JP2021516995A - マイクロアレイベースの多重病原体分析およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
この国際出願は、2018年10月11日に出願された係属中の米国出願第16/158,276号の35U.S.C.§120に基づく優先権の利益を主張するものであり、上記米国出願は、2018年3月8日に出願された、係属中の米国出願第15/916,036号および米国出願第15/916,062号の35U.S.C.§120に基づく一部継続出願であり、それらのすべてが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Cn/Co=P(Sn/So)x、式中:
Cn=マイクロアレイ分析のためのアンプリコンを調製するために使用される、2つのタンデムPCR反応の1つ目に加えられた元のサンプル混合物中に存在する、各タイプ(n)の微生物DNAコピー数;
Co=マイクロアレイ分析のためのアンプリコンを調製するために使用される、2つのPCR反応の1つ目に加えられた既知の合成DNAコピー数(内部参照標準)、ここで、Coは、遭遇し得る未知の微生物コピーの範囲に応じて、例えば、100、500、3,000、および5,000の値に設定され得る。好ましい実施形態では、Co=3000であり;
Sn=PCR増幅、およびn番目の微生物種のマイクロアレイのハイブリダイゼーション、その後の画像分析の後に得られる、相対蛍光単位(RFU)シグナルデータであり;
So=PCR増幅、および合成DNA種のマイクロアレイのハイブリダイゼーション、その後の画像分析の後に得られる、相対蛍光単位(RFU)シグナルデータであり;
X=元のサンプル中に存在する微生物DNAコピーVS合成DNA標準コピーの基礎となる比(Cn/Co)に対する、実験用マイクロアレイデータ比(Sn/So)間の関数関係を定義する複素指数因子である。Xは、線形関数あるいは指数関数または関連する関数の形式、もしくは、それ自体がマイクロアレイ分析および画像化の増幅パラメータおよび増幅条件の関数である定数であり得る。一態様では、Xは約1〜約3に及ぶ指数因子であり;および、
P=実験用マイクロアレイデータ比(Sn/So)を、マイクロアレイに結合する増幅されたPCR産物の濃度に関連付ける定数であり、ここで、一態様では、Pは約0.1〜約10に及ぶ。
本発明は、二官能性ポリマーリンカーの使用によって、核酸プローブを固体支持体表面に結合させる方法を教示する。核酸プローブは、PCRアンプリコン、合成オリゴヌクレオチド、等温増幅産物、プラスミド、あるいは一本鎖または二本鎖の形態のゲノムDNA断片であり得る。本発明は、核酸プローブが結合される上記表面の性質に基づいて、2つのクラスへと細分することができる。
これらの核酸プローブのいずれか1つの共有結合は、上記表面に対して直接生じないが、その代わり、表面との化学反応が可能であり、かつ核酸プローブで効率的なUV開始架橋も可能である、比較的長い二官能性ポリマーリンカーによって媒介される。このプロセスの力学は、自発的な3D自己アセンブリ(spontaneous 3D self assembly)であり、図1A−1Dにおいて例示される。図1Aで見られるように、このマイクロアレイシステムを製作するために必要な構成要素は以下の通りである:(a)オリゴヌクレオチド、PCRまたは等温アンプリコン、プラスミドあるいはゲノムDNAなどの未修飾の核酸プローブ(3);(b)エポキシシラン、イソシアネート、スクシンイミド、カルボジイミド、アルデヒドなどの一級アミンとの反応に適合する化学的に活性可能な基(「X」で示される)を備えた化学的に活性可能な表面(1);(c)天然あるいは修飾されたOligodT、アミノ多糖、支持体表面上の化学的に活性可能な基に結合するのに適したアミノポリペプチドなどの、二官能性ポリマーリンカー(2)(その各々に蛍光標識(4)が結合する);および、(d)水と、グリセロール、DMSO、あるいはプロパンジオールなどの高沸点の水混和性液体を含む溶媒(10:1〜100:1の間の水対溶媒の比率)。
このマイクロアレイシステムでは、核酸プローブの結合は、上記表面には直接生じないが、その代り、固体支持体で非共有的に結合するが、UV開始架橋により核酸プローブで共有結合的に結合する比較的長い二官能性ポリマーリンカーを介して媒介される。このプロセスの力学は、自発的な3D自己アセンブリであり、図2A−2Dにおいて例示される。図2Aで見られるように、このマイクロアレイシステムを製作するために必要な構成要素は以下の通りである:
(1)オリゴヌクレオチド、PCRまたは等温アンプリコン、プラスミドあるいはゲノムDNAなどの未修飾の核酸プローブ(3);
(2)未修飾の固体支持体(1);
(3)固体支持体への吸着性結合に適合する官能基(「R」で示される)を本質的に有するか、またはそれを有するように修飾される、OligodTあるいはアミノ多糖、アミノポリペプチドなどの二官能性ポリマーリンカー(2)(各々が蛍光標識(4)を有する);および、
(4)水と、グリセロール、DMSO、あるいはプロパンジオールなどの高沸点の水混和性液体を含む溶媒(10:1〜100:1の間の水対溶媒の比率)。
DNA分析のための三次元格子マイクロアレイシステムを使用することサンプル処理植物表面からの病原体の収集は以下の工程を含む:
1.1xリン酸緩衝食塩水(PBS)中で植物サンプルを洗浄またはテーププルする
2.植物材料/テープを除去する
3.遠心機にかけて細胞をペレット化し、上清を廃棄する
4.Sample Digestion Bufferであらかじめ混合したPathogenDx(登録商標) Sample Prep Buffer中で再懸濁する
5.55°Cで45分間加熱する
6.ボルテックスしてペレットを消散させる
7.95°Cで15分間加熱する
8.PCRでの使用前にボルテックスし、短時間遠心機にかける
増幅およびハイブリダイゼーション分析に使用されるサンプルは、認可されたカンナビス研究所(Cannabis lab)からのカンナビスの花洗浄液(Cannabis flower wash)であった。その後、洗浄した花材料を遠心分離によってペレット化した。次に、ペレットをプロテイナーゼKで消化し、その後、PCR増幅前に既知量のサルモネラ菌DNAでスパイクした。
マイクロアレイ製造の従来の方法は、マイクロアレイ表面の前処理を必要とせずにハイブリダイゼーションを介してDNAを分析することができるので、そのマイクロアレイの使用は単純であり、6つの手動あるいは自動のピッペッティング工程を含む。
1)増幅されたDNA+結合緩衝液をマイクロアレイ上にピッペッティングする
