JP2003507023A - 癌診断用抗体 - Google Patents

癌診断用抗体

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Abstract

(57)【要約】 転移性疾患の検出及び診断のための方法及びキットを提供する。より特に、前記方法及びキットは、転移性腫瘍細胞において過剰発現されるところの上皮細胞特有のチロシン・キナーゼであるＥｐｈＡ２を検出しうる混合物を使用する。１の態様において、前記混合物は、ＥｐｈＡ２のエピトープに結合可能な抗体である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明の分野 本発明は、転移性疾患の診断に関する。より特に、本願発明は、転移性癌細胞
内に過剰発現される特異的な上皮細胞チロシン・キナーゼを検出しうる試薬に関
する。最も特に、本願発明は、上皮細胞チロシン・キナーゼの細胞内エピトープ
に結合する試薬、及び癌診断へのそれら試薬の使用に関する。
【０００２】 本発明の背景及び概要 癌細胞の転移は、１）原発腫瘍から分離し、２）局所組織中を遊走及び浸潤し
、３）（リンパ液又は血液を介して）体内の遠位に場所を移し、４）異質な部位
にコロニー形成し、そして５）この異質な環境の中で増幅及び生き残る細胞の能
力を必要とする。これらの性質の全てが細胞接着に関係している。細胞接着は、
細胞とその微小環境との物理的相互作用を制御する。細胞接着は、腫瘍細胞の増
殖、死、及び分化を命令するシグナルをも惹起する。
【０００３】 乳癌細胞を含む、さまざまな癌細胞は、変更された細胞接着を示すことが知ら
れている。正常乳房上皮と比較した時、形質転換ヒト乳房上皮細胞は、細胞−細
胞接触が減少し、そして周囲の細胞外マトリックスとの相互作用が増加した。こ
れらの変化は、細胞コロニーを離れた癌細胞の分離及び遊走の増加を促進し、そ
してそれは細胞膜タンパク質のチロシン・リン酸化における変化に直接関係して
いる。チロシン・リン酸化は、細胞シグナル伝達に有効な形態であり、そしてチ
ロシン・リン酸化のレベルの変化は腫瘍細胞の侵襲力にとって重要であると考え
られている。したがって、チロシン・リン酸化の制御は、転移性癌に対する治療
処置に関する前途有望な標的を提示する。チロシン・リン酸化は、細胞膜チロシ
ン・キナーゼにより制御され、そしてチロシン・キナーゼの発現増加は転移性癌
細胞において発生することが知られている。
【０００４】 細胞膜チロシン・キナーゼ発現増加の同定は、転移性疾患の診断及び治療の助
けとなるであろう。上述のチロシン・キナーゼの１つがＥｐｈＡ２である。エフ
リン（Ｅｐｈｒｉｎｓ）として知られるチロシン・キナーゼのＥｐｈファミリー
の仲間であるＥｐｈＡ２は、膜結合リガンドをもつ膜貫通受容体チロシン・キナ
ーゼである。１０年前にクローンされたが、（Lindberg, R.A. and Hunter, T.,
“cDNA Cloning and Characterization of Eck, an Epithelial Cell Receptor
Protein-tyrosine Kinase in the Eph/elk Family of Protein Kinases”, Mol.
