JP5139332B2 - 成長刺激タンパク質の使用 - Google Patents
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Description
i)RT−PCR又はハイブリダイゼーション技術によって、前記組織又は体液からKIAA1524のmRNAの発現を決定し、或いは
ii)タンパク質KIAA1524を含むと予想される組織若しくは体液を、前記KIAA1524を認識する抗体にさらし、前記抗体を検出及び/若しくは定量し、又は前記組織若しくは体液をプロテオミクス技術による分析にかけることにより、組織又は体液におけるKIAA1524タンパク質のレベルを検出又は定量することに基づく。
結果
KIAA1524の同定
HT−1080細胞からPP2A相互作用タンパク質を同定するために、PP2A複合体の足場サブユニットであるTAPタグ付けされたPR65タンパク質を安定して過剰発現する細胞クローンを生成した(図1A)。偽のトランスフェクションを行った対照又はPR65TAP発現細胞の細胞質抽出物のTAP精製により、PR65TAPと共精製するが対照細胞の最終溶出物には存在しない、いくつかのタンパク質が明らかになった(図1B)。その後、これらの推定PR65相互作用タンパク質のいくつかを、質量分析によるペプチド配列決定により同定した。PR65TAP複合体から同定されるタンパク質には触媒性サブユニット(PP2Ac)及びPP2AのBサブユニットの両方が含まれ、これによりアプローチが検証される(図1B)。加えて、KIAA1524を新規な推定PP2A関連タンパク質であると同定することができた。KIAA1524は、いずれの細胞機能もこれまでに同定されていない、90kDAの細胞質タンパク質である(図2)(Soo Hooら、2002年)。以下に示す結果により、KIAA1524は、癌において特異的に上方調節される、PP2Aの内因性阻害剤であると同定される。
KIAA1524の特徴付けされていない細胞機能を明らかにするために、スクランブルsiRNA及びKIAA1524のsiRNAをトランスフェクトしたHeLa細胞のゲノム規模での遺伝子発現プロフィールを72時間後に比較した。注目すべきことに、Sentrix(登録商標)Human−6 Expression BeadChip(Illumina Inc.)内に含まれる遺伝子の少数の画分(26091のうち76)のみが、スクランブルsiRNAをトランスフェクトした細胞及びKIAA1524のsiRNAをトランスフェクトした細胞の間で、再現性があり統計的に有意な(p<0.05、データは示していない)発現レベルの違いを示した(図1F)。PP2Aの活性は形質転換に関与する2つの転写因子、p53及びc−Mycの活性を調節すると示されている。KIAA1524が減少した細胞の転写プロフィールに関してこれらの2つの転写因子を特徴付けるために、KIAA1524の減少に影響される76個の遺伝子のリストを、p53及びc−Mycについて発行された標的遺伝子のデータベースと比較した。p53標的遺伝子のデータベース(http://p53.bii.a−star.edu.sg/aboutp53/targetgene/index.php)に基づくと、KIAA1524の減少に影響を受ける76個の遺伝子のうち1つのみが、そのプロモーター内にp53結合部位を有するか又はp53に転写調節されると公表されている。しかし、c−Myc標的遺伝子のデータベース(http://www.myc−cancer−gene.org/site/mycTargetDB.asp)と比較すると、KIAA1524の減少に影響を受ける遺伝子の16%(12/76)がそれらのプロモーター領域においてc−Mycを結合することが見出された。これらの所見は、公表されている、c−Mycタンパク質の安定性を調節するPP2Aの役割と共に、KIAA1524がc−Mycの機能を調節し得るということを示唆している。
上記の結果は、KIAA1524がPP2A複合体と相互作用し、c−Mycの安定性を高めることを示す。KIAA1524がc−Myc関連PP2A活性を実際に阻害するかどうかを研究するために、スクランブルsiRNA及びKIAA1524のsiRNAをトランスフェクトした細胞のc−Mycの免疫沈降物を、基質として6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルホスフェートを用いる(Pastulaら、2003年)、インビトロでのPP2Aアッセイにかけた。重要なことに、siRNAによるKIAA1524の減少により、c−Myc免疫沈降物におけるPP2A活性が顕著に増加した(図4C)。興味深いことに、免疫沈降物の分析により、PP2Ac及びc−Mycが構成的に互いに複合していること、及びKIAA1524の減少がc−Myc−PP2Acの相互作用に影響を与えないことがさらに明らかになった(図4D)。総合すると、これらの結果は、KIAA1524がc−Myc−PP2A複合体におけるPP2Aの活性を阻害し、c−Mycのタンパク質分解を防止することを示している。