2)30分間インキュベートして、マイクロアレイにDNAを結合させる(典型的に室温(RT)で)
3)ピッペッティングによりDNA+結合緩衝液を除去する。
4)50μLの洗浄緩衝液をマイクロアレイ(0.4xSSC+0.5xDenhardt)上でピッペッティングし、室温で5分間インキュベートする
5)ピペッティングにより洗浄緩衝液を除去する
6)工程4および5を繰り返す
7)532nmおよび635nmで画像分析を行い、プローブスポット位置(532nm)およびPCR産物ハイブリダイゼーション(635nm)を検出する。
以下の画像化条件で、ラスターベースの共焦点スキャナ:GenePix4000Bマイクロアレイスキャナ上において、2つの波長(532nmおよび635nm)で画像分析を行った:33%のレーザーパワー、532nmでの400PMT設定/33%のレーザーパワー、635nmでの700PMT設定。
増幅、ハイブリダイゼーション、およびマイクロアレイ分析
図4Aは、第1のPCR工程の模範を示す。標準的なものとして、そのようなPCR反応を、PCRプライマーの適用によって開始する。プライマーは、PCRベースのDNA増幅反応の開始点および停止点を定義する。この実施形態では、必要とされるDNA増幅をサポートするために、1対のPCR反応を利用する。一般に、そのようなPCR増幅は連続して行なわれ:図4のAの接尾辞「P1」を有する第1の対のPCRは、約1μLの任意の未精製のDNAサンプル、例えば、生のカンナビス葉洗浄液などを増幅するために使用される。第1のPCR反応の約1μLの産物を、DNAに蛍光色素標識を取り付けるために使用される第2のPCR反応の基板として使用し、その結果、その標識は、ハイブリダイゼーションによってマイクロアレイに結合するとき、PCR産物を検出するために使用することができる。第1および第2のPCRのためのプライマー配列が表6に示される。この2段階反応の役割は、分析される病原体DNAを精製する必要性を回避することである。プライマー「P1」を有する第1のPCR反応を、生の出発物質に対応するために最適化するが、第2のPCRプライマー対「P2」は、最大のDNA収率と第1の反応の産物からの色素標識化とを得るために最適化する。まとめると、2つの反応の合計は、対象の病原体DNAの精製あるいは特徴付けを不必要にする。
定量的DNA分析のために、三次元格子マイクロアレイシステムを使用する方法
サンプル処理植物表面からの微生物の収集は以下の工程を含む:
1.1xリン酸緩衝食塩水(PBS)中で植物サンプルを洗浄またはテーププルする
2.植物材料/テープを除去する
3.遠心機にかけて細胞をペレット化し、上清を廃棄する
4.Sample Digestion Bufferであらかじめ混合したPathogenDx(登録商標) Sample Prep Buffer中で再懸濁する
5.55°Cで45分間加熱する
6.ボルテックスしてペレットを消散させる
7.95°Cで15分間加熱する
8.ボルテックスし、短時間遠心機にかけて、1つ以上のタイプの微生物からDNAを含むサンプルを得る。
既知量(既知のコピー数)の合成DNAを、上記のサンプル処理工程で得られたサンプルに加える。合成DNAは、増幅されている16s(細菌)またはITS2(真核生物)DNA配列と同様の長さと配列構造を有するが、合成DNAをサンプル中の細菌および真核生物のDNAと区別するために、異なる中央領域配列を有する。合成DNAの5’および3’末端配列は、検索されている未知の細菌あるいは未知の真核生物のDNA中のコンセンサス配列と実質的に同一であるように設計され、サンプル中の未知のDNAの増幅に使用された同じPCRプライマーの対を使用した増幅を可能にする。そのようなコンセンサス配列の例は、SEQ ID NO:152、およびSEQ ID NO:153に示される(表17)。これらの特徴により、サンプル中の合成DNAおよび未知の微生物プールDNAの両方を偏りなく増幅することができる。合成DNA配列の例は、SEQ ID、No:SEQ ID NO:154〜SEQ ID NO:157に示される(表17)。
座位特異的プライマー対を使用して、合成DNA配列を含むサンプルを 増幅した(PCR反応#1)(表6および18)。その後、PCR反応#1(1μL)の産物を、標識化プライマー(表6および18)を使用して第2のPCR反応(PCR反応#2)にさらし、それを、2つの標的化領域をさらに増幅して標識化し、フルオロフォア標識アンプリコンを生成した。その後、PCR反応#2(50μL)の産物を、ハイブリダイゼーション緩衝液(4xSSC+5xデンハルト溶液)で1−1に希釈し、次に、ハイブリダイゼーションのためにマイクロアレイに直接適用した。
マイクロアレイ製造の従来の方法は、マイクロアレイ表面の前処理を必要とせずにハイブリダイゼーションを介してDNAを分析することを可能にするため、マイクロアレイの使用は単純であり、6つの手動あるいは自動のピッペッティング工程を含む。
1)増幅されたDNA+結合緩衝液を、検索されている病原体遺伝子のオリゴヌクレオチドプローブ配列が固定化されているマイクロアレイ上でピペッティングし、合成DNAは内部参照標準として使用する(表7−11および19)。
2)30分間インキュベートして、マイクロアレイにDNAを結合させる(典型的に室温(RT)で)
3)ピッペッティングによりDNA+結合緩衝液を除去する。
4)50μLの洗浄緩衝液をマイクロアレイ(0.4xSSC+0.5xDenhardt)上でピペッティングし、室温で5分間インキュベートする
5)ピペッティングにより洗浄緩衝液を除去する
6)工程4および5を繰り返す
7)532nmおよび635nmで画像分析を行い、プローブスポット位置(532nm)およびPCR産物ハイブリダイゼーション(635nm)を検出する。
以下の画像化条件で、ラスターベースの共焦点スキャナ:GenePix4000Bマイクロアレイスキャナ上で、2つの波長(532nmおよび635nm)で画像分析を行った:33%のレーザーパワー、532nmでの400PMT設定/33%のレーザーパワー、635nmでの700PMT設定。図3は、マイクロアレイの構造およびハイブリダイゼーション性能の例を示す。
絶対的なDNAコピー数の定量化