Cell.Biol. 10 (12), 6316-6324 (1990)を参照のこと）ＥｐｈＡ２の機能につい
てごくわずかしか知られていない、なぜなら主としてＥｐｈＡ２特異的抗体が以
前は製造することが困難であったからである。
【０００５】 ＥｐｈＡ２研究を容易にするために、チロシン・リン酸化したタンパク質に特
異的なモノクローナル抗体の一団を製造する改良された方法が発達した。この方
法の使用により、ＥｐｈＡ２の多様性を認識するモノクローナル抗体が作製され
た。これらの抗体は、ＥｐｈＡ２が転移性乳房、肺、大腸、及び前立腺細胞にお
いて過剰発現されることを示すために用いられた。なぜならＥｐｈＡ２が、正常
細胞と転移性細胞では異って発現されるため、ＥｐｈＡ２特異的抗体は、転移性
疾患の診断に有効だからである。抗体は、ＥｐｈＡ２の細胞内エピトープを認識
する１の特定のハイブリドーマより製造され、そしてＥｐｈＡ２に対する結合に
おいて高い特異性を示した。
【０００６】 したがって、本願発明の１の側面は、ＥｐｈＡ２の細胞内エピトープに特異的
に結合するところの化合物である。好ましい態様において、前記化合物は、Ｅｐ
ｈＡ２タンパク質ドメインに特異的な抗体である。他方において、ＥｐｈＡ２を
特異的に標的化しうる天然又は人工的なリガンド、ペプチド、アンチセンス、Ａ
ＴＰ類似物、若しくは他の低分子が利用されうる。本願発明の２の側面は、Ｅｐ
ｈＡ２細胞内エピトープを認識するところの抗体の製法である。本願発明の他の
側面は、転移性疾患の診断におけるＥｐｈＡ２特異的抗体の使用である。本願発
明の付加的な側面は、ＥｐｈＡ２、その断片のいずれか又はＥｐｈＡ２タンパク
質をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡを検出するための特異的な診断用試薬であ
る。本願発明のさらなる側面は、ＥｐｈＡ２のエピトープに特異的に結合しうる
抗体及び抗体−ＥｐｈＡ２結合を検出するための手段を含むキットである。
【０００７】 本発明のさらなる特徴は、目下わかっているところの本発明実施のベスト・モ
ードを具体化する以下の好ましい態様の詳細な記載を考慮して、当業者に対して
明らかにされるであろう。
【０００８】 発明の詳細な記載 ＥｐｈＡ２に特異的な抗体は、改良された方法により単離される。利用された
方法は、応答性ハイブリドーマの増加された感受性及び多様性を意図する。この
方法により、Ｒａｓ形質転換ヒト上皮細胞からのチロシン・リン酸化タンパク質
がリン酸化チロシン特異性を示す抗体を用いたアフィニティー・クロマトグラフ
ィーにより単離される。そのチロシン・リン酸化タンパク質は、次にモノクロー
ナル抗体製造のための抗原として使用される。低用量のチロシン・リン酸化タン
パク質を、１日おきに１０日間にわたりリンパ節近位に注射する（ＲＩＭＭＳ法
）。はれたリンパ節からのＢ細胞をその後単離し、そしてＢｃｌ−２過剰発現ミ
エローマと融合し、融合後のアポト−シスを最小限に抑える。この方法は、多様
性、特異性、及びハイブリドーマ製造の費用効率の増加をもたらす。前記ハイブ
リドーマは、通常の癌細胞と悪性の癌細胞を区別しうる抗体を産生するハイブリ
ドーマを同定するためにまずスクリーニングされる。現在まで、少なくとも４５
０株の上述のハイブリドーマが同定されている。
【０００９】 ＥｐｈＡ２に特異的なハイブリドーマが選ばれる。ＲＩＭＭＳ法の使用は、Ｅ
ｐｈＡ２に特異的に結合するさまざまなモノクローナル抗体の製造をもたらす。
特徴づけされた最初の４つのハイブリドーマのうち、２つがＥｐｈＡ２上の独立
するエピトープを認識する。１つ目のＤ７は、細胞内エピトープを認識する。２
つ目のＢ２Ｄ６は、細胞外エピトープに結合する。Ｄ７が、ＥｐｈＡ２の細胞内
エピトープに高度に特異的であることを証明し、そしてこの特異性は転移性腫瘍
の診断に最新の基礎の多くを提供する。
【００１０】 特定のタンパク質の存在又は過剰発現を検出するために抗体を使用することは
本技術分野で知られる。転移性細胞においてＥｐｈＡ２が過剰発現されるので、
本発明のＥｐｈＡ２特異性抗体を、この過剰発現の検出に使用し、そして、それ
により転移性疾患を検出しうる。上述の技術は、これだけに制限されることなく
、ウエスタン・ブロッティング、ドット・ブロッティング、沈殿、凝集、ＥＬＩ
ＳＡアッセイ、免疫組織化学、インサイチュー・ハイブリダイゼーション、さま
ざまな組織又は体液におけるフロー・サイトメトリー、及びさまざまなサンドイ
ッチ・アッセイを含む。これらの技術は、本技術分野で周知である。例えば米国
