JP2002522097A

JP2002522097A - ヒト第２０染色体の２０ｑ１３領域における新規アンプリコンおよびその使用

Info

Publication number: JP2002522097A
Application number: JP2000565192A
Authority: JP
Inventors: ドナアルバートソン，; ダニエルピンケル，; コリンコリンズ，; ジョーグレイ，
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1998-08-14
Filing date: 1999-08-12
Publication date: 2002-07-23
Also published as: US6664057B2; EP1112379A4; JP2012249638A; JP5579999B2; CA2339948C; EP1112379A1; JP2009165493A; CA2339948A1; US20020120526A1; WO2000009758A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、癌遺伝学および細胞遺伝学の分野に関する。特に、本発明は、癌に関連する、ヒト第２０染色体上の新規なアンプリコンに関連する核酸配列の同定に関する。より詳細には、本発明は、種々の癌（特に、乳癌）に関連した、約２０ｑ１３．２での増幅の領域における新規な「アンプリコン」またはゲノム核酸の同定に関する。本発明の新規なアンプリコンは、２０ｑ１３．２のこの領域に特異的なプローブとして、ならびに種々の癌の診断および予後のために使用され得る。ヒト核酸を含むサンプル中の本発明の新規なアンプリコンの存在およびコピー数についてスクリーニングするためのキットもまた、提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は、米国特許出願番号（「ＵＳＳＮ」）第０８／６８０，３９５号（１
９９６年７月１５日出願）；およびＵＳＳＮ０８／７３１，４９９号（１９９
６年１０月１６日出願）に関連する。本出願はまた、上記出願の各々をそれら全
体として、かつ全ての目的のために参考として援用する。

【０００２】本発明は、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈに
よって与えられた助成金番号ＮＩＨ／ＮＣＩ５Ｐ５０ＣＡ−５８２０７−０６
の下、米国政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明において特定の権
利を有する。

【０００３】（発明の分野）本発明は、癌遺伝学および細胞遺伝学の分野に関する。特に、本発明は、癌に
関連する、ヒト第２０染色体上の新規なアンプリコンに関連する核酸配列の同定
に関する。より詳細には、本発明は、約２０ｑ１３でのゲノム核酸増幅の領域に
おける、新規な「アンプリコン」の同定に関する。これらの核酸配列は、種々の
癌の診断および予後におけるプローブとして使用され得る。

【０００４】（発明の背景）染色体異常は、しばしば、遺伝障害、変性疾患および癌に関連する。染色体全
体の欠失または増殖、および染色体セグメントまたは特異的領域の欠失あるいは
増幅は、癌における共通の出来事である（Ｓｍｉｔｈ（１９９１）Ｂｒｅａｓｔ
ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１８：Ｓｕｐｐｌ．１：５−１４；ｖａ
ｎｄｅＶｉｊｅｒ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ．１０７２：３３−５０）。実際に、ＤＮＡ配列の増幅および欠失は、癌の原
因であり得る。例えば、プロトオンコジーンおよび腫瘍抑制遺伝子はそれぞれ、
頻繁に腫瘍形成の特徴である（Ｄｕｔｒｉｌｌａｕｘ（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ
Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．４９：２０３−２１７）。明らかに、癌に
関連する特定のゲノム領域の同定およびクローニングは、腫瘍形成の研究に対し
て、ならびに診断および予後のより良好な手段を開発することにおいての、両方
で重要である。

【０００５】比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）を使用する研究は、ヒト乳房腫
瘍において約２０倍増幅されたゲノム領域を明らかにした（Ｍｕｌｅｒｉｓ（１
９９４）ＧｅｎｅｓＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓＣａｎｃｅｒ１０：１６０−
１７０；Ｋａｌｌｉｉｏｎｉｅｍｉ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：２１５６−２１６０；Ｉｓｏｌａ（１９９５）Ａｍ．
Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４７：９０５−９１１）。これらの領域は、腫瘍進行また
は治療に対する応答において役割を果たし得る、優位に作用する遺伝子をコード
することが予測される。これらの増幅された領域のうち３つは、以下の確立され
たオンコジーンに関連した：１７ｑ１２のＥＲＢＢ２、８ｑ２４のＭＹＣならび
に１１ｑ１３のＣＣＮＤ１およびＥＭＳ１。乳癌において、ＥＲＢＢ２およびＣ
ＣＮＤ１／ＥＭＳ１の増幅ならびに過剰発現は、平均与命の減少に関連する（Ｇ
ａｕｄｒａｙ（１９９２）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２７６：３１７−３２８；Ｂｏ
ｒｇ（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ６：１３７−１４３）。ＭＹＣ増幅は、リ
ンパ節関与、進行段階の癌および再発の危険性の増加に関連した（Ｂｏｒｇ（１
９９２）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ５１：６８７−６９１；Ｂｅｒｎｓ
（１９９５）ｇｅｎｅ１５９：１１−１８）。明らかに、乳癌または他の腫瘍
細胞に関連する、さらなる増幅されたゲノム領域の同定は、腫瘍形成の研究に対
して、および癌診断を開発することにおいて重要である。

【０００６】ＣＧＨ研究において見出された増幅された領域のうちの１つは、第２０染色体
、特に、２０ｑ１３上に存在した。２０ｑ１３の増幅は、その後、種々の腫瘍型
において存在すること、および攻撃的な腫瘍挙動に関連することが見出された。
２０ｑ１３コピー数の増加は、乳癌細胞株の４０％および原発性乳房腫瘍の１８
％において見出された（Ｋａｌｌｉｉｏｎｉｅｍｉ（１９９４）前出）。２０ｑ
１３でのコピー数増加はまた、以下の癌の２５％より多くにおいて報告されてい
る：卵巣（Ｉｗａｂｕｃｈｉ（１９９５）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５５：６１７
２−６１８０）、結腸（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ（１９９５）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．
５５：６００２−６００５）、頭部および頸部（Ｂｏｃｋｍｕｈｌ（１９９６）
Ｌａｒｙｎｇｏｒ．７５：４０８−４１４）、脳（Ｍｏｈａｐａｔｒａ（１９９
５）ＧｅｎｅｓＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓＣａｎｃｅｒ１３：８６−９３）
、および膵臓（Ｓｏｌｉｎａｓ−Ｔｏｌｄｏ（１９９６）ＧｅｎｅｓＣｈｒｏ
ｍｏｓｏｍｅｓＣａｎｃｅｒ２０：３９９−４０７）。２０ｑ１３領域は、
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して、乳房腫瘍お
よび乳房細胞株においてより高い分解能で分析された。２０ｑ１３内の１．５メ
ガベース（Ｍｂ）の広範に増幅された領域が、同定された（Ｓｔｏｋｋｅ（１９
９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２６：１３４−１３７）；Ｔａｎｎｅｒ（１９９４）
ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５４：４２５７−４２６０）。間期ＦＩＳＨは、乳癌の
２９％および７％においてそれぞれ、低レベル（＞１．５×）および高レベル（
＞３×）の２０ｑ１３配列増幅を明らかにした（Ｔａｎｎｅｒ（１９９５）Ｃｌ
ｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１：１４５５−１４６１）。高レベルの増幅は、
攻撃的な腫瘍表現型と関連した（Ｔａｎｎｅｒ（１９９５）前出；Ｃｏｕｒｊａ
ｌ（１９９６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ７４：１９８４）。別の研究は、ＦＩ
ＳＨを使用して１４６の未培養乳癌腫における染色体２０ｑに沿った１４の遺伝
子座を分析し、以下を含む、３つの独立して増幅された領域を同定した：２０ｑ
１３．２のＲＭＣ２０Ｃ００１領域（この場合の９．６％において高度に増幅さ
れた）、ＰＴＰＮ１領域の３Ｍｂ近位（６．２％）、および２０ｑ１１のＡＩＢ
３領域（６．２％）（Ｔａｎｎｅｒ（１９９６）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５６：
３４４１−３４４５）。明らかに、２０ｑ１３内の増幅された領域の明確な特徴
付けは、これらの癌の診断および予後における重要な工程である。

【０００７】培養細胞における染色体２０ｑのコピー数の増加もまた、進行性腫瘍の表現型
特徴（不死化およびゲノムの不安定性を含む）に関連した。例えば、２０ｑ１１
−ｑｔｅｒでのコピー数の増加は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６Ｅ７
またはＨＰＶ１６でそれぞれ感染させた後の、ヒト尿路上皮（ｕｒｏ−ｅｐｉｔ
ｈｅｌｉａｌ）細胞（ＨＵＣ）（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ（１９９４）Ｇｅｎｅｓ
Ｄｅｖ．８：２２２７−２２４０）およびケラチノサイト（Ｓｏｌｉｎａｓ−Ｔ
ｏｌｄｏ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：
３８５４−３８５９）において頻繁に観察された。さらに、２０ｑ１３．２での
コピー数の増加は、いくらかのＨＰＶ１６Ｅ７をトランスフェクトしたＨＵＣ
株におけるｐ５３非依存性のゲノム不安定性に関連した（Ｓａｖｅｌｉｅｖａ（
１９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１４：５５１−５６０）。これらの研究は、２０
ｑ（特に、２０ｑ１３．２）上の１以上の遺伝子の発現の増加が、乳癌および他
の固形腫瘍の進化に寄与することを示唆する。いくつかの候補オンコジーンは、
ＡＩＢ１（Ａｎｚｉｃｋ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７：９６５−９６８
）、ＢＴＡＫ（Ｓｅｎ（１９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１４：２１９５−２００
）、ＣＡＳ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ（１９９６）ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．６：１８
７−１９４）およびＴＦＡＰ２Ｃ（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ（１９９６）Ｇｅｎｏ
ｍｉｃｓ３５：２６２−２６４）を含む、２０ｑ上で増幅されるものとして同
定されている。明らかに、腫瘍表現型に関連する２０ｑ１３中の核酸配列の明確
な特徴付けは、これらの癌の診断および予後における重要な工程である。本発明
は、これらおよび他の必要性を満たす。

【０００８】（発明の要旨）本発明は、癌および腫瘍形成に関連する核酸の新規領域の同定およびゲノムマ
ッピングに関する。

【０００９】本発明は、ヒト核酸のサンプル中のアンプリコンの存在についてスクリーニン
グするための新規な方法を提供する。この方法の第１の工程は、ヒト細胞由来の
核酸のサンプルおよびプローブを提供する。ここで、このプローブは、Ｄ２０Ｓ
２１１からＤ２０Ｓ１２０までを含む核酸配列に特異的にハイブリダイズする核
酸を含む。第２の工程は、このヒト核酸にプローブを接触させる工程を含み、こ
こで、このプローブは、プローブがヒトゲノム核酸にストリンジェント条件下で
選択的に結合する条件下で、ヒトゲノム核酸と接触され、ハイブリダイゼーショ
ン複合体を形成する。最後の工程は、このハイブリダイゼーション複合体の形成
を検出する工程である。１つの実施態様において、このヒト核酸は、ゲノムＤＮ
Ａであり得、このゲノムＤＮＡは、乳房腫瘍細胞から単離され得る。この検出工
程は、アンプリコンのコピー数を決定する工程をさらに包含する。

【００１０】この方法において、このプローブはまた、Ｄ２０Ｓ１２０とＤ２０Ｓ２１１と
の間の距離にわたる核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含み得る。代
替的な実施態様において、このプローブは、ＡＦＭａ２３３ｗｇ１、ＡＦＭ０８
０ｙａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ
０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７および
ＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群より選択されるＳＴＳマーカーに特異的にハイブ
リダイズする核酸を含み得る。このプローブはまた、Ｄ２０Ｓ２１１、Ｄ２０Ｓ
８５４、Ｄ２０Ｓ８７６、Ｄ２０Ｓ１０４４、Ｄ２０Ｓ９１３、Ｄ２０Ｓ７２０
およびＤ２０Ｓ１２０からなる群より選択されるＧＤＢ遺伝子座核酸配列に特異
的にハイブリダイズする核酸を含み得る。あるいは、このプローブはまた、ＲＭ
Ｃ２０Ｂ４０９７、ＲＭＣ２０Ｂ４１０３、ＲＭＣ２０Ｐ４０１６、ＲＭＣ２０
Ｂ４１３０、ＲＭＣ２０Ｐ４１８５、ＲＭＣ２０Ｂ４１８８、ＲＭＣ２０Ｂ４１
０９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１０、ＲＭＣ２０Ｐ４０２８、ＲＭＣ２０Ｐ４００３、
ＲＭＣ２０Ｂ４０９９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１８、ＲＭＣ２０Ｐ４０６９、ＲＭＣ
２０Ｂ４１２１、ＲＭＣ２０Ｂ４０８７およびＲＭＣ２０Ｐ４０７０からなる群
より選択されるクローン化されたゲノム核酸配列に特異的にハイブリダイズする
核酸を含み得る。

【００１１】別の実施態様において、このプローブは、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０
までを含む核酸配列のいくらかまたは全てを増幅し得るポリメラーゼ連鎖反応プ
ライマー対を含み得る。この検出工程は、このポリメラーゼ連鎖反応増幅反応の
形成を検出する工程を包含し得る。このポリメラーゼ連鎖反応プライマー対は、
ＡＦＭａ２３３ｗｇ１、ＡＦＭ０８０ｙａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６
７４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２
４ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群より選択され
るＳＴＳＰＣＲプライマー対であり得る。

【００１２】本発明の方法において、このプローブは、固体表面に結合され得、そしてこの
結合されたプローブは、核酸アレイのメンバーであり得る。ヒト核酸は、検出可
能な組成物で標識され得る。この検出可能な組成物は、フルオレセインまたはテ
キサスレッドであり得る。代替的な実施態様において、プローブが、検出可能な
組成物で標識され得る。この方法はさらに、参照細胞由来の核酸を提供し、ここ
で、この参照細胞核酸は、ヒトゲノム核酸より前に、またはヒトゲノム核酸と同
時に、このプローブと接触される。この方法はさらに、Ｃｏｔ−１ＤＮＡを提
供し得、ここでこのＣｏｔ−１ＤＮＡは、ヒトゲノム核酸にプローブを接触さ
せる前に、ヒトゲノム核酸にハイブリダイズされる。

【００１３】本発明はまた、ヒトゲノム核酸のサンプル中のアンプリコンの存在についてス
クリーニングするための核酸プローブを提供し、このプローブは、Ｄ２０Ｓ２１
１からＤ２０Ｓ１２０までを含む核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を
含む。あるいは、このプローブは、以下のものに特異的にハイブリダイズする核
酸を含み得る：Ｄ２０Ｓ１２０とＤ２０Ｓ２１１との間の距離にわたる核酸配列
；または、ＡＦＭａ２３３ｗｇ１、ＡＦＭ０８０ｙａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、
ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、
ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群よ
り選択されるＳＴＳマーカー；または、Ｄ２０Ｓ２１１、Ｄ２０Ｓ８５４、Ｄ２
０Ｓ８７６、Ｄ２０Ｓ１０４４、Ｄ２０Ｓ９１３、Ｄ２０Ｓ７２０およびＤ２０
Ｓ１２０からなる群より選択されるＧＤＢ遺伝子座核酸配列；または、ＲＭＣ２
０Ｂ４０９７、ＲＭＣ２０Ｂ４１０３、ＲＭＣ２０Ｐ４０１６、ＲＭＣ２０Ｂ４
１３０、ＲＭＣ２０Ｐ４１８５、ＲＭＣ２０Ｂ４１８８、ＲＭＣ２０Ｂ４１０９
、ＲＭＣ２０Ｐ４０１０、ＲＭＣ２０Ｐ４０２８、ＲＭＣ２０Ｐ４００３、ＲＭ
Ｃ２０Ｂ４０９９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１８、ＲＭＣ２０Ｐ４０６９、ＲＭＣ２０
Ｂ４１２１、ＲＭＣ２０Ｂ４０８７およびＲＭＣ２０Ｐ４０７０からなる群より
選択されるクローン化されたゲノム核酸配列。

【００１４】別の実施態様において、このプローブは、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０
までを含む核酸配列のいくらかまたは全てを増幅し得るポリメラーゼ連鎖反応プ
ライマー対を含み得る。このポリメラーゼ連鎖反応プライマー対は、ＡＦＭａ２
３３ｗｇ１、ＡＦＭ０８０ｙａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６７４８、Ｗ
Ｉ−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２
、ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群より選択されるＳＴＳ
ＰＣＲプライマー対であり得る。