本発明で開示されるようなサンプル中の対象の微生物の絶対的なDNAコピー数の定量化は、第1のPCR増幅工程前の合成DNAの既知のコピー数をサンプルに導入することにより達成される。合成DNAは、第1のPCR(図17A、17B、および18)で生成された16s(細菌)またはITS2(真核生物)DNAアンプリコンと同様の長さと配列構造を有するが、合成DNAをサンプル中の細菌および真核生物のDNAと区別するために、異なる中央領域配列を有する。合成DNAの5’および3’末端配列は、検索されている未知の細菌あるいは未知の真核生物のDNA中のコンセンサス配列と実質的に同一であるように設計され、サンプル中の未知のDNAの増幅に使用された同じPCRプライマー対を使用した増幅を可能にする。これらの特徴は、検索されている未知の微生物の超可変領域を増幅するために使用される同じPCRプライマー対によって合成DNAが増幅されることを可能にする。その結果、合成DNAは、第1および第2のPCR増幅反応中のプライマー/鋳型のハイブリダイゼーションに関しては、サンプル中の微生物のプールDNAと区別がつかない。このことは、合成(内部参照標準)DNAと微生物(未知)DNAの偏りのない増幅を確かなものにし、それにより、検索されているDNAおよび合成DNAからのアンプリコンのシグナル強度は、各DNAの元のコピー数にそれぞれ比例する(以下に議論される)。そのようなコンセンサス配列の例は、SEQ ID NO:152、およびSEQ ID NO:153(表17)に示される。合成DNA配列の例は、SEQ ID NO:154〜SEQ ID NO:157に示される(表17)。
合成DNA(標準的な種)のコピーの数が、元のサンプル中の微生物DNA(未知の種)のコピーの数と等しい場合、微生物DNA対合成DNAの比率は、PCR反応の始め(増幅は指数関数的である)からPCR反応の終わり(増幅は、最終産物阻害を介して飽和させ始める)まで1に等しくなる。
Cn/Co=Sn/So、
式中、
Cn=マイクロアレイ分析のためのアンプリコンを調製するために使用された2つのタンデムPCR反応の1つ目に加えられる、元のサンプル混合物中に存在する各タイプの微生物DNAコピーの数(n)、
Co=マイクロアレイ分析のためのアンプリコンを調製するために使用された2つのPCR反応の1つ目に加えられる、既知の合成DNAのコピー数(内部参照標準)、
Sn=PCR増幅、およびn番目の微生物種のマイクロアレイハイブリダイゼーション、その後、画像分析の後に得られた、相対蛍光単位(RFU)シグナルデータ、
So=PCR増幅、および合成DNA種のマイクロアレイハイブリダイゼーション、その後の画像分析の後に得られた、相対蛍光単位(RFU)シグナルデータ
微生物DNA(未知の種)が既知の合成DNA(標準の種)に対して大過剰であった場合、微生物DNA対合成DNAの比率は>1である。この状況では、PCR反応の開始時に、アンプリコン(PCR産物)の相対存在量は、元の入力鎖比率(original input strand ratio)(未知:標準)の真実の表現(truthful representation)になる。しかし、反応が飽和へと進むにつれ、1つ以上の反応物の消費、あるいは、PCR反応産物−ピロリン酸および/またはアンプリコンによる酵素阻害のいずれかにより、より豊富な種(この場合、未知の種)が最初に最終産物飽和に近づく。その結果、比較的それほど豊富ではない標準種の増幅は阻害される。この状況では、増幅されたDNA産物種の存在量は、「未知の種>標準種」の適切な定性的関係を保持するが、DNA産物の比率は、元の入力サンプル中の未知:標準の比率と直線的に関連しない。
Cn/Co≠Sn/So
入力と反応のそのような非線形の関係は、化成皮膜中あるいは電荷結合素子(CCD)中の粒子密度対光子露光の関係などの、化学と物理分析においてよく知られており、ここで、写真の入力の相対的な明るさは、結果として生じる像において相対的順位で維持されるが、非線形の反応についての詳細な理解は、反応データ(増幅およびマイクロアレイハイブリダイゼーション後のPCR産物シグナルと類似する)から元の入力(元のサンプル中のDNAコピー数と類似する)の相対的存在量を予測することを必要とする。
微生物DNA(未知の種)が既知の合成DNA(標準の種)より少なかった場合、微生物DNA対合成DNAの比率は<1である。この状況では、PCR反応の開始時に、アンプリコン(PCR産物)の相対存在量は、元の入力鎖比率(original input strand ratio)(未知:標準)の真実の表現(truthful representation)になる。しかし、反応が飽和へと進むにつれ、1つ以上の反応物の消費、あるいは、PCR反応産物−ピロリン酸および/またはアンプリコンによる酵素阻害のいずれかにより、より豊富な種(この場合、標準の種)はが最初に最終産物飽和に近づく。その結果、比較的それほど豊富ではない未知種の増幅は阻害される。この状況では、増幅されたDNA産物種の存在量は、「未知の種>標準種」の適切な定性的関係を保持するが、DNA産物の比率は、元の入力サンプル中の未知:標準の比率と直線的に関連しない;
Cn/Co≠Sn/So。
図19Aおよび19Bにおいて示される種類の「クロスオーバー」滴定データは、本出願に記載されるPCRマイクロアレイ分析に固有であると判定された。合成DNAコピー数が一定に保持され、標的微生物DNAコピー数が増加するにつれ、微生物PCR反応の産物、したがって、マイクロアレイ表面上の同族のプローブへのそれらの産物の結合によるシグナルは、微生物DNAコピー数の増加に伴い増加するが、(固定された)一致した内部参照標準から得られたシグナルは一斉に減少する(図19A−19B)。2つの曲線は、コピー数等値で、あるいはそのコピー数等値の近くで交差し(矢印、図19A−19B)、微生物DNAコピーの数は、内部参照標準DNAコピーの数と等しくなる。
として近似され得、式中、
Cn=マイクロアレイ分析のためのアンプリコンを調製するために使用される、2つのタンデムPCR反応の1つ目に加えられた元のサンプル混合物中に存在する各タイプの微生物DNAコピー数(n)、
Co=マイクロアレイ分析のためのアンプリコンを調製するために使用される、2つのPCR反応の1つ目に加えられた既知の合成DNAコピー数(内部参照標準)
Sn=PCR増幅、およびn番目の微生物種のマイクロアレイのハイブリダイゼーション、その後の画像分析後に得られる、相対蛍光単位(RFU)シグナルデータ;
So=PCR増幅、および合成DNA種のマイクロアレイハイブリダイゼーション、その後の画像分析の後に得られた、相対蛍光単位(RFU)シグナルデータ
X=元のサンプル(Cn/Co)中に存在する微生物DNAコピーVS合成DNA標準コピーの基礎となる比率に対する、実験用マイクロアレイデータ比率(Sn/So)間の関数関係を定義する複素指数因子
P=実験用のマイクロアレイデータ比率(Sn/So)を、マイクロアレイに結合する増幅されたPCR産物の濃縮と関連づける定数。
Cn=Co(Sn/So)2 方程式#2
