA2特異性抗体による検査は、侵襲性に関係のある情報を提供する。したがって、D7抗体は、たとえ疾患の早期段階であっても、診断薬として有効である。
他の抗体と組合わせた状態でEphA2抗体は、EphA2発現におけるさらなる変化の検出に使用される。実施例2において先に述べたとおり、D7を用いたウエスタン・ブロットは、非転移性腫瘍がEphA2の発現を欠き、そして転移性細胞がEphA2を過剰発現していることにより、非転移性と転移性腫瘍を識別しうる。しかしながら、チロシン・リン酸化を調べると、異なる結果が見出された。リン酸化チロシン特異的抗体を用いることで、EphA2は正常細胞においてリン酸化されているが、しかし転移性細胞ではリン酸化されていないことが発見された。したがって、EphA2特異的抗体は、転移性と非転移性乳房腫瘍細胞の差異を質的に検出できるのに対して、EphA2特異的抗体及びリン酸化チロシン特異的抗体の両方を組込んだ診断薬は、正常、非転移性、及び転移性乳房細胞を識別するための高感度の検査を提供する。
免疫蛍光標識されたEphA2特異的抗体は、形質転換細胞におけるEphA2発現の再分布を検出する。この実施例で使用したEphA2特異的抗体は、B2D6として知られる細胞株により産生され、そしてこれらの抗体は、EphA2の細胞外エピトープに特異的である。図3Aで見られるように、B2D6による免疫蛍光発光は、EphA2が正常細胞において細胞−細胞接触部位に見出されることを証明する。しかしながら、図3Bに示される形質転換細胞においては、EphA2は、再分布されている。さらに、転移性細胞におけるEphA2は、膜のひだに見出される。同様に正常な前立腺上皮細胞において、EphA2は細胞接着部位に見出されるが、しかし転移性前立腺上皮細胞において、EphA2は、過剰発現され、そしてその発現は拡散性に分布している。したがって、EphA2特異的抗体を用いた免疫蛍光発光は、形質転換及び腫瘍細胞の転移の状態を診断するためのさらなる方法を提供する。
Claims (9)
- ハイブリドーマ細胞株D7。
- 単離されたハイブリドーマ細胞株D7。
- ハイブリドーマ細胞株D7によって産生されたモノクローナル抗体。
- ハイブリドーマ細胞株D7によって産生された、単離されたモノクローナル抗体。
- EphA2の細胞内エピトープに特異的に結合する抗体の製法であって、以下の
(a)チロシン・リン酸化タンパク質を哺乳動物のリンパ節近位に注射し、
(b)リンパ節細胞を上記哺乳動物から採取し、
(c)リンパ節細胞をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマを形成し、
(d)EphA2の細胞内エピトープに結合する抗体を産生する少なくとも1つのハイブリドーマを選び、そして
(e)抗体を単離する、
ステップを含む上記製法。 - 前記抗体が、モノクローナル抗体D7によっても認識される抗原を認識する、請求項5に記載の方法。
- 前記チロシン・リン酸化タンパク質がEphA2を含む、請求項5又は6に記載の方法。
- ミエローマ細胞がBcl-2を過剰発現している、請求項5〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項5〜8のいずれか1項に記載の方法により作製された抗体。
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