特許第５，８７６，９４９号（本明細書に援用）を参照のこと。ＥｐｈＡ２の細
胞内エピトープに特異的な抗体を使用したとき、細胞を、溶解し、そしてその抗
体と一緒にインキュベートする必要がある。上述の技術は全細胞溶解物又は例え
ば免疫沈殿により試験するために分離されるＥｐｈＡ２において行われうる。本
願発明のＤ７抗体は、ＥｐｈＡ２の細胞内エピトープについて高度に特異的であ
り、そして転移性細胞におけるＥｐｈＡ２の特異な発現に感受性であることを証
明した。他の技術、例えば免疫組織学的染色は、細胞全体を必要とし、そして特
定の細胞密度の細胞層をさらに必要とする。上述の試験は、ＥｐｈＡ２の細胞外
エピトープに特異的な抗体を必要とする。
【００１１】 本願発明の抗体は、広くさまざまな組織サンプルにおいて転移性疾患を検出す
るために使用されうる。例えばＥｐｈＡ２特異的抗体を用いた調査は乳房、腎臓
、前立腺、肺、及び大腸において生じる変更されたＥｐｈＡ２発現を明らかにし
、そして変更されたＥｐｈＡ２発現が他の種類の細胞転移、特に上皮悪性腫瘍に
おいて生じると考えられている。ＥｐｈＡ２特異的抗体は、生検により採取され
た腫瘍組織における転移の検出に使用されうる。さまざまな体液のサンプル、例
えば血液、血漿、髄液、唾液、及び尿も本発明の抗体により検査されうる。これ
らのサンプル中の変更されたＥｐｈＡ２発現は、転移性疾患の存在を示す。
【００１２】 さらに、他の抗体が、転移性疾患の状態についてさらなる情報を提供するため
に本発明の抗体と取り合わせて使用されうる。例えば転移性細胞のＥｐｈＡ２は
、変更されたチロシン・リン酸化を示す。正常な乳房上皮細胞においてＥｐｈＡ
２は発現され、そしてチロシン・リン酸化されている。しかしながら、転移性乳
房上皮細胞においてＥｐｈＡ２は、過剰発現され、そしてそのＥｐｈＡ２はチロ
シン・リン酸化されていない。ＥｐｈＡ２発現を定量化する検査はしばしばあい
まいな結果を導くために、ＥｐｈＡ２発現の規模と同様にチロシン・リン酸化を
測定することが望ましい。要するに、本願発明の抗体をリン酸化チロシン特異性
抗体と取合わせて用いる診断方法は、転移性疾患の状態を決定するためのデータ
を提供する。
【００１３】 その上、本願発明のＥｐｈＡ２特異性抗体は、転移と関連するＥｐｈＡ２局在
性の変化を検出するために利用されうる。正常な乳房及び前立腺上皮細胞におい
てＥｐｈＡ２は、細胞接着部位に濃縮される。逆に転移性前立腺細胞においてＥ
ｐｈＡ２は、拡散性に分布し、そして転移性乳癌細胞においてＥｐｈＡ２は、膜
のひだに再分布する。一連の処理方法、例えば免疫組織学的染色又は免疫蛍光顕
微鏡検査は、本技術分野で周知であり、そしてＥｐｈＡ２分布を視覚化するため
に使用されうる。例えば米国特許第５，５１４，５５４号（本明細書に援用）を
参照のこと。ＥｐｈＡ２発現は、ＥｐｈＡ２全体又はＥｐｈＡ２タンパク質の断
片を検出しうる抗体を使用することにより検出されうる。変更されたＥｐｈＡ２
発現の他の検出方法は、ＥｐｈＡ２タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配
列の検出を含む。
【００１４】 ＥｐｈＡ２の過剰発現又は変更された分布を検出するために、ＥｐｈＡ２特異
的抗体は、たくさんの知られた検出可能な標識、すなわち本願技術分野で知られ
るような蛍光、放射性又は酵素物質のいずれかにより、共有結合的又は非共有結
合的に標識されうる。あるいは、本願発明の抗体に特異的な２次抗体が、知られ
た検出可能な標識により標識され、そして前記技術においてＥｐｈＡ２特異的抗
体を検出するために使用される。
【００１５】 好ましい標識はクロモゲン色素を含む。最も一般的に使用されているものは、
３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）及び３，３′−ジアミノベンジ
ジン・テトラヒドロクロライド（ＤＡＢ）である。これらは光学顕微鏡検査を用
いて検出されうる。さらに好ましくは蛍光標識である。最も一般的に使用されて
いる蛍光標識化合物は、フルオレッセイン・イソチオシアネート、ローダミン、
フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒ
ド、及びフルオレスカミンである。化学発光及び生物発光化合物、例えばルミノ
ール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウム・エステル（ｔｈｅｒｏ