式中、
Cn=元のサンプル中に存在する微生物DNAコピーの数であり、
Co=合成DNAの標準コピーの既知数を元のサンプルに加えることにより、調節される。
X=2であり(図19Aに見られるような実験データから評価される)
P=1であり(図19Aに見られるような実験によって決定される)。
Claims (45)
- 三次元格子マイクロアレイシステムであって、前記三次元格子マイクロアレイシステムは:
前面および背面を備えた固体支持体と;
複数の二官能性ポリマーリンカーであって、その各々がトップドメインおよびボトムエンドを有し、前記ボトムエンドが固体支持体に結合されている、複数の二官能性ポリマーリンカーと;
複数の二官能性ポリマーリンカーの各々のトップドメインに結合されている複数の核酸プローブと、
を含む、三次元格子マイクロアレイシステム。 - 複数の二官能性ポリマーリンカーの各々は、そのトップドメインの末端に共有結合されるか、あるいは内部に共有結合される蛍光標識をさらに含む、請求項1に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
- 前記固体支持体は、その前面に結合した複数の化学的に活性可能な基をさらに含み、ここで、複数の二官能性ポリマーリンカーは、それらのボトムエンドによって複数の化学的に活性可能な基の各々に共有結合される、請求項1に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
- 化学的に活性可能な基は、エポキシシラン基、マレイミド基、アミノ基、あるいは活性化カルボン酸エステルである、請求項3記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
- 複数の二官能性ポリマーリンカーの各々は、固体支持体中の化学的に活性可能な基に共有結合するためのボトムエンドにおける第1の反応性部分、または複数の核酸の各々に共有結合するためのトップドメインにおける第2の反応性部分、あるいはそれらの組み合わせを含む、請求項1に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
- 第1の反応性部分は、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、あるいはカルボキシレートである、請求項5に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
- 第2の反応性部分は、ヌクレオチド塩基、アミノ酸、あるいはアミノ糖である、請求項5に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
- 複数の二官能性ポリマーリンカーの各々は、固体支持体に非共有結合するためにボトムエンドに吸着性基を有する、請求項1に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
- 吸着性基は、一本鎖核酸、アミン多糖、あるいは拡張した平面疎水基である、請求項8に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
- 複数の二官能性ポリマーリンカーの各々は、オリゴヌクレオチド、アミノ多糖、ポリアミン、あるいはポリアミノ酸である、請求項1に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
- 複数の核酸プローブの各々は、5’末端および3’末端で少なくとも3つの末端チミジン塩基を有する、請求項1に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
- チミジン塩基は、複数の二官能性ポリマーリンカーの各々の第2の反応性部分に共有結合される、請求項11に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
- 核酸プローブは、病原体、植物、あるいは動物中のシグネチャーヌクレオチド配列に相補的な配列を有する、請求項1に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
- 固体支持体は、ホウケイ酸ガラス、不活性金属、熱可塑性アクリル樹脂、シクロオレフィンポリマー、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ナイロン、セラミック、操作された炭素表面、あるいはそれらの組み合わせである、請求項1に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
- 三次元格子マイクロアレイシステムを製造する方法であって、前記方法は:
請求項1に記載の三次元格子マイクロアレイシステム内の固体支持体を、
(i)複数の核酸プローブ;
(ii)複数の二官能性ポリマーリンカー;および
(iii)水と水混和性液体を含む、100°Cより高い沸点を有する溶媒混合液;を含む製剤と接触させる工程と:
第1の結合反応として、複数の二官能性ポリマーリンカーの各々のボトムエンドを、固体支持体の前面に結合させる工程と;
溶媒混合液中の水を蒸発させ、それにより、複数の核酸プローブおよび固体支持体に結合する複数の二官能性ポリマーリンカーを濃縮する工程と;
第2の結合反応として、核酸プローブの各々を複数の二官能性ポリマーリンカーの各々のトップドメインに共有結合させる工程と;
三次元格子マイクロアレイシステムを製造するために、固体支持体を少なくとも一回洗浄して、結合されていない二官能性ポリマーリンカーおよび核酸プローブを除去する工程と、
を含む、方法。 - 第1の結合反応は吸着である、請求項15に記載の方法。
- 第1の結合反応は、固体支持体上の化学的に活性可能な基と、複数の二官能性ポリマーリンカーの各々のボトムエンド上の第1の反応性部分との共有結合によるものである、請求項15に記載の方法。
- 水混和性液体は、グリセロール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、プロパンジオール、あるいはその組み合わせである、請求項15に記載の方法。
- 第1の結合反応は、0°Cから40°Cの間の温度で生じる、請求項15に記載の方法。
- 第2の結合反応は、0°Cから40°Cの間の温度で生じる、請求項15に記載の方法。
- 第2の結合反応は、複数の二官能性ポリマーリンカーの各々のトップドメインにおける第2の反応性部分を、複数の核酸プローブに光化学的架橋することによって生じる、請求項15に記載の方法。
- カスタマイズ可能なマイクロアレイキットであって、前記マイクロアレイキットは:
請求項1に記載の三次元格子マイクロアレイシステム内の固体支持体および複数の二官能性ポリマーリンカーと;
複数の核酸プローブであって、その各々が、病原体、植物、あるいは動物中のシグネチャーヌクレオチド配列に相補的な配列を有する、複数の核酸プローブと;
溶媒混合液と;
前記キットを使用するための説明書と、
を備える、カスタマイズ可能なマイクロアレイキット。 - 核酸プローブは、5’末端および3’末端で少なくとも3つの末端チミジン塩基を有する、請求項22に記載のカスタマイズ可能なマイクロアレイキット。
- 溶媒混合液は、約10:1〜約100:1の体積比の、水と、グリセロール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、あるいはプロパンジオールのうち1つとの混合物を含む、請求項22に記載のカスタマイズ可能なマイクロアレイキット。
- 植物サンプル中の病原体を検出するための方法であって、前記方法は:
a)植物組織サンプルを収集する工程と;
b)植物組織サンプルからDNAを含む全核酸を単離する工程と;
c)1つ以上の病原体特異的な第1のアンプリコンを得るために、各々が少なくとも1つの病原体のDNAに選択的なフォワードプライマーとリバースプライマーとを含む少なくとも1つの第1のプライマー対を使用して、単一のアッセイにおいて、第1の増幅をタンデムで行う工程と;
d)鋳型としての病原体特異的な第1のアンプリコンおよび少なくとも1つの第2のプライマー対を使用して、第2の増幅をタンデムで行う工程であって、蛍光標識された第2のアンプリコンを得るために、各プライマー対は、蛍光標識で標識され、かつ病原体特異的な第1のアンプリコン中に、内部隣接領域に相補的な配列を有するフォワードプライマーとリバースプライマーとを含む、工程と;
e)請求項1に記載の三次元格子マイクロアレイシステムを使用して:
(i)第2のアンプリコンを、病原体DNA中のシグネチャー配列決定因子に特異的な核酸プローブでハイブリタイズする工程であって、ここで、核酸プローブは、複数の二官能性ポリマーリンカーの各々を介して三次元格子マイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化される、工程と;
(ii)マイクロアレイを少なくとも一回洗浄する工程と;
(iii)蛍光標識された第2のアンプリコンからの蛍光シグナルを検出するために、マイクロアレイを画像化し、それにより、植物サンプル中の病原体を検出する工程と、を行う、工程と、
を含む、方法。 - 複数の二官能性ポリマーリンカーの各々は蛍光標識を含み、前記方法は、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーの蛍光シグナルを検出するためにマイクロアレイを画像化する工程と、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーのシグナル上に、蛍光標識された第2のアンプリコンのシグナルを重ね合わせ、それにより、植物サンプル中で検出された病原体を同定する工程と、をさらに含む、請求項25に記載の方法。
- 病原体は、細菌、真菌、ウイルス、藻類、または原生動物、あるいはそれらの組み合わせである、請求項25に記載の方法。
- 病原体は細菌であり、第1の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、SEQ ID NO:1および2、あるいはSEQ ID NO:3および4、あるいはSEQ ID NO:5および6、あるいはSEQ ID NO:7および8、あるいはSEQ ID NO:9および10、あるいはSEQ ID NO:11および12、あるいはSEQ ID NO:137および138にそれぞれ示される配列を有し、第2の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、SEQ ID NO:19および20、あるいはSEQ ID NO:21および22、あるいはSEQ ID NO:23および24、あるいはSEQ ID NO:25および26、あるいはSEQ ID NO:27および28、あるいはSEQ ID NO:29および30、あるいはSEQ ID NO:141および30にそれぞれ示される配列を有し、核酸プローブはSEQ ID NO:37−85に示される配列を有する、請求項27に記載の方法。
- 病原体は真菌であり、第1の増幅フォワードプライマーとリバースプライマー対は、SEQ ID NO:13および14、あるいはSEQ ID NO:15および16、あるいはSEQ ID NO:135および136にそれぞれ示される配列を有し、第2の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、SEQ ID NO:31および32、あるいはSEQ ID NO:33および34、あるいはSEQ ID NO:139および140にそれぞれ示される配列を有し、核酸プローブはSEQ ID NO:86−125に示される配列を有する、請求項27に記載の方法。
- 蛍光標識された病原体DNA特異的な第2のアンプリコン中の蛍光標識は、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカー中の蛍光標識とは異なる、請求項25に記載の方法。
- 単一アッセイにおいて、植物および病原体からDNAを同時に検出するための方法であって、前記方法は:
a)1つ以上の病原体を潜在的に含む植物組織サンプルを収集する工程と;
b)少なくとも植物組織および1つ以上の病原体からDNAを含む全核酸を単離する工程と;
c)病原体特異的な第1のアンプリコンおよび植物特異的な第1のアンプリコンを得るために、少なくとも1つの病原体DNA選択的な第1のプライマー対と、少なくとも1つの植物DNA選択的な第1のプライマー対を使用して、全核酸上で単一アッセイにおいて、第1の増幅をタンデムで行う工程と;
d)蛍光標識された病原体特異的な第2のアンプリコンおよび蛍光標識された植物特異的な第2のアンプリコンを得るために、鋳型としての病原体特異的な第1アンプリコンおよび植物特異的な第1アンプリコンと、蛍光標識で標識され、かつ病原体特異的な第1のアンプリコン中に内部隣接領域に相補的な配列を有する少なくとも1つの第2のプライマー対と、蛍光標識で標識され、かつ植物特異的な第1のアンプリコン中に内部隣接領域に相補的な配列を有する少なくとも1つの第2のプライマー対とを使用して、第2の増幅をタンデムで行う工程と;
e)請求項1に記載の三次元格子マイクロアレイシステムを使用して:
(i)蛍光標識された病原体特異的な第2のアンプリコン、および蛍光標識された植物特異的な第2のアンプリコンを、病原体DNAおよび植物DNA中のシグネチャー配列決定因子に特異的な核酸プローブでハイブリタイズする工程であって、ここで、核酸は、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーを介して三次元格子マイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化される、工程と;
(ii)マイクロアレイを少なくとも一回洗浄する工程と;
(iii)蛍光標識された病原体特異的な第2のアンプリコンから、および蛍光標識された植物特異的な第2のアンプリコンから、蛍光シグナルを検出するために、マイクロアレイを画像化し、それにより、サンプル中の病原体および植物を同時に検出する工程と、を行う、工程と、
を含む、方法。 - 複数の二官能性ポリマーリンカーの各々は蛍光標識を含み、前記方法は、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーの蛍光シグナルを検出するためにマイクロアレイを画像化する工程と、蛍光標識された植物特異的な第2のアンプリコンおよび蛍光標識された病原体特異的な第2のアンプリコンのシグナルを、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーのシグナルの上に重ね合わせ、それにより、植物サンプル中で検出された病原体および植物を同時に同定する工程と、をさらに含む、請求項31に記載の方法。
- 病原体は細菌であり、第1の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、SEQ ID NO:1および2、あるいはSEQ ID NO:3および4、あるいはSEQ ID NO:5および6、あるいはSEQ ID NO:7および8、あるいはSEQ ID NO:9および10、あるいはSEQ ID NO:11および12、あるいはSEQ ID NO:137および138にそれぞれ示される配列を有し、第2の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、SEQ ID NO:19および20、あるいはSEQ ID NO:21および22、あるいはSEQ ID NO:23および24、あるいはSEQ ID NO:25および26、あるいはSEQ ID NO:27および28、あるいはSEQ ID NO:29および30、あるいはSEQ ID NO:141および30にそれぞれ示される配列を有し、核酸プローブはSEQ ID NO:37−85に示される配列を有する、請求項31に記載の方法。
- 病原体は真菌であり、第1の増幅フォワードプライマーとリバースプライマー対は、SEQ ID NO:13および14、あるいはSEQ ID NO:15および16、あるいはSEQ ID NO:135および136にそれぞれ示される配列を有し、第2の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、SEQ ID NO:31および32、あるいはSEQ ID NO:33および34、あるいはSEQ ID NO:139および140にそれぞれ示される配列を有し、核酸プローブはSEQ ID NO:86−125に示される配列を有する、請求項31に記載の方法。
- 植物サンプル中の1つ以上の病原体DNAのコピー数を定量化するための方法であって、前記方法は:
a)病原体を潜在的に含む植物組織サンプルを収集する工程と;
b)DNAを含む全核酸を単離する工程と;
c)内部参照標準としての少なくとも1つの合成DNA配列の既知のコピー数を、単離された全核酸に加える工程であって、合成DNA配列の各々は:
病原体DNA中のシグネチャー配列決定因子とは異なるヌクレオチド配列を有する中央領域と;
病原体DNA中のコンセンサス配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有する5’末端および3’末端と;
を含む、工程と;
d)1つ以上の病原体DNA特異的な第1のアンプリコンおよび合成DNA特異的な第1のアンプリコンを得るために、各々が病原体DNAに選択的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む少なくとも1つの第1のプライマー対を使用して、全核酸上で単一のアッセイにおいて、第1の増幅をタンデムで行う工程と;
e)蛍光標識された病原体DNA特異的な第2のアンプリコンおよび蛍光標識された合成DNA特異的な第2のアンプリコンをそれぞれ得るために、鋳型としての病原体特異的な第1のアンプリコンおよび合成DNA特異的な第1のアンプリコン、ならびに少なくとも1つの第2のプライマー対を使用して、第2の増幅をタンデムで行う工程であって、各プライマー対は、蛍光標識で標識され、かつ病原体特異的な第1のアンプリコンおよび合成DNA特異的な第1のアンプリコン中に内部隣接領域に相補的な配列を有するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む、工程と;
f)請求項1に記載の三次元格子マイクロアレイシステムを使用して:
(i)病原体DNAおよび合成DNAのそれぞれにおけるシグネチャー配列決定因子に特異的な核酸プローブで第2のアンプリコンをハイブリタイズする工程であって、ここで、核酸プローブは、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーを介して三次元格子マイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化される、工程と;
(ii)マイクロアレイを少なくとも一回洗浄する工程と;
(iii)蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーを介してマイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化された核酸プローブに対応する蛍光シグナル、および、病原体DNA特異的な第2のアンプリコンならびに合成DNA特異的な第2のアンプリコンの各々の蛍光シグナルを検出するために、マイクロアレイを画像化する工程と、を行う工程と;
g)重ね合わせたシグナル画像を得るために、病原体DNA特異的な第2のアンプリコンと合成DNA特異的な第2のアンプリコンの蛍光シグナルの画像を、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーの画像上に重ね合わせる工程と;