癌細胞の挙動の調節におけるKIAA1524の役割を研究するために、HeLa細胞をKIAA1524のsiRNAでトランスフェクトし、細胞培養物及びインビボでのマウスモデルの両方において細胞増殖を研究した。次に、細胞増殖の調節におけるKIAA1524の役割を、HeLa細胞におけるチミジン組み込みアッセイによって分析した。スクランブルsiRNAをトランスフェクトした細胞と比較して、KIAA1524の減少により、トランスフェクションの72時間後の細胞増殖が顕著に阻害された(図6A)。しかし、KIAA1524のsiRNAのトランスフェクションは、細胞DNA含有量のFACS分析においてサブG1画分を誘導せず(図6B)、またPARPタンパク質の切断も誘導せず(図6C)、このことは、KIAA1524の減少がプログラム細胞死を誘導しないことを示している。
上記に示した結果により、KIAA1524がPP2A介在性のc−Mycの分解を阻害し、癌細胞の成長及び増殖を促進することについての証拠が得られる。これらの特徴に基づいて、KIAA1524は癌治療のための新規な薬物標的となり得る。癌治療におけるタンパク質標的への期待を満たすためには、KIAA1524はヒト癌組織において過剰発現することが好ましい。本発明者による定量RT−PCR分析によると、KIAA1524のmRNAは、骨髄、前立腺、睾丸、小脳、及び大脳以外の21の非悪性試料の大部分において非常に低いレベル(β−アクチンのmRNAの発現レベルの1%未満)で発現した(図7A)。非悪性細胞と悪性細胞との間でKIAA1524のタンパク質レベルを比較するために、異なる細胞型の全細胞溶解物をKIAA1524について免疫ブロットした。図7Aと一致して、非常に低いレベルのKIAA1524タンパク質がヒト表皮角化細胞(HEK)、非腫瘍形成性MEF、及び不死化NIH3T3マウス線維芽細胞において検出された。しかし、KIAA1524タンパク質はHeLa細胞及びHT−1080線維肉腫細胞の両方において高いレベルで発現し、このことは、KIAA1524の発現が細胞の腫瘍形成能と相関し得ることを示している。
抗体
KIAA1524に対するウサギポリクローナル抗体が公表されている(Soo Hooら、2002年)(フロリダ大学のChan博士により提供していただいた)。PP2Ac、PR65、Flag、HA、GST、PARP、c−Myc、及びアクチンに対する抗体を、Santa Cruz biotechnologies inc.から入手した。
PR65TAPタグベクターのPR65αをpRC/CMV.HA PR65a(スイス、バーゼル、Friendrich Miescher−InstitutのBrian A.Hemmings博士から譲っていただいた)からPCR増幅し、XhoI部位及びBamHI部位を用いてTAPベクターであるJW16(Westermarckら、2002年)内にクローニングした。Flag−KIAA1524wt構築物を、公表されているKIAA1524の全長cDNA(Soo Hooら、2002年)(フロリダ大学のChan博士により提供していただいた)からPCRで構築した。Flag−KIAA1524mutのcDNA構築物を、5−Ttaatagagaaacttcagtctggaatg(配列番号80)及び5−Gtggtaaaggatcagatttgtgatgtgaga(配列番号81)のオリゴを用いてプラスミドFlag−KIAA1524wtからPCRで構築した。その後、全てのクローンをDNAの配列決定により検証した。
インフォームドコンセントの後、Turku大学中央病院において1990年から2002年の間にHNSCCから手術によって除去された腫瘍から、腫瘍試料を集めた。HNSCCの研究のために、正常な試料を口蓋垂軟口蓋咽頭形成術を受けている患者から集めた。試料は29歳から87歳までの男女から集めた。