ｍａｔｉｃ ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニ
ウム塩、シュウ酸エステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びエクオリンも
使用されうる。蛍光標識抗体が適切な波長の光に晒されるとき、その存在は蛍光
により検出されうる。さらに好ましくは放射性標識である。本発明の抗体の標識
に特に有用な放射性同位体は、 3Ｈ， 125Ｉ， 131Ｉ，35Ｓ，32Ｐ、及び14Ｃを
含む。放射性同位体はガンマ・カウンター、シンチレーション・カウンター又は
オートラジオグラフィーを用いるような方法により検出されうる。
【００１６】 抗体を検出できるように標識しうる他の方法は、抗体を酵素に連結し、引き続
いてその抗体を酵素免疫測定法（ＥＩＡ）又は酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ
）に使用することによる。その酵素は、次にその基質に触れたとき、その基質と
反応し、そして、例えば分光光度的、蛍光光度的又は視覚的方法により検出され
うる化学成分を生じる。抗体を検出可能な状態に標識するために使用されうる酵
素は、これだけに制限されることなく、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌
ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイド・イソメラーゼ、酵母アルコール・デヒ
ドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオース・リン
酸イソメラーゼ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリ・ホスファ
ターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース・オキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダ
ーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼを含む。
抗体を標識及び検出する他の方法は、本技術分野で知られ、そして本願発明の範
囲の中にある。
【００１７】 実施例１ Ｄ７ハイブリドーマにより産生された抗体を、正常な前立腺上皮細胞と転移性
細胞の間のＥｐｈＡ２の差異のある発現を検出するために使用した。図１は、さ
まざまなヒト前立腺細胞株におけるＥｐｈＡ２発現を示す。まず図１Ａに触れる
と、３つの転移性細胞株、ＬＮＣＡＰ，ＤＵ１４５、及びＰＣ３をＥｐｈＡ２発
現のレベルについて試験する。これら３つの細胞株について、ＬＮＣＡＰは侵襲
性が最も少なく、ＤＵ１４５はいくらかより侵襲性であり、そしてＰＣ３は最も
侵襲性である。ＥｐｈＡ２発現を、Ｄ７抗体によるウエスタン・ブロッティング
によって測定する。図１Ａで理解されうるように、ＥｐｈＡ２発現は、侵襲性と
確かに相関する。
【００１８】 図１Ｂにおいて、Ｄ７抗体を、形質転換細胞における発現との比較として、正
常ＭＬＣ細胞におけるＥｐｈＡ２発現の試験に使用する。正常ＭＬＣ細胞、Ｋ−
Ｒａｓにより形質転換されたＭＬＣ細胞、及びＸ線照射により形質転換されたＭ
ＬＣ細胞を試験した。図１Ｂで理解されうるように、ＥｐｈＡ２は、両形質転換
細胞株において過剰発現されている。図１Ｃは、正常細胞が２６７Ｂ１であるこ
とを除いて、図１Ｂに類似した結果を示す。図１Ｂと同様に、図１Ｃは、Ｅｐｈ
Ａ２は形質転換細胞において過剰発現されていることを示す。つまり図１は、Ｅ
ｐｈＡ２特異的抗体が転移性細胞における変化を検出し、そしてそれらの抗体を
用いた試験が転移の侵襲性のレベルを示すことを証明する。
【００１９】 実施例２ ＥｐｈＡ２抗体を、転移性乳房細胞における変更されたＥｐｈＡ２発現を検出
するために使用する。ＥｐｈＡ２は正常乳房上皮細胞において発現される。図２
は、乳癌細胞株における変更されたＥｐｈＡ２発現を説明する。図２で理解され
るように、Ｄ７抗体を用いた全細胞溶解物からのウエスタン・ブロットは、非転
移性乳房腫瘍から得られた細胞（ＺＲ７５−１，ＢＴ４７４，ＳＫＢＲ３）にお
いてＥｐｈＡ２発現が全く存在しないことを明らかにする。それに反して、Ｅｐ
ｈＡ２は、転移性乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５，ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）