【００１５】本発明はまた、ヒト核酸のサンプル中のアンプリコンの存在についてスクリー
ニングするためのキットを提供し、このキットは、プローブを含む区画を含み、
ここで、このプローブは、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０までを含む核酸配
列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む。あるいは、このプローブは、以下
のものに特異的にハイブリダイズする核酸を含み得る：Ｄ２０Ｓ１２０とＤ２０
Ｓ２１１との間の距離にわたる核酸配列；または、ＡＦＭａ２３３ｗｇ１、ＡＦ
Ｍ０８０ｙａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、Ａ
ＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７
およびＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群より選択されるＳＴＳマーカー；または、
Ｄ２０Ｓ２１１、Ｄ２０Ｓ８５４、Ｄ２０Ｓ８７６、Ｄ２０Ｓ１０４４、Ｄ２０
Ｓ９１３、Ｄ２０Ｓ７２０およびＤ２０Ｓ１２０からなる群より選択されるＧＤ
Ｂ遺伝子座核酸配列；または、ＲＭＣ２０Ｂ４０９７、ＲＭＣ２０Ｂ４１０３、
ＲＭＣ２０Ｐ４０１６、ＲＭＣ２０Ｂ４１３０、ＲＭＣ２０Ｐ４１８５、ＲＭＣ
２０Ｂ４１８８、ＲＭＣ２０Ｂ４１０９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１０、ＲＭＣ２０Ｐ
４０２８、ＲＭＣ２０Ｐ４００３、ＲＭＣ２０Ｂ４０９９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１
８、ＲＭＣ２０Ｐ４０６９、ＲＭＣ２０Ｂ４１２１、ＲＭＣ２０Ｂ４０８７およ
びＲＭＣ２０Ｐ４０７０からなる群より選択されるクローン化されたゲノム核酸
配列。

【００１６】別の実施態様において、このキットのプローブは、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０
Ｓ１２０までを含む核酸配列のいくらかまたは全てを増幅し得るポリメラーゼ連
鎖反応プライマー対を含み得る。このポリメラーゼ連鎖反応プライマー対は、Ａ
ＦＭａ２３３ｗｇ１、ＡＦＭ０８０ｙａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６７
４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４
ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群より選択される
ＳＴＳＰＣＲプライマー対であり得る。このプローブは、クローン化されたヒ
ト核酸であり得、そしてこのクローン化されたヒトゲノム核酸は、固体表面に結
合され得る。この結合されたプローブは、核酸アレイのメンバーであり得る。こ
のキットはさらに、細胞中の２より多いアンプリコンのコピーの検出が、癌また
は腫瘍形成の診断または予後であり得ることを示す、説明書をさらに含み得る。

【００１７】本発明の性質および利点のさらなる理解は、詳細な説明の残りの部分、図面お
よび特許請求の範囲を参照することによって明らかになり得る。

【００１８】本明細書中に引用される全ての刊行物、ＧｅｎＢａｎｋ登録証書（配列）、特
許および特許出願は、全ての目的のために参考として本明細書中に明確に援用さ
れる。

【００１９】

【表１】（定義）本発明の理解を容易にするために、多くの用語を以下に定義する。

【００２０】本明細書中で使用される場合、用語「アンプリコン」とは、変更されたコピー
数で存在する場合に癌に関連するゲノム核酸の領域をいう。例えば、本発明は、
異常なコピー数で存在する場合に癌に関連する、ヒト染色体２０ｑ１３．２上の
新規な核酸配列を提供する。代表的に、本発明の核酸配列は、癌（例えば、乳癌
）に関連する場合、増加されたコピー数を有する。従って、用語「アンプリコン
」とは、これらの新規な配列についてをいう。しかし、このコピー数はまた、い
くつかの環境下で減少され得る。従って、本発明は、コピー数における変化を分
析して、癌をスクリーニングおよび診断するためのプローブとして使用され得る
核酸を提供する。高分解能アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（「アレイ
ＣＧＨ」）を使用して、本発明のアンプリコン由来の配列を、核酸サンプル中の
単一コピー数の変化決定するためのプローブとして使用され得る。コピー数の決
定（定量）はまた、癌の予後において補助し得る。なぜなら、アンプリコンのコ
ピー数の増加は、攻撃性の腫瘍表現型に関連するからである。特に、本発明のプ
ローブは、特に２０ｑ１３．２領域における、例えば、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２
０Ｓ１２０までを含む核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む。代替
的な実施態様において、このプローブは、Ｄ２０Ｓ１２０とＤ２０Ｓ２１１との
間の距離にわたる任意の核酸配列；２０ｑ１３．２領域における任意のクローン
、ＧＤＢ遺伝子座またはＳＴＳマーカー（例えば、表１に列挙される例示的クロ
ーン、ＧＤＢ遺伝子座、ＳＴＳおよび他のマーカー（例えば、ＷＩ−９２２７）
）に特異的にハイブリダイズする核酸を含み得る。

【００２１】本明細書中で使用される場合（例えば、表１および図２において使用される場
合）、用語「Ｄ２０Ｓ１２０」、「Ｄ２０Ｓ２１１」、「Ｄ２０Ｓ１９３」およ
び同様の「Ｄナンバー」とは、ＧｅｎｏｍｅＤａｔａｂａｓｅ（「ＧＤＢ」）
の命名であり、これらは、特定の染色体にマッピングされた特定のゲノム核酸配
列をいう（例えば、Ｌｅｔｏｖｓｋｙ（１９９８）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２６：９４−９９を参照のこと）。これらの遺伝子座およびＳＴＳの
命名の情報は、公共のデータベース上で利用可能であり、例えば、ｈｔｔｐ：／
／ｗｗｗ．ｇｄｂ．ｏｒｇ／を参照のこと。表１は、本発明の新規なアンプリコ
ンを同定するために使用される高密度アレイを含むクローンについての、ＧＤＢ
遺伝子座およびそれらに対応するＳＴＳ名を列挙する。これらのＧＤＢ遺伝子座
は、ヒト第２０染色体の２０ｑ１３．２領域をマッピングする。遺伝子座「Ｄ２
０Ｓ１２０」、「Ｄ２０Ｓ２１１」および「Ｄ２０Ｓ１９３」は、以下でさらに
詳細に記載される。

【００２２】本明細書中で使用される場合、用語「特異的にハイブリダイズする」および「
特異的なハイブリダイゼーション」および「選択的にハイブリダイズする」とは
、ストリンジェント条件下で特定のヌクレオチドに優先的な、核酸分子の結合、
二重鎖形成またはハイブリダイズをいう。用語「ストリンジェント条件」とは、
プローブがその標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして他の配列により少
ない程度でハイブリダイズするか、または全くハイブリダイズしない条件をいう
。核酸ハイブリダイゼーションの状況下（例えば、アレイハイブリダイゼーショ
ン、サザンハイブリダイゼーションまたはノーザンハイブリダイゼーション）で
の「ストリンジェントハイブリダイゼーション」および「ストリンジェントハイ
ブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、そして異なる環境パラメ
ーター下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対する例示的ガイドは、例
えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌ
ｏｇｙ−−ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ＰｒｏｂｅｓｐａｒｔＩ、第２章、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｐｒｉｎ
ｃｉｐｌｅｏｆｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｓｔｒａｔ
ｅｇｙｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｐｒｏｂｅａｓｓａｙ」、Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ，ＮＹ（「Ｔｉｊｓｓｅｎ」）に見出される。一般に、高度にストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、規定されたイオン
強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融点（Ｔ_m）より約５℃低く選択さ
れる。Ｔ_mは、標的配列の５０％が、完全に一致するプローブにハイブリダイズ
する温度（規定されたイオン強度およびｐＨ下）である。非常にストリンジェン
トな条件は、特定のプローブについてのＴｍと等しく選択される。アレイ上ある
いはサザンブロットまたはノーザンブロットのフィルター上に１００を超える相
補的残基を有する、相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェ
ントハイブリダイゼーション条件の例は、標準的なハイブリダイゼーション溶液
（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋおよび以下の詳細な議論を参照のこと）を使用して
４２℃であり、このハイブリダイゼーションを一晩行う。高度にストリンジェン
トな洗浄条件の例は、０．１５ＭＮａＣｌで、７２℃、約１５分間である。ス
トリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃で約１５分間の０．２×ＳＳＣ洗浄で
ある（ＳＳＣ緩衝液の説明については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ（第２版）第１〜３巻、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＮＹ（「Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ」）を参照のこと）。しばしば、低ストリンジェンシーの洗浄が
、高ストリンジェンシーの洗浄に先立ち、バックグラウンドプローブシグナルを
除去する。例えば、１００ヌクレオチドをこえるヌクレオチドの二重鎖について
の中程度のストリンジェンシーの洗浄の例は、１×ＳＳＣで、４５℃、１５分間
である。１００ヌクレオチドをこえるヌクレオチドの二重鎖についての低ストリ
ンジェンシーの洗浄の例は、４〜６×ＳＳＣで、４０℃、１５分間である。

【００２３】本明細書中で使用される場合、用語「検出可能な組成物で標識される」とは、
検出可能な組成物（すなわち、標識）に結合された核酸をいう。検出は、例えば
、顕微鏡的、光化学的、生化学的、免疫化学的、物理的または化学的手段により
得る。例えば、有用な標識としては、以下が挙げられる：³²Ｐ、³⁵Ｓ、³Ｈ、¹⁴
Ｃ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ；蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン
光体、テキサスレッド）、電子密度試薬（例えば、金）、酵素（例えば、ＥＬＩ
ＳＡにおいて一般に使用されるようなもの（例えば、西洋ワサビペルオキシダー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ））、比
色標識（例えば、金コロイド）、磁気標識（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ^TM）、
ビオチン、ジオキシゲニン、またはハプテンおよび抗血清またはモノクローナル
抗体が利用可能なタンパク質。標識は、検出されるべき核酸、ペプチドまたは他
の標的化合物中に直接組み込まれ得るか、あるいは標識は、その標的にハイブリ
ダイズするかもしくは結合するプローブまたは抗体に結合され得る。ペプチドは
、二次レポーターによって認識される、予め決定されたポリペプチドエピトープ
（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体についての結合部位、転写アクチ
ベーターポリペプチド、金属結合ドメイン、エピトープタグ）を組み込むことに
よって検出可能にされ得る。標識は、種々の長さのスペーサーアームによって結
合され、可能性のある立体障害を減少し得るか、または他の有用もしくは所望の
特性に対して影響を与え得る。Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ（１９９５）ＭｏｌＣｅｌ
ｌＰｒｏｂｅｓ９：１４５−１５６を参照のこと。

【００２４】本明細書中で使用される場合、用語「核酸」とは、一本鎖または二本鎖形態の
デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドをいう。この用語は、参照核
酸として、所望される目的のために、類似のまたは改善された結合特性を有する
天然のヌクレオチドの既知のアナログを含む、核酸、すなわちオリゴヌクレオチ
ドを含む。この用語はまた、天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で、また
は所望される目的のためにその上に改善された速度で代謝される核酸を含む。こ
の用語はまた、合成骨格を有する核酸様構造を含む。本発明によって提供される
ＤＮＡ骨格アナログには、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジ
チオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミダイト、アルキルホスホトリエ
ステル、スルファメート、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、
３’−Ｎ−カルバメート、モルホリノカルバメート、およびペプチド核酸（ＰＮ
Ａ）が含まれる；ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄＡｎａｌｏｇｕｅ
ｓ，ａＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、Ｏ
ｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓにおけるＩＲＬＰｒｅｓｓ（
１９９１）；ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＳｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｎｎａｌｓｏｆ
ｔｈｅＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，第６
００巻、ＢａｓｅｒｇａおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編（ＮＹＡＳ１９９２）を参
照のこと；Ｍｉｌｌｉｇａｎ（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１９２
３−１９３７；ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ（１９９３，ＣＲＣＰｒｅｓｓ）。ＰＮＡは、非イオン性骨格（
例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位）を含む。ホスホロチオエート
結合は、ＷＯ９７／０３２１１；ＷＯ９６／３９１５４；Ｍａｔａ（１９９
７）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４４：１８９−１９７
に記載されている。この用語に含まれる他の合成骨格には、メチルホスホネート
結合、または交互のメチルホスホネートおよびホスホジエステル結合（Ｓｔｒａ
ｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３６：８６９２
−８６９８）ならびにベンジルホスホネート結合（Ｓａｍｔａｇ（１９９６）Ａ
ｎｔｉｓｅｎｓｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＤｒｕｇＤｅｖ．６：１５３
−１５６）が含まれる。用語核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌク
レオチドプライマー、プローブ、および増幅産物に交換可能に使用される。

【００２５】本明細書中で使用される場合、用語「核酸アレイ」とは、複数の標的エレメン
トであり、各々の標的エレメントは、サンプル核酸がハイブリダイズする固体表
面に固定化された１つ以上の核酸分子（プローブ）を含む。標的エレメントの核
酸は、特異的な遺伝子またはクローン由来の配列（例えば、本明細書中に開示さ
れる本発明のプローブ）を含み得る。他の標的エレメントは、例えば、参照配列
を含む。種々の寸法の標的エレメントが、本発明のアレイにおいて使用され得る
。一般的に、より小さな標的エレメントが好ましい。代表的には、標的エレメン
トは、直径約１ｃｍより小さい。一般的なエレメントサイズは、約１μｍ〜約３
ｍｍ、好ましくは約５μｍと約１ｍｍとの間である。アレイの標的エレメントは
、異なる密度で固体表面上に配置され得る。標的エレメントの密度は、多数の因
子（例えば、標識の性質、固体支持体など）に依存する。当業者は、各々の標的
エレメントが、異なる長さおよび配列のプローブ核酸の混合物を含み得ることを
認識する。従って、例えば、標的エレメントは、１コピー以上のクローニングさ
れたＤＮＡの断片を含み得、そして各コピーは、異なる長さのフラグメントに分
解され得る。標的エレメント上に固定されたプローブ核酸の長さおよび複雑さは
、本発明にとって重要ではない。当業者は、これらの要因を調節して、所定のハ
イブリダイゼーション手順のために最適なハイブリダイゼーションおよびシグナ
ル産生を提供し得、そして異なる遺伝子またはゲノム位置間での必要とされる分
解能を提供する。種々の実施態様において、プローブ配列は、約１ｋｂと約１Ｍ
ｂとの間、約１０ｋｂと約５００ｋｂとの間、約２００〜約５００ｋｂの間、お
よび約５０ｋｂ〜約１５０ｋｂの複雑さを有する。

【００２６】本明細書中で使用される場合、用語「プローブ」または「核酸プローブ」は、
サンプルに対するハイブリダイゼーションが検出され得る１つ以上の核酸フラグ
メントのコレクションであると定義される。このプローブは、以下に記載される
ように、標識されなくともまたは標識されてもよく、その結果、標的またはサン
プルへのその結合が検出され得る。このプローブは、１つ以上の特定の（あらか
じめ選択された）ゲノムの部分由来の核酸の供給源（例えば、１つ以上のクロー
ン、単離された全体の染色体、または染色体フラグメント、またはポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）増幅産物のコレクション）から作製される。本発明のプロー
ブは、本明細書中で記載される領域において見出される核酸から作製される。プ
ローブまたはゲノム核酸サンプルは、いくつかの様式でプロセスされ得る（例え
ば、反復核酸のブロッキングもしくは除去、または独特な核酸での富化）。用語
「サンプル」は、検出された核酸をいうだけではなく、標的に適用される形態に
ある（例えば、核酸のブロッキングなどを伴う）検出可能な核酸をいう。核酸の
ブロッキングはまた、別々に言及され得る。「プローブ」が特異的に表すことは
、その用語が使用される文脈から明確である。プローブはまた、アレイ中にある
場合、固体表面（例えば、ニトロセルロース、ガラス、石英、融合したシリカス
ライド）に固定化された、単離された核酸であり得る。いくつかの実施態様にお
いて、プローブは、例えば、ＷＯ９６／１７９５８に記載されるように、核酸
のアレイのメンバーであり得る。高密度アレイを作製し得る技術もまた、この目
的のために使用され得る（例えば、Ｆｏｄｏｒ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ７
６７−７７３（１９９１）；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ
．８：Ｒ１７１−Ｒ１７４；Ｓｃｈｕｍｍｅｒ（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ２３；１０８７−１０９２；Ｋｅｒｎ（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ２３：１２０−１２４；米国特許第５，１４３，８５４号を参照の
こと）。当業者は、本明細書中に記載される特定のプローブの正確な配列がある
程度まで改変されて、開示されたプローブに「実質的に同一」であるが、しかし
それが由来するプローブと同じ標的またはサンプルに特異的に結合する（すなわ
ち、特異的にハイブリダイズする）能力を保持するプローブを作製し得ることを
認識する（上記の議論を照のこと）。このような改変は、本明細書中に記載され
る個々のプローブに対する言及として詳細に網羅される。