ヒトSCC細胞系を、頭頚部SCCの原発腫瘍(UT−SCC−8)、再発腫瘍、又は転移(UT−SCC−7、UT−SCC−9)から確立した。6nmol/lのグルタミン、非必須アミノ酸、100U/mlのペニシリン、100mgのストレプトマイシン、及び10%ウシ胎児血清(FCS)を補ったDMEMにおいて、SCC細胞を培養した。正常なヒト表皮角化細胞を、SingleQuots(登録商標)(Cambrex Bioscience Walkersville、米国メリーランド州)を補ったケラチノサイト基礎培地(Keratinocyte Basal Medium)2(KBM(登録商標)−2)において培養した。HT−1080、HeLa、及びHK293を含む全ての他の細胞系を、100U/mlのペニシリン、100mgのストレプトマイシン、及び10%FCSを補ったDMEMにおいて培養した。
FuGene6トランスフェクション試薬(Roche)を製造者の指示に従って用いて、サブコンフルエントな細胞を一過性にトランスフェクトした。siRNA処理のために、細胞を80%のコンフルエンスまで成長させ、培地を、何も補っていないDMEMで置き換えた。二本鎖RNAオリゴヌクレオチド(スクランブル:5’−UAACAAUGAGAGCACGGCTT−3’(配列番号82)及び5’−CCUACAUCCCGAUCGAUGAUGTT−3’(配列番号83)、KIAA1524:5’−CUGUGGUUGUGUUUGCACUTT−3’(配列番号84)及び5’−ACCAUUGAUAUCCUUAGAATT−3’(配列番号6)、IBA)をOligofectamine(商標)試薬(Invitrogen)で調製し、細胞に加えた。4〜6時間のインキュベーションの後、培地を10%FCSに平衡させ、siRNA処理を適切な長さの時間まで延長した。
TRIzol試薬(Invitrogen)を製造者の手順に従って用いて、培養細胞から全RNAを抽出した。臨床腫瘍試料から、酸性グアニジウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム法を用いてRNAを抽出した。可能性のある汚染DNAを排除するため、RNA試料を5単位のDNアーゼI(Roche)で処理した。鋳型としての1μgの全RNA、0.5μgのランダムヘキサマー、及び200単位のモロニーマウス白血病ウイルスRNアーゼHマイナス逆転写酵素(どちらもPromega、米国ウィスコンシン州Madisonから入手)を25μlの全量に含む反応において、製造者の手順に従ってcDNAを合成した。
HA−PP2Ac及びFlag−KIAA1524のcDNA構築物でのトランスフェクションの24時間後に、ガラスカバースリップ上で培養したHeLa細胞を透過処理し、PTEMF(100mMのPipes(pH6.8)、10mMのEGTA、1mMのMgCl2、0.2%トリトンX−100、及び4%ホルムアルデヒド)において10分間固定した。PBSで3回洗浄した後、非特異的抗体の結合を、PBSにおける3%のBSAで30分間遮断した。その後カバースリップをHA及びFlagタグ特異的抗体と、PBSにおける2%のBSA内で室温で1時間インキュベートした。3回洗浄した後、結合した抗体を、Cy3及びCy2と結合した二次抗体(Jackson ImmunoResearch)と室温で1時間インキュベートすることで可視化した。PBSで3回洗浄した後、カバースリップを50%グリセロール、PBS、及び2%w/vのDABCO(Sigma−Aldrich)内に置いた。同時局在の分析のために、共焦点レーザー走査顕微鏡(LSM510、Carl Zeiss Inc.)を用いて画像を得た。
プロテインG−セファロースビーズを、20mMのHEPES−KOH(pH7.5)、300mMのNaCl、0.25mMのEGTA、1.5mMのMgCl2、0.25%NP−40、プロテアーゼ阻害剤(Roche)、10mMのb−グリセロリン酸、及び0.5mMのDTT内において、PR65、PP2Ac、c−Myc抗体、又は対照の免疫前血清と、4℃で2時間、回転機上で撹拌した。Flag−KIAA1524突然変異体の免疫沈降を、Flag抗体樹脂(M3、Sigma)を用いて実施した。その後、沈殿したビーズを細胞溶解物と混合し、4℃で一晩インキュベートした。その後、沈殿したビーズを、50mMのTris−HCl(pH7.4)、150mMのNaCl、0.3%NP−40、及び0.5mMのDTTで4回洗浄し、結合したタンパク質を、Trueブロット二次抗体を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。ホスファターゼアッセイのために、免疫複合体をビーズ上に保持し、等量のビーズを加えて、6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルホスフェート(DiFMUP)基質を有するタンパク質セリン/スレオニンホスファターゼアッセイキット(Molecular Probes、米国オレゴン州Eugene)を製造者の指示に従って用いてホスファターゼアッセイを行った。