において過剰発現されている。したがってＥｐｈＡ２抗体は、転移性の診断に使
用されうるところの、乳癌細胞における変更されたＥｐｈＡ２発現を検出する。
さらに非転移性乳房上皮細胞において、ＥｐｈＡ２の欠損が疾患の早期に発生し
、そのため、たとえ他の知られたマーカーが正常状態を維持するときでも、Ｅｐ
ｈＡ２特異性抗体による検査は、侵襲性に関係のある情報を提供する。したがっ
て、Ｄ７抗体は、たとえ疾患の早期段階であっても、診断薬として有効である。
【００２０】 実施例３ 他の抗体と組合わせた状態でＥｐｈＡ２抗体は、ＥｐｈＡ２発現におけるさら
なる変化の検出に使用される。実施例２において先に述べたとおり、Ｄ７を用い
たウエスタン・ブロットは、非転移性腫瘍がＥｐｈＡ２の発現を欠き、そして転
移性細胞がＥｐｈＡ２を過剰発現していることにより、非転移性と転移性腫瘍を
識別しうる。しかしながら、チロシン・リン酸化を調べると、異なる結果が見出
された。リン酸化チロシン特異的抗体を用いることで、ＥｐｈＡ２は正常細胞に
おいてリン酸化されているが、しかし転移性細胞ではリン酸化されていないこと
が発見された。したがって、ＥｐｈＡ２特異的抗体は、転移性と非転移性乳房腫
瘍細胞の差異を質的に検出できるのに対して、ＥｐｈＡ２特異的抗体及びリン酸
化チロシン特異的抗体の両方を組込んだ診断薬は、正常、非転移性、及び転移性
乳房細胞を識別するための高感度の検査を提供する。
【００２１】 実施例４ 免疫蛍光標識されたＥｐｈＡ２特異的抗体は、形質転換細胞におけるＥｐｈＡ
２発現の再分布を検出する。この実施例で使用したＥｐｈＡ２特異的抗体は、Ｂ
２Ｄ６として知られる細胞株により産生され、そしてこれらの抗体は、ＥｐｈＡ
２の細胞外エピトープに特異的である。図３Ａで見られるように、Ｂ２Ｄ６によ
る免疫蛍光発光は、ＥｐｈＡ２が正常細胞において細胞−細胞接触部位に見出さ
れることを証明する。しかしながら、図３Ｂに示される形質転換細胞においては
、ＥｐｈＡ２は、再分布されている。さらに、転移性細胞におけるＥｐｈＡ２は
、膜のひだに見出される。同様に正常な前立腺上皮細胞において、ＥｐｈＡ２は
細胞接着部位に見出されるが、しかし転移性前立腺上皮細胞において、ＥｐｈＡ
２は、過剰発現され、そしてその発現は拡散性に分布している。したがって、Ｅ
ｐｈＡ２特異的抗体を用いた免疫蛍光発光は、形質転換及び腫瘍細胞の転移の状
態を診断するためのさらなる方法を提供する。
【００２２】 図１〜４に示すとおり、転移性細胞におけるＥｐｈＡ２の過剰発現、再分布、
及びリン酸化は、ＥｐｈＡ２特異的抗体を用いた、転移性腫瘍の診断のためのさ
まざまな基礎を提供する。免疫組織化学又はウエスタン・ブロッティングは、患
者の乳房組織、前立腺組織又は他の腫瘍からの組織の生検サンプルにおけるＥｐ
ｈＡ２発現の変化を観察するために使用されうる。さらに、Ｄ７及び他のＥｐｈ
Ａ２特異的抗体は、転移性の徴候であろうところの、ＥｐｈＡ２の変更された発
現を検出するために血漿、尿、及び他の体液の検討に使用されうる。ＥｐｈＡ２
発現の変化に関係する情報と組合わせて、ＥｐｈＡ２の変更されたチロシン・リ
ン酸化の検出は、転移性疾患の診断をさらに助ける。
【００２３】 本発明は、好ましい態様、バリエーション及び変更に対する言及について詳細
に記載されているが、それらは先の請求項に記載され、そして定められた本発明
の範囲及び本質の中に存在する。
【００２４】
【表１】
【００２５】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 図１Ａ〜Ｃは、ヒト前立腺細胞から得られた細胞株におけるＥｐｈＡ２発現を
示す一連のウエスタン・ブロットを示し；図１Ａは、さまざまなヒト前立腺癌細
胞株におけるＥｐｈＡ２発現を示すウエスタン・ブロットである。
【図１Ｂ】 図１Ａ〜Ｃは、ヒト前立腺細胞から得られた細胞株におけるＥｐｈＡ２発現を
示す一連のウエスタン・ブロットを示し；図１Ｂは、ヒト前立腺上皮細胞株ＭＬ
ＣにおけるＥｐｈＡ２発現及び癌遺伝子Ｋ−Ｒａｓ又はＸ線照射による形質転換
後の上記細胞株におけるＥｐｈＡ２発現を示すウエスタン・ブロットである。
【図１Ｃ】 図１Ａ〜Ｃは、ヒト前立腺細胞から得られた細胞株におけるＥｐｈＡ２発現を
示す一連のウエスタン・ブロットを示し；図１Ｃは、ヒト前立腺上皮細胞株２６
７Ｂ１における発現及び癌遺伝子Ｋ−Ｒａｓ又はＸ線照射による形質転換後の上
記細胞株における発現を示すことを除いて、図１Ｂと類似している。