【００２７】本明細書中で使用される場合、用語「ヒト核酸のサンプル」とは、本発明のプ
ローブに対するハイブリダイゼーションのために適切な形態でヒトＤＮＡまたは
ヒトＲＮＡを含むサンプルをいう。核酸は、単離、クローニング、または増幅さ
れ得る；それは、特定の染色体、または本明細書で開示される特定のアンプリコ
ンもしくは欠失中の選択された配列（例えば、特定のプロモーター、遺伝子、増
幅フラグメントまたは制限フラグメント、ｃＤＮＡなど）由来の、例えば、ゲノ
ムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡであり得る。核酸サンプルは、特定の細胞
または組織から抽出され得る。核酸サンプルが調製される細胞または組織サンプ
ルは、代表的には、アンプリコン増幅もしくは欠失または検出される転座と関連
する癌を有すると疑われる患者から取られる。細胞サンプルおよび組織サンプル
を単離する方法は、当業者に周知であり、そして吸引、組織切片、針生検などを
含むがこれらに限定されない。しばしばサンプルは、患者由来のサンプルである
「臨床サンプル」である。これは、組織学的目的のために取られた組織の切片（
例えば、凍結切片またはパラフィン切片）を含む。このサンプルはまた、細胞培
養物からの（細胞の）上清または細胞自体に由来し得るか、組織培養物、および
、染色体異常を検出することまたはアンプリコンコピー数を決定することが所望
され得る他の培地からの細胞に由来し得る。いくつかの場合において、核酸は、
ハイブリダイゼーションの前に、ＰＣＲのような標準的な技術を用いて増幅され
得る。サンプルは、固体上に固定された単離された核酸であり得る。サンプルは
また、個々の核酸が実質的にインタクトで残って、そして含むように調製され得
る。

【００２８】用語「配列タグ化部位」または「ＳＴＳ」とは、配列に基づく、クローニング
したＤＮＡセグメント（例えば、コンティグのメンバー、異常な制限部位（制限
マップのメンバー）を含むセグメント、遺伝的にマッピングされたＤＮＡ多型を
検出するプローブ、または特定の細胞遺伝学的バンドにインサイチュでハイブリ
ダイズする配列）を「タグ化する」かまたは同定する方法をいう。ＳＴＳ指定を
割り当てるために、各々のクローニングされたＤＮＡセグメントは、（少なくと
も）約２００〜５００塩基対領域にわたって配列決定される。この配列データを
用いて、ＰＣＲプライマーは設計され、そしてそれらがＰＣＲ増幅によるその特
定の配列を同定するか、または「タグする」ために使用され得ることを確認する
ために試験される。セグメントおよびプライマー配列、ならびにＰＣＲアッセイ
条件の公的データベースへの提出は、誰でも迅速かつ都合よく、実質的にいかな
るゲノムクローンまたはフラグメントをも同定−およびマッピング−することを
可能にする。例えば、Ｏｌｓｏｎ（１９８９）「Ａｃｏｍｍｏｎｌａｎｇｕ
ａｇｅｆｏｒｐｈｙｓｉｃａｌｍａｐｐｉｎｇｏｆｔｈｅｈｕｍａ
ｎｇｅｎｏｍｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４５：１４３４−１４３５を参照のこ
と。

【００２９】（発明の詳細な説明）本発明は、ヒトの癌の検出、診断、および診断のために有用な、ヒト染色体２
０の２０ｑ１３．２領域中の、新規な、核酸の限定される領域を同定する。本明
細書中で開示される核酸領域は、しばしば、ヒトの癌（特にヒトの乳癌）におけ
る染色体異常およびコピー数の変化と関連する。この新規な領域は、「アンプリ
コン」と呼ばれる。なぜなら、これらは代表的には、癌細胞におけるコピー数を
増加するからである。従って、これらの新規な配列は、コピー数の変化を検出し
て、疾患（例えば癌、特に乳癌）の存在についてスクリーニングするためのプロ
ーブおよび方法において使用される。さらに、コピー数の決定は、特定の癌の予
後において使用され得る。なぜなら、高コピー数は、しばしば、攻撃的な腫瘍の
ふるまいおよび治療に対する不良な応答に関連するからである。

【００３０】核酸領域、すなわちアンプリコンの増幅は、代表的には、増幅した表現型の原
因である決定的な最小の「ｃｏｒｅ」遺伝子配列によって駆動される。多くの例
において、この決定的なコア遺伝子は、オンコジーンをコードする。従って、増
幅を駆動する最小遺伝子配列の同定は、オンコジーンを同定するようである。さ
らに、非常に増幅された領域を有する腫瘍は、代表的には、非常に増幅された２
０ｑ１３．２領域を有する腫瘍を用いて観察されたように、より攻撃的な腫瘍で
あるようである。従って、最小の、または「増幅を駆動する」アンプリコン配列
の定義および使用は、新規なかつ改善された診断的および予後的手順を生成する
。癌細胞中での領域のコピー数を決定するための、より小さなまたは「最小の」
アンプリコン遺伝子配列の使用は、より正確な結果（すなわち、より大きな遺伝
子セグメントを使用して獲得された結果よりも、より良好な診断および予後）を
生じる。本発明は、第２０染色体の２０ｑ１３．２領域中の、このようなより小
さな、最小の「コア」領域、新規なアンプリコンを提供する。これは、以前に記
載されたコア領域とは異なる。

【００３１】高分解能アレイに基づく比較的なゲノムハイブリダイゼーション（アレイＣＧ
Ｈ）は、特に癌細胞（例えば、乳癌細胞）中の第２０染色体の２０ｑ１３．２領
域中のコピー数の変動を分析するために適用された。２０ｑ１３．２配列の高分
解能マッピングは、位置的に重複するクローンのアレイ（「コンティグ」と呼ば
れる）を使用して達成された。コンティグを含むクローンの第２０染色体インサ
ートの大部分は、サイズが約１メガベース（Ｍｂ）未満で、約１００〜２００キ
ロベース（ｋｂ）の範囲であった。このことは、このアレイが、核酸サンプル由
来の区切られた領域（「アンプリコン」）を非常に高程度の分解能まで物理的に
マッピングし、そして定量することを可能にした。このことは、本発明の新規な
２０ｑ１３．２アンプリコンの発見をもたらした。

【００３２】本発明の新規なアンプリコンを同定した高分解能アレイにおいて使用されるク
ローンは、図３の一番上のパネルにおいて示される。このアレイは、１．５Ｍｂ
をカバーするクローンの重複するセットを含む。図３の一番上のパネルは、この
高分解能アレイのコンティグを含むクローンの名称および相対位置を示す（図３
において、プローブクローンの名称は、最後の４つの数字で省略されており、す
なわち、クローンＲＭＣ２０Ｂ４０９７は、「４０９７」と省略されている）。
図３は、いかに高分解能アレイ（「ＣＧＨ」）データが、増幅された領域中で、
より小さな「決定的な」遺伝子セグメントを位置付けする際に補助し得るかを図
示する（例えば、図示された重複するクローンのセットが、本発明の新規な２０
ｑ１３．２アンプリコンを発見するためにアレイ中で使用されたように）。図３
は、乳癌細胞株ＭＣＦ７（例えば、Ｂｅｎｚ（１９８９）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎ
ｃｅｒＩｎｓｔ．８１：１７０４−１７０９を参照のこと）（上のパネル）、
および２つの腫瘍、Ｓ２１およびＳ５０（下の２つのパネル）（ＢａｙＡｒｅ
ａＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＳＰＯＲＥ，ＵＣＳＦＣａｎｃｅｒＣｅ
ｎｔｅｒ，Ｕｎｉｖ．ｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａより提供された）の高分解能
分析の結果を示す。

【００３３】表１はさらに、このアレイの種々のクローン（「ＲＭＣ」クローン名称、左側
のカラム）および対応するＧＤＢ遺伝子座名（「Ｄ番号」）、ＳＴＳマーカー表
示、ならびに公的ドメインからの他の関連する名称を例証する。いくつかのクロ
ーンは、公的なデータベース由来のいくつかのＳＴＳマーカー（例えば、ＲＭＣ
２０Ｐ４０３０）を含む。多くのＳＴＳマーカー（およびそれらの関連するＰＣ
Ｒプライマー、上記のＳＴＳの定義を参照のこと）は、「Ｄ番号」によって表示
されたＧＤＢ遺伝子座を同定するために使用され得る。「Ｄ」遺伝子座（例えば
、Ｄ２０Ｓ９０２）はまた、別のクローンの表示（例えば、ＡＦＭｃ０２８ｚｃ
５）と関連し得る。別の例は、クローンＲＭＣ２０Ｐ４００９であり、これはＳ
ＧＣ３１０１０およびＷＩ−１６６９７を含む。

【００３４】図３において、水平軸上のクローン的に関連する線の長さは、染色体に沿った
距離に比例する。テロメアは右側にある。ＭＣＦ７（上のパネル）、腫瘍Ｓ２１
（中間のパネル）、および乳房腫瘍Ｓ５０（下のパネル）についての高分解能ア
レイＣＧＨデータは、個々のクローン（プローブ）の長さおよび染色体に沿った
それらのマッピングされた位置を表す、水平方向の黒い棒とともにプロットされ
る。それらは、それらのＣＧＨ比を示す垂直方向の高さでプロットされ、すなわ
ち、より高い線がより多いコピー数を有する。測定の標準偏差は、約１０％であ
ると見積もられる。

【００３５】細胞株ＭＣＦ７において、急激なコピー数の増加が存在する。上昇した比は、
クローンＲＭＣ２０Ｂ４０９７（「４０９７」）の遠位の部分に記録され、そし
て増加は、クローンＲＭＣ２０Ｂ４１０３（「４１０３」）およびＲＭＣ２０Ｂ
４１３０（「４１３０」）を用いて検出され、これらは、より遠位にマッピング
している（表１を参照のこと、例えば、クローン４０９７はまた、ＳＴＳ表示Ａ
ＦＭａ２３３ｗｇ１、ＧＤＢマーカー名Ｄ２０Ｓ２１１またはＤ２０Ｓ８５４に
よって同定され得る）。このコピー数は、測定の不確実性の範囲内で、この増幅
された領域から遠位で一定になる。これらのデータは、ＭＣＦ７において、ＲＭ
Ｃ２０Ｂ４０９７の最も遠位部（「４０９７」の右側）にマッピングし、また部
分的にＲＭＣ２０Ｂ４１０３（「４１０３」）およびＲＭＣ２０Ｂ４１３０（「
４１３０」）に含まれ、そしてより遠位のクローンに全体的に含まれる高コピー
数の領域が存在することを示す。従って、急激なコピー数の増加の位置（垂直方
向の灰色線）は、重複クローン（ＲＭＣ２０Ｂ４０９７、ＲＭＣ２０Ｂ４１０３
、およびＲＭＣ２０Ｂ４１３０）上の比から非常に正確にマッピングされ得る。

【００３６】対照的に、腫瘍Ｓ２１およびＳ５０は、数百キロベース（ｋｂ）の距離にわた
る、コピー数の比較的連続する変化を示す。腫瘍Ｓ５０において、コピー数のピ
ークは、クローンＲＭＣ２０Ｂ４０９７（「４０９７」）の周辺に存在する。Ｓ
５０の増幅領域の遠位の境界（テロメアに向かって図３の右側）は、およそＲＭ
Ｃ２０Ｐ４０２８（「４０２８」）からクローンＲＭＣ２０Ｐ４０１８（「４０
１８」）までにマッピングする。腫瘍Ｓ２１について、増幅された領域の近位の
境界（左側）は、（高分解能アレイ中で連続するクローンの適用範囲の領域内で
）およそのクローン４０９７に位置付けされる。Ｓ２１において、染色体に沿っ
てより遠位に（右側に）動くに従って、コピー数は増加し続ける。

【００３７】Ｓ２１（および別の腫瘍Ｓ５９、これらのデータは図３には示されていない）
におけるコピー数の増加の大きさは著しい。これは、コンティグに対して遠位で
ある（図３の右側）か、なおスキャニングアレイ上の次のマーカーＤ２０Ｓ１２
０に対して近位である染色体領域に注意を集める（Ｄ２０Ｓ１２０は、マーカー
ＲＭＣ２０Ｂ４０８７に対して遠位にマッピングする；Ｄ２０Ｓ１２０は、ＲＭ
Ｃ２０Ｐ０７０中に含まれる；表１を参照のこと）。ＧＤＢマーカーＤ２０Ｓ１
２０を含むクローンは、コピー数が上昇していないか、またはそのコピー数は、
これらの腫瘍中で非常に減少されている（データは示さず）。３つの他の腫瘍に
ついて、遠位の境界は、Ｄ２０Ｓ１２０と次の最も遠位の標的クローン、Ｄ２０
Ｓ１００との間にマッピングされた（データは示さず）；これらはまた、他の２
０ｑ１３．２コンティグクローンと比較して、Ｄ２０Ｓ１２０で非常に減少した
コピー数を有した。従って、これらの観察は、この新規な２０ｑ１３．２アンプ
リコンの遠位の境界が、一般的に、Ｄ２０Ｓ１２０の近くに存在することを示す
。さらに、それらは、最少の増幅された領域の遠位の境界が、この遺伝子座に対
して近位にマッピングすることを確立する。従って、新規なアンプリコンは、（
近位から遠位へ）ＲＭＣ２０Ｂ４０９７（「４０９７」またはＤ２０Ｓ２１１、
表１を参照のこと）とＤ２０Ｓ１２０（ＲＭＣ２０Ｐ０７０）との間に同定され
た。

【００３８】この新規なアンプリコンはさらに、図１に示されるようにＦＩＳＨを用いて特
徴付けされた。クローンＲＭＣ２０Ｃ００１、ＲＭＣ２０Ｂ４０９７（「４０９
７」）、ＷＩ−９２２７、Ｄ２０Ｓ１２０、およびＤ２０Ｓ１００を、プローブ
として使用した。増加したＧ／Ｒ比に基づいて、コピー数増幅の境界領域−アン
プリコン−を検出した。新規な２０ｑ１３．２アンプリコンの遠位の境界は、Ｄ
２０Ｓ１２０に対して近位であると決定された。この結論に到達するにおいて、
腫瘍サンプルＳ２１のコピー数分析が、最も情報量が多かった。図１に示される
ように、Ｓ２１では、上昇したコピー数の領域は、クローンＲＭＣ２０Ｂ４０９
７（「４０９７」）の近位で始まり、そしてコンティグの最も遠位の部分、ＷＩ
−９２２７（ＲＭＣ２０Ｂ４０８７、表１を参照のこと）においてコピー数が最
も高い。コピー数は、Ｄ２０Ｓ１２０において上昇せず、これは、新規なアンプ
リコンの遠位の境界を、Ｄ２０Ｓ１２０に対して近位に配置する。このハイブリ
ダイゼーションデータは、新規なアンプリコンが（近位から遠位へ）ＲＭＣ２０
Ｂ４０９７とＤ２０Ｓ１２０（ＲＭＣ２０Ｐ０７０）との間に同定されたことを
確証する。