cDNA試料の定量リアルタイム逆転写PCR(RT−PCR)分析を、Primer Expresssソフトウェア(PE Biosystems)を用いて設計した特異的プライマー及び蛍光プローブを用いて実施し、KIAA1524及びβ−アクチンのmRNAのレベルを特異的に定量した。プライマー及びプローブの配列を以下に示す。
プローブ:att gct cag cat cgc tgt caa aga act ca(配列番号85)
フォワード:aag ctc tag ccc ttg cac agg(配列番号86)
リバース:gtc cgt gcc tct gtt tca gc(配列番号87)
プローブ:atg ccc tcc ccc atg cca tcc tgc gt(配列番号88)
フォワード:tca ccc aca ctg tgc cca tct acg c(配列番号89)
リバース:cag cgg aac cgc tca ttg cca atg g(配列番号90)
増殖巣形成アッセイ及び軟寒天における足場非依存性の成長のために、HeLa細胞をトリプシン処理し、siRNA処理の48時間後に10cmのプレートに細胞4×105個にして播種した。軟寒天アッセイを、文献に記載されているように10%FBSを含む培地で実施した。9日間のインキュベーションの後、培養物を二重盲検で写真撮影した。生存しているコロニーの形の細胞を顕微鏡画像(倍率×5)で測定した。各画像で見られたコロニーの数及びサイズを、NIH(http://rsb.info.nih.gov/ij/)のImageJ 1.33uソフトウェアを用いて分析した。足場非依存性コロニーを200〜10000ピクセルの間の数に従って分類した。
SDS−PAGEゲル電気泳動によるタンパク質の分離の後、タンパク質をImmobilo−P膜(Millipore、米国マサチューセッツ州Billerica)に移した。一次抗体及び二次抗体とのインキュベーションの後、免疫ブロットしたタンパク質を高感度化学発光(ECL、Amersham Biosciences)によって可視化した。
KIAA1524の、パラフィン包埋した腫瘍切片及び対照の組織切片の免疫染色を、PBSに1:100で希釈したp90抗体(Soo Hooら、2002年)を用いて実施した。免疫染色は、ジアミノベンジジン(DAB)を組み合わせたアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体法(VectaStain、Vector Labs、米国カリフォルニア州Burlingame)で行い、ヘマトキシリンで対比染色した。
PR65TAPタンパク質を安定して発現するHT−1080細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、緩衝液A(10mMのHepes(pH7.9)、10mMのKCl、0.1mMのEDTA、0.1mMのEGTA、1.5mMのMgCl2、コンプリートプロテアーゼインヒビター、20mMのb−グリセロリン酸、25mMのNaF、0.5mMのPMSF、及び0.5mMのDTT)内に再懸濁した。細胞を氷上でインキュベートし、ボルテックスし、そしてその後3900rpmで3分間遠心分離して細胞質溶解物を得た。次に、IgG結合緩衝液(IBB:10mMのTris HCl(pH8.0)、150mMのNaCl、0.2%NP−40、0.5mMのDTT)として、同レベルのNaClとNP−40とを含むように抽出物を調整した。次に、調整した抽出物を、IBBで洗浄したIgGセファロース4 Fast Flow(Amersham)を含むPoly−Prep(登録商標)クロマトグラフィーカラム(BioRad)上に添加した。抽出物を4℃で4時間インキュベートし、その後10mlのIBBで3回洗浄した。次に、ビーズをTEV切断緩衝液(TCB:10mMのTris HCl(pH8.0)、150mMのNaCl、0.3%NP−40、0.5mMのEDTA、及び0.5mMのDTT)及び組換えタバコエッチウイルスプロテアーゼ(TEV)において、4℃で一晩インキュベートした。