【図２】 図２は、さまざまなヒト乳房上皮細胞株におけるＥｐｈＡ２の発現を示すウエ
スタン・ブロットである。
【図３Ａ】 図３Ａ及びＢは、免疫蛍光発光の顕微鏡検査により観察された、さまざまな乳
房上皮細胞株の細胞膜におけるＥｐｈＡ２の局在を示し；図３Ａは、正常なＭＣ
Ｆ−１０Ａ細胞の細胞接着部位におけるＥｐｈＡ２の局在を示す。
【図３Ｂ】 図３Ａ及びＢは、免疫蛍光発光の顕微鏡検査により観察された、さまざまな乳
房上皮細胞株の細胞膜におけるＥｐｈＡ２の局在を示し；図３Ｂは、悪性細胞に
おけるＥｐｈＡ２の再分布を示す。
【手続補正書】特許協力条約第１９条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年４月１２日（２００１．４．１２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ Ｄ // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 グラクソ グループ リミテッド ＧＬＡＸＯ ＧＲＯＵＰ ＬＩＭＩＴＥＤ イギリス ミドルセックス ユービー６ ０エヌエヌ グリーンフォード バークレ ー アベニュー グラクソ ウェルカム ハウス （番地なし) Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓ ｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇ ｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａ ｉｎ (71)出願人 ザ ユニバーシティ オブ ノース カロ ライナ アット チャペル ヒル ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ Ｎ ＯＲＴＨ ＣＡＲＯＬＩＮＡ ＡＴ ＣＨ ＡＰＥＬ ＨＩＬＬ アメリカ合衆国27599−4105 ノース・カ ロライナ州、チャペル・ヒル、バイナム・ ホール308番 シービー・ナンバー4105 (72)発明者 キンチ，マイケル スコット アメリカ合衆国，インディアナ 47905， ラファイエット，フラワリング クラブ ドライブ 2320 (72)発明者 ザンテク，ニコル ドッジ アメリカ合衆国，メリーランド 20904， シルバー スプリング，コルゲイト ウェ イ 13632，ナンバー 744 (72)発明者 キルパトリック，キャサリン イー． アメリカ合衆国，ノースカロライナ 27516，チャペル ヒル，ローレル スプ リングス ドライブ 9204 Ｆターム(参考） 2G054 AA08 AB10 EA03 4B024 AA12 BA61 CA01 CA11 GA05 HA14 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ96 QR07 QR32 QR35 QS33 QX02 QX07 4H045 AA11 AA20 AA30 CA40 DA75 EA51 FA72 【要約の続き】

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 細胞集団内の転移性細胞の存在の検出方法であって、以下の
    ： 上記細胞集団の少なくとも一部を溶解し、 上記溶解した細胞を、ＥｐｈＡ２のエピトープに特異的に結合しうる試薬とイ
    ンキュベートして、抗体を上記エピトープに結合させ、そして 試薬−エピトープ結合を検出する、 ステップを含む上記検出方法。
  2. 【請求項２】 前記試薬が抗体である、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記ＥｐｈＡ２のエピトープがＥｐｈＡ２の細胞内エピトー
    プである、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記抗体がハイブリドーマ細胞株Ｄ７により産生される、請
    求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記抗体を検出可能な標識により標識し、かつ、前記検出ス
    テップがその標識の検出を含む、請求項２に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記抗体を蛍光標識により標識し、かつ、前記検出ステップ