h)マイクロアレイ上の1つ以上の重ね合わせたシグナル位置での核酸プローブの配列を、複数の病原体DNAのシグネチャー配列決定因子のデータベースと比較し、それにより、サンプル中の病原体を同定する工程と;
i)病原体DNA特異的な第2のアンプリコンと、合成DNA特異的な第2のアンプリコンの蛍光シグナルからの蛍光シグナル強度および単離された全核酸に加えられた合成DNAの既知のコピー数を数学的に相関させ、それにより、サンプル中の病原体DNAのコピー数を定量化する工程と、
を含む、方法。 - 合成DNAは、SEQ ID NO:154−157に示される配列を有する、請求項35に記載の方法。
- 病原体は細菌であり、コンセンサス配列はSEQ ID NO:153に示され、第1の増幅フォワードプライマーとリバースプライマー対は、SEQ ID NO:1および2、あるいはSEQ ID NO:3および4、あるいはSEQ ID NO:5および6、あるいはSEQ ID NO:7および8、あるいはSEQ ID NO:9および10、あるいはSEQ ID NO:11および12、あるいはSEQ ID NO:137および138にそれぞれ示される配列を有し、コンセンサス配列はSEQ ID NO:153に示され、第2の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、SEQ ID NO:19および20、あるいはSEQ ID NO:21および22、あるいはSEQ ID NO:23および24、あるいはSEQ ID NO:25および26、あるいはSEQ ID NO:27および28、あるいはSEQ ID NO:29および30、あるいはSEQ ID NO:141および30にそれぞれ示される配列を有し、細菌に特異的な核酸プローブは、SEQ ID NO:37−85に示される配列を有し、合成DNAは、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、およびSEQ ID NO:144にそれぞれ示される配列を有する合成DNA特異的核酸プローブにハイブリタイズする、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、およびSEQ ID NO:157に示される配列を有する、請求項35に記載の方法。
- 病原体は真菌であり、コンセンサス配列はSEQ ID NO:152に示され、第1の増幅フォワードプライマーとリバースプライマー対は、SEQ ID NO:13および14、あるいはSEQ ID NO:15および16、あるいはSEQ ID NO:135および136にそれぞれ示される配列を有し、コンセンサス配列はSEQ ID NO:152に示され、第2の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、SEQ ID NO:31および32、あるいはSEQ ID NO:33および34、あるいはSEQ ID NO:139および140にそれぞれ示される配列を有し、真菌に特異的な核酸プローブは、SEQ ID NO:86−125に示される配列を有し、合成DNAは、SEQ ID NO:145に示される配列を有する合成DNA特異的核酸プローブにハイブリタイズする、SEQ ID NO:154に示される配列を有する、請求項35に記載の方法。
- 数学的に相関させる工程は、以下の関係を使用して行われ:
Cn/Co = P(Sn/So)x、
式中、
Cnは、定量化される病原体種の病原体DNAの各タイプnのコピー数であり、Coは、第1の増幅工程を行う前にサンプルに加えられた、合成DNAの既知のコピー数であり、Snは、マイクロアレイ上の特定の既知の位置で病原体DNA特異的な核酸プローブにハイブリタイズした、病原体DNA特異的な蛍光標識された第2のアンプリコンからの相対蛍光単位(RFU)での病原体種のタイプnの各々の蛍光シグナル強度であり、Soは、マイクロアレイ上の特定の既知の位置で合成DNA特異的な核酸プローブにハイブリタイズした、合成DNA特異的な第2のアンプリコンからのRFUでの蛍光シグナル強度であり、Pは、約0.1〜約10に及ぶ定数であり、ならびにXは、約1〜約3に及ぶ指数因子である、請求項35に記載の方法。 - 蛍光標識された病原体DNA特異的な第2のアンプリコンおよび蛍光標識された合成DNA特異的な第2のアンプリコン中の蛍光標識は、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカー中の蛍光標識とは異なる、請求項35に記載の方法。
- 単一のアッセイにおいて、植物組織サンプル中の1つ以上の病原体および植物のDNAのコピー数を同時に定量化するための方法であって、前記方法は:
a)1つ以上の病原体を潜在的に含む植物組織サンプルを収集する工程と;
b)少なくとも植物組織DNAおよび病原体DNAを含む全核酸を単離する工程と;
c)内部参照標準としての少なくとも1つの合成DNA配列の既知のコピー数を、単離された全核酸に加える工程であって、合成DNA配列の各々は:
病原体DNAおよび植物DNA中のシグネチャー配列決定因子とは異なるヌクレオチド配列を有する中央領域と;
病原体DNA中のコンセンサス配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有する5’末端および3’末端と;
を含む、工程と;
d)病原体DNA特異的な第1のアンプリコン、植物DNA特異的な第1のアンプリコン、および合成DNA特異的な第1のアンプリコンを得るために、少なくとも1つの病原体特異的な第1のプライマー対、および少なくとも1つの合成DNA特異的な第1のプライマー対、および少なくとも1つの植物特異的な第1のプライマー対を使用して、全核酸上で単一アッセイにおいて、第1の増幅をタンデムで行う工程と;
e)蛍光標識された病原体DNA特異的な第2のアンプリコン、蛍光標識された植物DNA特異的な第2のアンプリコン、ならびに蛍光標識された合成DNA特異的な第2のアンプリコンを得るために、鋳型としての第1のアンプリコン、少なくとも1つの病原体DNA特異的な第2のプライマー対、および少なくとも1つの植物DNA特異的な第2のプライマー対を使用して、第2の増幅をタンデムで行う工程であって、各プライマー対は、蛍光標識で標識され、かつ、第1のアンプリコン中の内部隣接領域に相補的な配列をそれぞれ有する、工程と;
f)請求項1に記載の三次元格子マイクロアレイシステムを使用して:
(i)第2のアンプリコンを、病原体DNA、植物DNA、および合成DNAそれぞれにおけるシグネチャー配列決定因子に特異的な核酸プローブでハイブリタイズする工程であって、ここで、核酸プローブは、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーを介して三次元格子マイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化される、工程と;
(ii)マイクロアレイを少なくとも一回洗浄する工程と;
(iii)蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーを介してマイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化された核酸プローブに対応する蛍光シグナルと、蛍光標識された病原体DNA特異的な第2のアンプリコン、蛍光標識された植物DNA特異的な第2のアンプリコン、および蛍光標識された合成DNA特異的な第2のアンプリコンの各々に対応する蛍光シグナルとを検出するために、マイクロアレイを画像化する工程と、を行う工程と;
g)重ね合わせたシグナル画像を得るために、蛍光標識された病原体DNA特異的な第2のアンプリコン、蛍光標識された植物DNA特異的な第2のアンプリコン、および蛍光標識された合成DNA特異的な第2のアンプリコンのシグナルを、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーの画像シグナル上に重ね合わせる工程と;
h)マイクロアレイ上の1つ以上の重ね合わせたシグナル位置での核酸プローブの配列を、複数の病原体DNAおよび植物DNAのシグネチャー配列決定因子のデータベースと比較し、それにより、サンプル中の病原体および植物を同定する工程と;
i)病原体DNA特異的な第2のアンプリコンと、合成DNA特異的な第2のアンプリコンからの蛍光シグナル強度および合成DNAの既知のコピー数を数学的に相関させ、それにより、サンプル中の病原体DNAのコピー数を定量化する工程と;
j)植物DNA特異的な第2のアンプリコンからの蛍光シグナル強度を、合成DNA特異的な第2のアンプリコンからの蛍光シグナル強度および合成DNAの既知のコピー数と数学的に相関させ、それにより、サンプル中の植物DNAのコピー数を定量化する工程と、
を含む、方法。 - 病原体は細菌であり、コンセンサス配列は、SEQ ID NO:153に示され、第1の増幅フォワードプライマーとリバースプライマー対は、SEQ ID NO:1および2、あるいはSEQ ID NO:3および4、あるいはSEQ ID NO:5および6、あるいはSEQ ID NO:7および8、あるいはSEQ ID NO:9および10、あるいはSEQ ID NO:11および12、あるいはSEQ ID NO:137および138にそれぞれ示される配列を有し、コンセンサス配列は、SEQ ID NO:153に示され、第2の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、SEQ ID NO:19および20、あるいはSEQ ID NO:21および22、あるいはSEQ ID NO:23および24、あるいはSEQ ID NO:25および26、あるいはSEQ ID NO:27および28、あるいはSEQ ID NO:29および30、あるいはSEQ ID NO:141および30にそれぞれ示される配列を有し、細菌に特異的な核酸プローブは、SEQ ID NO:37−85に示される配列を有し、ここで、合成DNAは、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、およびSEQ ID NO:144にそれぞれ示される配列を有する合成DNA特異的な核酸プローブにハイブリタイズする、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、およびSEQ ID NO:157に示される配列を有する、請求項41に記載の方法。
- 病原体は真菌であり、コンセンサス配列は、SEQ ID NO:152に示され、第1の増幅フォワードプライマーとリバースプライマー対は、SEQ ID NO:13および14、あるいはSEQ ID NO:15および16、あるいはSEQ ID NO:135および136にそれぞれ示される配列を有し、コンセンサス配列は、SEQ ID NO:152に示され、第2の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、SEQ ID NO:31および32、あるいはSEQ ID NO:33および34、あるいはSEQ ID NO:139および140にそれぞれ示される配列を有し、真菌に特異的な核酸プローブは、SEQ ID NO:86−125に示される配列を有し、合成DNAは、SEQ ID NO:145に示される配列を有する合成DNA特異的核酸プローブにハイブリタイズする、SEQ ID NO:154に示される配列を有する、請求項41に記載の方法。
- 数学的に相関させる工程は、以下の関係を使用して行われ:
Cn/Co = P(Sn/So)x、
式中、
Cnは、定量化される病原体または植物の種の各タイプnの病原体DNAあるいは植物DNAのコピー数であり、Coは、第1の増幅工程を行う前にサンプルに加えられた、合成DNAの既知のコピー数であり、Snは、病原体種のタイプnの各々について、マイクロアレイ上の特定の既知の位置で病原体DNA特異的な核酸プローブにハイブリタイズした、病原体DNA特異的な第2のアンプリコンからの相対蛍光単位(RFU)での、蛍光シグナル強度であるか、あるいは、植物種のタイプnの各々について、マイクロアレイ上の特定の既知の位置で植物DNA特異的な核酸プローブにハイブリタイズした、植物DNA特異的な第2のアンプリコンからのRFUでの蛍光シグナル強度であり、Soは、マイクロアレイ上の特定の既知の位置で合成DNA特異的な核酸プローブにハイブリタイズした、合成DNA特異的な第2のアンプリコンからのRFUでの蛍光シグナル強度であり、Pは、約0.1〜約10に及ぶ定数であり、ならびにXは、約1〜約3に及ぶ指数因子である、請求項41に記載の方法。 - 蛍光標識された病原体DNA特異的な第2のアンプリコン、蛍光標識された植物DNA特異的な第2のアンプリコン、および蛍光標識された合成DNA特異的な第2のアンプリコン中の蛍光標識は、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカー中の蛍光標識とは異なる、請求項41に記載の方法。
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