カルモジュリンビーズ(Startagene)を、Poly−Prep(登録商標)クロマトグラフィーカラムにおいてカルモジュリン結合緩衝液(CBB:10mMのb−メルカプトエタノール、50mMのTris HCl(pH8.0)、150mMのNaCl、1mMの酢酸Mg、1mMのイミダゾール、2mMのCaCl2、及び0.2%NP−40)で洗浄した。次に、TEVの溶出物をカラムから回収し、カルモジュリンビーズに結合するよう調整した(1mlの各溶出物に対して、1MのCaCl2を4ml、及びCBBを3ml)。調整した溶出物を4℃で2時間インキュベートし、その後10mlのCBBで3回洗浄した。次に、カルモジュリンビーズに結合したタンパク質をカルモジュリン溶出緩衝液(CEB:10mMのb−メルカプトエタノール、10mMのTris HCl(pH8.0)、150mMのNaCl、1mMの酢酸Mg、1mMのイミダゾール、5mMのEGTA、及び0.2%NP−40)で回収するか、又はSDSローディングバッファー内で煮沸して回収した。
目的のタンパク質バンドをゲルから切り取り、還元し、アルキル化し、以前に記載されているようにトリプシンで一晩消化した。抽出されたペプチドを、ナノフローHPLCシステム(LC Packings、米国カリフォルニア州San Francisco)と組み合わせた、ハイブリッドリニアイオントラップ機器(Q−Trap、Applied Biosystems、米国マサチューセッツ州Framingham)で、LC−MS/MSにより特徴付けた。得られたペプチド断片のスペクトルを、包括的で非冗長なタンパク質データベースに対して、Mascotを用いてサーチした。最低3つのマッチしたトリプシンペプチドが各タンパク質の同定に必要であり、必要であれば、手作業での検査により断片の正確なイオンの割り当てを確実にした。
スクランブルsiRNA又はKIAA1524のsiRNAのいずれかでのトランスフェクションの72時間後にHeLa細胞から抽出された全RNAを、Sentrix(登録商標)Human−6 Expression BeadChipアレイ(Illumina Inc.)により、ゲノム規模での遺伝子発現プロフィールについて分析した。cDNAの増幅、標識、及びハイブリダイゼーションは、製造者の指示及び標準的な手順に従って、フィンランドDNAマイクロアレイセンター(バイオテクノロジーセンター、Turku大学及びAbo Akademi大学、Turku、フィンランド)で行った。アレイから得られたデータを、フィンランド、TurkuのTurku大学及びAbo Akademi大学のバイオテクノロジーセンターに所在のバイオインフォマティクス中央施設で分析した。スクランブルsiRNAをトランスフェクトした細胞と比較して、2つの実験の両方において発現レベルが少なくともlog0.5変化するという基準に従って、発現がKIAA1524の減少に応じて顕著に変化した76個の遺伝子のリストをフィルターした。
図6G、8A、8B、9A、及び9Bについては、統計的有意性はマンホイットニーのU検定によって決定し、統計分析を有する全ての他の実験については、統計分析はスチューデントt検定で行った。
Claims (5)
- KIAA1524を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉RNA(siRNA)、又はリボザイムを含む、癌及び他の過剰増殖性疾患からなる群から選択される疾患を治療、予防、及び/又は緩和するための医薬組成物。
- 前記癌が、頭頚部扁平上皮癌、乳癌、及び結腸癌からなる群から選択される、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記過剰増殖性疾患が、乾癬、心筋肥大、及び良性腫瘍からなる群から選択される、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記siRNAが配列番号2〜6からなる群から選択される、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、PP2A複合体若しくは転写因子c−Mycとの前記KIAA1524タンパク質の相互作用を阻害することにより細胞の増殖及び成長を予防若しくは阻害し、又は前記医薬組成物が、PP2A若しくはc−MycとのKIAA1524の相互作用に依存しない、KIAA1524の増殖及び成長の効果を阻害する、請求項1に記載の医薬組成物。
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