【００３９】（アンプリコン、プローブ、およびアレイをコードする核酸の特徴付け、単離
、および合成）本発明は、ヒト染色体２０ｑ１３．２由来の新規な核酸配列−新規なアンプリ
コン−の位置付け、クローニング、および発現を初めて提供した。本発明は、こ
れらの配列を含むプローブを提供する。さらなる実施態様は、生物学的サンプル
、特に、ヒトの癌におけるこれらのアンプリコン配列のコピー数の変化の存在を
スクリーニングするための手段を提供する。アンプリコンのコピー数は一般に乳
癌において変化するが、それらはまた、前立腺癌、子宮頸部癌、卵巣癌、膀胱癌
、頭頸部の癌、および結腸癌を含むがこれらに限定されない、他の癌に診断的お
よび予後的であり得る。

【００４０】本発明は、科学文献および特許文献において十分に記載されている、当該分野
で公知の任意の方法またはプロトコルと組み合わせて実施され得る。従って、本
発明の新規な試薬および方法に対して特定の方法論および例を議論する前に、ほ
んのいくつかの一般的な技術を記載する。

【００４１】（一般技術）本発明の核酸をコードする全ＤＮＡまたはＲＮＡを単離する方法は、当業者に
周知である。核酸の単離、精製、および操作のための技術、遺伝子、プローブ、
およびアンプリコン配列、例えばライブラリーを産生させること、発現ベクター
へのサブクローニング、プローブを標識すること、ＤＮＡハイブリダイゼーショ
ンなどは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ；Ｔｉｊｓｓｅｎ；「ＣＵＲＲＥＮＴＰＲ
ＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ」、Ａｕｓｕｂｅ
ｌ編、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９
７）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）、に記載される。

【００４２】本発明の核酸は、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、また
は遺伝子組換えのハイブリッドに関わらず、種々の供給源から単離され得るか、
またはインビトロで合成され得る。本発明の核酸は、例えば、トランスジェニッ
ク動物、形質転換された細胞、形質転換された細胞溶解物、または部分的に精製
されたもしくは実質的に純粋な形態において発現され得る。配列決定方法は、代
表的には、ジデオキシ配列決定（Ｓｅｑｕｅｎｑｓｅ，Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ）を使用するが、しかし、他のキットおよび方法が利用可能であり、そ
して当業者に周知である。

【００４３】核酸およびタンパク質は、当業者に周知である多数の一般手段のいずれかによ
って、本明細書中に記載の本発明の教示および方法に従って、検出および定量さ
れる。これらには、いくつか名前を挙げると、例えば、分析的生化学的方法（例
えば、分光光度法、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、お
よび高速拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー）、種々の
免疫学的方法（例えば、液体またはゲル沈降反応、免疫拡散（一重または二重）
、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相酵素免疫測定法（ＥＬ
ＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイなど）、サザン分析、ノーザン分析、ドットブロッ
ト分析、ゲル電気泳動、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、他の核酸もしくは標的もし
くはシグナルの増幅方法、放射性標識、シンチレーション計数、およびアフィニ
ティークロマトグラフィーが含まれる。

【００４４】（合成核酸）例えば、プローブ、アレイ、増幅のための鋳型などとしての使用のためのヌク
レオチドは、以下に記載されるように、化学的に合成され得る。オリゴヌクレオ
チドプローブおよびプライマー、アンプリコンコード配列を含む合成核酸は、種
々の溶液法または固相法によって調製され得る。ホスファイト−トリエステル化
学、ホスホトリエステル化学、およびＨ−ホスホネート化学による核酸の固相合
成のための手順の詳細な記載は、広範に利用可能である。例えば、自動合成機を
使用するＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓの固相ホスホルアミダイ
トトリエステル法は、例えば、Ｉｔａｋｕｒａ、米国特許第４，４０１，７９６
号；Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ、米国特許第４，４５８，０６６号および同第４，５
００，７０７号に記載されている。Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ（
１９８４）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：６１５９−６１６８；
Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ（１９９５）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ２３：
３９８９−３９９４；ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳＹＮＴＨＥＳＩＳ：
ＡＰＲＡＣＴＩＣＡＬＡＰＰＲＯＡＣＨ，Ｇａｉｔ（編）、ＩＲＬＰｒｅ
ｓｓ，ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．（１９８４）（Ｊｏｎｅｓ、第２章、Ａ
ｔｋｉｎｓｏｎ、第３章、およびＳｐｒｏａｔ、第４章を参照のこと）；Ｆｒｏ
ｅｈｌｅｒ（１９８６）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．２７：４６９−４
７２；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１４：５３９
９−５４０７（１９８６）もまた参照のこと。オリゴヌクレオチドを精製する方
法には、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９８３）Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７−１４９
に記載されるように、未変性アクリルアミドゲル電気泳動、アニオン交換ＨＰＬ
Ｃが含まれる。合成オリゴヌクレオチドの配列は、任意の化学分解法（例えば、
Ｍａｘａｍ（１９８０）ＭａｔｈｏｄｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６５：４
９９−５６０，Ｘｉａｏ（１９９６）ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄＤｒｕｇＤｅｖ６：２４７−２５８、または固相化学分解手順につ
いては、Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ（１９８７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＳｙｍ
ｐ．Ｓｅｒ．１８：２４９−２５２を参照のこと）を使用して確認され得る。

【００４５】（核酸の増幅）種々の実施態様において、本発明のアンプリコン配列は、Ｄ２０Ｓ２１１から
Ｄ２０Ｓ１２０までを含む核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸；Ｄ２０
Ｓ１２０とＤ２０Ｓ２１１との間の距離にわたる核酸セグメントを含む。このア
ンプリコン領域中にマッピングされたクローン、ＧＤＢ遺伝子座、ＳＴＳマーカ
ー、および他のクローニングされた核酸セグメントを表１に示し、そしてこれら
には、例えば、ＷＩ−９２２７の核酸配列を含む。本発明の核酸は、当該分野で
公知の任意の増幅方法論を用いて同定または生成され得る。

【００４６】本発明のアンプリコン核酸は、アンプリコン配列（例えば、表１に示されるク
ローン、ＧＤＢ遺伝子座、およびＳＴＳマーカー）の任意のセグメントを含むか
、またはこれに隣接するプライマー対を用いて増幅され得る。ＳＴＳマーカーは
、マーカーを増幅するプライマー対によって部分的に規定される。Ｏｌｓｏｎ（
１９８９）前出および上記の説明を参照のこと。１つの実施態様において、本発
明のアンプリコンの存在および／またはコピー数は、ＰＣＲを用いて決定される
。代替的な実施態様において、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー対は、以下から
なる群から選択されるＳＴＳＰＣＲプライマー対である：ＡＦＭａ２３３ｗｇ
１、ＡＦＭ０８０ｙａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９
３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、ＷＩ−
９２２７、およびＡＦＭ２７６ｘｈ１。本発明のアンプリコンのすべてもしくは
一部の存在を検出するかまたはそのコピー数を定量するための他のＰＣＲプライ
マー対は、当業者によって容易に設計され得る。

【００４７】本発明の核酸の増殖は、例えば、ハイブリダイゼーションプローブの構築、配
列決定、クローンなどのために使用され得る。増幅プライマー対は、ヒト核酸の
サンプル中のアンプリコン配列の存在についてスクリーニングするために使用さ
れ得る。プライマー対は、さらなるアンプリコン種（例えば、多型、対立遺伝子
、および他の改変体など）を同定するために使用され得る。

【００４８】オリゴヌクレオチドは、種々のハイブリダイゼーション技術および条件を使用
して、アンプリコン配列を同定、検出、および増幅するために使用され得る。適
切なアンプリコン方法は、以下を含むがこれらに限定されない：ポリメラーゼ連
鎖反応、ＰＣＲ（ＰＣＲＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，ＡＧＵＩＤＥＴＯＭＥＴ
ＨＯＤＳＡＮＤＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｉｎｎｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉ
ｃＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）およびＰＣＲＳＴＲＡＴＥＧＩＥＳ（
１９９５）、Ｉｎｎｉｓ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ
．（Ｉｎｎｉｓ））、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ（１９８９）Ｇｅｎｏ
ｍｉｃｓ４：５６０；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４
１：１０７７；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ（１９９０）Ｇｅｎｅ８９：１１７）；転
写増幅（Ｋｗｏｈ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：１１７３）；および自律的（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）配列複製
（Ｇｕａｔｅｌｌｉ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ８７：１８７４）；Ｑβレプリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼ媒
介技術（例えば、ＮＡＳＢＡ，Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎ
ｔａｒｉｏ）；以下を参照のこと、Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３０７−３１６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕ
ｂｅｌ、ならびにＭｕｌｌｉｓ（１９８７）米国特許第４，６８３，１９５号お
よび同第４，６８３，２０２号；Ａｒｎｈｅｉｍ（１９９０）Ｃ＆ＥＮ３６−
４７；ＬｏｍｅｌｌＪ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３５：１８２６（１９８９）
；ＶａｎＢｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：２９１−２９４（１
９９０）；Ｗｕ（１９８９）Ｇｅｎｅ４：５６０；Ｓｏｏｋｎａｎａｎ（１９
９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３：５６３−５６４。インビトロ増幅さ
れた核酸をクローニングするための方法は、Ｗａｌｌａｃｅ、米国特許第５，４
２６，０３９号に記載される。大きな核酸を増幅する方法は、例えば、Ｃｈｅｎ
ｇ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３６９：６８４−６８５に要約される。

【００４９】本発明は、アンプリコン含有核酸をコードするＤＮＡを調製するための上記の
各々の方法からの生成物の増幅および操作または検出を提供する。ＰＣＲ技術に
おいて、増幅されるＤＮＡ領域の２つの境界に対して相補的なオリゴヌクレオチ
ドプライマーが、合成されそして使用される（例えば、Ｉｎｎｉｓを参照のこと
）。ＰＣＲは、核酸を増幅、同定、定量、単離、および操作するための種々のプ
ロトコルにおいて使用され得る。これらのプロトコルにおいて、増幅およびハイ
ブリダイゼーションのためのプライマーおよびプローブが生成され、これらは本
明細書中に列挙したＤＮＡ配列のすべてまたは任意の部分を含む。

【００５０】ゲノムＤＮＡを増幅する際に、１つの好ましい技術は、縮重オリゴヌクレオチ
ドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（「ＤＯＰ−ＰＣＲ」）であり、
これは例えば、Ｔｅｌｅｎｉｕｓ（１９９２）ＧｅｎｅｓＣｈｒｏｍｏｓｏｍ
ｅｓＣａｎｃｅｒ４：２５７−２６３；Ｔｅｌｅｎｉｕｓ（１９９２）Ｇｅ
ｎｏｍｉｃｓ１３：７１８−７２５；Ｘｉａｏ（１９９６）Ｃｙｔｏｇｅｎｅ
ｔ．Ｃｅｌｌ．Ｇｅｎｅｔ．７５：５７−６２によって記載される。ＤＯＰ−Ｐ
ＣＲは、部分的に縮重した配列のオリゴヌクレオチドを利用する。この縮重は、
低い最初のアニーリング温度を利用するＰＣＲプロトコルとともに、複数の、例
えば、ヒトにおいて約１０⁶の、所定のゲノム中の均一に分散した部位からのプ
ライミングを確実にする。

【００５１】ゲノムＤＮＡを増幅するための別の好ましい技術は、例えば、Ｌｕｃｉｔｏ（
１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：４４８７−
４４９２；Ｍｉｙａｓｈｉｔａ（１９９４）Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．ＣｅｌｌＧ
ｅｎｅｔ．６６：５４−５７；Ｖｏｏｉｊｓ（１９９３）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇ
ｅｎｅｔ．５２：５８６−５９７に記載されるような、リンカー−アダプターＰ
ＣＲによる。この手順において、ＤＮＡは、分別された染色体から抽出され、し
ばしば切断する制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓａｕ３Ａ１）を使用するこ
とによって完全に消化され、そして各々の末端において、アダプターオリゴヌク
レオチドに連結される。次いで、これらのフラグメントは、プライマーとしてア
ダプターオリゴヌクレオチドに対して相同な配列を使用して、ＰＣＲを用いて増
幅される。腫瘍ゲノムおよび正常なゲノムの高度に再現可能な大量の「提示」が
、オリゴヌクレオチドアダプターに連結された、ナノグラム量の、制限エンドヌ
クレアーゼ切断されたＤＮＡからのＰＣＲによって作製され得る。

【００５２】ＰＣＲ−増幅された配列はまた、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブとし
て、標識および使用され得る（しかし、本発明の核酸プローブは、本明細書中に
記載されるように、当該分野において周知である任意の合成技術または他の技術
を使用して生成され得る）。本発明の標識され増幅されたＤＮＡまたは他のオリ
ゴヌクレオチドもしくは核酸は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ゲノムライ
ブラリー、インサイチュ核酸などを含む、任意の核酸の供給源からのアンプリコ
ン配列をさらに同定および単離するために、または同定および定量するために、
プローブとして使用され得る。

【００５３】（クローン）本発明の核酸を得るための別の有用な手段は、例えば、ゲノムクローンまたは
ｃＤＮＡクローンまたは完全なゲノムクローンから単離された（または増幅され
た）インサートをスクリーニングおよびクローニングすることである。これらに
は、例えば、哺乳動物の人工染色体（例えば、Ａｓｃｅｎｚｉｏｎｉ（１９９７
）ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ．１１８：１３５−１４２を参照のこと）（ヒトの人
工染色体を含む、例えば、Ｗａｒｂｕｒｔｏｎ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ３８
６：５５３−５５５；Ｒｏｕｓｈ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７６：３８−
３９；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：３３３−３
３５を参照のこと）；酵母の人工染色体（ＹＡＣ）；細菌の人工染色体（ＢＡＣ
）；Ｐ１人工染色体（Ｗｏｏｎ（１９９８）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ５０：３０６−
３１６；Ｂｏｒｅｎ（１９９６）ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．６：１１２３−１１３
０）；ＰＡＣ（バクテリオファージＰ１由来のベクター、例えば、Ｉｏａｎｎｏ
ｕ（１９９４）ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．６：８４−８９；Ｒｅｉｄ（１９９
７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４３：３６６−３７５；Ｎｏｔｈｗａｎｇ（１９９７）
Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４１：３７０−３７８を参照のこと）；コスミド、プラスミ
ド、またはｃＤＮＡに含まれるゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー
が含まれる。ＢＡＣは、１２０＋Ｋｂインサートを含み得るベクターである。Ｂ
ＡＣは、Ｅ．ｃｏｌｉＦ因子プラスミド系に基づき、ミリグラム量で操作およ
び精製するのに簡単である。なぜなら、ＢＡＣプラスミドは、細胞当たり１〜２
コピーに保たれているからであり、ＹＡＣ（これもまた、本発明の方法において
使用され得る）で観察される再配列の問題が除外されるからである。ＢＡＣベク
ターは、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子およびグリーン蛍光タンパク質遺伝子（
Ｂａｋｅｒ（１９９７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ２５：１９５０
−１９５６）のようなマーカー遺伝子を含み得る。ＹＡＣＳはまた、８０〜７０
０ｋｂのサイズの範囲でインサートを使用および含有し得る。例えば、Ｔｕｃｋ
ｅｒ（１９９７）Ｇｅｎｅ１９９：２５−３０；Ａｄａｍ（１９９７）Ｐｌａ
ｎｔＪ．１１：１３４９−１３５８を参照のこと。Ｐ１は、７５〜１００Ｋｂ
のＤＮＡインサートを含み得る、Ｅ．ｃｏｌｉに感染するバクテリオファージで
あり（Ｍｅｊｉａ（１９９７）ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ７：１７９−１８６；Ｉ
ｏａｎｎｏｕ（１９９４）ＮａｔＧｅｎｅｔ６：８４−８９）、λライブラ
リーと非常によく似た方法でスクリーニングされる。

【００５４】（核酸の配列決定）新規に単離されたＤＮＡの配列決定は、本発明のアンプリコンをコードする核
酸を同定および特徴付けする。単離されたアンプリコンをコードする核酸の配列
決定はまた、その配列の可能な機能的特徴（例えば、オンコジーンポリペプチド
についてのコード配列、転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハン
サー）など）を同定する。