    がその蛍光標識の検出を含む、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記抗体を放射性標識により標識し、かつ、前記検出ステッ
    プがその放射性標識の検出を含む、請求項５に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記細胞集団が乳房又は前立腺組織生検からの細胞を含む、
    請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記細胞集団が血液、血漿、髄液、唾液、及び尿から成る群
    から選ばれる体液から採取される、請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記検出ステップがＥＬＩＳＡアッセイ及びフロー・サイ
    トメトリーから成る群から選ばれる診断法を含む、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記インキュベート及び検出ステップがウエスタン・ブロ
    ッティング方法論を含む、請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 以下の リン酸化チロシン特異性を有する２次抗体を準備し、そして その２次抗体によりウエスタン・ブロッティングする、 ステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記転移性細胞が乳癌、前立腺癌、肺癌、及び大腸癌から
    成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 ＥｐｈＡ２の細胞内エピトープに特異的に結合する抗体の
    製法であって、以下の チロシン・リン酸化タンパク質を哺乳動物のリンパ節内に注射し、 リンパ節細胞を上記哺乳動物から採取し、 リンパ節細胞をミエローマ細胞と融合させて、ハイブリドーマを形成し、 ＥｐｈＡ２の細胞内エピトープに結合する抗体を産生する少なくとも１のハイ
    ブリドーマを選び、そして その抗体を単離する、 ステップを含む上記製法。
  15. 【請求項１５】 前記抗体が、モノクローナル抗体Ｄ７によっても認識され
    る抗原を認識する、請求項１４に記載の製法。
  16. 【請求項１６】 前記チロシン・リン酸化タンパク質がＥｐｈＡ２である、
    請求項１４に記載の製法。
  17. 【請求項１７】 請求項１４の方法により作製された抗体。
  18. 【請求項１８】 ＥｐｈＡ２の細胞内エピトープに特異的に結合する抗体。
  19. 【請求項１９】 検出可能な標識に結合した、請求項１８に記載の抗体。
  20. 【請求項２０】 ハイブリドーマ細胞株Ｄ７により産生される、請求項１９
    に記載の抗体。
  21. 【請求項２１】 細胞集団内の転移性細胞の存在の検出方法であって、以下
    の 上記細胞を、ＥｐｈＡ２発現に関連した化合物に特異的に結合しうる試薬とイ
    ンキュベートし、そして 試薬−化合物結合を検出する、 ステップを含む上記検出方法。
  22. 【請求項２２】 前記試薬が抗体である、請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記化合物がＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ２断片、ＥｐｈＡ２タ
    ンパク質をコードするＤＮＡ、及びＥｐｈＡ２タンパク質をコードするＲＮＡか
    ら成る群から選ばれる、請求項２１に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 細胞をスライド上に固定するステップをさらに含み、かつ
    、検出ステップが免疫蛍光染色を含む、請求項２１に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 細胞集団内の転移性細胞の存在の検出キットであって、以
    下の ＥｐｈＡ２のエピトープに特異的に結合しうる抗体、及び 抗体−エピトープ結合の検出手段、 を含む上記検出キット。
  26. 【請求項２６】 前記抗体−エピトープ結合の検出手段が抗体に結合させた
    標識である、請求項２５に記載のキット。
  27. 【請求項２７】 リン酸化チロシン特異性を有する抗体をさらに含む、請求
    項２５に記載のキット。
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