【００５５】アンプリコンをコードする核酸配列は、ベクター中のインサートとして、ベク
ターから遊離および単離されたインサートとして、または種々の他の形態のいず
れかにおいて（すなわち、増幅産物として）配列決定され得る。インサートは、
制限酵素によってベクターから遊離され得るか、またはＰＣＲによって増幅され
得るか、またはポリメラーゼによって転写され得る。インサートの配列決定のた
めに、Ｎ末端またはＣ末端に基づくプライマー、またはもともとのファージもし
くは他のベクターにおける挿入点に基づくプライマーが使用され得る。さらなる
プライマーは、重複する配列を提供するために合成され得る。種々の核酸配列決
定技術が周知であり、そして科学文献および特許文献に記載される。例えば、Ｒ
ｏｓｅｎｔｈａｌ（１９８７）前出；配列決定のためのバイオセンサーチップの
使用について、Ａｒｌｉｎｇｈａｕｓ（１９９７）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：
３７４７−３７５３；Ｐａｓｔｉｎｅｎ（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２
：１３９１−１３９７；Ｎｙｒｅｎ（１９９３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２
０８：１７１−１７５を参照のこと。赤外線補助レーザー脱離／イオン化（ＭＡ
ＬＤＩ）質量分析もまた、大きな核酸セグメント（例えば、ゲノムクローン）を
配列決定するために使用され得る；例えば、Ｂｅｒｋｅｎｋａｍｐ（１９９８）
Ｓｃｉｅｎｃｅ２８１：２６０−２６２を参照のこと。

【００５６】（核酸の標識）核酸を標識する方法は、当業者に周知である（上記の「検出可能な組成物を用
いて標識する」の定義を参照のこと）。好ましい標識は、アレイにおける使用お
よびインサイチュハイブリダイゼーションのために適切である標識である。１つ
の実施態様において、本発明の核酸プローブまたはサンプルは、ハイブリダイゼ
ーション反応の前に検出可能に標識される、あるいは、ハイブリダイゼーション
産物に結合する検出可能な標識が使用され得る。このような検出可能な標識には
、例えば、イムノアッセイの分野における物質のような、検出可能な物理的また
は化学的特性を有する任意の物質が含まれる。使用される特定の標識は、それが
プローブのアレイに基づくハイブリダイゼーションまたはインサイチュハイブリ
ダイゼーションを妨害しない限り、本発明には決定的ではない。しかし、蛍光標
識（例えば、フルオレセイン、Ｔｅｘａｓｒｅｄなど）を用いて直接的に標識
されたプローブは、染色体ＤＮＡハイブリダイゼーションのために好ましい。好
ましい実施態様において、標識は、アッセイの感度を最大化するために可能なほ
どの低コピー数で検出可能であり、そしてなおいかなるバックグラウンドシグナ
ルを上回って検出可能である。標識は、好ましくは高度に局在化したシグナルを
有し、とりわけ、染色体（例えば、中期染色体として）に対して染色を物理的に
マッピングする場合に高度の空間的な分解能を提供する。従って、特に好ましい
蛍光標識は、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰおよびＴｅｘａｓＲｅｄ−５−
ｄＵＴＰを含む（以下の実施例１を参照のこと）。

【００５７】種々の実施態様において、標識は、当業者に公知の種々の手段においてプロー
ブに結合し得る。種々の実施態様において、核酸プローブは、ニックトランスレ
ーション、ＰＣＲ、またはランダムプライマー伸長を用いて標識される（例えば
、Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。

【００５８】（アンプリコンプローブ）本発明は、ヒトゲノム核酸のサンプル中のアンプリコンの存在についてスクリ
ーニングするための核酸プローブを提供する。種々の実施態様において、プロー
ブは、核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む。この配列はＤ２０Ｓ
２１１からＤ２０Ｓ１２０までを含み；そしてＤ２０Ｓ１２０とＤ２０Ｓ２１１
との間の距離にわたる。これらのアンプリコン領域にハイブリダイズする任意の
プローブが、サンプル中の対応する領域を検出する際の使用に適切である。表１
を参照のこと。プローブを調製する方法は、当業者に周知である（例えば、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋまたはＡｕｓｕｂｅｌを参照のこと）。

【００５９】１つの実施態様において、本発明のプローブは、以下からなる群より選択され
るＳＴＳマーカーに特異的にハイブリダイズする核酸を含む：ＡＦＭａ２３３ｗ
ｇｌ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｚ５２６３６）、ＡＦＭ０８０ｙａ１（Ｇｅｎｂ
ａｎｋ登録番号Ｚ２７０６７）、ＡＦＭ０６９ｙａｌ、ＷＩ−１６７４８（Ｇｅ
ｎｂａｎｋ登録番号Ｇ２４１３３）、ＷＩ−９９３９（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号
Ｇ１１７６６）、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｚ５１８７３
）、ＷＩ−６５７８（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｇ０６１１５）、ＡＦＭ２２４ｚ
ｄ１２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｚ６６８２４）、ＷＩ−９２２７（Ｇｅｎｂａ
ｎｋ登録番号Ｇ０７１８９）、およびＡＦＭ２７６ｘｈ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録
番号Ｚ１７２０２）。

【００６０】別の実施態様は、以下からなる群から選択されるＧＤＢ遺伝子座核酸配列に特
異的にハイブリダイズする核酸を含むプローブを提供する：Ｄ２０Ｓ２１１（Ｇ
ｅｎｂａｎｋ登録番号Ｚ２７０６７）、Ｄ２０Ｓ８５４（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番
号Ｚ５２６３６）、Ｄ２０Ｓ８７６（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｚ５３２５８）、
Ｄ２０Ｓ１０４４、Ｄ２０Ｓ９１３（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｚ５１８７３）、
Ｄ２０Ｓ７２０、およびＤ２０Ｓ１２０（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｚ１７２０２
）。

【００６１】さらに別の実施態様は、以下からなる群から選択される、クローン化されたゲ
ノム核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含むプローブを提供する：Ｒ
ＭＣ２０Ｂ４０９７、ＲＭＣ２０Ｂ４１０３、ＲＭＣ２０Ｐ４０１６、ＲＭＣ２
０Ｂ４１３０、ＲＭＣ２０Ｐ４１８５、ＲＭＣ２０Ｂ４１８８、ＲＭＣ２０Ｂ４
１０９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１０、ＲＭＣ２０Ｐ４０２８、ＲＭＣ２０Ｐ４００３
、ＲＭＣ２０Ｂ４０９９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１８、ＲＭＣ２０Ｐ４０６９、ＲＭ
Ｃ２０Ｂ４１２１、ＲＭＣ２０Ｂ４０８７、およびＲＭＣ２０Ｐ４０７０。

【００６２】本発明はまた、Ｄ２０Ｓ２１１〜Ｄ２０Ｓ１２０を含む核酸配列のいくつかま
たは全てを増幅し得るポリメラーゼ連鎖反応プライマー対を含むサンプル中のア
ンプリコンの存在についてスクリーニングするためのプローブを提供する。１つ
の実施態様において、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー対は、以下からなる群か
ら選択されるＳＴＳＰＣＲプライマー対である：ＡＦＭａ２３３ｗｇｌ、ＡＦ
Ｍ０８０ｙａｌ、ＡＦＭ０６９ｙａｌ、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、Ａ
ＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄｌ２、ＷＩ−９２２７
、およびＡＦＭ２７６ｘｈｌ。

【００６３】プローブは、本明細書に開示されるように、１つ以上のアンプリコン核酸配列
、またはこのような配列を含むクローンを組合せ、そして標識化することによっ
て調製され得る。インサイチュハイブリダイゼーション方法論を使用してアンプ
リコン配列を検出する場合、この構築物は断片化されて、細胞へ容易に透過し、
そして標的核酸にハイブリダイズする、より小さな核酸フラグメントを提供する
。断片化は、当業者に周知の多くの方法のいずれかによってなされ得る。好まし
い方法には、分子を選択的に切断するための制限酵素を用いる処理、またはある
いはＭｇ²⁺の存在下で核酸を短時間加熱することが、挙げられる。多くの場合に
おいて、ニックトランスレーションのような標識化プロセスは，適切な長さのプ
ローブを提供し得る。プローブは、好ましくは、約５０塩基対（ｂｐ）〜約２０
００ｂｐ、より好ましくは約１００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、そして最も好ましく
は約１５０ｂｐ〜約５００ｂｐの範囲の平均フラグメント長に断片化される。

【００６４】（核酸ハイブリダイゼーション技術）本明細書中に開示されるハイブリダイゼーション技術は、ヒト核酸のサンプル
においてアンプリコンの存在についてスクリーニングするために、本発明の方法
において使用され得る。本発明のアンプリコンを使用するハイブリダイゼーショ
ンはまた、２０ｑ１３．２（これは、多数の癌の存在および／または予後の指標
である）におけるコピー数の変化を検出し得る。これらには、以下が含まれるが
、これらに限定されない：乳房、前立腺、子宮頸部、卵巣、膀胱、頭部および頸
部、ならびに結腸。この方法は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下（上記の定義を参照のこと）で、ヒト核酸をプローブ（アンプリコン配列を
含む）と接触させる工程、ハイブリダイゼーション複合体の形成を検出する工程
、およびサンプル中のアンプリコンコピー数を定量する工程を包含する。ハイブ
リダイゼーション技術はまた、アンプリコン種、アイソフォーム、対立遺伝子な
らびに多型性を含むアンプリコン遺伝子および遺伝子産物（すなわち、例えば、
オンコジーンをコードするｍＲＮＡ）を同定、単離、ならびに特徴付けるために
利用され得る。核酸ハイブリダイゼーション技術を使用する特定のＤＮＡおよび
ＲＮＡ測定のための種々の方法は、当業者に公知である。例えば、ＮＵＣＬＥＩ
ＣＡＣＩＤＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ，ＡＰＲＡＣＴＩＣＡＬＡＰＰ
ＲＯＡＣＨ、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．編、ＩＲＬＰｒｅｓｓ，１９８５；Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと。

【００６５】サンプル中のアンプリコンをコードする核酸の存在または非存在を評価するた
ための１つの方法は、サザン転写を含む。サザンブロットにおいて、ゲノムまた
はｃＤＮＡ（代表的に、電気泳動ゲル上で断片化および分離される）は、標的遺
伝子に特異的なプローブにハイブリダイズされる。標的領域に対するプローブか
らのハイブリダイゼーションシグナルと、正常なゲノムＤＮＡ（例えば、アンプ
リコン配列を含む腫瘍ゲノムの非増幅化部分）の分析からのコントロールプロー
ブシグナルとのハイブリダイゼーションの強度の比較は、標的核酸の相対的コピ
ー数の推定を提供する。

【００６６】同様に、ノーザン転写は、アンプリコン配列を含むＲＮＡの検出のために使用
され得る。例えば、ＲＮＡは、酸グアニジウム−フェノール−クロロホルム抽出
方法を使用して所定の細胞サンプルから単離される。次いで、ＲＮＡは電気泳動
されて異なる種を分離し、そしてゲルからニトロセルロースメンブレンへ転写さ
れる。サザン転写でのように、標識化プローブまたはＰＣＲを使用して、アンプ
リコン核酸の存在または非存在を同定し得る。

【００６７】サンドイッチアッセイは、タンパク質または核酸を検出または単離するための
商業的に有用なハイブリダイゼーションアッセイである。このようなアッセイは
、しばしば、代表的には溶液中で、固体支持体および標的化「シグナル」核酸に
共有結合的に固定化された「捕捉」核酸またはタンパク質を利用する。臨床的ま
たは他のサンプルは、標的核酸およびタンパク質を提供する。この「捕捉」核酸
またはタンパク質および「シグナル」核酸またはタンパク質は、標的核酸または
タンパク質とハイブリダイズするか、または標的核酸またはタンパク質に結合し
て、「サンドイッチ」ハイブリダイゼーション複合体を形成する。有効にするた
めに、シグナル核酸またはタンパク質は、実質的に捕捉核酸またはタンパク質と
ハイブリダイズまたは結合し得ない。

【００６８】代表的に、オリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイゼーションを検出す
るために使用される標識化シグナル核酸である。相補的なプローブ核酸またはシ
グナル核酸は、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドの存在を検出するために
代表的に使用されるいくつかの方法のいずれか１つによって標識化され得る。検
出方法は、上記のような任意の標識を使用し得る。本発明の好ましい実施態様に
おいて、サンプル核酸は、テキサスレッドまたはフルオレセインで標識化される
。他の標識には、標識化抗体に結合するリガンド、蛍光団、化学発光薬剤、酵素
、および標識化リガンドに特異的な結合対メンバーとして作用し得る抗体が挙げ
られ得る。

【００６９】ハイブリダイゼーション複合体の検出は、標的およびプローブのポリヌクレオ
チドまたは核酸の二重鎖に対して複合体を生成するシグナルの結合を必要とし得
る。代表的に、このような結合は、リガンド結合体化プローブと、シグナルで結
合体化した抗リガンドとの間のリガンドおよび抗リガンド相互作用（すなわち、
抗体−抗原または相補的核酸結合）によって生じる。標識はまた、ハイブリダイ
ゼーション複合体の間接的な検出を可能にし得る。例えば、標識がハプテンまた
は抗原である場合、サンプルは、抗体を使用して検出され得る。これらの系にお
いて、シグナルは、抗体に対して蛍光標識もしくは放射性標識または酵素的分子
を付着することによって生成される。ハイブリダイゼーションアッセイの感度は
、検出される標的核酸またはシグナルを倍増する、標的核酸またはシグナル増幅
系の使用によって増強され得る。あるいは、配列は、一般に、非特異的ＰＣＲプ
ライマーおよび変異の指標である特定の配列に対してプローブされた後に増幅さ
れた標的領域を使用して増幅され得る。

【００７０】（インサイチュハイブリダイゼーション）アンプリコン配列のコピー数またはタンパク質をコードするアンプリコンの発
現のレベルを決定するための代替の手段は、インサイチュハイブリダイゼーショ
ンである。インサイチュハイブリダイゼーションアッセイは、周知である（例え
ば、Ａｎｇｅｒｅｒ（１９８７）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ１５２：６
４９）。一般に、インサイチュハイブリダイゼーションは、以下の主要な工程を
包含する：（１）分析される組織または生物学的構造の固定；（２）標的ＤＮＡ
の接近性を増大するため、および非特異的結合を減少するための、生物学的構造
のプレハイブリダイゼーション処理；（３）生物学的構造または組織の核酸への
、核酸の混合物のハイブリダイゼーション；（４）ハイブリダイゼーションにお
いて結合しなかった核酸フラグメントを除去するためのハイブリダイゼーション
後洗浄および（５）ハイブリダイズした核酸フラグメントの検出。これらの工程
の各々において使用される試薬および使用のためのこれらの条件は、特定の適用
に依存して変化する。

【００７１】代表的なインサイチュハイブリダイゼーションにおいて、細胞は、固体支持体
、代表的にはガラススライドに固定される。核酸がプローブされる場合、細胞は
，代表的に熱またはアルカリを用いて変性される。次いで、細胞は、タンパク質
をコードする核酸配列に特異的な標識化プローブのアニーリングを許容するため
に中程度の温度でハイブリダイゼーション溶液と接触させる。プローブは、代表
的には標識化される（すなわち、放射性同位体または蛍光レポーターを用いる）
。いくつかの適用において、繰り返し配列のハイブリダイゼーション能力をブロ
ックすることが必要である。この場合において、ヒトゲノムＤＮＡまたはＣｏｔ
−１ＤＮＡを使用して、非特異的ハイブリダイゼーションをブロックする。好
ましいサイズ範囲は、約２００ｂｐ〜約１００塩基、より好ましくは二本鎖のニ
ックトランスレーション化核酸に対して約４００と約８００ｂｐとの間である。
本発明の方法を用いる使用に適切なハイブリダイゼーションプロトコルは、例え
ば、Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ（１９８４）ＥＭＢＯＪ．３：１２２７〜１２３４；
Ｐｉｎｋｅｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８
５：９１３８〜９１４２；ＥＰＯＰｕｂ．Ｎｏ．４３０，４０２；Ｍｅｔｈｏ
ｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第３３巻、ＩｎＳｉｔｕ
ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃｈｏｏ編，Ｈｕｍａｎ
ａＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（１９９４）に記載される。特定の好まし
い実施態様において、Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８９：５３２１〜５３２５（１９９２）のハ
イブリダイゼーションプロトコルが、使用される。

【００７２】（核酸アレイ）アンプリコンを含む配列の検出、コピー数の定量、配列決定などのための核酸
ハイブリダイゼーションアッセイは、アレイに基づく形式で実施され得る。アレ
イは、サンプル核酸とハイブリダイズされる、複数の異なる「プローブ」または
「標的」核酸（または他の化合物）である。アレイ形式において、多数の異なる
ハイブリダイゼーション反応が、本質的に「並行して」実行され得る。これによ
って、迅速に、本質的に同時に、多数の遺伝子座の評価が、提供される。アレイ
に基づく形式でハイブリダイゼーション反応を実施する方法はまた、例えば、Ｐ
ａｓｔｉｎｅｎ（１９９７）ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．７：６０６〜６１４；（１
９９７）Ｊａｃｋｓｏｎ（１９９６）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ１４：１６８５；Ｃｈｅｅ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４：６１０；
ＷＯ９６／１７９５８に、記載される。

【００７３】アレイ核酸プローブを、固体表面に固定化した。これらのプローブは、本発明
の全てのアンプリコンの部分、ならびにゲノムのほかの部分由来のプローブを含
む。アンプリコン核酸は、例えば、ＭＡＣ、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、Ｐ１、コ
スミド、プラスミド（上記のような）、ゲノムクローンのインターＡｌｕＰＣ
Ｒ産物、ゲノムクローンの制限消化物、ｃＤＮＡクローン、増幅（例えば、ＰＣ
Ｒ）産物などから得られ得る。種々の実施態様において、アレイ核酸は、以下に
記載されるように、本発明のアンプリコン配列にわたるかまたは本発明のアンプ
リコン配列を含むクローンの、以前にマッピングされたライブラリー、ならびに
ゲノムの他の領域由来のクローンに由来する。アレイは、（試験サンプルおよび
参照サンプルを用いて）サンプル核酸の単一集団とハイブリダイズされ得るか、
または２つの示差的に標識化された収集物とともに使用され得る。

【００７４】核酸を種々の固体表面上に固定化するための多くの方法は、当該分野で公知で
ある。広範に種々の有機ポリマーおよび無機ポリマー、ならびに他の材料（天然
および合成の両方）は、固体表面のための材料として利用され得る。例示的な固
体表面には、例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、石英、ジアゾ化メ
ンブレン（紙またはナイロン）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロー
ス、およびセルロースアセテートが挙げられる。さらに、プラスチック（例えば
、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなど）が、使用され得る。利用
され得る他の材料には、紙、セラミックス、金属、メタロイド、半導体材料、サ
ーメットなどが挙げられる。さらに、ゲルを形成し得る物質が、使用され得る。
このような材料には、例えば、タンパク質（例えば、ゼラチン）、リポポリサッ
カリド、シリケート、アガロースおよびポリアクリルアミドが挙げられる。固体
表面が多孔性である場合、種々の孔サイズが、系の性質に依存して利用され得る
。

【００７５】表面を調製するために、多くの異なる材料が、特に積層板として利用されて、
種々の特性を獲得し得る。例えば、タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）
または高分子の混合物（例えば、デンハルト溶液）を利用して、非特異的結合を
回避し得、共有結合を単純化し得、シグナル検出などを増強し得る。化合物と表
面との間の共有結合が所望される場合、その表面は、通常、多官能性であるか、
または多官能化され得る。表面上に存在し、そして連結に使用され得る官能基に
は、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル
基、メルカプト基などが挙げられ得る。広範に種々の化合物の種々の表面への連
結の様式は周知であり、そして文献に十分に例示されている。例えば、分子への
種々の官能基の導入による核酸の固定化のための方法は、公知である（例えば、
Ｂｉｓｃｈｏｆｆ（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６４：３３６〜
３４４；Ｋｒｅｍｓｋｙ（１９８７）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：２
８９１〜２９１０を参照のこと）。改変されたヌクレオチドは、改変されたヌク
レオチドを含むＰＣＲプライマーを使用して、または改変されたヌクレオチドで
の酵素的末端標識によって、標的上に配置され得る。本発明の核酸アレイのため
のメンブレン支持体（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ポリプロピレン）
の使用は、比較的高いエレメント密度で標的を配列する手動およびロボット利用
の方法を利用する十分に開発された技術のために、有利である。このようなメン
ブレンは、一般に利用可能であり、そしてメンブレンへのハイブリダイゼーショ
ンについてのプロトコルおよび機器は、周知である。

【００７６】所定のアッセイ形式を最適化するために、当業者は、メンブレンの型、蛍光色
素、励起および放出バンド、スポットサイズなどの異なる組合せについての標識
（例えば、蛍光）検出の感度を決定し得る。低い蛍光バックグラウンドのメンブ
レンが、使用され得る（例えば、Ｃｈｕ（１９９２）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ
ｓｉｓ１３：１０５〜１１４を参照のこと）。候補メンブレン上での種々の直
径のスポット（「標的エレメント」）の検出についての感度は、例えば、蛍光的
に末端標識されたＤＮＡフラグメントの連続希釈のスポッティングによって、容
易に決定され得る。次いで、これらのスポットは、従来の蛍光顕微鏡を使用して
画像化される。従って、感度、線形性、ならびに蛍光色素および固体表面（例え
ば、メンブレン、ガラス、石英ガラス）の種々の組合せからの達成可能なダイナ
ミックレンジが、決定され得る。公知の相対比における蛍光色素の連続希釈の対
もまた、分析され得る。これは、蛍光の比が、プローブが固定化される基材の検
出器および蛍光によって許容されるダイナミックレンジにわたって、実際の蛍光
色素比を反映する精度を決定する。

【００７７】１ｍｍ直径〜１ｕｍの範囲である種々のサイズの標的エレメントが、これらの
材料とともに使用され得る。少量の濃縮された固定化プローブＤＮＡを含む、よ
り小さな標的エレメントは、高度に複雑な比較ハイブリダイゼーションのために
使用され得る。なぜなら、各標的エレメントに結合するために利用可能なサンプ
ルの総量が制限されるからである。従って、少量の濃縮されたＤＮＡを含む小さ
なアレイ標的エレメントを有することが有利であり、その結果、得られるシグナ
ルが、高度に局在化されそして明るい。このような小さなアレイ標的エレメント
は、代表的に、１０⁴／ｃｍ²よりも大きい密度を有するアレイにおいて使用され
る。１ｃｍ²面積の蛍光画像を定量し得る比較的単純なアプローチは、単一の画
像における多数の標的エレメントからのデータの獲得を可能にすることが記載さ
れている（例えば、Ｗｉｔｔｒｕｐ（１９９４）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ１６：２
０６〜２１３を参照のこと）。

【００７８】メンブレンよりも十分に低い蛍光を有する固体表面基材（例えば、ガラス、石
英、または小さなビーズ）上のアレイは、よりよい感度を達成し得る。ガラスま
たは石英ガラスのような基材は、これらが非常に低い蛍光基材、および非常に効
率的なハイブリダイゼーション環境を提供することにおいて有利である。標的核
酸のガラスまたは合成石英ガラスへの共有的な付着は、多くの公知の技術に従っ
て達成され得る（上記に記載される）。核酸は、市販の試薬を使用して、簡便に
ガラスに結合され得る。例えば、多くの官能基を有するシラン処理ガラス（ｓｉ
ｌａｎｉｚｅｄｇｌａｓｓ）の調製のための材料は、市販されているか、また
は標準的技術を使用して調製され得る（例えば、Ｇａｉｔ（１９８４）Ｏｌｉｇ
ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐ
ｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．を参照のこと）。石
英カバースリップ（これは、ガラスよりも少なくとも１０倍低い自己蛍光を有す
る）もまた、シラン処理され得る。

【００７９】あるいは、プローブはまた、市販のコーティング化ビーズまたは他の表面上に
固定化され得る。例えば、ビオチン末端標識化核酸は、市販のアビジンコーティ
ング化ビーズに結合され得る。ストレプトアビジンまたは抗ジゴキシゲニン抗体
はまた、例えば、プロテインＡを使用するタンパク質媒介カップリング、続く標
準的プロトコルによって、シラン処理ガラスに付着され得る（例えば、Ｓｍｉｔ
ｈ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８：１１２２〜１１２６を参照のこと）。
ビオチンまたはジゴキシゲニン末端標識化核酸は、標準的技術に従って調製され
得る。ビーズに付着された核酸に対するハイブリダイゼーションは、ハイブリダ
イゼーション混合物においてそれらを懸濁すること、次いで、洗浄後の分析のた
めにガラス基材上にそれらを沈着させることによって達成される。あるいは、ア
ビジンコーティングされているか、またはアビジンコーティングされていない、
常磁性粒子（例えば、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子）が、使用され得る。

【００８０】１つの特定の好ましい実施態様において、プローブ核酸は、表面（例えば、ガ
ラスまたは石英表面）上にスポットされる。核酸は、ジメチルスルホキシド（Ｄ
ＭＳＯ）およびニトロセルロースの混合物中に溶解され、そしてアミノ−シラン
コーティング化ガラススライド上にスポットされる。小さな毛管を使用して、プ
ローブ混合物を「スポット」し得る。

【００８１】（核酸アレイを使用する比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ））比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）は、単回実験において、ゲノム
全体を通じてＤＮＡ配列コピー数バリエーションを検出およびマッピングし得る
。ＣＧＨの１つの改変において、ゲノムは、中期染色体の使用による細胞遺伝地
図として提供される。好ましい実施態様において、中期染色体の代わりに、ハイ
ブリダイゼーションプローブは、本発明のアンプリコン配列（ならびに実施例１
で詳細に記載されるような、ゲノムの他の配列）を含むゲノム配列のアレイであ
る。相対的なコピー数はまた、中期染色体に基づくＣＧＨおよびアレイに基づく
ＣＧＨの両方において、蛍光的に標識化された試験核酸および参照核酸のハイブ
リダイゼーションによって測定され得る。

【００８２】中期染色体に基づくＣＧＨにおいて、総ゲノムＤＮＡは、「試験」細胞集団お
よび「参照」細胞集団から単離され、異なる蛍光色素で標識化され、そして正常
な中期染色体に対してハイブリダイズされる。Ｃｏｔ−１ＤＮＡを使用して、
繰り返し配列のハイブリダイゼーションを抑制する。染色体上のある位置におけ
る２つの蛍光色素の蛍光強度の得られた比は、試験ゲノムおよび参照ゲノムにお
ける対応するＤＮＡ配列のコピー数の比にほぼ比例する。従って、ＣＧＨは、中
期染色体によって提供される細胞遺伝地図に参照される全ゲノムのコピー数分析
を提供する。しかし、中期染色体ＣＧＨの使用は、分解能を１０〜２０メガベー
ス（Ｍｂ）に制限し、接近した空間の異常性の分解能を妨げ、そしてＣＧＨの結
果と細胞遺伝の精度を伴うゲノム情報および資源との関連性のみを可能にする。

【００８３】従って、好ましい実施態様において、同様のハイブリダイゼーション方法論が
、アンプリコン配列を含む核酸（または、アンプリコン配列を位置的にマッピン
グする場合には、目的の領域に隣接するゲノム核酸）を含むマッピングされたク
ローンのアレイを用いて使用される。これは、クローンのサイズおよび／または
クローン間の地図間隔によって決定される分解能によって、アンプリコンコピー
数の測定を可能にする。アレイに基づくＣＧＨにおいて、分解能は、標的クロー
ンのゲノム間隔によって決定される。プローブとしての連続的なクローン範囲の
領域からの重複クローンの使用は、クローン長よりも短い（５０Ｋｂ程度低い）
ゲノム分解能を有するマッピングを可能にする。従って、ここで、ヒトゲノムの
物理的地図に対するアンプリコンの程度をマッピングすることの両方が可能であ
る。この方法論はまた、アンプリコンの増幅レベルおよびアンプリコン内の部分
領域を定量的に測定する。さらに、その分析時間は、中期染色体に基づくＣＧＨ
よりも非常に短いので、大量のサンプル（例えば、腫瘍または他の組織サンプル
）上でこれらの分析を実施することが可能である。これは、速度および分解能の
両方を増大し、これを用いて、反復性の異常領域（例えば、増幅、転座）が同定
され得、そしてコピー数が確認された。

【００８４】アレイＣＧＨは、いくつかの腫瘍が単一の領域にわたって均一の高いアンプリ
コンコピー数を有する一方、その他の腫瘍は、数百キロベースにわたって伸長す
るコピー数の連続的な変化を示したことを示してきた。増幅された領域内のコピ
ー数におけるこれらの改変は、時々、薬物選択下におけるインビトロ系で観察さ
れるように、コピー数が増加されるにつれ増幅されたセグメントの進行性の「ト
リミング」を含む増幅プロセスに起因し得る。従って、増幅を駆動する核酸配列
、または「臨界配列」は、アンプリコン内の最も高いコピー数の位置で見出され
る。多くの増幅事象の後、この「臨界遺伝子」（最小アンプリコン配列）は、非
駆動セグメントが「トリミング」された後に残存する。本発明は、第２０染色体
の２０ｑ１３．２中の新規な臨界最小アンプリコン配列を同定する。

【００８５】高コピー数の本発明のアンプリコンはまた、転写された配列および／または翻
訳された配列（例えば、オンコジーンコード配列）を同定するために使用され得
る。増幅された領域から候補オンコジーンを評価する際の中心工程の１つは、そ
れらの発現を評価することである。腫瘍は、本発明のプローブを用いてスクリー
ニングされて、可能性のあるオンコジーン転写産物（すなわち、ｍＲＮＡ）が同
定され得る。パラフィンに包埋される腫瘍サンプルの本発明のプローブとのハイ
ブリダイゼーションは、アンプリコン転写産物の迅速な同定を可能にする。さら
に、ｍＲＮＡに対するインサイチュハイブリダイゼーションは、１回のハイブリ
ダイゼーションにおいて多くの異なる腫瘍における遺伝子発現の評価を可能にす
る。この胚スループット法は、候補オンコジーンから発現データを得るプロセス
を、実質的に非常に加速させる。

【００８６】（ヒト第２０染色体の２０ｑ１３．２領域）本発明は、ヒト染色体２０ｑ１３．２における新規なアンプリコン配列を同定
した。代替の実施態様において、例えば、プローブとして使用される本発明の単
離されたアンプリコン配列は、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０を含み、かつ
Ｄ２０Ｓ１２０とＤ２０Ｓ２１１との間の距離にかかる核酸配列に特異的にハイ
ブリダイズする核酸セグメントを含む。本発明のプローブは、Ｄ２０Ｓ１２０と
Ｄ２０Ｓ２１１との間の距離にかかる任意の核酸配列、２０ｑ１３．２領域にお
ける任意のクローン、ＧＤＢ遺伝子座またはＳＴＳマーカー（例えば、表１に列
挙される例示的なクローン、ＧＤＢ遺伝子座、ＳＴＳおよび他のマーカー（例え
ば、ＷＩ−９２２７））に特異的にハイブリダイズする核酸を含み得る。

【００８７】コピー数において改変される場合、本発明のアンプリコンは、癌（特に、ヒト
乳癌）に関連する。より攻撃的な腫瘍は、高いアンプリコンコピー数を有する可
能性が高い。従って、本発明は、癌を診断、予後および処置するための、これら
のアンプリコンを含む新規なプローブを提供する。本発明の新規なアンプリコン
を特徴付けるに有用ないくつかの例示的な遺伝子座およびマーカーを、以下に特
徴付ける。本発明の新規なアンプリコンセグメントを特徴付けるために使用され
得るさらなるクローン、ＧＤＢ遺伝子座、ＳＴＳおよび他のマーカーについては
表Ｉを参照のこと。

【００８８】（Ｄ２０Ｓ１２０）Ｄ２０Ｓ１２０は、例えば、Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ（１９９２）「Ａｓｅ
ｃｏｎｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｌｉｎｋａｇｅｍａｐｏｆｔｈｅｈ
ｕｍａｎｇｅｎｏｍｅ」、Ｎａｔｕｒｅ３５９：７９４−８０１；Ｇｙａｐ
ａｙ（１９９４）「Ｔｈｅ１９９３−９４Ｇｅｎｅｔｈｏｎｈｕｍａｎ
ｇｅｎｅｔｉｃｌｉｎｋａｇｅｍａｐ」ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．７（２
ＳｐｅｃＮｏ）：２４６−３３９によって記載されるように、ヒト第２０染
色体の２０ｑ１３領域にマップされたＧＤＢマーカーである。これはまた、クロ
ーンＡＦＭ２７６ｘｈ１またはＲＨ３６１として参照されている。Ｄ２０Ｓ１２
０配列は寄託されている（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号第Ｚ１７２０２号）。そのＳ
ＴＳマーカーの命名はＡＦＭ２７６ｘｈ１である（表１を参照のこと）。

【００８９】（Ｄ２０Ｓ２１１）Ｄ２０Ｓ２１１は、例えば、Ｇｙａｐａｙ（１９９４）（前出）によって記載
されるように、ヒト第２０染色体の２０ｑ１３領域にマップされたＧＤＢマーカ
ーである。そのＳＴＳマーカーは、ＡＦＭ０８０ｙａ１である（表１を参照のこ
と）。Ｄ２０Ｓ２１１配列は寄託されている（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号第Ｚ２７
０６７号）。

【００９０】（ＷＩ−９２２７）ＷＩ−９２７７は、ヒト第２０染色体の２０ｑ１３領域にマップされた。１３
１９塩基対のアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）マーカーである。ＷＩ−９２７
７は寄託されている（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号第Ｇ０７１８９号）。

【００９１】（Ｄ２０Ｓ９１３）Ｄ２０Ｓ９１３は、例えば、Ｄｉｂ（１９９６）「Ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓ
ｉｖｅｇｅｎｅｔｉｃｍａｐｏｆｔｈｅｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅ
ｂａｓｅｄｏｎ５，２６４ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅｓ」、Ｎａｔｕ
ｒｅ３８０：１５２−１５４によって記載されるように、ヒト第２０染色体の
２０ｑ１３領域にマップされたＧＤＢマーカーである。そのＳＴＳの命名は、Ａ
ＦＭａ０７２ｚｂ９である（表１を参照のこと）。Ｄ２０Ｓ９１３配列は寄託さ
れている（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号第Ｚ５１８７３号）。

【００９２】（プローブを含むキット）本発明はまた、染色体異常および第２０染色体上のアンプリコンコピー数にお
ける変更の検出のための診断用キットを提供する。好ましい実施態様において、
このキットは、本発明のアンプリコンに対する１つ以上のプローブを含む。この
キットはさらに、ブロッキング核酸（すなわち、Ｃｏｔ−１ＤＮＡ）およびキ
ットの内容を使用する時および方法を記載する指示資料を含む。このキットはま
た、以下の１つ以上を含み得る：プローブの検出を容易にするための種々の標識
または標識化剤、ハイブリダイゼーションのための試薬（緩衝液、分裂中期スプ
レッド（ｍｅｔａｐｈａｓｅｓｐｒｅａｄ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
および他のブロッキング剤を含む）、ｔＲＮＡ、ＳＤＳサンプリングデバイス（
微細な針、スワブ、吸引機などを含む）、陽性および陰性ハイブリダイゼーショ
ンコントロールなど。

【００９３】（実施例）以下の実施例は、本発明の例示するために提供されるが、限定するためではな
い。

【００９４】（実施例１：高分解能比較ゲノムハイブリダイゼーション方法論）本発明は、ヒト核酸のサンプル中の本発明のアンプリコンの存在についてスク
リーニングするための方法を提供する。この方法は、プローブがストリンジェン
トな条件下でアンプリコン配列に選択的に結合し得る条件下で、核酸をアンプリ
コン配列含有プローブと接触させる工程、およびハイブリダイゼーション複合体
の形成を検出する工程を包含する。以下の実施例は、好ましい方法論「高分解能
の、アレイに基づく比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）」（これは、
サンプル間の単一コピー数の差異を検出し得る）を詳述する。

【００９５】（高分解能の、アレイに基づく比較ゲノムハイブリダイゼーション装置）本発明は、改良された性能に寄与する、高分解能アレイＣＧＨ方法論に対する
新規な特徴を提供する。高密度のプローブＤＮＡを、アレイ基板に結合させる。
この基板は、代表的には、ガラスまたは石英の顕微鏡スライドである。石英スラ
イドが好ましい。なぜなら、それらは、ガラスよりかなり低い固有の蛍光を有し
、従って、蛍光測定を妨害し得るバックグラウンド光をあまり産生しないからで
ある。ガラススライドもまた使用され得る。それらはあまり高価ではなく、そし
て適切な性能を提供する。

【００９６】アレイからの蛍光シグナルを、ＣＣＤカメラに装着したカスタムビルト大視野
画像化システム（広視野画像化システム）を使用して獲得する。アレイを含む溶
融シリカまたは溶融石英の基板を、後側からプリズムを通じる励起光によって照
射する。コリメーティングレンズ（スライドの下の全て）を通じてアークランプ
によって供給される励起光は、アレイ標的エレメントを通過する（サンプル核酸
は固定したプローブにハイブリダイズされている）。この光は、カバースリップ
の上部表面の全内部反射を受け、そしてアレイに戻す。鏡はこの光を反射してプ
リズムに戻る。従って、光学表面における不完全性によって散乱される励起光の
みがカバースリップを通過し、そして検出レンズ（スライドの上）に入る。蛍光
を、一対のカメラレンズによって収集（検出）する。第１のカメラレンズは、標
的からの蛍光発光を収集し、そして平行光を出す。これは、画像化される蛍光色
素の波長バンドを選択する発光フィルターを通過する。第２のレンズは、ＣＣＤ
チップ上に収集された光を収束させる。同じ焦点距離を有する一対のレンズの使
用は、１倍率を生じる（Ｗｉｔｒｕｐ（１９９４）前出）。

【００９７】アレイプリンティング技術を、プリンティングスピードを増加させてアレイ製
造を容易にすること、およびアレイの物理的サイズを減少させてハイブリダイゼ
ーションに必要な標本核酸の量を最小化させることに集中させる。基本的なアプ
ローチは、複数のプリンティングチップを有するプリントヘッドを使用すること
であり、その結果、多くの異なる標的は、平行にプリントされ得る。このことは
、アレイをプリントするのに必要な時間を減少させる。アレイロボットの簡単な
該略として、このプリントヘッドを、マイクロタイタープレートフィーダーとプ
リンティング位置との間の高速オーバーヘッドガントリー上で行う。アレイ基板
を、Ｘ−Ｙステージを有するプリントヘッドの下におく。プリンティングピンを
、プレートフィーダーとステージの間に位置するステーションにて洗浄する。９
ピンプリントヘッドを、８６４ウェルマイクロタイタープレートのプリントアウ
トのために、３ｍｍ中心上にキャピラリーチューブを取り付けた３×３アレイの
スプリングの形態で使用する。各キャピラリーを、そこを通して真空または圧力
が供給される可撓性チュービングによってマニホルドに接続する。プリンティン
グの間にわずかな圧力を適用しながら、真空を使用して、クリーニング溶液をチ
ップを通じて排出し、そしてそのチップにプリンティング溶液をロードする。

【００９８】（アレイ分析のための核酸サンプルの調製）任意の生物学的物質由来の核酸を使用して、分析のための標識サンプルを調製
し得る。例えば、乳房組織の生検のために、疑われる原発性乳房腫瘍組織のスナ
ップ凍結（ｓｎａｐ−ｆｒｏｚｅｎ）ブロックを、代表的には約４ミクロンにて
凍結切断し（ｃｒｙｏｓｅｃｔ）、そして例えば、ヘマトキシリンおよびエオシ
ンを用いて染色して、切片内の非悪性細胞に対する悪性細胞の比を決定し得る。
ブロックトリミングによって除去可能な正常な管および小葉を含む領域を、スラ
イド上にマークする。このブロックを、スライド上の切片と整列させて、そして
冷却したカミソリ刃でトリミングする。トリミングしたブロックの次の１０〜２
０の切片を、ＤＮＡ抽出のために微量遠心管中に収集する。ＤＮＡを、例えば、
ＱＵＩａｍｐ組織キット（＃２９３０４）を用いて、製造業者の指示に従って単
離し得る。溶解時間を、必要ならば、組織の状態に依存して延長し得る。サンプ
ルもまた、ＲＮＡａｓｅＡとともにインキュベートする。ＤＮＡを、７０℃にて
５分のインキュベーションの後に、水中のカラムから溶出させる。必要ならば、
第２の溶出工程を使用して、収率を増加させ得る。

【００９９】このサンプル（すなわち試験）核酸を、フルオレセインで標識する。参照ＤＮ
Ａを、別の試薬（代表的にはテキサスレッド）で標識する。標識を、標準的な手
順および製造業者の指示に従って、ニックトランスレーションによって行う。

【０１００】（アレイプローブ）プローブとして使用するためのクローン化ゲノムＤＮＡを、上記のような当該
分野で公知の任意のプロトコル（例えば、組換えまたはＰＣＲ増幅技術を含む）
によって生成し得る。ＰＣＲ増幅を、公のデータベースにおけるＳＴＳプライマ
ー対情報によって容易にする（例えば、Ｏｌｓｏｎ（１９８９）（前出）を参照
のこと）。代表的な組換え技術もまた使用し得る。例えば、ＭＡＣ、ＹＡＣ、Ｂ
ＡＣ、ＰＡＣ、Ｐｌｓ、コスミド、プラスミドまたはｃＤＮＡを含有するプロー
ブ配列を生成し得る。１つの例示的なプロトコルにおいて、プラスミドは、細菌
の５００ｍｌ培養物から、ＱＩＡＧＥＮマキシキット（＃１２１６２）を使用し
て、溶解緩衝液の量を約１．５倍〜２倍に増加させたことを除いて製造業者の指
示に従って、単離する。ＤＮＡを、４００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉ
ｓ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８）中に再懸濁し、フェノール、クロロホルム、イ
ソアミルアルコール（２５：２４：１の比）で抽出する。次いで、エタノールで
沈殿させる。ＴＥ緩衝液中に再懸濁した後、ＤＮＡの濃度を、蛍光測定器（例え
ば、ＨｏｅｆｅｒＴＫＯ１００）を用いて決定する。この手順により、代表
的には、スライドに効率的に結合する核酸を生成するに十分な純度であり、かつ
受容可能な低い自己蛍光を有する、４０〜８０μｇのＰ１またはＢＡＣＤＮＡ
が得られる。

【０１０１】以下に示す研究のためのアレイを、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）お
よびニトロセルロースの混合物中にプローブＤＮＡを溶解させ、そして得られた
溶液のナノリットル量を、ガラスまたは石英キャピラリーを有するアミノ−シラ
ンコートアレイ基板上に堆積させることによって、作製した。プローブ溶液を、
エタノール中に１０μｇのＤＮＡを沈殿させ、そして１μｌの水中にペレットを
溶解させ、続いて約０．４μｇ／μｌのニトロセルロースを含む４μｌのＤＭＳ
Ｏを添加することによって作製する。ニトロセルロース溶液を、ＤＭＳＯ中にニ
トロセルロースメンブレン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ＃４１０５１−０１２）を溶解
させることによって調製する。このニトロセルロースは、標的において数キロベ
ースより長い長さのハイブリダイズ可能なＤＮＡフラグメントを保持する能力を
実質的に改良したが、より小さなフラグメントには効率的には結合しない。

【０１０２】ガラス、石英または溶融シリカスライドを、５０％濃硫酸、５０％過酸化水素
中で一晩インキュベーションすることによってクリーニングする。次いで、これ
らを、蒸留水中で１０回洗浄し、そして風乾し、そして１５分間９０℃まで加熱
する。クリーニングしたスライドの表面を、０．１％アミノプロピルトリメトキ
シシランを含む９５％アセトン中に室温にて２分間浸漬することによってコート
し、その後、アセトン中で５回洗浄し、そして風乾する。

【０１０３】得られたプローブ標的エレメントは一次ＤＮＡであり、質量で１５％未満のニ
トロセルロースを含む。この標的エレメントからの自己蛍光は無視できた。プロ
ーブＤＮＡのさらなる変性は、ハイブリダイゼーションの前には必要ではなかっ
た。

【０１０４】（ハイブリダイゼーション）ハイブリダイゼーションのために、低い障壁を、ゴムセメントを用いてアレイ
の周りに形成した。得られたウェルは、約０．６〜１ｃｍ²の面積である。ハイ
ブリダイゼーションミックスは、代表的には、試験ＤＮＡおよび参照ＤＮＡを各
々を約４００ナノグラム（ｎｇ）含む。試験ＤＮＡを、フルオレセインで標識し
、そして参照ＤＮＡを、テキサスレッドで染色する（上記のとおり）。代表的な
ハイブリダイゼーション反応において、２００〜４００ｎｇの標識試験ＤＮＡ（
ヒト核酸サンプル）および参照標識ＤＮＡを混合する。約３５〜約５０μｇのＣ
ｐｔ−１（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）ＤＮＡもまた、ハイブリダイゼーションミック
スに含めて、反復配列をブロックする。次いで、この混合物を、エタノールで沈
殿させる。蛍光測定手段（例えば、ＨｏｅｆｆｅｒＴＫＯ１００蛍光測定器
）によってＣｏｔ−１の量を決定することが重要である。なぜなら、商業的供給
業者によって使用される濃度の吸収測定は、頻繁に、ブロッキングＤＮＡの存在
の有効量を３〜６倍まで過剰評価するからである。少なすぎるブロッキングＤＮ
Ａを使用すると、小さな割合の変化を検出する能力は実質的に減少する。

【０１０５】沈殿したＤＮＡを、１０μｌのハイブリダイゼーションミックスに溶解させて
、５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、２×ＳＳＣ、２％ＳＤＳおよ
び１００μｇのｔＲＮＡの最終組成を達成する。このウェルを、このハイブリダ
イゼーションミックスの１０μｌで満たす。カバースリップは使用しない。この
ハイブリダイゼーション溶液を、７０℃まで５分間加熱して、ＤＮＡを変成させ
、次いで、３７℃にて約１時間インキュベートして、反復配列をブロックする。
ハイブリダイゼーションを、ゆっくり揺れるテーブル上で３７℃にて１６〜７２
時間進行させて、ハイブリダイゼーションミックスを標的の上に能動的に輸送す
る。このスライドを、２００μｌのハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルム
アミド／２×ＳＳＣ）を含みプローブを含まない小さな密封スライドボックス中
に置いて、ハイブリダイゼーションの間の蒸発を防ぐ。

【０１０６】ハイブリダイゼーションの後、このスライドを、５０％ホルムアミド、２×Ｓ
ＳＣ（ｐＨ７）中で４５℃にて１５分間１回洗浄し、そして０．１％ＮＰ４０を
含む０．１Ｍリン酸ナトリウム中（ｐＨ８）で室温にて１回洗浄する。過剰な液
体をスライドから排出させ、そしてアレイを１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩを含む抗消
（ａｎｔｉｆａｄｅ）溶液中にマウントし、ＤＮＡを対比染色する。ガラスカバ
ーストリップを、その場所にシールする。上記のように、このスライドを、アレ
イ装置に置き、そして蛍光を読み取る。

【０１０７】（分析データ）スライド上の位置の関数としてのバックグラウンド蛍光を、プローブ蛍光色素
画像（代表的には、フルオレセイン（サンプルＤＮＡ）およびテキサスレッド（
参照ＤＮＡ））について計算し、そしてバックグラウンド補正した全フルオレセ
インおよびテキサスレッドの強度を、セグメント化した標的の各々について計算
する（蛍光シグナルを、画像分析プログラムを用いて分析した）。２つの蛍光色
素の強度もまた、各標的について計算する。この分析には、約１分かかる。次い
で、このデータを、保存および画像分析プログラムによる分析のために、データ
ベースに移す。

【０１０８】各画素の緑色強度と赤色強度との間のＰｅａｒｓｏｎの「ｒ」相関もまた、計
算した。理想的には、標的における各画素の緑色および赤色強度は、互いに比例
され、その結果、これらの測定のプロットを、直線にし、そしてその相関は、１
．０であると予測する。実際には、「ｒ」値は、ほぼ１．０から非常に低い値ま
での範囲であり、このことは、データにおける散乱を示す。それゆえ、本発明者
らは、任意に決定した０．８の閾値未満の相関を有する全てのスポット上の測定
を捨てる。従って、最終比は、有用なシグナルを与える標的の比の平均を示す。

【０１０９】任意の画像分析プログラムを使用して上記の計算をなし得るが、これらの実験
において、ＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅＣＧＨＡｎａｌｙｓｉｓＰｒｏｇｒａｍ
（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．，ＤｏｗｎｅｒｓＧｒｏｖｅ，ＩＬ）のバリエーショ
ンを使用した。各標的クローンの４通りのスポットを、これらの実験において使
用したように、代表的に、アレイにおいて使用する。この標的スポットの位置を
、ＤＡＰＩ対比染色画像をセグメント化することによって決定した。

【０１１０】このアレイＣＧＨ手順を、以下の点で評価した：（ａ）反復配列を含まないモ
デル系、（ｂ）正常ヒト細胞、および（ｃ）公知のコピー数変化を含む細胞株。
反復配列の比存在下の性能を、変動量のλＤＮＡでスパイクした２００μｇの全
ヒトゲノムＤＮＡからなる試験ゲノムおよび参照ゲノムを用いて評価した。λＤ
ＮＡはヒトゲノムの１．７×１０^-5の長さ（５０ｋｂ対３×１０⁶ｋｂ）を有す
るので、約３ｐｇのλＤＮＡは、単一コピーのヒト配列に等しい。試験ゲノムは
、２００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ、ならびに１、２、２０、２００および２００
０ｐｇのλＤＮＡを含んだ。その比をハイブリダイゼーションに関して正規化し
た。参照ゲノムは、２００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡおよび２０ｐｇのλＤＮＡを
含んだ。２０ｐｇのλＤＮＡを参照において使用した。なぜなら、ハイブリダイ
ゼーションにおけるより高い試験ゲノム濃度（２００および２０００ｐｇのλＤ
ＮＡ）での二本鎖λ配列の再会合は、参照シグナルを抑制し、そして試験シグナ
ルの対応するほぼ直線的な増加を生成するからである。しかし、試験蛍光シグナ
ルおよび参照蛍光シグナルの比は、２つのゲノムにおけるλＤＮＡの量の比に比
例して増加した。

【０１１１】単純な理論的検討は、蛍光色素がハイブリダイゼーションに示差的に影響しな
い場合は、蛍光比はコピー数比に正確に比例するはずであるという予想を導く。
このような性能を、単一コピーの等価レベル未満から約１０³以上倍より高くま
での、全測定範囲にわたって達成した。それゆえ、ヒトゲノムのコスミドサイズ
のセグメントまたはより大きいものに関与するコピー数の増加または減少は、単
一コピーレベルで検出可能であるはずである。重要なことに、より高いレベルの
変化もまた、正確に定量され得る（反復配列が影響しない場合）。

【０１１２】（検出される単一コピー数の差異）ヒト標本における測定を、約３Ｍｂの間隔で第２０染色体の長さに沿って分布
するコスミド、Ｐ１およびＢＡＣクローン、ならびに染色体２０ｑ１３．２の１
．５Ｍｂ領域にわたるコンティグからのクローンから作製される標的を含むアレ
イを用いて行った。このアレイはまた、公知のオンコジーンｃＭＹＣ、ｃＥＲＢ
Ｂ２、ｐ５３およびｐ１６についてのゲノムクローン、ならびに第Ｘ染色体の領
域からのクローンを含む。正常な女性ＤＮＡに対する正常な男性ＤＮＡの比較を
使用して、２つのゲノムにおける相対的に同じコピー数で存在する標的間の比に
おける変動、ならびに低レベルのコピー数変化を検出する能力を評価した。第２
０染色体標的の比（１．０の平均値を有するように正規化した）は、１．０＋／
−０．１４の比であった（標準偏差）。第Ｘ染色体標的もまた含まれ、そしてそ
の比（第２０染色体に対して正規化した）は、０．６３＋／−０．０４であった
。それゆえ、この比は有意により低かった。従って、二倍体ゲノムにおける単一
コピーの増加は、検出可能であった。０．５の期待値（一倍体コピー数について
の）からの第Ｘ染色体比の偏差は、反復配列からのシグナルの不完全な抑制に起
因する可能性が最も高い。

【０１１３】上記の実施例は、本発明を例示するために提供され、その範囲を限定するもの
ではない。本発明の他の改変物は、当業者に容易に理解され、そして添付の特許
請求の範囲によって包含される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許お
よび特許出願を、本明細書中に参考として援用する。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ハイブリダイゼーション分析を使用する、腫瘍（「Ｓ２１」）の２０
ｑ１３．２領域の分析の結果を示す。このグラフは、腫瘍Ｓ２１において選択さ
れた２０ｑ１３．２クローンについての比較ゲノムハイブリダイゼーション（Ｃ
ＧＨ）比を示し、これは、「Ｇ／Ｒ」、すなわち赤色蛍光（テキサスレッドｄＣ
ＴＰ）に対する緑色蛍光（フルオレセインｄＣＴＰ）の比を、この２０ｑ１３．
２コンティグクローンに対するゲノム核酸ハイブリダイゼーションの量の関数と
して表す。

【図２】図２は、第２０染色体の２０ｑ１３．２領域における、選択されたマーカーお
よびクローンの分布ならびに位置を示す。２０ｑ１３ゲノム核酸インサートを含
む３つの隣接したＹＡＣ（８５６ａ１０、９３１ｈ６、８２０ｆ５）を、水平線
として示す。

【図３】図３は、乳癌細胞株ＭＣＦ７（上パネル）、ならびに２つの乳癌腫瘍、Ｓ２１
およびＳ５０（下の２つのパネル）を使用する、２０ｑ１３．２の高分解能アレ
イ分析の結果を示す。上パネルは、コンティグのアレイプローブの位置を示す。
この上パネル中のプローブクローンを、表１に列挙する；クローン名は、最後の
４桁の数で示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＣＣＦ (72)発明者コリンズ，コリンアメリカ合衆国カリフォルニア 94115，サンフランシスコ，エス−131，サッターストリート 2340，キャンサーリサーチインスティチュート内 (72)発明者グレイ，ジョーアメリカ合衆国カリファルニア，サンフランシスコ，サンタポーラアベニュー 50 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA03 CA09 HA12 4B063 QA19 QQ02 QQ58 QR40 QR55 QR84 QS25 QS34 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト核酸のサンプル中のアンプリコンの存在についてスクリ
ーニングするための方法であって、該方法は、以下：ヒト細胞由来の核酸のサンプルおよびプローブを提供する工程であって、ここ
で、該プローブは、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０までを含む核酸配列に特
異的にハイブリダイズする核酸を含む、工程；該ヒト核酸に該プローブを接触させる工程であって、ここで、該プローブは、
該プローブがヒトゲノム核酸にストリンジェント条件下で選択的に結合する条件
下で、該ヒトゲノム核酸と接触され、ハイブリダイゼーション複合体を形成する
、工程；および該ハイブリダイゼーション複合体の形成を検出する工程を包含する、方法。
【請求項２】前記ヒト核酸が、ゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の方
法。
【請求項３】前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程が、前記
アンプリコンのコピー数を決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方
法。
【請求項４】前記ゲノム核酸が、乳房腫瘍細胞から単離される、請求項１
に記載の方法。
【請求項５】前記プローブが、Ｄ２０Ｓ１２０とＤ２０Ｓ２１１との間の
距離にわたる核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、請求項１に記
載の方法。
【請求項６】前記プローブが、ＡＦＭａ２３３ｗｇ１、ＡＦＭ０８０ｙａ
１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ０７２
ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ
２７６ｘｈ１からなる群より選択されるＳＴＳマーカーに特異的にハイブリダイ
ズする核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記プローブが、Ｄ２０Ｓ２１１、Ｄ２０Ｓ８５４、Ｄ２０
Ｓ８７６、Ｄ２０Ｓ１０４４、Ｄ２０Ｓ９１３、Ｄ２０Ｓ７２０およびＤ２０Ｓ
１２０からなる群より選択されるＧＤＢ遺伝子座核酸配列に特異的にハイブリダ
イズする核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】前記プローブが、ＲＭＣ２０Ｂ４０９７、ＲＭＣ２０Ｂ４１
０３、ＲＭＣ２０Ｐ４０１６、ＲＭＣ２０Ｂ４１３０、ＲＭＣ２０Ｐ４１８５、
ＲＭＣ２０Ｂ４１８８、ＲＭＣ２０Ｂ４１０９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１０、ＲＭＣ
２０Ｐ４０２８、ＲＭＣ２０Ｐ４００３、ＲＭＣ２０Ｂ４０９９、ＲＭＣ２０Ｐ
４０１８、ＲＭＣ２０Ｐ４０６９、ＲＭＣ２０Ｂ４１２１、ＲＭＣ２０Ｂ４０８
７およびＲＭＣ２０Ｐ４０７０からなる群より選択されるクローン化されたゲノ
ム核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記プローブが、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０までを
含む核酸配列のいくらかまたは全てを増幅し得るポリメラーゼ連鎖反応プライマ
ー対を含み、そして前記検出工程が、該ポリメラーゼ連鎖反応増幅反応の形成を
検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】前記ポリメラーゼ連鎖反応プライマー対が、ＡＦＭａ２３
３ｗｇ１、ＡＦＭ０８０ｙａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ
−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、
ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群より選択されるＳＴＳＰ
ＣＲプライマー対である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】前記プローブが、固体表面に結合される、請求項１に記載
の方法。
【請求項１２】前記結合されたプローブが、核酸アレイのメンバーである
、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】前記ヒト核酸が、検出可能な組成物で標識される、請求項
１に記載の方法。
【請求項１４】前記検出可能な組成物が、フルオレセインまたはテキサス
レッドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】前記プローブが、検出可能な組成物で標識される、請求項
１に記載の方法。
【請求項１６】請求項１に記載の方法であって、ここで、該方法はさらに
、参照細胞由来の核酸を提供し、ここで、該参照細胞核酸は、前記ヒトゲノム核
酸より前に、または該ヒトゲノム核酸と同時に、前記プローブと接触される、方
法。
【請求項１７】請求項１に記載の方法であって、ここで該方法はさらに、
Ｃｏｔ−１ＤＮＡを提供し、ここで該Ｃｏｔ−１ＤＮＡは、前記ヒトゲノム
核酸に前記プローブを接触させる前に、該ヒトゲノム核酸にハイブリダイズされ
る、方法。
【請求項１８】ヒトゲノム核酸のサンプル中のアンプリコンの存在につい
てスクリーニングするための核酸プローブであって、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０
Ｓ１２０までを含む核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、核酸プ
ローブ。
【請求項１９】Ｄ２０Ｓ１２０とＤ２０Ｓ２１１との間の距離にわたる核
酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、請求項１８に記載のプローブ
。
【請求項２０】ＡＦＭａ２３３ｗｇ１、ＡＦＭ０８０ｙａ１、ＡＦＭ０６
９ｙａ１、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−
６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ２７６ｘｈ１か
らなる群より選択されるＳＴＳマーカーに特異的にハイブリダイズする核酸を含
む、請求項１８に記載のプローブ。
【請求項２１】Ｄ２０Ｓ２１１、Ｄ２０Ｓ８５４、Ｄ２０Ｓ８７６、Ｄ２
０Ｓ１０４４、Ｄ２０Ｓ９１３、Ｄ２０Ｓ７２０およびＤ２０Ｓ１２０からなる
群より選択されるＧＤＢ遺伝子座核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を
含む、請求項１８に記載のプローブ。
【請求項２２】ＲＭＣ２０Ｂ４０９７、ＲＭＣ２０Ｂ４１０３、ＲＭＣ２
０Ｐ４０１６、ＲＭＣ２０Ｂ４１３０、ＲＭＣ２０Ｐ４１８５、ＲＭＣ２０Ｂ４
１８８、ＲＭＣ２０Ｂ４１０９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１０、ＲＭＣ２０Ｐ４０２８
、ＲＭＣ２０Ｐ４００３、ＲＭＣ２０Ｂ４０９９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１８、ＲＭ
Ｃ２０Ｐ４０６９、ＲＭＣ２０Ｂ４１２１、ＲＭＣ２０Ｂ４０８７およびＲＭＣ
２０Ｐ４０７０からなる群より選択されるクローン化されたゲノム核酸配列に特
異的にハイブリダイズする核酸を含む、請求項１８に記載のプローブ。
【請求項２３】Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０までを含む核酸配列の
いくらかまたは全てを増幅し得るポリメラーゼ連鎖反応プライマー対を含む、請
求項１８に記載のプローブ。
【請求項２４】前記ポリメラーゼ連鎖反応プライマー対が、ＡＦＭａ２３
３ｗｇ１、ＡＦＭ０８０ｙａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ
−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、
ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群より選択されるＳＴＳＰ
ＣＲプライマー対である、請求項２３に記載のプローブ。
【請求項２５】ヒト核酸のサンプル中のアンプリコンの存在についてスク
リーニングするためのキットであって、該キットは、プローブを含む区画を含み
、ここで、該プローブは、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０までを含む核酸配
列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、キット。
【請求項２６】前記プローブが、Ｄ２０Ｓ１２０とＤ２０Ｓ２１１との間
の距離にわたる核酸を含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】前記プローブが、ＡＦＭａ２３３ｗｇ１、ＡＦＭ０８０ｙ
ａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ−９９３９、ＡＦＭａ０７
２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、ＷＩ−９２２７およびＡＦ
Ｍ２７６ｘｈ１からなる群より選択されるＳＴＳマーカーに特異的にハイブリダ
イズする核酸を含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】前記プローブが、Ｄ２０Ｓ２１１、Ｄ２０Ｓ８５４、Ｄ２
０Ｓ８７６、Ｄ２０Ｓ１０４４、Ｄ２０Ｓ９１３、Ｄ２０Ｓ７２０およびＤ２０
Ｓ１２０からなる群より選択されるＧＤＢ遺伝子座核酸配列に特異的にハイブリ
ダイズする核酸を含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２９】前記プローブが、ＲＭＣ２０Ｂ４０９７、ＲＭＣ２０Ｂ４
１０３、ＲＭＣ２０Ｐ４０１６、ＲＭＣ２０Ｂ４１３０、ＲＭＣ２０Ｐ４１８５
、ＲＭＣ２０Ｂ４１８８、ＲＭＣ２０Ｂ４１０９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１０、ＲＭ
Ｃ２０Ｐ４０２８、ＲＭＣ２０Ｐ４００３、ＲＭＣ２０Ｂ４０９９、ＲＭＣ２０
Ｐ４０６９、ＲＭＣ２０Ｐ４０１８、ＲＭＣ２０Ｂ４１２１、ＲＭＣ２０Ｂ４０
８７およびＲＭＣ２０Ｐ４０７０からなる群より選択されるクローン化されたゲ
ノム核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸を含む、請求項２５に記載のキ
ット。
【請求項３０】前記プローブが、Ｄ２０Ｓ２１１からＤ２０Ｓ１２０まで
を含む核酸配列のいくらかまたは全てを増幅し得るポリメラーゼ連鎖反応プライ
マー対を含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項３１】前記ポリメラーゼ連鎖反応プライマー対が、ＡＦＭａ２３
３ｗｇ１、ＡＦＭ０８０ｙａ１、ＡＦＭ０６９ｙａ１、ＷＩ−１６７４８、ＷＩ
−９９３９、ＡＦＭａ０７２ｚｂ９、ＷＩ−６５７８、ＡＦＭ２２４ｚｄ１２、
ＷＩ−９２２７およびＡＦＭ２７６ｘｈ１からなる群より選択されるＳＴＳＰ
ＣＲプライマー対である、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】前記プローブが、クローン化されたヒト核酸である、請求
項２５に記載のキット。
【請求項３３】前記クローン化されたヒトゲノム核酸が、固体表面に結合
される、請求項２５に記載のキット。
【請求項３４】前記結合されたプローブが、核酸アレイのメンバーである
、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】細胞中の２より多いアンプリコンのコピーの検出が、癌ま
たは腫瘍形成の診断または予後であり得ることを示す、説明書をさらに含む、請
求項２５に記載のキット。